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Medicine

Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

Mostramos uma técnica para in vivo bioluminescência vivo e no infravermelho próximo de imagem de neurite óptica e encefalite no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) para a esclerose múltipla em ratinhos SJL / J.

Abstract

Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) em murganhos SJL / J é um modelo para a esclerose múltipla recorrente-remitente (EMRR). pontuações de EAE clínica que descrevem os défices de função de motor são leituras básicas da inflamação mediada por imune da medula espinhal. No entanto, a pontuação e peso corporal não permitem uma avaliação in vivo de inflamação do cérebro e neurite óptica. O último é uma manifestação precoce e frequente em cerca de 2/3 dos pacientes com EM. Aqui, mostramos métodos para a bioluminescência e imagens ao vivo do infravermelho próximo para avaliar EAE evocado neurite óptica, inflamação do cérebro, e barreira sangue-cérebro interrupção (BBB) em ratos vivos utilizando um sistema de imagem in vivo. Um substrato bioluminescente activado por oxidases mostrou principalmente neurite óptica. O sinal foi específico e permitiu a visualização de efeitos da medicação e cursos tempo de doença, que em paralelo os escores clínicos. nanopartículas fluorescentes peguilados que permaneceram dentro da vasculature por períodos de tempo prolongados foram usadas para avaliar a integridade da BHE. No infravermelho próximo de imagem revelou uma fuga de certificação no pico da doença. O sinal foi mais forte em torno dos olhos. Um substrato de infravermelho próximo para metaloproteinases de matriz foi usada para avaliar a inflamação evocados-EAE. Auto-fluorescência interferiu com o sinal, o que requer a separação espectral para efeitos de quantificação. Em geral, imagem de bioluminescência foi um método fiável para avaliar a neurite óptica e efeitos de medicação associada a EAE e foi superior ao das técnicas de infravermelho próximo, em termos de especificidade do sinal, robustez, facilidade de quantificação, e custo.

Protocol

1. EAE Indução em SJL / J Mice

  1. Ratos
    1. Use camundongos 11 semanas de idade SJL Mulher / J e permitir-lhes para se habituar à sala experimental durante cerca de 7 dias. Utilize n = 10 ratos por grupo.
    2. Para a avaliação dos efeitos da medicação, administrar a droga e placebo para o grupo de controlo continuamente através da água de beber ou através de peletes alimentares a partir de 3 ou 5 dias após a imunização (n = 10 por grupo). Durante o pico da doença, administrar medicação ou placebo com leite ou 3% flocos de milho-embebidas água com açúcar.
  2. material de imunização
    1. Utilizado um kit de indução de EAE que compreende o antigénio (péptido da proteína proteolipídica, PLP139-151, 1 mg / ml de emulsão) em uma emulsão com adjuvante de Freund completo (CFA, morta pelo calor de Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) e 2 frascos para injectáveis ​​(5 ug cada) de toxina da tosse convulsa liofilizado (PTX).
    2. Dissolve-se a PTX (2 ug / ml) em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS; isto é, </ Em> adicionar 1,5 mL de PBS a cada tubo de PTX, misturar bem, remover com a mesma ponta de pipeta, e adicionar a 1 mL de PBS num tubo de 50 mL); misture bem.
  3. Imunização
    1. Injectar PLP / CFA por via subcutânea em 2 porções, cada uma de 100 ul, tanto na base da cauda. Não injectar na parte de trás do pescoço, porque quaisquer reacções imunitárias na pele na parte superior das costas ou no pescoço vai perturbar a imagem da cabeça e da medula espinhal.
    2. Injectar 100 uL de PTX por via intraperitoneal (IP), duas vezes por ratinho, o primeiro 1-2 h após a imunização e a segunda a 24 h.
    3. Para os ratos de controlo, injectar CFA sem PLP (2 porções de 100 mL) mais PTX, sem PLP.
  4. Rato manuseamento após a imunização
    1. Pesar os ratos a cada dois dias até ao dia 7, e, em seguida, pesá-los diariamente.
      NOTA: Ratos perder cerca de 1-2 g de peso corporal durante a EAE. O declínio marca o início de EAE.
    2. Avaliar os sintomas clínicos diariamente desde o dia 7 de acordoing aos sistemas de pontuação padrão (ou seja, a pontuação 0: sem mudanças óbvias em funções motoras; marcar 0,5: paralisia distal da cauda; marcar 1: paralisia da cauda completa; marcar 1,5: paralisia leve de uma ou ambas as patas traseiras; marcar 2: grave paralisia das patas posteriores; marcar 2,5: paralisia completa uma perna; marcar 3: paralisia completa das duas patas traseiras; marcar 3.5:. paralisia completa dos membros posteriores e paresia de uma perna dianteira Euthanize camundongos com dezenas de 3.5 ou superior para > 12 h.
  5. Claro e hora da imagem EAE
    1. Realizar a primeira imagem no início da doença, quando os ratinhos atingir pontuações> 1, que vai ocorrer por volta do dia 10-12 após a imunização.
    2. Realizar a segunda imagem no pico, que vai ser atingido 1 ou 2 dias após os sintomas iniciais desenvolver e vai durar durante 1 - 3 dias.
      Nota: Subsequentemente, os ratos recuperar totalmente dentro de 7 a 10 dias. De imagem durante os intervalos ainda pode mostrar fugas vasculares,mas os indicadores de inflamação deve ser negativo.

2. Bioluminescent and Imaging Near-infrared de neurite óptica e Cérebro Inflamação

  1. Configuração do sistema de imagem
    1. Realiza-se em imagiologia in vivo com qualquer equipamento que permite a análise de bioluminescência e sinais do infravermelho próximo.
    2. Manter os ratos com menos de 2 - anestesia isoflurano 2,5% durante todos os procedimentos de imagem.
    3. Posição um ou dois ratos ao lado do outro no aparelho usando os fornecimentos de gás média. Posicionar a parte superior da coluna no centro.
    4. Use dois ratos simultaneamente, um por grupo, para a avaliação dos efeitos de medicação para comparar pares. Isto é importante para a imagiologia bioluminescente.
    5. Proteger o local da imunização com um pano preto e tomar uma imagem de fotografia e de linha de base para avaliar o posicionamento correto do mouse / mice. Use o foco B com um 6,5-cm de distância da câmera para todas as imagens.
  2. Injeção e imagem da sonda inflamação bioluminescente
    1. Use in vivo configurações do sistema de imagem: Epi-BLI, Em filtrar aberta, Ex bloco de filtro, fstop 1, binning 8, o foco B = 6,5 cm, anúncio de exposição 120 s; dar uma imagem de linha de base.
    2. Injectar 100 uL IP do reagente quimioluminescente pronto-para-uso (40 mg / mL). Misture bem antes de encher a seringa.
    3. Capturar imagens bioluminescência 5, 10, e 15 minutos após a injeção. O decurso de tempo do pico bioluminescente difere entre animais.
      NOTA: O pico ocorrerá 5 - 10 minutos após a injecção; um declínio de 15 min indica que não há imagens adicionais são necessários. Utilize pares de ratos com grupos de controle e tratamento para eliminar preconceitos menores devido a diferentes intervalos de tempo.
    4. Preencher descrições relevantes para o experimento. Observar uma caixa de diálogo pop-up automaticamente; que inclui informações, como estirpe de ratinhos, sexo, ponto de tempo, o tempo de injeção de sonda, o grupo, etc. Salve os arquivos de todos em One pasta; eles vão ter marcas de tempo e todas as descrições.
  3. Injeção e imagem de nanopartículas fluorescentes do infravermelho próximo para a integridade BBB
    1. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão das nanopartículas fluorescentes peguilados são 675/690 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar a 2 s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
    2. Injectar 70 mL de nanopartículas infravermelhos fluorescentes peguilados IV através da veia da cauda e imaginar os ratos 3 h e 24 h após a injecção utilizando as definições acima. Misture bem a solução, antes de encher a seringa.
    3. Injectar cloreto de sódio a 0,9% em ratinhos de controlo, que irá ser necessário para avaliar a especificidade do sinal.
  4. Injeção e de imagem da sonda de infravermelho próximo fluorescente para a atividade MMP
    1. Barbear ou depilar a cabeça e uregião da coluna pper cautela um dia antes de tomar a imagem de linha de base. A pele não deve ser ferido.
    2. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão da sonda activ�el MMP são 680/700 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar um 1-s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
    3. Adicionar 200 ul de 1x PBS para o tubo de 1,5 ml da solução de pronto-a-usar (20 nmol / 1,5 ml em PBS 1x), de modo que vai ser suficiente para 10 ratinhos; misturar bem antes de encher a seringa.
      NOTA: O volume fornecido não leva em conta que algum volume é perdido durante o enchimento de seringa e injeção.
    4. Injectar 150 mL da sonda IV através da veia da cauda 24 horas antes da imagiologia. Injectar PBS apenas em animais de controlo para avaliar a especificidade do sinal.
    5. Às 24 h após a injeção, tome imagens Epi-FL, pelo menos, em dois comprimentos de onda, Ex640 / Em700 e Ex 675 / EM720, com as configurações explicado acima (1-s exposição, a focagem B, binning 8 e fstop 2).
      NOTA: O uso de dois comprimentos de onda permite a separação espectral subtraindo o sinal não específico.

3. As análises da imagem

  1. Análise de bioluminescência (BLI)
    1. Clique duas vezes no software para abri-lo.
    2. Na barra de menu superior, clique no ícone do navegador de arquivos, vá para o diretório da pasta do experimento, e selecione-o; isso vai abrir todos os arquivos na pasta em uma tabela.
    3. Configurar as colunas mostram as descrições relevantes para o experimento.
    4. Para controle de qualidade, clique duas vezes em um arquivo de um rato não responder, sem sintomas de EAE e / ou um rato naïve para verificar a especificidade dos sinais de EAE.
      NOTA: Não deve haver nenhum sinal em camundongos ingênuos e sinal mínimo em ratos não responderam.
      1. Verifique a imagem de linha de base antes da injeção do proser para cada rato como um controlo posterior da especificidade do sinal; ele deve ser negativo.
    5. Para selecionar uma imagem, clique duas vezes no primeiro arquivo do primeiro rato EAE e verificar a intensidade bioluminescente (LUT gama bar) e localização. Verifique todas as imagens uma a uma. Feche o arquivo com a menor intensidade para cada rato (ou seja, mantenha 2 de 3 imagens para cada mouse).
    6. ajuste de imagem e exportação
      1. Clique duas vezes no primeiro arquivo a ser quantificado. Observar uma nova janela pop-up. Em "Opções" (menu superior), personalizar os rótulos para exibir em cada imagem.
      2. Na paleta ferramenta certa, ir para "ajuste de imagem." Por padrão, as intensidades mínimas e máximas estão definidas para "auto" e exibido em pseudo arco-íris. Selecione "manual" para alterar as configurações, se necessário.
        NOTA: Por exemplo, todas as imagens exportadas pode ter barras de TUS idênticos (minima idênticos e maxima) para ser facilmente comparáveis.O ajuste dos mínimos e máximos não tem impacto sobre os resultados quantitativos.
      3. Clique na exportação de imagens, selecione png, o diretório e um nome de imagem
    7. Quantificação de regiões de interesse (ROI)
      1. Ir para a função "ROI" na paleta de ferramentas. Selecione o método de ROI (círculo, rectangular, auto, ou free-hand) eo número de ROIs. Observe a janela de ROI aparecer na janela da imagem.
      2. Usando o mouse, ajustar o tamanho e posição. Use limiares de ROI idênticos para todas as imagens se a ferramenta de auto-ROI é usado. Use áreas idênticas para todas as imagens se os tamanhos e posições de ROI são definidos manualmente (por exemplo, ROI circular).
      3. Clique em "medir RO.I. Observar uma nova janela pop-up. Personalize as colunas (por exemplo, nome do arquivo, o número de animais, o grupo, experiência, área, as contagens totais, contagens médias, contagens SD, min e max conta, área, tempo ponto, o tempo de injeção de sonda, etc.). Salve as configurações personalizadas. Quando reAdy, selecione tudo (Ctrl + A), e copiar e colar a tabela em uma planilha.
      4. Exportar a imagem como um png com as ROIs no lugar. Salve e feche o arquivo de imagem.
    8. Repita o procedimento (etapas 3.1.6 - 3.1.7) para todos os arquivos de imagem que precisam ser quantificados. Copie todos quantificações de ROI na planilha.
      NOTA: Aqui, os resultados podem ser classificados por grupo, ponto de tempo, etc. e analisados estatisticamente. Use as contagens totais de sinais de bioluminescência na ROIs para análises estatísticas.
  2. Análise de infravermelho próximo (NIR) de nanopartículas fluorescentes
    1. Usando os controles no software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo.
    2. comparar visualmente as imagens capturadas no Ex / Em 675/720 e Ex / Em 640/700 para avaliar a especificidade do sinal.
    3. Use as imagens capturadas pelo Ex / Em 675/720 para a análise quantitativa (máximo de excitação: 680 nm). Definir ROIs, para o qual pode ser utilizado a ferramenta de auto-ROI. Ajuste o limite auto-ROI e usá-lo para todas as imagens. Quantificar a eficiência radiante total na ROIs (veja o passo 3.1).
  3. Análise de infravermelho próximo (NIR) da sonda sensível a protease
    1. Usando controles de software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo. Realizar a separação espectral do auto-fluorescência. A ferramenta desmistura é implementado em Imagem estar. A auto-desmistura usa o Ex / Em 640/700 como o específico e 675/720 como a imagem auto-fluorescente.
    2. Seleccionar a imagem não misturados e definir os ROIs, como descrito acima. Use a eficiência radiante total na ROIs para as análises quantitativas e estatísticas.

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Representative Results

Curso de tempo de bioluminescência de neurite óptica

O sinal da sonda de bioluminescência inflamação era a mais forte em torno dos olhos e ocorreu exclusivamente em ratinhos EAE com neurite óptica. Um sinal ocorreu em nenhum dos ratinhos não-EAE nem os ratinhos não injectados com a sonda de inflamação. O sinal desapareceu quando os ratos recuperaram. Assim, o sinal é específico para a neurite óptica, e o pico do sinal é paralelo ao pico das pontuações de EAE clínica. A Figura 1 mostra dois exemplos de ratinhos SJL / J fotografadas no dia 10 e 14 após a indução da EAE. O sinal bioluminescente foi o mais alto no dia 10 e desapareceu quando os murganhos começaram a recuperar. Os cursos de tempo das pontuações clínicas combinava com o desaparecimento do sinal bioluminescente (exemplo-1) ou precedido (exemplo-2) o declínio das pontuações.


Figura 1. Curso Tempo de neurite óptica e escores clínicos em ratos EAS-SJL / J. Bioluminescentes imagens de neurite óptica foram capturados 10 min após a injecção da sonda inflamação (100 ip uL) durante 1 a r alargamento da doença em dois ratinhos SJL / J, em diferentes pontos de tempo após a imunização. As imagens bioluminescentes (painel esquerdo) foram capturados 10 e 14 dias após a imunização e são apresentados como sobreposições de fotografia PseudoColor arco-íris. bares lut variam de azul (baixo) ao vermelho (high-bioluminescência). Barra de escala: 1 cm. O painel da direita mostra gráficos de barras de as contagens totais de bioluminescência individuais em rois (média ± desvio padrão de 3 imagens cada) e os cursos de tempo das pontuações de EAE clínicos. As setas vermelhas marcar os dias de imagem. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.

Avaliação da Eficácia do Tratamento

sonda inflamação

Os efeitos da medicação (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d), 5 são mostrados na Figura 2. Cinco exemplos das imagens bioluminescentes em cada grupo são apresentados. As pontuações do grupo de veículo e de tratamento foram heterogénea, mas em todos os ratinhos, o sinal bioluminescente no olho mostrando a inflamação no nervo óptico era inferior no grupo medicamento (Figura 2A). A quantificação das contagens totais bioluminescentes em rois confirmada significativa a eficácia do tratamento (Figura 2B, com gráficos de caixas das contagens totais bioluminescentes, desemparelhado 2-tailed t-teste, P <0,05). Os resultados de imagem acordado com o efeito terapêuticos da medicação em termos de escores clínicos e manifestações histopatológicas de EAE na medula espinhal e nervo óptico 5.

Figura 2
Figura 2. A eficácia de medicamentos em ratos EAE-SJL / j utilizando Bioluminescent Imaging. ratinhos SJL / J receberam veículo ou medicamento (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d) a partir de 5 dias após a imunização. As imagens foram capturadas após a injecção da sonda inflamação (100 mL ip) no pico EAE 1 r, n = 10 por grupo. EAE desenvolvido em 7/10 em ambos os grupos, e EAE não-respondedores estavam sem sinal. A) bioluminescência imagens em ratos vivos capturado 5-15 min após a injecção ip de 100 ul do sonda inflamação são apresentados como sobreposições fotografia PseudoColor arco-íris. bares TUS variam de azul (baixo) ao vermelho (alta intensidade). Barra de escala: 1 cm. O pico indivíduodas contagens totais bioluminescentes em rois foi usada para quantificação. ROIs foram restritas à cabeça. Os locais de injecção PLP estavam protegidos com um pano preto. B) Os diagramas de caixa mostrando a quantificação das contagens totais em rois. A caixa representa o intervalo interquartil, a linha é a mediana, e os bigodes mostrar o mínimo ao máximo. As contagens totais diferiu significativamente entre os grupos (teste t de dois lados não emparelhado, P <0,05), demonstrando uma redução de neurite óptica e encefalite em ratinhos que receberam a medicação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nanopartículas fluorescentes peguilados

imagens de epifluorescência de nanopartículas do infravermelho próximo revelou fugas vasculares em torno dos olhos e no cérebro em ambos os grou tratamentoPS (Figura 3A, 2 exemplos). As partículas distribuir-se muito lentamente a partir do sangue para o espaço intersticial, excepto para os locais de inflamação, em que o corante se acumula, o que permite uma avaliação da integridade da BHE. O vazamento foi evidente em 3 h e 24 h após a injecção das nanoparticulas, mas foi mais forte no ponto de tempo posterior. Não havia nenhum sinal específico em ratinhos não EAE ou ratos não injectados com nanopartículas (painel da direita). Assim, o sinal era específica. A análise quantitativa da eficácia radiante em rois (Figura 3B) não revelou diferenças significativas entre os grupos de tratamento (n = 3 por grupo, desemparelhado 2-tailed t-teste, P <0,05).

Figura 3
Figura 3. Avaliação de Sangue barreira do cérebro Disruption com peguilado fluorescente nanopartículas. SJL / J ratinhos receberam veículo ou medicamento (R-flurbiprofPT 5 mg / kg / d) a partir de 5 dias após a imunização. As imagens foram capturadas 3 h e 24 h após a injecção de nanopartículas de próximo do infravermelho-marcado (70 ul iv) durante o pico de EAE 1, n = 3 por grupo. EAE não-respondedores estavam sem sinal. A ferramenta de auto-ROI foi usada para a quantificação da eficácia radiante. Os ROIs foram restritas à cabeça. Os locais de injecção PLP foram blindados. A) Exemplos de epifluorescência imagens de ratos vivos, capturado 3 h e 24 h após a injecção de nanopartículas. Imagens de ratos sem EAE ou sem a injecção de nanopartículas foram utilizados como controlos de imagem. Barra de escala: 1 cm. bares TUS variam de vermelho escuro (baixo) para amarelo (alta intensidade). B) Os gráficos de barras que mostram a quantificação da eficácia radiante em rois (média ± DP). Os grupos de tratamento não diferiram significativamente (2 lados teste t não emparelhado). Por favor clique aqui para v IEW uma versão maior desta figura.

Metaloproteinase de matriz-sensível da sonda

Depois de subtrair o auto-fluorescência, a sonda de imagens de protease MMP-activável revelou a inflamação no cérebro e a medula espinal em ratos EAE (Figura 4A, os exemplos de 4 ratinhos por grupo). Não havia nenhum sinal em ratos não injectados com a sonda, e um sinal fraco ocorreu em um rato sem sintomas clínicos de EAE (não-respondedor). Imagens na Figura 4 mostra o sinal em Ex / Em 640/700 subtraído pela imagem de Ex / Em 675/720. As diferenças entre os tratamentos foram revelados apenas após a análise quantitativa da eficácia radiante em auto-ROIs após a separação espectral (Figura 4B, desemparelhado 2-tailed t-teste, n = 6 e 4, P <0,05).

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Figura 4. Avaliação da metaloproteinase Atividade com sonda de imagem MMP-sensível Near-infrared. ratinhos SJL / J receberam veículo ou medicamento (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d) a partir de 5 dias após a imunização. As imagens foram capturadas em 24 h após a injecção da sonda (150 uL iv) pelo o primeiro pico de EAE, n = 6 e 4. Os locais de injecção foram de PLP blindado. EAE não respondedores e os ratos sem injecções sonda de MMP foram usadas como controlos. Cada 2 imagens foram capturadas pelo Ex / Em 640/700 nm (sinal específico) e 675/720 nm (auto-fluorescência). Usando a ferramenta de separação espectral, a auto-fluorescência foi subtraída e, subsequentemente, a ferramenta de auto-ROI foi utilizada para identificar os locais de actividade de MMP específica. A eficiência total de radiação foi usada para quantificação. A) imagens de epifluorescência exemplares em ratos vivos capturados 24 h após a injeção sonda. As imagens são o resultado de separação espectral (UMX). Barra de escala: 1 cm. bar LUTs gama de vermelho escuro (baixo) para amarelo (alta intensidade). B) Os diagramas de caixa que mostra a quantificação da eficácia radiante total na ROIs. A caixa representa o intervalo interquartil, a linha é a mediana, e os bigodes mostrar o mínimo ao máximo. O asterisco indica uma diferença significativa entre os grupos (teste t não pareado 2 faces, P <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A presente vídeo mostra técnicas de bioluminescência e fluorescência no infravermelho próximo imagiologia in vivo de EAE em ratinhos SJL / J. Mostramos que imagem de bioluminescência utilizando uma sonda sensível à inflamação mostra principalmente a neurite óptica, e a quantificação está de acordo com a avaliação clínica da gravidade da EAE e os efeitos do medicamento. No entanto, o método de imagem de bioluminescência não foi capaz de detectar a inflamação da medula espinal lombar, que é um local principal de EAE manifestação 17, provavelmente porque o sinal é absorvida pela coluna.

A imagiologia do infravermelho próximo é mais sensível, mas à custa da interferência elevada com auto-fluorescência, o que não acontece com a bioluminescência. O tempo de exposição de NIR é muito mais curto (1 - 2 s), em comparação com BLI (2-5 minutos), o que torna NIR o método preferido para as séries cronológicas com intensidades de sinal que mudam rapidamente.

Passos críticos comno Protocolo e limitações da técnica

Sinais do local de imunização interferir com a imagiologia da espinal medula na EAE, mas isto pode ser contornado por localizar dois locais de injecção na base da cauda, ​​o que não era inferior aos locais de injecção recomendadas (pescoço e base da cauda). No entanto, é necessário proteger os locais de injecção com um pano preto.

Para imagem de bioluminescência, é crucial para captar uma série de imagens de tempo, porque a cinética diferem entre animais. Para evitar erros causados pela cinética, a imagem latente de pares de controle (por exemplo, veículo ou tipo selvagem) e verum (por exemplo, droga ou transgênicos) ratos é vantajoso. De acordo com o fabricante, o sinal deve ser estável durante 30 min. No entanto, na EAE, observou-se uma cinética mais rápidos e mais transitórios, com picos que ocorrem em 5 - 10 min e um declínio substancial em 15 min.

Para geração de imagens de infravermelho próximo, o manufacturer recomenda a criação Ex / Em para uma sonda específica. No entanto, foi útil para executar uma série de filtro inicialmente e para capturar imagens sempre, pelo menos, em duas combinações de excitação / emissão, que coincidem com os máximos Ex / Em relatados e pode ser usado posteriormente para a separação espectral de sinais inespecíficos.

É importante a utilização de ratos brancos, como SJL / J, porque a luz de fluorescência e são muito bem absorvidos pela pele preta. ratos pretos precisam ser cautelosamente raspou na cabeça e nas costas, um dia antes de imagem. As lesões cutâneas deve ser evitada, porque eles aparecem como manchas inflamatórias e interferir com a imagiologia do cérebro ou da medula espinhal. Para imagiologia NIR, o fabricante recomenda a depilação de todos os ratos, mesmo ratos brancos. Mesmo após o barbear, cabeça e nas costas resultados em ratos pretos eram menos convincente do que com os ratos brancos (não mostrado). Para o modelo de EAE primário-progressiva em ratinhos C57BL6, ratinhos C57BL6 branco, que estão disponíveis comercialmente, pode ser um alternativo. camundongos sem pêlo, imunocompetentes SKH1 são úteis para a imagiologia do infravermelho próximo, mas não EAE, porque estes ratos têm um fundo genético albino e não se desenvolvem de forma confiável EAE (pontuação máxima: 0,5 - 1). imagiologia bioluminescente utilizando a sonda de inflamação nestes ratinhos revelaram vários pontos inflamatórias da pele (não mostrada) em que os folículos capilares são perdidos.

NIR imagem da atividade da protease revelou cérebro e inflamação da medula espinhal, mas os sinais foram sobrepostas por auto-fluorescência, exigindo a separação espectral antes da análise quantitativa. Assim, NIR imagem foi menos robusto do que imagem de bioluminescência e foi mais caro. No entanto, a utilização de sondas de protease activáveis ​​pode ser útil para a avaliação das drogas que visam especificamente as metaloproteinases de matriz.

Vantagens e desvantagens

As técnicas de imagem diferentes são gratuitos e abordar questões específicas. As vantagens de Bioluminimaging escent são acessibilidade (cerca de 20 euros / mouse); a falta de auto-bioluminescência, o que iria interferir com o sinal; alta especificidade; injecção ip conveniente e análise de imagem; e robustez e confiabilidade. Desvantagens são longos tempos de exposição e absorção de sinal pela pele preta e osso.

Vantagens de NIR são a maior disponibilidade de sondas NIR-rotulados, facilidade de costume NIR rotulagem, tempo de exposição curta e de alta sensibilidade. As desvantagens são os custos elevados (50 - 100 Euro / rato), absorção pela pele, forte interferência com auto-fluorescência, e a necessidade de separação espectral e processamento de imagem antes da análise.

Um número de sondas estão disponíveis que detectar os locais de inflamação, porque eles são activados por enzimas pro-inflamatórios que são regulados positivamente nos locais de inflamação (por exemplo, as peroxidases ou as metaloproteinases) devido à infiltração de células imunes. Algumas destas sondas também irá detectar canceRS demonstrando a infiltração de células imunes para o microambiente do tumor ou a libertação de enzimas por o próprio tumor (por exemplo, as MMPs). Sondas que se acumulam no tecido devido ao extravasamento capilar irá detectar perturbações na certificação, mas também em outros locais de inflamação e câncer.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

A combinação de "imagem mais feridas clínicos" foi superior a "pontuação apenas" para a avaliação do estado da doença ea detecção de efeitos da medicação. O sinal de bioluminescência em torno dos olhos, também concorda com estudos histopatológicos anteriores que mostram a destruição da mielina e infiltrados de células imunes no nervo óptico 5. Cerca de 2/3 dos pacientes com EM desenvolvem episódios de neurite óptica. Até agora, não existem métodos confiáveis, não-invasivo para quantificar neurite óptica em ratinhos, exceto imagem de difusão por ressonância magnética (MRI) e op vivoA tomografia de coerência tica (OCT), que são tecnicamente exigente 18. Outubro foi introduzido na EAE como um método que mostra alterações na retina e a atrofia durante a EAE, sugerindo uma reacção auto-imune no nervo óptico 19.

Comparado com o método descrito neste manuscrito, OCT é um estressor mais elevado para os ratos, porque requer anestesia profunda. A leitura não é uma visualização direta do nervo óptico 19.

imagiologia de infravermelho próximo de nanopartículas fluorescentes foi útil para visualizar o rompimento da BBB, o que é uma outra característica da EAE e MS. Além de ressonância magnética 20, 21, não existe um método não invasivo para a monitorização in vivo da integridade da BHE. Isso seria bastante útil, porque as drogas experimentais e fitomedicamentos agir especificamente apertando a barreira 22, 23, o que normalmente impede o recrutamento de linfócitos para o SNC excessiva 24. Prevenção de fixação de leucócitos ou transmigração através da certificação e reduzindo sua leakiness é uma estratégia eficaz no tratamento MS 25, e imagem de nanopartículas pode ajudar a avaliar a eficácia das drogas candidatos. Até agora, as partículas são caros. Microscopia intravital é outra técnica utilizada para visualizar integridade da BHE 26, mas, normalmente, requer, anestesia profunda de longa duração (por exemplo, com cetamina e xilazina) por causa da craniotomia e não permite a re-despertar os ratinhos, portanto, a prevenção analisa curso de tempo. No entanto, microscopia intravital fornece imagens de alta resolução do celular para níveis subcelulares, que não é possível com imagem in vivo.

Aplicações futuras ou chegar após dominar a técnica

Em resumo, o te imagiologiachniques apresentadas na presente ajuda de vídeo para avaliar os cursos individuais da doença e para monitorar os efeitos da medicação, que foram em parte não revelada por escores clínicos sozinho. As técnicas de acordo com os 3 princípios "R" de substituição, redução e aperfeiçoamento em experimentos com animais e são úteis add-on ferramentas na pesquisa de drogas.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) e do programa de financiamento da investigação "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) do Estado de Hessen, Centro de Pesquisa para Translational Medicine and Pharmacology TMP ea Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), Research Training Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

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Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos
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Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

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