Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הדמית פליטת אור קרוב אינפרא אדום של אופטיק בעצב המוח דלקת במודל EAE של טרשת נפוצה בעכברים

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

אנו מציגים טכניקה פליטת אור in vivo חי קרוב אינפרא אדום הדמיה של בעצב הראייה דלקת המוח של encephalomyelitis אוטואימוניות הניסוי (EAE) מודל לטרשת נפוצה בעכברים SJL / J.

Abstract

encephalomyelitis אוטואימוניות ניסויית (EAE) בעכברים SJL / J הוא מודל לטיפול בטרשת נפוצה בשלב ההתקפי (RRMS). קליניים עשרות EAE המתאר גירעונות בתפקוד המוטורי הם readouts היסוד של דלקת בתיווך החיסונית של חוט השדרה. עם זאת, עשרות ומשקל הגוף אינם מאפשרים הערכה in vivo של דלקת המוח דלקת בעצב הראיה. זו האחרונה היא ביטוי מוקדם ותכוף בערך 2/3 של חולי טרשת נפוצה. כאן, אנו מציגים שיטות פליטת אור והדמיה האינפרה-אדום הקרוב חי להעריך EAE עורר דלקת בעצב הראיה, דלקת המוח, ואת מחסום הדם-מוח (BBB) שיבוש בעכברים חיים באמצעות מערכת הדמיה vivo. המצע bioluminescent מופעל על ידי oxidases הראה דלקת בעצב הראיה בעיקר. האות היה ספציפי ואפשר ההדמיה של שפעות תרופה וקורסי זמן מחלה, אשר הקבילה ציונים הקליניים. חלקיקים פלורסנט PEGylated שנותרו בתוך vasculaturדואר לפרקי זמן שימשו להעריך את היושרה BBB. קרוב אינפרא אדום ההדמיה חשפה דליפת BBB בשיא המחלה. האות היה החזק סביב העיניים. מצע קרוב אינפרא האדום metalloproteinases מטריקס שמש להערכת דלקת EAE העורר. Auto-קרינה הפריעה האות, מחייב unmixing ספקטרלי כימות. בסך הכל, הדמית פליטת אור הייתה שיטה אמינה להערכת תופעות EAE קשור אופטיות בעצב תרופות והייתה מעולה לטכניקות האינפרה-אדום הקרובים במונחים של סגוליות אות, איתן, קלות כימות, ועלות.

Protocol

1. אינדוקציה EAE ב SJL / עכברים J

  1. עכברים
    1. השתמש נקבה בת 11 שבועות SJL / עכברי J ולאפשר להם להרגיל לחדר הניסיון במשך כ 7 ימים. השתמש ב- N = 10 עכברים בכל קבוצה.
    2. להערכת השפעות של תרופות, את התרופה לבין הפלצבו לקבוצת הביקורת באופן רציף באמצעות מי שתייה או באמצעות כדורי מזון החלו 3 או 5 ימים לאחר החיסון (n = 10 בכל קבוצה). בתקופת השיא של המחלה, לנהל תרופה או פלצבו עם חלב או 3 סוכר% מים ספוגי פתיתי תירס.
  2. חומר חיסון
    1. השתמש ערכת אינדוקציה EAE המורכב של אנטיגן (פפטיד של חלבון proteolipid, PLP139-151, 1 מ"ג / מ"ל ​​אמולסיה) ב תחליב עם אדג'ובנט של פרוינד מלא (CFA, שחפת Mycobacterium-נהרג חום H37 Ra) ו -2 בקבוקונים (5 מיקרוגרם כל אחת) רעלן שעלת lyophilized (PTX).
    2. ממיסים את PTX (2 מיקרוגרם / מ"ל) ב שנאגרו מלוחים פוספט 1x (PBS; כלומר, </ Em> להוסיף 1.5 מ"ל של PBS על צינור אחד PTX, ומערבבים היטב, להסיר עם אותו קצה pipet, ולהוסיף 1 מ"ל של PBS בצינור 50 מ"ל); לערבב היטב.
  3. הִתחַסְנוּת
    1. להזריק מתחת לעור PLP / CFA ב 2 חלקים, כל 100 μL, הן בבסיס הזנב. אין להזריק לתוך החלק האחורי של הצוואר, כי כל תגובה חיסונית בעור בחלק האחורי או הצוואר העליון יפריע הדמיה של הראש ובחוט השדרה.
    2. להזריק 100 μL של PTX intraperitoneally (IP), פעמיים לכל עכבר, 1 הראשון - h 2 לאחר חיסון והשני ב 24 שעות.
    3. עבור העכברים השליטים, להזריק CFA ללא PLP (2 מנות של 100 μL) בתוספת PTX ללא PLP.
  4. עכבר טיפול לאחר חיסון
    1. לשקול העכברים כל עד לפני כמה ימים עד היום 7, ולאחר מכן לשקול אותם מדי יום.
      הערה: עכברים לאבד כ 1 - 2 גרם של משקל הגוף במהלך EAE. הירידה מסמנת את תחילתה של EAE.
    2. להעריך את הסימפטומים הקליניים מדי יום בין בהסכמה יום 7ing אל מערכות ניקוד סטנדרטי (כלומר, ציון 0: אין שינויים ברורים תפקודים מוטוריים; להבקיע 0.5: שיתוק הדיסטלי של זנב; ניקוד 1: שיתוק זנב שלם; להבקיע 1.5: paresis קלה של אחד או שתי הרגליים האחוריות; להבקיע 2: paresis החמורה של רגליים אחוריות; להבקיע 2.5: שיתוק מלא של רגל אחורית אחת; להבקיע 3: שיתוק מלא של שני רגליו האחוריות; להבקיע 3.5:. שיתוק מלא של רגליים אחוריות paresis של רגל אחת מול להרדים עכברים עם ציונים של 3.5 ומעלה עבור > 12 שעות.
  5. EAE כמובן והשעה של הדמיה
    1. בצע את ההדמיה הראשונה בתחילת המחלה, כאשר העכברים ולהשגה עוד> 1, אשר תתרחש בסביבות יום 10 - 12 אחרי החיסון.
    2. בצע ההדמיה השנייה בשיא, אשר יושג 1 או 2 ימים לאחר הסימפטומים הראשוניים לפתח ויימשך 1 - 3 ימים.
      הערה: כתוצאה מכך, העכברים יתאוששו באופן מלא בתוך 7 עד 10 ימים. הדמיה במהלך המרווחים עדיין עשויה להראות דליפות בכלי דם,אבל האינדיקטורים דלקת צריכים להיות שליליים.

2. Bioluminescent והדמיה האינפרה-אדום הקרוב של אופטיק בעצב המוח דלקת

  1. התקנה של מערכת ההדמיה
    1. בצע in vivo הדמיה עם כל ציוד המאפשר ניתוח של פליטת אור ואותות האינפרה-אדום הקרוב.
    2. שמור עכברים תחת 2 - 2.5% isoflurane הרדמה במהלך כל הליכי ההדמיה.
    3. תפקיד אחד או שניים עכברים לצד זה במנגנון באמצעות אספקת הגז באמצע. מקם את עמוד השדרה העליון במרכז.
    4. השתמש שני עכברים בו זמנית, אחד לכל קבוצה, להערכת השפעות של תרופות להשוות זוגות. זה חשוב עבור הדמיה bioluminescent.
    5. להגן על האתר של חיסון עם בד שחור ולקחת תמונת תצלום ואת הבסיס להעריך את המיקום הנכון של העכבר / עכברים. השתמש פוקוס B עם מרחק 6.5 ס"מ למצלמה עבור כל התמונות.
  2. הזרקת הדמיה של חללית דלקת bioluminescent
    1. השתמש בהגדרות מערכת הדמיה in vivo: Epi-BLI, Em לסנן פתוח, בלוק מסנן אקס, fStop 1, binning 8, להתמקד B = 6.5 ס"מ, חשיפת המודעה 120 s; לקחת תמונת בסיס.
    2. להזריק 100 μL IP של מגיב chemiluminescent מוכן לשימוש (40 מ"ג / מ"ל). מערבבים היטב לפני מילוי המזרק.
    3. צלמו תמונות פליטת אור 5, 10, ו -15 דקות לאחר ההזרקה. קורס הזמן של שיא bioluminescent שונה בין בעלי החיים.
      הערה: השיא יתרחש 5 - 10 דקות לאחר ההזרקה; ירידה בשיעור של 15 דק 'ניתן ללמוד שאין נדרשות תמונות נוספות. השתמש זוגות עכבר של קבוצות ביקורת והטיפול לחסל הטיות קטין בשל קורסי זמן שונים.
    4. מלא בתיאורים רלוונטיים לניסוי. שימו תיבת דו-שיח יצוץ באופן אוטומטי; זה כולל מידע, כגון זן עכבר, סקס, נקודת זמן, בזמן הזרקת בדיקה, קבוצה וכו '. שמור את כל הקבצים ב oתיקיית ne; הם יצטרכו תגי זמן וכל התיאורים.
  3. הזרקה והדמיה של חלקיקי ניאון האינפרה-אדום קרוב שלמות BBB
    1. השתמש קרוב אינפרא אדום הדמיה epifluorescence ב B-focus (מרחק: 6.5 ס"מ). מקסימום עירור / פליטה של ​​חלקיקים ניאון pegylated הם 675/690 ננומטר. לכידת שתי תמונות באורכי גל שונים, ב Ex640 / Em700 ו Ex675 / Em720; להשתמש חשיפה 2-s, binning 8, ו fStop 2. קח תמונה הבסיס.
    2. להזריק 70 μL של חלקיקים אינפרא אדום ניאון pegylated iv דרך וריד הזנב ולדמיין את h עכברים 3 ו -24 שעות לאחר ההזרקה באמצעות ההגדרות הנ"ל. מערבבי באר הפתרון לפני מילוי המזרק.
    3. להזריק נתרן כלורי 0.9% בעכברים שליטים, אשר יהיה צורך להעריך את הספציפיות של האות.
  4. הזרקת הדמיה של החללית פלורסנט האינפרה-אדום הקרוב לפעילות MMP
    1. לגלח או את שער הראש uבאזור עמוד השדרה pper בזהירות יום אחד לפני שלקח את התמונה הבסיסית. העור צריך לא להיפגע.
    2. השתמש קרוב אינפרא אדום הדמיה epifluorescence ב B-focus (מרחק: 6.5 ס"מ). מקסימום עירור / פליטה של ​​החללית activatable MMP הם 680/700 ננומטר. לכידת שתי תמונות באורכי גל שונים, ב Ex640 / Em700 ו Ex675 / Em720; להשתמש חשיפה 1-s, binning 8, ו fStop 2. קח תמונה הבסיס.
    3. הוספת 200 μL של 1x PBS על צינור 1.5 מ"ל של פתרון מוכן לשימוש (20 nmol / 1.5 מ"ל PBS 1x) כך שהוא יהיה מספיק עבור 10 עכברים; ומערבבים היטב לפני מילוי המזרק.
      הערה: ההיקף הניתנים לא לוקח בחשבון שחלק הנפח הולך לאיבוד במהלך מילוי מזרק להזרקה.
    4. להזריק 150 μL של iv החללית דרך וריד הזנב 24 שעות לפני הדמיה. להזריק PBS רק חיות בקרה להעריך את הספציפיות של האות.
    5. ב 24 שעות לאחר ההזרקה, לקחת תמונות Epi-FL לפחות בשני אורכי גל, Ex640 / Em700 ו אקס 675 / Em720, עם הגדרות שהוסבר לעיל (1-s חשיפה, מיקוד B, binning 8, ו fStop 2).
      הערה: השימוש בשני אורכי גל מאפשר unmixing ספקטרלי על ידי הפחתת האות הנוקבת.

3. ניתוח תמונה

  1. ניתוח פליטת אור (BLI)
    1. לחץ פעמיים על התוכנה כדי לפתוח אותו.
    2. בשורת התפריטים העליונה, לחץ על הסמל דפדפן קבצים, ללכת לספרייה של התיקיה של הניסוי, ובחר אותו; זה יפתח את כל הקבצים בתיקייה בטבלה.
    3. הגדר את העמודות המראות את התיאורים רלוונטיים לניסוי.
    4. עבור בקרת איכות, לחץ פעמיים על קובץ של עכבר שאינו מגיב ללא סימפטומים של EAE ו / או עכבר נאיבי כדי לבדוק את הספציפיות של אותות EAE.
      הערה: לא צריך להיות שום אות בעכברים נאיביים אות מינימאלית בעכברים שאינם מגיבים.
      1. בדוק את תמונת הבסיס לפני הזריקה של פרולהיות עבור כל עכבר כשליטה נוספת של הספציפיות של האות; זה צריך להיות שלילי.
    5. כדי לבחור תמונה, לחיצה כפולה על הקובץ הראשון של העכבר EAE הראשונה ולבדוק את עוצמת bioluminescent (טווח בר LUT) ולוקליזציה. בדוק את כל התמונות בזו אחר זו. סגור את הקובץ עם העוצמת הנמוכה ביותר עבור כל עכבר (כלומר, לשמור 2 מתוך 3 תמונות לכל עכבר).
    6. התאמה ועל ייצוא תמונה
      1. לחץ לחיצה כפולה על הקובץ הראשון לכימות. להתבונן מוקפץ חלון חדש. תחת "אפשרויות" (בתפריט העליון), להתאים אישית את התוויות כדי להציג כל תמונה.
      2. בחלונית הכלי הנכונה, עבור אל "התאמת תמונה." כברירת מחדל, עוצמות מינימום ומקסימום מוגדרות "אוטומטי" ומוצגות קשת pseudocolor. בחר "ידני" כדי לשנות את ההגדרות במידת הצורך.
        הערה: לדוגמה, את כל התמונות המיוצאות עלולות להכיל פסי LUT הזהה (ומינימום זהה מקסימום) כדי להשוות בקלות.ההתאמה של ומינימום ו מקסימום אין השפעה על תוצאות כמותיות.
      3. לחץ על יצוא תמונות, png הנבחר, ספרייה, וכן שם תמונה
    7. כימות של אזורים של עניין (ROI)
      1. עבור אל כלי "ROI" בלוח כלי. בחר את שיטת ההחזר על ההשקעה (עיגול, מלבני, אוטומטי, או-יד חופשית) ומספר ROIs. שים את חלון ROI צץ בחלון התמונה.
      2. באמצעות העכבר, להתאים את הגודל והמיקום. השתמש ספי ROI זהים עבור כל התמונות אם הכלי האוטומטי ROI משמש. השתמש בתחומים זהים עבור כל התמונות אם גדל עמדות ROI מוגדרים באופן ידני (למשל, ROIs המעגלי).
      3. לחץ על "למדוד RO.I. לצפות מוקפץ חלון חדש. התאמה אישית של העמודות (למשל, שם קובץ, מספר בעלי חיים, קבוצה, ניסוי, אזור, ספירת הכל, ספירת ממוצע, ספירת SD, דקות ומקס סופרות, אזור, זמן נקודה, בזמן הזרקת בדיקה, וכו '). שמור את ההגדרות המותאמות אישית. כאשר מחדשעדי, לבחור את כל (Ctrl + A), להעתיק ולהדביק השולחן לתוך גיליון אלקטרוני.
      4. לייצא את התמונה כקובץ png עם ROIs במקום. שמור וסגור את קובץ התמונה.
    8. חזרו על התהליך (שלבי 3.1.6 - 3.1.7) עבור כל קבצי התמונה שצריך לכמת. העתק את כל quantifications ROI לתוך הגיליון האלקטרוני.
      הערה: כאן, ניתן למיין את התוצאות על ידי הקבוצה, נקודת זמן, וכו 'ונותחו סטטיסטית. השתמש ספירת הכולל של אותות פליטת אור ב ROIs עבור ניתוחים סטטיסטיים.
  2. ניתוח קרוב אינפרא אדום (NIR) של חלקיקים פלורסנט
    1. באמצעות הפקדים בתוכנה, להתאים את הסף של התמונה.
      הערה: זו אין השפעה על התוצאה כמותית.
    2. ראייה להשוות את התמונות שנתפסו אקס / Em 675/720 ו Ex / Em 640/700 להעריך את הספציפיות של האות.
    3. השתמש התמונות שנתפסו אקס / Em 675/720 עבור ניתוח כמותי (מקסימום עירור: 680 ננומטר). גדר ROIs, שעבורם הכלי האוטומטי ROI ניתן להשתמש. התאם את הסף האוטומטי ROI ולהשתמש בו עבור כל התמונות. לכמת את היעילות הכוללת קורנת ROIs (ראה שלב 3.1).
  3. ניתוח קרוב אינפרא אדום (NIR) של החללית פרוטאז רגיש
    1. באמצעות פקדי תוכנה, להתאים את הסף של התמונה.
      הערה: זו אין השפעה על התוצאה כמותית. בצע unmixing ספקטרלי של הקרינה האוטומטית. כלי unmixing מיושם Living תמונה. האוטומטי unmixing משתמשת 640/700 Ex / Em כמו ספציפיים 675/720 כתמונת אוטומטי ניאון.
    2. בחר את התמונה הצרופה ולהגדיר את ROIs, כפי שתואר לעיל. השתמש יעילות הכוללת קורנת ROIs עבור ניתוחים כמותיים וסטטיסטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זמן הקורס של פליטת אור של אופטיק דלקת עצבים

אות פליטת האור של חללית הדלקת הייתה החזקה סביב העיניים התרחשה באופן בלעדי בעכברי EAE עם דלקת בעצב ראיה. אות התרחשה לא העכברים הלא EAE ולא העכברים לא מוזרקים עם חללית הדלקת. האות נעלמה כאשר העכברים התאוששו. לפיכך, האות היא ספציפית עבור דלקת בעצב הראיה, ואת השיא של האות מקביל לשיא של עשרות EAE קלינית. איור 1 מציג שתי דוגמאות של עכברים SJL / J צילמו ביום 10 ו -14 לאחר אינדוקציה EAE. אות bioluminescent הייתה הגבוהה ביותר ביום 10 ונעלמה כאשר העכברים החלו להתאושש. הקורסים זמן של עשרות קליניים מתאימים היעלמותו של האות bioluminescent (לדוגמה-1) או שקדמו (לדוגמה-2) ירידה של עשרות.

p-together.within-page = "1"> איור 1
איור 1. זמן ומהלך אופטיק בעצב ציוני קלינית EAS-SJL / J עכברים. תמונות Bioluminescent של דלקת בעצב הראיה נתפסו 10 דקות לאחר ההזרקה של החללית דלקת (100 μL IP) במהלך 1 הזיקוקים st של המחלה בשני עכברים SJL / J בנקודות זמן שונות לאחר חיסון. התמונות bioluminescent (פאנל משמאל) נתפסו 10 ו -14 ימים לאחר חיסון ומוצגות שכבות תצלום קשת pseudocolor. ברי LUT נעים בין כחול (נמוך) לאדום (-פליטת אור גבוהה). סרגל קנה מידה: 1 ס"מ. הפנל הימני מראה תרשימים ברים של ספירת פליטת אור הכוללת פרט ROIs (ממוצע ± סטיית התקן של 3 תמונות כל אחד) ואת הקורסים בזמן של העשרות EAE הקליניות. החיצים האדומים מציינים את יום ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול version של נתון זה.

הערכת טיפול יעילות

חללית דלקת

ההשפעות של התרופה (R-flurbiprofen 5 מ"ג / ק"ג / ד) 5 מוצגים באיור 2. חמש דוגמאות של תמונות bioluminescent בכל קבוצה מוצגות. הציונים בקבוצת הרכב והטיפול היו הטרוגניות, אבל בכל העכברים, אות bioluminescent בעיניים מראות דלקת עצב הראייה הייתה נמוכה יותר בקבוצת התרופות (איור 2 א). כימות של ספירת bioluminescent סך ROIs אישר יעילות הטיפול משמעותית (איור 2B, עם מגרשים התיבה של ספירת bioluminescent הכולל, מזווג 2 זנב מבחן t, p <0.05). תוצאות ההדמיה הסכימו עם האפקט הטיפוליים של תרופות מבחינת ציונים קליניים וגילויים histopathologic של EAE בחוט השדרה ו -5 עצב הראייה.

איור 2
איור 2. היעילות של תרופות בסל EAE-SJL / עכברים J באמצעות הדמיה Bioluminescent. עכברים SJL / J קיבל הרכב או תרופות (R-flurbiprofen 5 מ"ג / ק"ג / ד) מהיום 5 לאחר חיסון. תמונות נתפסו לאחר ההזרקה של החללית דלקת (100 ip μL) בשיא -1 EAE, n = 10 לכל קבוצה. EAE שפותח 7/10 בשתי הקבוצות, ו EAE שלא הגיב לטיפול היה ללא אות. א) תמונות פליטת אור בעכברים חיים בשבי 5 - 15 דקות לאחר הזרקת ip של 100 μL של חללית הדלקת מוצגות כשכבות תצלום הקשת pseudocolor. ברי LUT נעים בין כחול (נמוך) לאדום (בעצימות גבוהות). סרגל קנה מידה: 1 ס"מ. שיא הפרטשל הספירות bioluminescent סך ROIs שימש כימות. ROIs הוגבל הראש. המוזרקים PLP היו מסוככים עם בד שחור. B) מגרשים Box מראה את כימות של ספירת סך ROIs. התיבה מייצגת את הטווח בין-רבעונים, הקו הוא החציון, ואת השפם להראות המינימום למקסימום. ספירת הכולל שונה משמעותית בין שתי הקבוצות (2-צדדית מבחן t מזווג, P <0.05), הראו הפחתה של בעצב הראייה דלקת המוח בעכברים שקיבלו תרופות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חלקיקים פלורסנט PEGylated

תמונות epifluorescence של חלקיקים תת-אדומים הקרוב חשפו דליפות כלי דם סביב עיניים במוח בשני grou הטיפולנ.ב. (איור 3 א, 2 דוגמאות). החלקיקים להפיץ מאוד לאט מהדם במרחב הבין תחומי, למעט אתרים של דלקת, שבהם הצבע מצטבר, המאפשר הערכה של שלמות BBB. הדליפה ניכרה ב 3 שעות ו -24 שעות לאחר ההזרקה של חלקיקים, אבל זה היה חזק בנקודת זמן מה לאחר מכן. לא הייתה שום אות מסוימת בעכברים שאינם EAE או עכברים לא הזריקה חלקיקים (פנל מימין). לפיכך, האות היה ספציפי. הניתוח הכמותי של יעילות קורנת ROIs (איור 3B) לא גילה הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול (n = 3 לכל קבוצה, מזווג 2 זנב מבחן t, p <0.05).

איור 3
איור 3. הערכה של שיבוש דם מוח עם PEGylated פלורסנט חלקיקים. עכברי SJL / J קבלו רכב או תרופות (R-flurbiprofen 5 מ"ג / ק"ג / ד) מהיום 5 לאחר חיסון. תמונות נתפסו 3 שעות ו -24 שעות לאחר ההזרקה של חלקיקים תת-אדומים קרובים שכותרתו (70 μL iv) בתקופת שיא -1 EAE, n = 3 לכל קבוצה. EAE שלא הגיב לטיפול היה ללא אות. הכלי האוטומטי ROI שמש הכימות של היעילות הקורנת. את ROIs הוגבל הראש. המוזרקים PLP היו מסוככים. א) תמונות epifluorescence למופת של עכברים חיים, כבשו 3 שעות ו -24 שעות לאחר ההזרקה של חלקיקים. תמונות של עכברים ללא EAE או בלי זריקה של חלקיקים שימשו שולטת הדמיה. סרגל קנה מידה: 1 ס"מ. ברי LUT נעים בין אדום כהה (נמוך) לצהוב (בעצימות גבוהות). B) תרשימים בר מראה את כימות של יעילות קורנת ROIs (ממוצע ± סטיית תקן). קבוצות טיפול לא היו שונות משמעותית (2-צדדי מבחן t מזווג). אנא לחץ כאן כדי נ iew גרסה גדולה יותר של דמות זו.

מטלו-רגיש מטריקס חללי

לאחר הפחתת הקרינה האוטומטית, תמונות של חללית MMP activatable-פרוטאז גילו דלקת המוח וחוט השדרה בעכברי EAE (איור 4 א, דוגמאות של 4 עכברים בכל קבוצה). לא הייתה שום אות בעכברים לא מוזרקים עם החללית, ואת אות חלשה התרחשה עכבר EAE ללא תסמינים קליניים (לא מגיבים). תמונות באיור 4 להראות את האות אקס / Em 640/700 מופחתים בהתאם לתמונת אקס / Em 675/720. ההבדלים בין הטיפולים נחשפו רק לאחר ניתוח כמותי של יעילות קורנת האוטומטית ROIs לאחר unmixing ספקטרלי (איור 4 ב ', מזווג 2 זנב מבחן t, n = 6 ו -4, P <0.05).

Iles / ftp_upload / 55,321 / 55321fig4.jpg "/>
הערכת איור 4. פעילות מטלו עם Probe הדמיה האינפרה-אדום הקרוב MMP-הרגיש. עכברים SJL / J קיבל הרכב או תרופות (R-flurbiprofen 5 מ"ג / ק"ג / ד) מהיום 5 לאחר חיסון. תמונות נתפסו 24 שעות לאחר ההזרקה של החללית (150 μL iv) בשיא EAE 1, n = 6 ו -4 המוזרקים PLP היו מסוככים. EAE שלא הגיבו לטיפול ועכברים ללא זריקות בדיקה MMP שימשו שולטת. כל 2 תמונות נתפסו אקס / Em 640/700 ננומטר (אות מסוימת) לבין 675/720 ננומטר (קרינה אוטומטית). באמצעות כלי unmixing רפאים, את הקרינה האוטומטית נוכתה ובהמשך, הכלי האוטומטי ROI שמש לזיהוי באתרי פעילות MMP הספציפי. היעילות הקורנת הכולל שמשה כימות. א) תמונות epifluorescence למופת בעכברים חיים בשבי 24 שעות לאחר הזרקת החללית. התמונות הן תוצאה של unmixing ספקטרלי (UMX). סרגל קנה מידה: 1 ס"מ. בר LUTמגוון של מאדום כהה (נמוכה) לצהוב (בעצימות גבוהה). B) מגרשים Box מראה את כימות של יעילות קורנת סך ROIs. התיבה מייצגת את הטווח בין-רבעונים, הקו הוא החציון, ואת השפם להראות המינימום למקסימום. הכוכבית מציינת הבדל משמעותי בין קבוצות (2-צדדי מבחן t מזווג, P <0.05). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הסרטון הנוכחי מראה טכניקות פליטת אור פלואורסצנטי האינפרה-אדום הקרוב בתחום ההדמיה vivo של EAE בעכברים SJL / J. אנו מראים כי הדמיה פליטת אור באמצעות בדיקה רגיש-דלקת בעיקר תערוכות דלקת בעצב הראיה, ואת כימות מסכים עם הערכה קלינית של חומרת EAE ואת ההשפעות של התרופה. עם זאת, שיטת הדמית פליטת אור לא הייתה מסוגלת לזהות דלקת של חוט השדרה המותני, שהנו אתר ראשי של ביטוי EAE 17, ככל הנראה משום האות נספגה על ידי עמוד השדרה.

ההדמיה האינפרה-אדום הקרובה היא רגישה יותר, אבל על חשבון התערבות גבוהה עם קרינה אוטומטית, אשר אינו מתרחשת עם פליטת אור. זמן החשיפה של הניר הוא הרבה יותר קצר (1 - 2 ימים) לעומת BLI (2 - 5 דקות), מה שהופך NIR השיטה המועדפת עבור סדרות עתיות עם עוצמות אות משתנות במהירות.

קריטי שלבים עםבפרוטוקול ומגבלותיהם הטכניקה

אותות של אתר החיסון להפריע הדמית חוט שדרת EAE, אבל זו ניתן לעקוף על ידי האיתור שני המוזרקים בבסיס הזנב, אשר לא היה נח המוזרקים המומלצים (צוואר בבסיס הזנב). אף על פי כן, יש צורך להגן על מוזרקים עם בד שחור.

עבור הדמיה פליטת אור, זה חיוני כדי ללכוד סדרה עתית של תמונות, כי קינטיקה שונה בין בעלי חיים. כדי למנוע הטיות הנגרמות על ידי קינטיקה, הדמיה של זוגות שליטה (למשל, רכב או סוג בר) ו Verum (למשל, תרופה או מהונדס) עכברי יתרון. לדברי היצרן, האות צריך להיות יציב למשך 30 דקות. עם זאת, ב EAE, צפינו קינטיקה מהירה וחלף יותר, עם פסגות המתרחשות 5 - 10 דק 'ו ירידה משמעותית בשיעור של 15 דק'.

עבור הדמיה האינפרה-אדום הקרוב, את manufacturer ממליצה על הגדרת Ex / Em עבור בדיקה ספציפית. אף על פי כן, זה היה מועיל להפעיל סדרה מסננת בתחילה ותמיד ללכוד תמונות לפחות שני שילובי עירור / פליטה, שמתאים מאוד מקסימום Ex / Em דיווח וניתן להשתמש בו מאוחר יותר unmixing ספקטרלי של אותות נוקבים.

חשוב להשתמש בעכברים לבנים, כמו SJL / J, כי אור פלואורסצנטי נספגים מאוד על ידי פרווה שחורה. עכברים שחורים צריכים להיות מגולחים בזהירות על הראש והגיבו יום אחד לפני ההדמיה. נגעי עור יש להימנע, כי הם יופיעו כתמים דלקתיים להפריע ההדמיה של המוח או חוט שדרה. עבור הדמיה NIR, היצרן ממליץ על אפילציה של כל העכברים, ואפילו עכברים לבנים. גם לאחר גילוח, התוצאות בראש ובגב בעכברים שחורים היו פחות משכנעות מאשר עם עכברים לבנים (לא מוצגים). עבור דגם EAE העיקרי-פרוגרסיבי בעכברי C57BL6, עכברי C57BL6 לבנים, אשר זמינים מסחרי, עשויים להיות האלטריָלִיד. עכברים ללא שיער, עם מערכת חיסון תקין SKH1 שימושיים הדמיה האינפרה-אדום קרוב, אבל לא EAE, כי יש עכברים אלה רקע גנטי לבקנים לא מהימן לפתח EAE (ציון מקסימאלי: 0.5 - 1). הדמיה Bioluminescent באמצעות החללית דלקת בעכברים אלו חשף כמה כתמים דלקתיות בעור (לא מוצג) שם זקיקי השיער הם איבדו.

הדמית NIR של פעילות הפרוטאז חשפה מוח ודלקת חוט שדרה, אך אותות הוטבעו על ידי קרינה אוטומטית, מחייב unmixing ספקטרלי לפני הניתוח כמוני. לפיכך, הדמית NIR הייתה פחות חזקה מאשר הדמית פליטת אור והייתה יותר יקר. עם זאת, השימוש של בדיקות activatable פרוטאז עשוי להיות שימושי עבור הערכה של תרופות שמתמקדים metalloproteinases מטריקס.

יתרונות וחסרונות

טכניקות ההדמיה השונות המשתלבות וענו על שאלות ספציפיות. היתרונות של bioluminהדמית escent היא affordability (כ -20 אירו / עכבר); חוסר-פליטת אור אוטומטי, אשר היה להפריע לאות; סגולי גבוה; זריקת ip נוחה וניתוח תמונה; ו עמידות ואמינה. חסרונות הם ארוכי פעמי חשיפה וקליטה אות על ידי פרווה ושחורה עצם.

יתרונותיו של NIR הם זמינים הרחבה של בדיקות שכותרתו NIR, קלויות תיוג מותאם אישית NIR, זמן חשיפה קצר, ורגישות גבוהה. חסרונות הם עלויות גבוהות (50 - 100 אירו / עכבר), קליטה ידי פרווה, הפרעה חזקה עם קרינה אוטומטית, ועל הצורך unmixing ספקטרלי ועיבוד תמונה לפני הניתוח.

מספר בדיקות זמינים המאתרות האתרים של דלקת כי הם מופעלים על ידי אנזימים פרו-דלקתיים הם שהוגברו באתרים של דלקת (למשל, peroxidases או metalloproteinases) עקב חדירת תאי מערכת החיסון. חלק בדיקות אלה גם יאתר Cancers הוכחת חדירת תא החיסון לתוך המיקרו-סביבה של הגידול או שחרור של אנזימים על ידי הגידול עצמו (למשל, MMPs). בדיקות המצטברות ברקמות עקב דליפת נימים תאתרנה שיבושי BBB, אלא גם באתרים אחרים של דלקת וסרטן.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות

השילוב של "הדמיה בתוספת פצעים קליניים" היה מעולה "ציונים רק" עבור הערכת מצב המחלה ואת זיהוי ההשפעות של תרופות. אות פליטת האור סביב העיניים גם מתאימה לממצאי מחקרים קודמים שהראו histopathological הרס המיאלין מחלחל תא חיסוני עצב ראיית 5. בערך 2/3 של חולי טרשת נפוצה לפתח פרקים של דלקת בעצב הראיה. עד כה, אין שיטות אמינות, לא פולשנית לכמת דלקת בעצב ראיה לחיות עכברים למעט הדמיה בתהודה מגנטית דיפוזיה (MRI) opטומוגרפיה קוהרנטיות tical (אוקטובר), אשר דורשים 18 טכנית. אוקטובר כבר הציג לתוך EAE כשיטה מראה שינויים ברשתית וניוון במהלך EAE, דבר המצביע על תגובה אוטואימונית עצב הראייה 19.

לעומת השיטה המתוארת בכתב היד הזה, אוק הוא גורם לחץ גבוה עבור העכברים, מכיוון שהיא דורשת הרדמה עמוקה. על הצג אינו ראיה ישירה של עצב הראייה 19.

ההדמיה האינפרה-אדום הקרוב של חלקיקי פלורסנט הייתה שימושית כדי להמחיש את השיבוש של BBB, שהוא סימן היכר אחר של EAE ו- MS. מלבד 20 MRI, 21, לא קיימת שיטה לא פולשנית לניטור vivo של שלמות BBB. זה יהיה שימושי למדי, כי תרופות ניסיוניות ו-תרופות פייטו פועלים באופן יעיל על ידי הידוק המחסום 22, 23, אשר בדרך כלל מעכבת גיוס הלימפוציטים מוגזם לתוך מערכת העצבים המרכזית 24. מניעת לויקוציטים מצורף או גלגול דרך BBB והפחתת leakiness שלה היא אסטרטגיה יעילה בטיפול MS 25, ו הדמיה ננו-חלקיק יכול לעזור להעריך יעילות של תרופות המועמד. עד כה, החלקיקים הם יקרים. מיקרוסקופיה Intravital היא טכניקה נוספת להשתמש כדי להמחיש BBB יושרת 26, אבל זה בדרך כלל דורש לטווח ארוך, הרדמה עמוקה (למשל, עם קטמין ו xylazine) בגלל פתיחת הגולגולת ואת ביטול אפשרות מחדש התעוררות העכברים, ולפיכך למנוע מהלך הזמן מנתח. עם זאת, מיקרוסקופיה intravital מספק תמונות ברזולוציה גבוהה על הסלולר לרמות subcellular, אשר אינה יכולה להיות מושגת עם הדמיה in vivo.

יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג הטכניקה

לסיכום, הדמיה techniques המוצג לעזרת וידאו הנוכחית להעריך מהקורסים הבודדים של המחלה וכן לפקח על ההשפעות של תרופות, אשר היו חלק לא נחשף על ידי ציונים קליניים לבד. הטכניקות מסכימות עם 3 עקרונות "R" של החלפה, הפחתה ועידון בניסויים בבעלי חיים והם שימושי תוספת על כלים במחקר תרופה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (CRC1039 A3) והתוכנית למימון מחקר "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) של מדינת הסן, מרכז מחקר ברפואת Translational ופרמקולוגיה TMP וקרן Else קרונה-Fresenius (EKFS), ומחקר הדרכת קבוצת Translational Research Innovation - פארמה (תשמ"ה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
  3. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
  4. Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
  5. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
  6. Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
  7. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  8. Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
  9. Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
  10. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  11. Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
  12. Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
  13. Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
  14. Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
  15. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
  16. Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
  17. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  18. Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
  19. Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
  20. Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
  21. Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
  22. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
  23. Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
  24. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  25. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
  26. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS One. 7 (12), e50915 (2012).
  27. Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).

Tags

רפואה גיליון 121 encephalomyelitis אוטואימוניות טרשת נפוצה דלקת בעצב ראיה הדמית לחיות אופטית פליטת אור אינפרא אדום דלקת
הדמית פליטת אור קרוב אינפרא אדום של אופטיק בעצב המוח דלקת במודל EAE של טרשת נפוצה בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter