Summary
De getoonde techniek voor in vivo bioluminescentie levende en nabije infrarood beeldvorming van optische neuritis en encefalitis bij de experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) model voor multiple sclerose in SJL / J muizen.
Abstract
Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) in SJL / J-muizen is een model voor relapsing-remitting multiple sclerose (RRMS). Klinische EAE scores beschrijven motorische functie zijn eenvoudig uitlezen van de immuun-gemedieerde ontsteking van het ruggenmerg. Echter, scores en lichaamsgewicht niet mogelijk een in vivo bepaling van hersenontsteking en optische neuritis. Dit laatste is een vroege en frequente manifestatie bij ongeveer 2/3 van MS. Hier tonen wij werkwijzen voor bioluminescentie en nabij infrarood levende imaging beoordelen EAE opgewekt optische neuritis, hersenontsteking en bloed-hersenbarrière (BBB) verstoringen in levende muizen met een in vivo beeldvormingssysteem. Een lichtgevende substraat geactiveerd door oxidases voornamelijk toonde oogzenuwontsteking. Het signaal was specifiek en kon de visualisatie van medicatie effecten en ziekte tijdsverloop, waarbij de klinische scores parallel. Gepegyleerd fluorescente nanodeeltjes die in de vasculatur geblevene voor langere tijd werden gebruikt om de integriteit van BBB beoordelen. Nabij infrarood beeldvorming onthulde een BBB lek op het hoogtepunt van de ziekte. Het signaal was het sterkst rond de ogen. Een bijna-infrarood substraat voor matrix metalloproteïnasen werd gebruikt om EAE opgewekt inflammatie. Auto-fluorescentie bemoeid met het signaal, waarbij spectrale ontmenging voor de kwantificering. Overall, bioluminescentie een betrouwbare methode om EAE-geassocieerde optische neuritis en medicatie effecten ingeschat en was superieur aan het nabije infrarood technieken wat betreft signaal specificiteit, robuustheid, gemak van kwantificering en kosten.
Protocol
1. EAE inductie in SJL / J muizen
- muizen
- Gebruik 11 weken oude vrouwelijke SJL / J-muizen en laten wennen aan de laboratoriumruimte gedurende 7 dagen. Gebruik n = 10 muizen per groep.
- Voor de beoordeling van de medicatie effecten, het beheer van de drug en placebo voor de controlegroep continu via het drinkwater of via voedsel pellets te beginnen 3 of 5 dagen na immunisatie (n = 10 per groep). Tijdens de piek van de ziekte, de toediening van geneesmiddelen of placebo met melk of 3% suiker water geweekte cornflakes.
- immunisatie materiaal
- Gebruik een EAE inductie kit bestaande antigeen (peptide van proteolipide-eiwit, PLP139-151, 1 mg / ml emulsie) in een emulsie met volledig Freund's adjuvans (CFA, hitte gedode Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) en 2 flesjes (5 ug elk) gelyofiliseerd pertussis toxine (PTX).
- Los het PTX (2 ug / ml) in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, dat wil zeggen, </ Em> toe te voegen 1,5 ml PBS aan elke PTX buis, meng goed, verwijder met dezelfde pipet tip, en toe te voegen aan 1 ml PBS in een 50-mL buis); goed mengen.
- Immunisatie
- Injecteer PLP / CFA subcutaan in 2 porties, elk 100 pl, zowel aan de basis van de staart. Niet injecteren in de achterkant van de nek, omdat eventuele immuunreacties in de huid in de bovenrug of nek beeldvorming van het hoofd en ruggenmerg storen.
- Injecteer 100 ui PTX intraperitoneaal (ip), tweemaal per muis, de eerste 1-2 uur na immunisatie en de tweede van 24 uur.
- Voor de controlemuizen, injecteren CFA zonder PLP (2 porties van 100 ui) plus PTX zonder PLP.
- Muis hanteren na immunisatie
- Weeg de muizen om de andere dag tot dag 7, en weeg ze dagelijks.
OPMERKING: Muizen verliezen ongeveer 1-2 g lichaamsgewicht tijdens EAE. De daling markeert het begin van de EAE. - Beoordelen van klinische symptomen dagelijks van dag 7 accordgens de standaard scoringssystemen (dwz Score 0: geen duidelijke veranderingen in motorische functies; score 0,5: distale verlamming van de staart; score 1: volledige verlamming van de staart; score 1,5: lichte verlamming van één of beide achterpoten; score 2: ernstige parese van achterpoten; score 2.5: volledige verlamming van één achterpoot; score 3: volledige verlamming van beide achterpoten; score 3.5:. volledige verlamming van de achterpoten en parese van een voorpoot Euthanaseren muizen met een score van 3,5 of hoger voor > 12 h.
- Weeg de muizen om de andere dag tot dag 7, en weeg ze dagelijks.
- EAE verloop en het tijdstip van beeldvorming
- Voer de eerste beeldvormende bij het begin van de ziekte bij de muizen bereikt scores> 1, die optreedt rond dag 10 - 12 na immunisatie.
- Voer de tweede beeldvormende bij de piek, die wordt bereikt 1 of 2 dagen na de eerste symptomen en duurt 1-3 dagen.
OPMERKING: Vervolgens zal de muizen volledig herstellen binnen 7 tot 10 dagen. Imaging tijdens de pauzes kunnen vertonen nog steeds vasculair lekken,maar ontsteking indicatoren moeten negatief zijn.
2. Bioluminescent en nabij-infrarood beeldvorming van oogzenuwontsteking en hersenontsteking
- Instelling van het beeldvormingssysteem
- Voeren in vivo beeldvorming met alle apparatuur waarmee voor de analyse van bioluminescentie en nabij-infrarode signalen.
- Houd muizen onder 2-2,5% isofluraan anesthesie gedurende alle beeldvormende procedures.
- Plaats een of twee muizen naast elkaar in de inrichting met de middelste gasvoorziening. Plaats de bovenste rug in het midden.
- Gebruik twee muizen tegelijk, één per groep, voor de evaluatie van de medicatie effecten te vergelijken paren. Dit is belangrijk voor bioluminescente beeldvorming.
- Scherm de plaats van immunisatie met zwarte stof en nemen beeld een foto en basislijn tot de juiste positionering van de muis / muizen te beoordelen. Gebruik de B-focus met een 6,5-cm afstand tot de camera voor alle beelden.
- Injectie en beeldvorming van bioluminescent ontsteking sonde
- Gebruik de in vivo beeldvorming systeeminstellingen: Epi-BLI, Em filteren geopend, Ex filter blok, fStop 1, binning 8, richten B = 6,5 cm, ad blootstelling 120 s; neem een baseline afbeelding.
- Injecteer 100 ul ip van de kant-en-klare chemiluminescent reagens (40 mg / ml). Meng goed voor het vullen van de spuit.
- Leg bioluminescentie beelden 5, 10 en 15 minuten na injectie. Het tijdsverloop van de bioluminescent piek verschilt tussen dieren.
NB: De piek zal plaatsvinden 5 - 10 minuten na de injectie; een daling van 15 minuten geeft aan dat geen verdere beelden nodig. Gebruik de muis paren van controle en behandeling groepen om kleine vooroordelen als gevolg van verschillende verloop in de tijd te elimineren. - Vul beschrijvingen om het experiment betrokken. Observeer een dialoogvenster pop-up automatisch; Het bevat informatie, zoals muizenstam, geslacht, tijdstip, tijdstip probe injectie, groepen, enz. Sla de bestanden allemaal in one folder; ze zal tijd-tags en alle beschrijvingen hebben.
- Injectie en beeldvorming van nabij-infrarood fluorescerende nanopartikels voor BBB integriteit
- Gebruik nabij-infrarood epifluorescentie beeldvorming in de B-focus (afstand: 6,5 cm). De excitatie / emissie maxima van de gepegyleerde fluorescente nanodeeltjes 675/690 nm. Leg twee beelden op verschillende golflengten, bij Ex640 / Em700 en Ex675 / Em720; gebruik maken van een 2-s belichting, binning 8 en fStop 2. Neem beeld van een baseline.
- Injecteer 70 pi van gepegyleerde fluorescerende infrarood nanodeeltjes iv via de staartader en stel je de muizen 3 uur en 24 uur na injectie met behulp van de bovenstaande instellingen. Meng de oplossing ruim voor het vullen van de spuit.
- Injecteer 0,9% natriumchloride in controlemuizen, die nodig zijn om de specificiteit van het signaal te bepalen.
- Injectie en beeldvorming van de nabij-infrarood fluorescente probe voor MMP-activiteit
- Scheren of ontharen het hoofd en Upper wervelkolom regio voorzichtig een dag voor het nemen van de basislijn. De huid mag niet worden verwond.
- Gebruik nabij-infrarood epifluorescentie beeldvorming in de B-focus (afstand: 6,5 cm). De excitatie / emissie maxima van de MMP activeerbare probe 680/700 nm. Leg twee beelden op verschillende golflengten, bij Ex640 / Em700 en Ex675 / Em720; gebruik maken van een 1-s belichting, binning 8 en fStop 2. Neem beeld van een baseline.
- Voeg 200 ul van 1 x PBS om de 1,5 ml buis van de kant-en-klare oplossing (20 nmol / 1,5 ml in 1 x PBS), zodat het voldoende 10 muizen zijn; meng goed voor het vullen van de spuit.
LET OP: De verstrekte volume is geen rekening mee houden dat sommige volume verloren gaat tijdens het vullen van spuiten en injectie. - Injecteer 150 ui van de probe iv via staartader 24 uur voor de beeldvorming. Injecteer alleen PBS bij controledieren om de specificiteit van het signaal te bepalen.
- Op 24 uur na injectie, neem Epi-FL beelden ten minste twee golflengten, Ex640 / Em700 en Ex 675 / EM720, met de bovenstaande instellingen (1-s belichting, scherpstelling B, binning 8 en fStop 2) toegelicht.
Opmerking: Het gebruik van twee golflengten maakt spectrale ontmenging door het aftrekken van de niet-specifieke signaal.
3. Afbeelding Analyses
- Bioluminescentie analyse (BLI)
- Dubbelklik op de software om deze te openen.
- In de bovenste menubalk, klik op het icoon file browser, ga naar de directory van de map van het experiment, en selecteer deze; dit zal alle bestanden in de map in een tabel.
- Configureer de kolommen met de beschrijving om het experiment betrokken.
- Voor kwaliteitscontrole, dubbelklikt u op een bestand van een niet-responder muis zonder symptomen van EAE en / of een naïeve muis om de specificiteit van de EAE signalen te controleren.
NB: Er mag geen signaal in naïeve muizen en minimale signaal in non-responder muizen.- Controleer het basislijn voor de injectie van de provoor elke muis als verdere controle van de specificiteit van het signaal; het zou negatief zijn.
- Om een beeld te selecteren, dubbelklikt u op het eerste bestand van de eerste EAE muis en controleer de lichtgevende intensiteit (LUT bar bereik) en lokalisatie. Bekijk alle foto's één voor één. Sluit het bestand met de laagste intensiteit voor elke muis (dat wil zeggen, houd 2 van 3 beelden per muis).
- Beeldaanpassing en uitvoer
- Dubbelklik op het eerste bestand te kwantificeren. Observeer een nieuw venster pop-up. Onder "options" (bovenste menu), pas de labels weer te geven in elk beeld.
- In het juiste gereedschap palet, ga naar "image aanpassing." Standaard worden de minimum en maximum intensiteiten ingesteld op "auto" en weergegeven in regenboogkleuren pseudocolor. Selecteer "manual" om de instellingen indien nodig te wijzigen.
OPMERKING: Bijvoorbeeld kunnen alle uitgevoerde beelden identiek LUT bars (identiek minima en maxima) moeten goed vergelijkbaar zijn.De aanpassing van de minima en maxima heeft geen invloed op de kwantitatieve resultaten. - Klik op de afbeelding export, selecteert png, de directory, en de naam van een afbeelding
- Kwantificering van de Regio's of Interest (ROI)
- Ga naar de "ROI" tool in het palet tool. Selecteer de ROI-methode (cirkel, auto rechthoekig, of de vrije hand) en het aantal van de ROI. Houd u aan de ROI pop-up venster in het venster afbeelding.
- Met behulp van de muis, passen de grootte en positie. Gebruik identieke ROI drempels voor alle beelden als de auto-ROI-tool wordt gebruikt. Gebruik identieke gebieden voor alle afbeeldingen als ROI maten en posities handmatig (bijv ronde ROI) worden gedefinieerd.
- Klik op "meten RO.I. Neem een nieuw venster pop-up. Pas de kolommen (bijvoorbeeld bestandsnaam, dier nummer, groep, experiment, gebied, totaal telt, gemiddeld telt, SD telt, min en max telt, ruimte, tijd , tijdstip van sonde injectie, etc.). Sla de aangepaste instellingen. Wanneer ready, alles selecteren (Ctrl + A) en kopieer en plak de tabel in een spreadsheet.
- Exporteer het beeld als png de ROI op zijn plaats. Opslaan en sluiten van het beeldbestand.
- Herhaal de procedure (stappen 3.1.6 - 3.1.7) voor alle beeldbestanden die moeten worden gekwantificeerd. Kopieer alle ROI kwantificering in de spreadsheet.
LET OP: Hier kunnen de resultaten worden gesorteerd per groep, tijdstip, enz. En statistisch geanalyseerd. Gebruik de totale tellingen van bioluminescentie signalen in de ROI voor statistische analyses.
- (NIR) analyse van fluorescerende nanodeeltjes-Infrared in de buurt
- Met behulp van de controles in de software aan te passen aan de drempel van het beeld.
Let op: Dit heeft geen invloed op de kwantitatieve resultaat. - Visueel vergelijken de opnamen bij Ex / Em 675/720 en Ex / Em 640/700 om de specificiteit van het signaal te beoordelen.
- Gebruik de opnamen bij Ex / Em 675/720 voor de kwantitatieve analyse (maximaal excitatie: 680 nm). Definieer ROI, waarbij de auto-ROI gereedschap kan worden gebruikt. Stel de auto-ROI drempel en gebruiken voor alle afbeeldingen. Kwantificeren van de totale stralende efficiëntie in ROI (zie stap 3.1).
- Met behulp van de controles in de software aan te passen aan de drempel van het beeld.
- (NIR) analyse van protease-gevoelige probe-infrarood buurt
- Met behulp van software, moet u het drempel van het beeld.
Let op: Dit heeft geen invloed op de kwantitatieve resultaat. Voer spectrale ontmenging van de auto-fluorescentie. De unmixing tool is geïmplementeerd in Living Image. De auto-unmixing maakt gebruik van de Ex / Em 640/700 als de specifieke en 675/720 als de auto-tl-imago. - Selecteer de ongemengde beeld en bepalen de ROI, zoals hierboven beschreven. Gebruik de totale stralende efficiëntie in ROI voor kwantitatieve en statistische analyses.
- Met behulp van software, moet u het drempel van het beeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdsverloop van bioluminescentie van oogzenuwontsteking
De bioluminescentie signaal van de probe ontsteking was de sterkste rond de ogen en traden uitsluitend EAE muizen met neuritis optica. Een signaal deed zich noch in de niet-EAE muizen of muizen niet geïnjecteerd met ontsteking probe. Het signaal verdween toen de muizen hersteld. Dus het signaal specifiek voor optische neuritis, en de piek van het signaal loopt parallel met de piek van de klinische EAE scores. Figuur 1 toont twee voorbeelden van SJL / J-muizen afgebeeld op dag 10 en 14 na EAE inductie. De lichtgevende signaal was het hoogst op dag 10 en verdween toen de muizen begonnen te herstellen. Het tijdsverloop van de klinische scores overeen met de verdwijning van de lichtgevende signaal (voorbeeld-1) of voorafgegaan (voorbeeld-2) de daling van de scores.
Figuur 1. tijdsverloop van oogzenuwontsteking en klinische scores in EAS-SJL / J muizen. Bioluminescente beelden van optische neuritis werden gevangen 10 min na de injectie van de ontsteking probe (100 pi ip) in de 1 ste flare van de ziekte in twee SJL / J muizen op verschillende tijdstippen na immunisatie. De bioluminescente beelden (linker paneel) werden gevangen genomen 10 en 14 dagen na immunisatie en worden gepresenteerd als regenboog pseudocolor foto overlays. Lut bars variëren van blauw (lage) tot rood (high-bioluminescentie). Schaal bar: 1 cm. Het rechter paneel toont staafdiagrammen van de individuele totale bioluminescentie tellingen in ROI (gemiddelde ± sd van 3 beelden per stuk) en het tijdsverloop van de klinische EAE scores. De rode pijlen geven de beeldvorming dagen. Klik hier om te zien een grotere version van dit cijfer.
Beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling
ontsteking probe
De effecten van het geneesmiddel (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) 5 worden getoond in Figuur 2. Vijf voorbeelden van bioluminescente beelden in elke groep worden gepresenteerd. De scores in de dragergroep en behandeling heterogeen, maar in alle muizen, de lichtgevende signaal in het oog blijkt ontsteking in de oogzenuw was lager in de medicatie groep (Figuur 2A). De kwantificering van de totale tellingen in bioluminescent ROI bewezen significante werkzaamheid van de behandeling (figuur 2B, met boxplots van de totale tellingen bioluminescent, ongepaarde 2-tailed t-test, p <0,05). De beeldvorming resultaten overeengekomen met de therapeutische werkings van het geneesmiddel wat betreft de klinische scores en histopathologische manifestaties van EAE in het ruggenmerg en de oogzenuw 5.
Figuur 2. doeltreffendheid van medicatie in EAE-SJL / J muizen Met behulp van Bioluminescent Imaging. SJL / J muizen ontvingen vehikel of medicijnen (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) vanaf dag 5 na immunisatie. Beelden werden vastgelegd na de injectie van de ontsteking probe (100 pi ip) en 1 st EAE piek, n = 10 per groep. EAE ontwikkeld in 7/10 in beide groepen en EAE non-responders waren zonder signaal. A) Bioluminescentie beelden in levende muizen gevangen 5-15 minuten na de ip injectie van 100 pi van de ontsteking sonde worden gepresenteerd als regenboog pseudocolor foto overlays. LUT bars variëren van blauw (lage) tot rood (hoge intensiteit). Schaal bar: 1 cm. De afzonderlijke piekvan de totale tellingen in bioluminescent ROI werd gebruikt voor kwantificering. ROI's werden beperkt tot het hoofd. De PLP injectieplaatsen werden afgeschermd met zwarte doek. B) Box plots met de kwantificering van de totale tellingen in ROI. De doos is de interkwartielafstand, de lijn is de mediaan, en de snorharen tonen de minimum naar maximum. De totale tellingen significant tussen groepen (2-zijdige ongepaarde t-test, p <0,05), die een vermindering van optische neuritis en encefalitis bij muizen die medicatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gepegyleerde fluorescerende nanodeeltjes
Epifluorescentie beelden van near-infrared nanodeeltjes onthulde vasculair lekken rond de ogen en in de hersenen in beide behandelingsgroepen groups (Figuur 3A, 2 voorbeelden). De deeltjes verspreiden langzaam uit het bloed naar de interstitiële ruimte, met uitzondering van plaatsen van ontsteking, waarbij de kleurstof zich ophoopt, waardoor een beoordeling van BBB integriteit. De lekkage was het op 3 uur en 24 uur na de injectie van de nanodeeltjes, maar het was sterker in de latere tijdstip. Er was geen specifiek signaal in niet-EAE muizen of muizen niet geïnjecteerd met nanodeeltjes (rechter paneel). Derhalve was het signaal specifiek. De kwantitatieve analyse van stralende efficiëntie ROI (figuur 3B) geen significante verschillen tussen behandelingsgroepen (n = 3 per groep, ongepaarde 2-tailed t-test, p <0,05) zichtbaar.
Figuur 3. Beoordeling van de bloed-hersenbarrière Disruption met Pegylated Fluorescerende Nanodeeltjes. SJL / J muizen kregen voertuig of medicatie (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) vanaf dag 5 na immunisatie. Beelden werden vastgelegd 3 uur en 24 uur na de injectie van nabij-infrarood-gelabelde nanodeeltjes (70 pl iv) tijdens de 1e piek EAE, n = 3 per groep. EAE non-responders waren zonder signaal. De auto-ROI instrument werd gebruikt voor de kwantificering van de stralende efficiëntie. De ROI's werden beperkt tot het hoofd. De PLP injectieplaats werden afgeschermd. A) Voorbeelden epifluorescentie beelden van levende muizen, gevangen 3 uur en 24 uur na de injectie van nanodeeltjes. Beelden van muizen zonder EAE of zonder injectie van nanopartikels werden gebruikt als controles beeldvorming. Schaal bar: 1 cm. LUT bars variëren van donkerrood (lage) naar geel (hoge intensiteit). B) Bar grafieken die de kwantificering van de stralende efficiëntie in ROI (gemiddelde ± SD). Behandelingsgroepen niet significant (2-zijdige ongepaarde t-test). Klik hier om v IEW een grotere versie van deze figuur.
Matrix metalloproteïnase-gevoelige probe
Na aftrek van de auto-fluorescentie, beelden van de protease-activeerbare MMP probe onthulde ontsteking in de hersenen en het ruggenmerg in EAE-muizen (Figuur 4A, voorbeelden van 4 muizen per groep). Er was geen signaal bij muizen niet geïnjecteerd met de sonde, en een zwak signaal is opgetreden in een EAE muizen zonder klinische symptomen (non-responder). Beelden in figuur 4 tonen het signaal bij Ex / Em 640/700 afgetrokken door het beeld bij Ex / Em 675/720. Verschillen tussen de behandelingen werden geopenbaard nadat de kwantitatieve analyse van de stralende efficiëntie in auto-ROI na spectrale ontmenging (figuur 4B, ongepaarde 2-tailed t-test, n = 6 en 4, p <0,05).
iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
Figuur 4. Beoordeling van metalloproteinases met nabij-infrarood MMP-gevoelige Imaging Probe. SJL / J muizen ontvingen vehikel of medicijnen (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) vanaf dag 5 na immunisatie. Beelden werden gevangen genomen 24 uur na de injectie van de probe (150 pi iv) en EAE 1e piek, n = 6 en 4 PLP injectieplaatsen werden afgeschermd. EAE non-responders en muizen zonder MMP probe injecties werden als controles. Elke 2 beelden werden gevangen bij Ex / Em 640/700 nm (specifiek signaal) en 675/720 nm (auto-fluorescentie). Met het spectrale ontmenging gereedschap, werd de auto-fluorescentie afgetrokken en vervolgens werd de auto-ROI instrument bij het plaatsen van specifieke MMP-activiteit te identificeren. De totale stralende rendement werd gebruikt voor de kwantificering. A) Voorbeelden van epifluorescentie beelden in levende muizen gevangen 24 uur na injectie probe. De beelden zijn het gevolg van spectrale ontmenging (UMX). Schaal bar: 1 cm. LUT bars variëren van donkerrood (lage) naar geel (hoge intensiteit). B) Box plots met de kwantificering van de totale stralende efficiëntie in ROI. De doos is de interkwartielafstand, de lijn is de mediaan, en de snorharen tonen de minimum naar maximum. Het sterretje geeft een significant verschil tussen de groepen (2-zijdige ongepaarde t-test, p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige video toont technieken voor bioluminescentie en nabij-infrarood fluorescentie in vivo beeldvorming van EAE in SJL / J muizen. We tonen aan dat bioluminescentie met gebruikmaking van een ontsteking-gevoelige probe toont voornamelijk optische neuritis en kwantificering eens met de klinische evaluatie van EAE ernst en de werking van medicijnen. De bioluminescentie methode niet kon ontsteking van het lumbale ruggenmerg, die een primaire plaats van EAE manifestatie 17 detecteren, waarschijnlijk omdat het signaal wordt opgenomen door de wervelkolom.
Het nabij-infrarood imaging is gevoeliger, maar ten koste van hoge interferentie met auto-fluorescentie, die niet optreedt bij bioluminescentie. De belichtingstijd van NIR veel korter (1-2 s) in vergelijking met BLI (2-5 min), waarbij de NIR voorkeurswerkwijze maakt voor tijdreeksen met snel veranderende signaalintensiteiten.
Kritische Stappen metin het protocol en Beperkingen van de Techniek
Signalen van de immunisatie plaats verstoren ruggenmerg in EAE beeldvorming, maar dit kan worden omzeild door het lokaliseren beide injectieplaatsen bij de basis van de staart, die lager zijn dan de aanbevolen injectieplaatsen (hals van de staart) was. Niettemin moet de injectieplaatsen met zwart doek schild.
Voor bioluminescentie beeldvorming, is het cruciaal om een tijdreeks van de beelden vast te leggen, omdat de kinetiek verschillen tussen dieren. Om vooroordelen veroorzaakt door kinetiek te vermijden, beeldvorming van paren van controle (bijvoorbeeld voertuig of wild type) en verum (bijvoorbeeld geneesmiddel of transgene) muizen is voordelig. Volgens de fabrikant, moet het signaal stabiel zijn gedurende 30 min. In EAE observeerden we sneller en voorbijgaande kinetiek, met pieken optreedt bij 5-10 min en een aanzienlijke daling in 15 min.
Voor de nabij-infrarood imaging, de manufacturer beveelt de Ex / Em setting voor een specifieke probe. Toch was het nuttig om een filter serie in eerste instantie lopen en altijd foto's ten minste vast te leggen op twee excitatie / emissie-combinaties, die nauw aansluit bij de gerapporteerde Ex / Em maxima en kunnen later worden gebruikt voor spectrale ontmenging van niet-specifieke signalen.
Het is belangrijk om witte muizen, zoals SJL / J gebruiken, omdat licht en fluorescentie sterk worden geabsorbeerd door zwart bont. Black muizen moeten voorzichtig worden geschoren op het hoofd en een dag terug voor de beeldvorming. Huidletsels worden vermeden, omdat ze verschijnen als vlekken inflammatoire en interfereren met beeldvorming van de hersenen of het ruggenmerg. Voor NIR imaging, de fabrikant adviseert het ontharen van alle muizen, zelfs witte muizen. Zelfs na het scheren, de kop en rug resultaten in zwarte muizen minder overtuigend dan bij witte muizen (niet afgebeeld). Voor de primaire progressieve EAE model in C57BL6 muizen, kan wit C57BL6 muizen, die commercieel verkrijgbaar zijn, zijn alternative. Kaal, immunocompetente SKH1 muizen zijn handig voor het nabij-infrarood imaging, maar niet EAE, omdat deze muizen hebben een albino genetische achtergrond en niet op betrouwbare wijze te ontwikkelen EAE (maximale score: 0,5-1). Bioluminescente beeldvorming met de ontsteking probe in deze muizen bleek dat verscheidene inflammatoire plekken in de huid (niet getoond) wanneer haarfollikels verloren.
NIR beeldvorming van proteaseactiviteit geopenbaard hersenen en ruggemerg ontsteking, maar signalen werden bovenop door auto-fluorescentie, waarbij spectrale ontmenging voor kwantitatieve analyse. Vandaar dat NIR imaging was minder robuust dan bioluminescentie beeldvorming en was duurder. Echter kan het gebruik van protease activeerbare probes voor de beoordeling van specifieke medicijnen die matrix metalloproteïnases zijn.
Voor-en nadelen
De verschillende beeldvormende technieken zijn gratis en specifieke vragen te beantwoorden. De voordelen van bioluminescent imaging zijn betaalbaarheid (ongeveer 20 Euro / muis); gebrek aan auto-bioluminescentie, die afbreuk doen aan het signaal; hoge specificiteit; handig ip injectie en beeldanalyse; en robuustheid en betrouwbaarheid. Nadelen zijn lange belichtingstijden en signaal absorptie door zwarte vacht en bot.
De voordelen van NIR zijn de bredere beschikbaarheid van NIR-gelabelde probes, het gemak van aangepaste NIR etikettering, korte belichtingstijd, en een hoge gevoeligheid. Nadelen zijn hoge kosten (50 - 100 Euro / muis), absorptie door bont, sterke interferentie met auto-fluorescentie, en de noodzaak voor de spectrale ontmenging en beeldverwerking voor de analyse.
Een aantal sondes beschikbaar die ontstekingsplaatsen detecteren omdat ze worden geactiveerd door pro-inflammatoire enzymen die worden gereguleerd op plaatsen van ontsteking (bijvoorbeeld peroxidase of metalloproteïnasen) door de infiltratie van immuuncellen. Sommige van deze probes ook nis detecteertrs demonstreren immune cel infiltratie in de tumor micro-omgeving of het vrijgeven van enzymen door de tumor zelf (bijvoorbeeld MMP). Probes die zich ophopen in het weefsel als gevolg van capillaire lekkage storingen detecteert in de BBB, maar ook op andere plaatsen van ontsteking en kanker.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
De combinatie van 'imaging plus klinische zweren' superieur was aan "alleen scores" voor de beoordeling van de status van de ziekte en de opsporing van medicatie effecten. De bioluminescentie signaal rond de ogen is het ook eens met eerdere histopathologische studies blijkt myeline vernietiging en immuuncel infiltreert in de oogzenuw 5. Ongeveer 2/3 van de MS-patiënten ontwikkelen afleveringen van oogzenuwontsteking. Tot nu toe zijn er geen betrouwbare, niet-invasieve methoden voor optische neuritis kwantificeren levende muizen behalve diffusie magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en opsche coherentie tomografie (OCT), die technisch eisen 18. Oktober is ingevoerd in EAE als een werkwijze toont retinale atrofie en veranderingen in EAE suggereert een auto-immuunreactie in de oogzenuw 19.
Vergeleken met de in dit manuscript beschreven werkwijze, oktober een hogere stressor voor muizen, omdat het diepe verdoving vereist. De uitlezing is geen directe visualisatie van de oogzenuw 19.
Nabije infrarood beeldvorming van fluorescente nanodeeltjes is nuttig om de verstoring van de BBB, een ander kenmerk van EAE en MS visualiseren. Naast MRI 20, 21, is er geen niet-invasieve werkwijze voor de in vivo opvolging van BBB integriteit. Dat zou heel nuttig zijn, omdat de experimentele drugs en fyto-medicatie specifiek inwerken door het aandraaien van de barrière 22, 23, die normaliter verhindert overmatige lymfocyten rekrutering bij CNS 24. Voorkomen van leukocyten beslaglegging of transmigratie door de BBB en het verminderen van de leakiness is een effectieve strategie in de behandeling van MS 25 en nanodeeltjes imaging kan helpen om de werkzaamheid van kandidaat-geneesmiddelen te evalueren. Tot nu toe zijn de deeltjes duur. Intravitale microscopie is een andere techniek die gebruikt wordt om BBB-integriteit 26 zichtbaar te maken, maar het vereist doorgaans een langdurige, diepe narcose (bijvoorbeeld met ketamine en xylazine) als gevolg van de craniotomie en verbiedt opnieuw ontwaken van de muizen en voorkomt zo tijdsverloop analyses. Echter intravitale microscopie levert hoge-resolutie beelden op cellulair subcellulaire niveaus, die niet worden bereikt met in vivo beeldvorming.
Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering the Technique
Samengevat, de beeldvorming techniques gepresenteerd in deze video helpen om de afzonderlijke vakken van de ziekte te beoordelen en de effecten van geneesmiddelen, die deels niet geopenbaard door klinische scores waren alleen bewaken. De technieken komen overeen met de 3 "R" beginselen van vervanging, vermindering en verfijning van dierproeven en zijn handige add-on gereedschappen in geneesmiddelenonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) en de financiering van onderzoek programma "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) van de staat van Hessen, Research Center for Translational Medicine en Farmacologie TMP en de Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), Research Training Group Translationeel Onderzoek Innovatie - Pharma (TRIP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AngioSpark-680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10149 | Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity |
| MMP-sense 680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10126 | Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation |
| XenoLight RediJect Inflammation Probe | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | 760535 | Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation |
| PLP139-151/CFA emulsion | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| Pertussis Toxin | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| IVIS Lumina Spectrum | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | Bioluminescence and Infrared Imaging System | |
| LivingImage 4.5 software | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | CLS136334 | IVIS analysis software |
| Isoflurane | Abbott Labs, Illinois, USA | 26675-46-7 | Anaesthetic |
References
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
- Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
- Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
- Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
- Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
- Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
- Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
- Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
- Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
- Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
- Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
- Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
- Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
- Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
- Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
- Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
- Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
- Andresen, V., et al.
- Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).
