Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Farelerde Multipl Skleroz EAE Modeli Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Biyoparlaklık ve Yakın-Kızılötesi Görüntüleme

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

Biz, in vivo canlı biyolüminesans ve yakın kızılötesi SJL / J farelerinde multipl skleroz için deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) modelinde optik nevrit ve ensefalit görüntüleme tekniğini göstermektedir.

Abstract

SJL / J farelerde deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) tekrarlayan-düzelen multipl skleroz (RRMS) için bir modeldir. fonksiyon kayıpları tarif Klinik EAE puanları omurilik bağışıklık aracılıklı iltihaplanma temel okumalar vardır. Ancak, puanları ve vücut ağırlığı, beyin iltihabı ve optik nörit in vivo değerlendirilmesi için izin vermez. İkincisi yaklaşık 2/3 MS hastalarının erken ve sık bulgusudur. Burada, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak canlı farelerde biyolüminesans ve EAE optik nörit uyarılmış değerlendirmek için yakın kızıl ötesi canlı görüntüleme, beyin iltihabı ve kan-beyin bariyeri (KBB) bozulması için yöntemler göstermektedir. oksidazlar ile aktive olan bir biyolüminesens alt tabaka öncelikle optik nörit gösterdi. Sinyal özgü ve klinik skorları paralel ilaç etkileri ve hastalık süresi derslerin görselleştirme, izin verdi. vasculatur içinde kalmıştır pegile floresan nanopartiküllerUzun bir süre için, e KBB devamlılığını değerlendirmek için kullanıldı. Yakın-kızılötesi görüntüleme hastalığının zirvesinde BBB sızıntısı tespit edildi. Sinyal göz çevresindeki en güçlü oldu. Matris metaloproteinazların için yakın kızılötesi alt-tabaka EAE uyarılmış iltihabı değerlendirmek için kullanıldı. Otomatik floresans ölçümü için spektral Karışmama gerektiren sinyaline müdahale. Genel olarak, biyoparlaklık görüntüleme EAE ilişkili optik nevrit ve ilaç etkilerini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem olduğunu ve sinyal özgüllük, sağlamlık, ölçme kolaylığı ve maliyet açısından yakın kızılötesi tekniklerden üstündü.

Protocol

SJL 1. EAE İndüksiyon / J Fareler

  1. fareler
    1. 11 haftalık dişi SJL / J fareler kullanın ve onları yaklaşık 7 gün boyunca deneysel odasına alıştırmak için izin verir. Grup başına n = 10 fare kullanın.
    2. ilaç etkilerinin değerlendirilmesi için, sürekli olarak içme suyu yoluyla ya da 3 ya da 5 gün Aşıdan sonra (n = 10 grup başına) başlangıç ​​gıda pelet yoluyla kontrol grubunda ilaç ve plasebo yönetmek. Hastalığın zirve sırasında, süt ya da% 3 şekerli su ile ıslatılmış mısır gevreği ile ilaç ya da plasebo yönetmek.
  2. Aşılama malzemesi
    1. Tam Freund katkı maddesi (CFA, ısı ile öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) ve 2 şişeler (5 ug her biri) ile bir emülsiyon içinde bir EAE indüksiyon kiti antijenini içeren (proteolipid protein peptidi, PLP139-151, 1 mg / ml emülsiyon) kullanarak liyofilize boğmaca toksin (PTX).
    2. 1x Fosfat tamponlu tuzlu su içinde PTX (2 ug / ml) (PBS içinde çözülür, yani, </ Em>), aynı bir pipet ucu ile kaldırma, iyice karıştırın ve 50 ml bir tüp içinde 1 mL PBS ile eklemek için, her PTX tüpüne PBS 1.5 mL eklemek; iyice karıştırın.
  3. aşılama
    1. kuyruk dibinde, 2 kısım halinde, her 100 uL, her iki PLP / CFA deri altına enjekte edilir. Üst sırt ya da boyun deride herhangi bir immün reaksiyonlar baş ve omurilik görüntüleme rahatsız olacaktır, çünkü boyun arkasına enjekte etmeyin.
    2. aşılamadan sonra 2 saat ve 24 saat sonra ikinci - iki kez, fare başına intraperitonal PTX (ip), 100 uL, önce, 1 enjekte edilir.
    3. kontrol fareleri için, PLP olmadan PLP olmadan CFA (100 uL 2 porsiyon) artı PTX enjekte edilir.
  4. Fare aşılama sonrası işleme
    1. farelere günde 7 her geçen gün yukarı tartılır ve daha sonra onları her gün tartın.
      NOT: Fareler yaklaşık 1 kaybetmek - EAE sırasında vücut ağırlığının 2 g. düşüş EAE başlangıcına işaret.
    2. gün 7 anlaşmanın günlük klinik semptomları değerlendirmekmotor fonksiyonlarda belirgin bir değişiklik; 0.5 puan: Standart skorlama sistemlerine ing (yani 0 Skor kuyruk distal felç; 1 puan: tam kuyruk paralizi; 1,5 puan: Bir veya her iki arka bacaklarda hafif parezi; 2 puan: arka ayakları şiddetli parezi; skoru 2.5: bir arka bacak tam paralizi; skoru 3: Her iki arka ayakları tam felç, 3.5 puan. arka ayakları ve bir ön bacak parezi tam felç 3.5 veya daha yüksek puanları ile fareler Euthanize > 12 saat.
  5. EAE ders ve görüntüleme zamanı
    1. aşılamadan sonra 12 - fareler günde 10 civarında oluşacak puanları> 1, ulaştığınızda, hastalığın başlangıcında ilk görüntüleme gerçekleştirmek.
    2. 3 gün - ilk belirtileri gelişebilir sonra 1 ya da 2 gün ulaşılacaktır ve 1 sürecek zirve, ikinci görüntüleme gerçekleştirmek.
      NOT: Daha sonra, fareler tamamen 7 ila 10 gün içinde iyileşir. aralarda görüntüleme hala vasküler sızıntıları gösterebilirancak inflamasyon göstergeleri negatif olmalıdır.

2. Bioluminescent ve Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Yakın kızılötesi görüntüleme

  1. Görüntüleme sisteminin Kur
    1. Biyolüminesans ve yakın kızılötesi sinyallerin analizi için izin veren herhangi bir ekipman ile in vivo görüntüleme gerçekleştirin.
    2. Tüm görüntüleme işlemleri sırasında% 2.5 izofluran anestezisi - 2 altında fareler tutun.
    3. Pozisyon bir veya orta gaz tedarikini kullanarak aygıtında yanyana iki fare. merkezde üst omurga yerleştirin.
    4. ilaç etkilerinin değerlendirilmesi çiftleri karşılaştırmak için, aynı anda iki fare, grup başına birini kullanın. Bu bio-ışıldar görüntüleme için önemlidir.
    5. siyah bezle bağışıklama siteyi kalkan ve fare / farelerin doğru konumlandırma değerlendirmek için bir fotoğraf ve temel görüntü almak. Tüm görüntüler için kameraya 6.5 cm mesafe ile B-odak kullanın.
  2. Enjeksiyon ve biyolojik olarak ışık veren inflamasyon prob görüntüleme
    1. In vivo görüntüleme sistemi ayarları kullanın: 8 binning Epi-BLI, Em açık filtre, Ex filtre bloğu, fStop 1, B = 6.5 cm, reklam maruz kalma 120 s odak; temel bir görüntü çekmek.
    2. Hazır kullanımlı kemilüminesan bir reaktif (40 mg / ml), 100 uL ip enjekte edilir. şırınga doldurmadan önce iyice karıştırın.
    3. biyolüminesans görüntüleri 5, 10, ve enjeksiyon sonrası 15 dakika yakalayın. biyolüminesans zirve zaman ders hayvanlar arasında farklılık gösterir.
      NOT: pik 5 oluşacak - enjeksiyondan sonra 10 dakika; 15 dakika bir düşüş başka görüntüler gerekli olduğunu göstermektedir. nedeniyle farklı zaman kursları küçük önyargıları ortadan kaldırmak için kontrol ve tedavi grupları fare çiftleri kullanınız.
    4. deney ile ilgili açıklamalarda doldurun. otomatik olarak açılır bir iletişim kutusu gözlemlemek; Böyle fare suşu, cinsiyet, zaman noktasında, sonda enjeksiyon, grubun, vb gibi bilgileri içerir. Dosyaları tüm o kaydetne klasör; Onlar zaman etiketleri ve tüm açıklamaları olacaktır.
  3. BBB bütünlüğü için yakın kızılötesi floresan nanopartiküller Enjeksiyon ve görüntüleme
    1. B-odak (6.5 cm mesafe) yakın-kızılötesi Epifloresans görüntüleme kullanın. pegile floresan nanopartiküllerin uyarma / emisyon maxima 675/690 nm. Ex640 / Em700 ve Ex675 / Em720 farklı dalga boylarında, iki görüntü yakalamak; 8 binning 2 s pozlama, kullanabilir ve fStop 2. bir temel görüntü çekin.
    2. kuyruk damar yoluyla pegile floresan kızılötesi nanopartiküllerin 70 mcL iv enjekte edilir ve fareler 3 saat ve üzeri ayarları kullanarak enjeksiyondan sonra 24 saat düşünün. şırınga doldurmadan önce çözüm iyice karıştırın.
    3. sinyalin özelliğini değerlendirmek için gerekli olacak kontrol farelerinde,% 0.9 sodyum klorür enjekte edilir.
  4. Enjeksiyon ve MMP aktivitesi için yakın kızılötesi flüoresan probun görüntüleme
    1. Tıraş veya baş atmaktadır ve uBazal görüntüsünü almadan önce dikkatli bir gün pper omurga bölgesi. Cilt yaralı olmamalıdır.
    2. B-odak (6.5 cm mesafe) yakın-kızılötesi Epifloresans görüntüleme kullanın. MMP aktive edilebilir prob uyarım / emisyon maksimum 680/700 nm. Ex640 / Em700 ve Ex675 / Em720 farklı dalga boylarında, iki görüntü yakalamak; 8 kutulamanın 1-s maruz kullanımı ve fStop 2. Bir taban çizgisi görüntüsü al.
    3. 10 fareler için yeterli olacak şekilde hazır kullanım çözeltisi (1 x PBS içinde 20 nmol / 1.5 mL) içinde 1.5 mL bir tüpe 200 uL 1x PBS ilave et; şırınga doldurmadan önce iyice karıştırın.
      NOT: sağlanan hacim bazı ses şırınga doldurma ve enjeksiyon sırasında kaybolur dikkate almaz.
    4. görüntüleme önce kuyruk damar yoluyla 24 saat sonda iv 150 mcL enjekte edilir. sinyalin özelliğini değerlendirmek için tek kontrol hayvanlarında PBS enjekte edilir.
    5. enjeksiyondan 24 saat sonra, en az iki dalga boylarında, Ex640 / Em700 ve Ör 675 / E'de Epi-FL görüntüleri çekmekM720, ayarları (8 ve Fstop 2 binning 1-s pozlama odak B) Yukarıda açıklanan.
      NOT: İki dalga boyu kullanımı belirsiz sinyal çıkarılarak spektral unmixing sağlar.

3. Görüntü Analizi

  1. Biyoparlaklık analizi (BLI)
    1. açmak için yazılım çift tıklatın.
    2. Üst menü çubuğunda, deney klasörün dizine gidin ve onu seçin, dosya tarayıcı ikonuna tıklayın; Bu tablodaki klasördeki tüm dosyaları açacak.
    3. deney ile ilgili açıklamalar gösteren sütunları yapılandırın.
    4. kalite kontrolü için, EAE sinyallerinin özgüllüğünü kontrol etmek EAE ve / veya naif fare semptomu olmayan bir yanıtsızlık fare dosyasına çift tıklayın.
      NOT: naif farelerde ve non-cevap farelerde az sinyal sinyal olmalıdır.
      1. pro enjeksiyonundan önce bazal görüntüyü kontrolsinyalin özgüllük daha kontrol olarak her fare için olacak; negatif olmalıdır.
    5. Bir görüntüyü seçmek için, ilk EAE fare ilk dosyasına çift tıklayın ve biyolüminesens yoğunluğunu (LUT çubuğu aralık) ve yerelleştirme kontrol edin. Tüm görüntüleri teker teker kontrol edin. Her fare için en düşük yoğunlukla dosyayı kapatın (yani, her fare için 2 out of 3 görüntüleri tutmak).
    6. Görüntü ayarı ve ihracat
      1. sayısal olarak ilk dosyasını çift tıklatın. Yeni bir penceresi açılır gözlemleyin. "Seçenekleri" (üst menü) altında, her görüntüde görüntülemek için etiketleri özelleştirebilirsiniz.
      2. Doğru aracı paletinde, gidin "görüntü ayarı." Varsayılan olarak, minimum ve maksimum şiddetleri "auto" olarak ayarlanır ve gökkuşağı Pseudocolor görüntülenir. Gerekirse ayarları değiştirmek için "el" i seçin.
        NOT: Örneğin, tüm ihraç görüntüleri aynı LUT çubukları (aynı minima ve maxima) olabilir kolayca karşılaştırılabilir olması.asgari ve azami ayarlanması nicel sonuçlar üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
      3. görüntü ihracat seçin png, dizin ve bir resim adını tıklayın
    7. İlgi Bölgeler miktarının belirlenmesi (YG)
      1. araç paletinde "ROI" aracı gidin. ROI yöntemi (daire, dikdörtgen, otomatik ya da serbest el) ve ROI sayısını seçin. ROI pencere görüntü penceresinde açılır gözlemleyin.
      2. Fareyi kullanarak, boyutunu ve konumunu ayarlamak. Otomatik ROI aracı kullanıldığı takdirde tüm görüntüler için aynı ROI eşikleri kullanın. YG boyutları ve konumları elle (örneğin, dairesel ROI) tanımlanmış olup olmadığını tüm görüntüler için aynı yerlerde kullanın.
      3. RO.I. yeni penceresi açılır gözlemleyin ölçmek "üzerine tıklayın. Sütunları özelleştir (örneğin, dosya adı, hayvan sayısı, grup, deney, alan, toplam sayım, ortalama sayısı, SD sayımı, min ve max sayar, alan, zaman nokta, sonda enjeksiyonu, vb) zamanı. özelleştirilmiş ayarları kaydedin. ne zaman yenidenady, bütün (Ctrl + A) seçin ve kopyalayıp bir elektronik tabloya tablo yapıştırın.
      4. yerinde ROI ile png görüntü olarak dışa aktarın. Kaydet ve görüntü dosyasını kapatın.
    8. sayısal gereken tüm resim dosyaları için - prosedürü tekrarlayın (3.1.7 3.1.6 adımlar). elektronik tabloya tüm ROI quantifications kopyalayın.
      NOT: Burada, sonuçları vb grubunda, zaman noktasında, sıralanabilir ve istatistiksel analiz edildi. istatistiksel analizler için ROI biyolüminesens sinyallerinin toplam sayılarını kullanın.
  2. Floresan nanopartiküllerin Near-Infrared (NIR) analizi
    1. Yazılımda kontrolleri kullanarak, görüntünün eşiğini ayarlayın.
      NOT: Bu nicel sonuç üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.
    2. Görme sinyalin özelliğini değerlendirmek için Ex / Em 675/720 ve Ex / Em 640/700 çekilen görüntüleri karşılaştırın.
    3. kantitatif analiz için Ex / Em 675/720 yakalanan görüntüleri kullanın (uyarma maksimum: 680 nm). Otomatik ROI aracı kullanılabileceği için İB'leri, tanımlayın. Otomatik ROI eşiğini ayarlamak ve tüm görüntüler için kullanabilirsiniz. ROI toplam radyant verimlilik ölçmek (adım 3.1).
  3. Proteaz duyarlı prob Near-Infrared (NIR) analizi
    1. Yazılım denetimlerini kullanma, görüntünün eşiğini ayarlayın.
      NOT: Bu nicel sonuç üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. otomatik floresans spektral Karışmama gerçekleştirin. Karışmama aracı Image Yaşayan uygulanmaktadır. Otomatik Karışmama otomatik floresan görüntü olarak özel ve 675/720 Ex / Em 640/700 kullanır.
    2. karışmamış görüntü seçin ve yukarıda açıklandığı gibi, ROI tanımlar. Nicel ve istatistiksel analizler için ROI toplam radyant verimlilik kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optik nörit Bioluminescence Zaman Kursu

inflamasyon prob biyoparlaklık sinyal göz çevresindeki en güçlü ve optik nevrit EAE farelerde sadece oluştu. Bir sinyal olmayan EAE fareler ne de inflamasyon probu ile enjekte olmayan farelerde ne oluştu. fareler kurtarıldı zaman sinyal kayboldu. Bu nedenle, bir sinyal, optik nevrit özgüdür, ve sinyal tepe Klinik EAE puanları tepe paraleldir. Şekil 1 EAE indüksiyon sonrası 10. günde ve 14 görüntülü SJL / J farelerinin iki örnek gösterilmektedir. biyolüminesans sinyal günde 10 en yüksek ve fareler kurtarmak için başladı kayboldu. Klinik puanlar zaman içerisinde biyolojik olarak ışık veren sinyal (örnek 1) ya da puanları önce (örnek 2) düşüş yok olduğunu eşleşti.


Şekil 1. Optik Nörit ve EAS-SJL / J Farelerde Klinik Puanlarının gün Dersin. Optik nörit biyolojik olarak ışık veren ve görüntüler aşılamadan sonra farklı zaman noktalarında, iki SJL / J farelerinde hastalığın 1. parlama iltihap prob (100 uL IP) enjeksiyonundan 10 dakika sonra ele geçirildi. biyolüminesans görüntüleri (sol panel) 10 ve 14 gün Aşıdan sonra yakalandı ve gökkuşağı Pseudocolor fotoğraf bindirmeleri olarak sunulmuştur. Lut çubukları kırmızı (yüksek-biyolüminesans) için mavi (düşük) arasında değişir. Ölçek çubuğu: 1 cm. sağ panel ROI bireysel toplam biyolüminesans sayımı çubuk grafikler gösterir ve klinik EAE puanları zamanlı kurslar (3 görüntülerin her ortalama ± SD). kırmızı oklar görüntüleme gün işaretleyin. Daha büyük bir ettik görmek için buraya tıklayınızBu rakamın rsion.

Tedavi Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Enflamasyon probu

Ilaç (R-flurbiprofen, 5 mg / kg / gün) 5 etkileri, Şekil 2'de gösterilmektedir. Her iki grupta da biyolüminesans görüntüleri Beş örnekler sunulmuştur. Araç ve tedavi grubundaki puanları heterojen, ama tüm farelerde, optik sinir iltihabı gösteren gözünde bioluminescent sinyal ilaç grubuna (Şekil 2A) daha düşüktü. ROI toplam bioluminescent sayısı ölçümü önemli tedavi etkinliği doğruladı (toplam bioluminescent sayımı kutu araziler ile, Şekil 2B, eşleşmemiş t-testi, p <0.05 2-kuyruklu). görüntüleme sonuçları terapötik etkisi ile anlaştıKlinik skorlar ve omurilikteki EAE histopatolojik bulguları ve optik sinir 5 bakımından ilaç s.

şekil 2
Şekil Bioluminescent Görüntüleme kullanma EAE-SJL / J Farelerde İlaçlar 2. Etkinliği. SJL / J fareleri, immünizasyondan 5 gün sonra aracın ya da ilaç (R-flurbiprofen, 5 mg / kg / gün) verildi. Görüntüler n = 10 grup başına, 1. EAE zirvesinde inflamasyon probu (100 uL ip) enjeksiyonu sonrasında ele geçirildi. EAE her iki grupta da 7/10 geliştirilmiştir ve EAE olmayan yanıt sinyali yoktu. Gökkuşağı Pseudocolor fotoğraf bindirmeleri olarak sunulmaktadır inflamasyon sondasının 100 uL ip enjeksiyonundan sonra 15 dakika - A) yaşayan farelerde Biyolüminesans görüntüleri 5 ele geçirdi. LUT çubukları kırmızı (yüksek yoğunluklu) için mavi (düşük) arasında değişir. Ölçek çubuğu: 1 cm. bireysel zirveROI toplam biyolojik olarak ışık veren sayısı ölçümü için kullanılmıştır. ROI kafasına sınırlı idi. PLP enjeksiyon siteleri siyah bezle korumalı bulundu. B) ROI toplam sayımların miktarının gösteren Kutu araziler. kutu hat medyan ve bıyıkları maksimum minimum göstermek, çeyrekler arası aralığını temsil eder. toplam sayım ilaç alan farelerde optik nevrit ve ensefalit bir azalma göstererek, gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı (2-taraflı eşleştirilmemiş t-testi, p <0.05) farklıydı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Pegylated floresan nanopartiküller

yakın kızılötesi nanopartiküllerin Epifloresans görüntüleri göz çevresi ve her iki tedavi Grou beyinde damar sızıntıları ortayaPS (Şekil 3A, 2 örnekleri). parçacıklar, boya BBB bütünlüğünün bir değerlendirme için izin biriken enflamasyon bölgelerinde haricinde ara boşluk kandan çok yavaş dağıtır. Sızıntı, 3 saat ve nanopartiküllerin enjekte 24 saat sonra açıktı ancak daha sonraki bir zaman noktasında daha fazla olmuştur. olmayan nanopartiküller (sağ panel) ile enjekte edilen EAE fareler veya farelerde herhangi bir özel sinyal oluştu. Bu nedenle, sinyal spesifikti. ROI radyant verimlilik (Şekil 3B) kantitatif analiz tedavi grupları (grup başına n = 3, eşleşmemiş 2 kuyruklu t-testi, p <0.05) arasında önemli farklılıklar ortaya koymamıştır.

Şekil 3,
Şekil 3. Pegile Floresan Nanopartiküller ile Kan Beyin Bariyeri bozulması değerlendirilmesi. SJL / J fareleri taşıt veya ilaç (R-flurbiprof aldıaşılamadan sonra 5 gün ila 5 mg / kg / d) En. Çıkan 3 saat ve yakın kızılötesi işaretlenmiş nanopartiküllerin enjekte edildikten sonra 24 saat (70 uL IV) 1 EAE zirve sırasında, grup başına n = 3 ele geçirildi. EAE olmayan yanıt sinyali olmadan idi. Otomatik ROI aracı radyant verimlilik ölçümü için kullanıldı. ROI kafasına sınırlı idi. PLP enjeksiyon siteleri korumalı bulundu. A) canlı farelerde örnekleri epifloresans Fotoğraflar, 3 saat ve nanopartiküllerin enjeksiyonundan 24 saat sonra ele. EAE olmayan veya nanopartiküllerin enjekte olmayan farelerde görüntüleri görüntü kontrol olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu: 1 cm. LUT çubukları koyu kırmızı (düşük), sarı (yüksek yoğunluklu) arasında değişmektedir. B) ROI radyant verimlilik ölçümü (gösteren Çubuk grafikler) ortalama ± SD. Tedavi grupları anlamlı (2-taraflı eşleştirilmemiş t-testi) farklı değildi. V için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew.

Matriks metalloproteinaz duyarlı prob

Otomatik floresan çıkartıldıktan sonra, proteaz ile aktifleştirilebilen MMP prob Çıkan beyin ve EAE farelerde omurilik (Şekil 4A, grup başına 4 fare örnekleri) inflamasyonu tespit edildi. Orada prob ile enjekte olmayan farelerde hiçbir sinyal oldu ve zayıf sinyal klinik belirtiler (non-cevaplayıcı) olmaksızın EAE fare meydana geldi. Şekil 4'te Görüntüler Ex / Em 675/720 görüntünün tarafından çıkarılır Ex / Em 640/700 de sinyal göstermiyor. Tedaviler arasındaki farklar sadece spektral Karışmama sonra otomatik ROI radyant verimlilik kantitatif analizinden sonra ortaya çıkarılmıştır (Şekil 4B, eşleştirilmemiş t-testi 2 kuyruklu, n 6 ve 4, p <0.05 =).

iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
Yakın kızılötesi MMP-duyarlı Görüntüleme Probe ile Metalloproteinaz Faaliyet Şekil 4. değerlendirilmesi. SJL / J fareleri, immünizasyondan 5 gün sonra aracın ya da ilaç (R-flurbiprofen, 5 mg / kg / gün) verildi. Çıkan sondanın enjeksiyonundan sonra 1 EAE zirvesinde (150 uL IV) 24 saat ele, N = 6 ve 4 PLP enjeksiyon bölgeleri korumalı edildi. MMP prob enjeksiyonu olmadan EAE yanıt vermeyenler ve fareler kontrol olarak kullanılmıştır. Her 2 resim Ex / Em 640/700 nm (spesifik sinyali) ve 675/720 nm (otomatik floresan) ele geçirildi. Spektral Karışmama aracını kullanarak, bir oto-floresan çıkarıldı ve daha sonra, otomatik YG cihazı, belirli MMP aktivitesinin mevkilerin belirlenmesi için kullanılmıştır. Toplam ışıma verimi ölçümü için kullanılmıştır. A) canlı farelerde örnekleri epifloresans görüntüler prob enjeksiyonundan 24 saat sonra ele. görüntüler spektral unmixing (Umx) sonucudur. Ölçek çubuğu: 1 cm. LUT çubuğusarı (yüksek yoğunluklu), koyu kırmızı (düşük) den s aralığı. B) ROI toplam radyant verimlilik ölçümü gösteren Kutu araziler. kutu hat medyan ve bıyıkları maksimum minimum göstermek, çeyrekler arası aralığını temsil eder. Yıldız işareti gruplar arasında anlamlı bir farklılık (2-taraflı eşleşmemiş t-testi, p <0.05) gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mevcut Video SJL / J farelerinde EAE in vivo görüntüleme biyolüminesans ve yakın kızılötesi floresan teknikleri göstermektedir. Biz bir enflamasyon duyarlı prob kullanılarak biyolüminesans görüntüleme esas optik nörit gösterir ve miktar EAE şiddetinin klinik değerlendirme ve ilaç etkileri ile uyumlu olduğunu göstermektedir. Sinyal omurga tarafından emilir Ancak, biyolüminesans görüntüleme yöntemi olasılıkla, EAE tezahürü 17 birincil site lomber spinal kord, iltihabı tespit etmek mümkün değildi.

yakın kızılötesi görüntüleme daha duyarlıdır, ancak biyoparlaklık oluşmaz otomatik floresan, yüksek müdahale pahasına. hızla değişen sinyal şiddetleri ile zaman serisi NIR tercih edilen bir yöntemdir yapar - (5 dk 2), BLI kıyasla - (2 s 1) NUR maruziyet süresi çok daha kısadır.

Kritik AdımlarProtokol ve Tekniğin Sınırlamalar

bağışıklama sitenin sinyalleri EAE spinal kord görüntüleme müdahale, ancak bu tavsiye enjeksiyon siteleri (boyun ve kuyruk tabanı) aşağı değildi kuyruk, dibinde hem de enjeksiyon siteleri bularak atlatılabilir. Bununla birlikte, siyah bir bez ile enjeksiyon yerlerini korumak için gereklidir.

kinetik hayvanlar arasındaki farklılık nedeniyle biyoparlaklık görüntüleme için, görüntülerin bir zaman serisi yakalamak için çok önemlidir. Kinetiği nedeniyle yanlılığı önlemek için, kontrol (ör araç veya vahşi tip) ve VERUM (örneğin, bir ilaç ya da transjenik) farelerin çiftlerinin görüntüleme avantajlıdır. Üreticiye göre, sinyal, 30 dakika boyunca sabit olmalıdır. 10 dakika ve 15 dakika bir önemli düşüş - Bununla birlikte, EAE olarak, 5 meydana gelen zirveleri ile, daha hızlı ve daha fazla geçici kinetiği görülmektedir.

yakın kızılötesi görüntüleme için, manufacturer Belirli bir prob için Ex / Em ayarı önerir. Bununla birlikte, ilk filtre seri testler için yararlı olduğunu ve her zaman sıkı rapor Ex / Em maxima neticesinde daha sonra spesifik olmayan sinyallerin spektral unmixing için kullanılabilecek, iki uyarma / emisyon kombinasyonlarında az çekim.

Işık ve floresan yüksek siyah kürk tarafından absorbe edilir, çünkü SJL / J gibi beyaz fareler, kullanmak önemlidir. Siyah fareler dikkatli kafasına traş ve görüntüleme önce bir gün geri gerekir. onlar inflamatuar noktalar olarak görünür ve beyin veya omurilik görüntüleme engel olacak çünkü deri lezyonları, kaçınılmalıdır. NIR görüntüleme için, üretici tüm fareler, hatta beyaz farelerin epilasyon önerir. Hatta tıraştan sonra, siyah farelerde baş ve sırt sonuçlar (gösterilmemiştir) beyaz farelere göre daha az ikna edici idi. C57BL6 farelerine primer progresif EAE modelinde, ticari olarak temin edilebilir, beyaz C57BL6 fare, bir alter olabiliryerli. (: - 1 en fazla 0.5 puan), bu farelerin bir albino genetik geçmişe sahip ve güvenilir EAE geliştirmek değil, çünkü Tüysüz, bağışıklığı SKH1 fareler, EAE yakın kızılötesi görüntüleme için yararlıdır, ama değil. Bu farelerde iltihaplanma probu kullanılarak biyoluminesen görüntüleme saç köklerinin kaybolur (gösterilmemiştir) deride enflamatuvar noktalar göstermiştir.

proteaz aktivitesinin NIR görüntüleme beyin ve omurilik iltihabı ortaya, ama sinyaller kantitatif analiz önce spektral unmixing gerektiren, otomatik floresan bindirilmiş bulundu. Bu nedenle, NIR görüntüleme biyoparlaklık görüntüleme daha az güçlü ve daha pahalı idi. Bununla birlikte, proteaz aktive edilebilir probların kullanımı özellikle matriks metalloproteinazları hedefleyen ilaçların değerlendirilmesi için de yararlı olabilir.

Avantajlar ve dezavantajlar

Farklı görüntüleme teknikleri ücretsizdir ve belirli soruları. Biolumin avantajlarıescent görüntüleme uygun fiyatta olan (yaklaşık 20 Euro / fare); sinyal müdahale eden otomatik biyoparlaklık, eksikliği; Yüksek derecede spesifik olmaları; uygun ip enjeksiyon ve görüntü analizi; ve sağlamlık ve güvenilirlik. Dezavantajları siyah kürk ve kemik ile pozlama süreleri ve sinyal emilimi uzun.

NUR Avantajları NIR etiketli sondalar, özel NIR etiketleme, kısa pozlama süresi ve yüksek hassasiyet kolaylığı geniş kullanılabilirliği vardır. (- 100 Euro / fare 50), kürk emme, otomatik floresan ile güçlü girişim ve analizden önce spektral unmixing ve görüntü işleme gerekliliği dezavantajları yüksek maliyetlerdir.

Sondaların bir kısmı, immün hücrelerin infiltrasyonu enflamasyon (örneğin, peroksidazlar ve metalloproteinazlar) bölgelerinde upregüle pro-enflamatuar enzimler tarafından aktive edilmektedir, çünkü, iltihap bölgelerinde tespit piyasada mevcuttur. Bu prob bazıları da CANCE algılartümörün mikro ya da tümörün kendisi tarafından enzimlerin salınımı (örn MMP) içine bağışıklık hücre infiltrasyonu gösteren rs. nedeniyle kılcal kaçak dokusunda birikir Sondalar BBB aksaklıkların tespit değil, aynı zamanda iltihap ve kanser diğer sitelerdeki olacaktır.

Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi

"Görüntüleme artı klinik yaralar" kombinasyonu üstün hastalık durumunun değerlendirilmesi ve ilaç etkilerinin tespiti için "sadece puanları". Göz çevresindeki biyoparlaklık sinyali de optik sinir 5 miyelin yıkımı ve immün hücre infiltrasyon gösteren önceki histopatolojik çalışmalar ile kabul eder. Yaklaşık MS hastalarının 2/3 optik nevrit atakları gelişebilir. Şimdiye kadar, difüzyon manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve op dışında fareler yaşayan optik nörit ölçmek için güvenilir, non-invaziv yöntemler vardırkortikal koherens tomografi teknik 18 talep ediyorlar (OKT). Ekim optik sinir 19 bir otoimmün tepki gösteren, EAE esnasında retina değişiklikleri, atrofi gösteren bir yöntem olarak EAE dâhil edilmiştir.

Derin anestezi gerektirdiğinden, bu metin içinde tarif edilen yönteme göre, OCT, fareler için daha yüksek bir stresördür. Okuma optik sinir 19 doğrudan görselleştirme değildir.

Floresan nanoparçacıkların yakın kızılötesi görüntüleme EAE ve MS başka işaretidir BBB, bozulması görselleştirmek için yararlı oldu. MR 20, 21 yanında, BBB bütünlük in vivo izlenmesi için hiçbir non-invaziv bir yöntem yoktur. Deneysel ilaçlar ve bitki-ilaç, özellikle bariyer 22 sıkarak hareket, çünkü bu, oldukça yararlı olacaktır 24 içine aşırı lenfosit işe engel p> 23. BBB ile lökosit eki veya Tenasüh önlenmesi ve leakiness azaltarak MS tedavisinde 25 ve nanoparçacık görüntülemede etkili bir strateji aday ilaçların etkinliğini değerlendirmek için yardımcı olabilir olduğunu. Şu ana kadar, parçacıklar pahalıdır. Intravital mikroskopi BBB bütünlüğünü 26 görselleştirmek için kullanılan bir tekniktir, ama normalde bu nedenle zaman ders analizleri önlenmesi, çünkü kraniyotominin (ketamin ve ksilazin ile örneğin) uzun ömürlü, derin anestezi gerektirir ve yeniden uyanan fareler izin vermiyor. Ancak, intravital mikroskopi in vivo görüntüleme ile elde değil hücre içi düzeyleri, hücresel yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.

Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi

Özet olarak, görüntüleme teMevcut bir video yardımı sunulan chniques hastalığın bireysel dersler değerlendirmek ve tek başına klinik skorları açıklanmayan parçası olduğumuzu ilaç etkilerini izlemek. teknikler Hayvan deneylerinde Değiştirme, Azaltma ve Rafinelik 3 "R" ilkeleri ile katılıyorum ve ilaç araştırmalarında araçları eklenti yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Bu araştırma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) ve araştırma fonu programı Hessen, Translasyonel Tıp ve Farmakoloji TMP Araştırma Merkezi Devlet "Landesoffensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) ve Else Kröner-Fresenius Vakfı tarafından desteklenen (EKFS), Araştırma Eğitim Grubu Translational Araştırma Yenilik - Pharma (AÇMA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
  3. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
  4. Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
  5. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
  6. Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
  7. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  8. Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
  9. Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
  10. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  11. Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
  12. Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
  13. Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
  14. Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
  15. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
  16. Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
  17. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  18. Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
  19. Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
  20. Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
  21. Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
  22. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
  23. Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
  24. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  25. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
  26. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS One. 7 (12), e50915 (2012).
  27. Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).

Tags

Tıp Sayı 121 otoimün ensefalomiyelit çoklu skleroz optik nevrit optik canlı görüntüleme biyoluminesans kızıl ötesi enflamasyon
Farelerde Multipl Skleroz EAE Modeli Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Biyoparlaklık ve Yakın-Kızılötesi Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter