Summary
Mostramos una técnica para la bioluminiscencia in vivo en vivo y en el infrarrojo cercano de formación de imágenes de la neuritis óptica y la encefalitis en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) para la esclerosis múltiple en ratones SJL / J.
Abstract
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones SJL / J es un modelo para la esclerosis múltiple recurrente-remitente (EMRR). puntuaciones de EAE clínicos que describen déficit de la función de motor son lecturas básicas de la inflamación inmune mediada de la médula espinal. Sin embargo, las puntuaciones y el peso corporal no permiten una evaluación in vivo de la inflamación del cerebro y la neuritis óptica. Este último es una manifestación temprana y frecuente en aproximadamente 2/3 de los pacientes con EM. Aquí, se muestra métodos para la bioluminiscencia y de formación de imágenes en vivo en el infrarrojo cercano para evaluar EAE evocado neuritis óptica, inflamación del cerebro, y alteración de la barrera hematoencefálica (BBB) en ratones vivos utilizando un sistema de imagen in vivo. Un sustrato bioluminiscente activado por oxidasas mostró principalmente la neuritis óptica. La señal era específico y permite la visualización de los efectos de la medicación y cursos de tiempo de la enfermedad, que en paralelo las puntuaciones clínicas. nanopartículas fluorescentes pegilada que permanecían dentro del vasculature durante largos períodos de tiempo se utilizaron para evaluar la integridad BBB. Infrarrojo cercano de imágenes revela una fuga de acreditación en el pico de la enfermedad. La señal fue el más fuerte alrededor de los ojos. Un sustrato de infrarrojo cercano para metaloproteinasas de la matriz se utilizó para evaluar la inflamación EAE-evocado. Auto-fluorescencia interfirió con la señal, lo que requiere desmezcla espectral para la cuantificación. En general, imágenes de bioluminiscencia era un método fiable para evaluar la neuritis óptica y la medicación efectos de EAE asociado y fue superior a las técnicas de infrarrojo cercano en términos de especificidad de la señal, robustez, facilidad de cuantificación, y el costo.
Protocol
1. EAE inducción en SJL / J Mice
- Ratones
- Utilice SJL ratones hembra de 11 semanas de edad / J y permitir que se habitúan a la sala de experimentación durante unos 7 días. Use n = 10 ratones por grupo.
- Para la evaluación de los efectos de la medicación, para administrar el fármaco y el placebo para el grupo control de forma continua a través del agua de bebida o a través de gránulos de comida a partir de 3 o 5 días después de la inmunización (n = 10 por grupo). Durante el pico de la enfermedad, administrar medicamentos o placebo con leche o 3% de copos de maíz remojadas en agua de azúcar.
- material de la inmunización
- Utilice un kit de la inducción de EAE que consiste en antígeno (péptido de la proteína proteolipídica, PLP139-151, 1 mg / ml de emulsión) en una emulsión con adyuvante completo de Freund (CFA, muertos por calor-Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) y 2 viales (5 mg cada uno) de la toxina pertussis liofilizado (PTX).
- Disolver la PTX (2 mg / ml) en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS; es decir, </ Em> añadir 1,5 ml de PBS a cada tubo PTX, mezclar bien, retirar con la misma punta de la pipeta, y añadir a 1 ml de PBS en un tubo de 50 ml); mezclar bien.
- Inmunización
- Inyectar PLP / CFA subcutáneamente en 2 porciones, cada 100 l, tanto en la base de la cola. No se inyecte en la parte posterior del cuello, porque las reacciones inmunes en la piel en la parte superior trasera del cuello o perturbarán la imagen de la cabeza y la médula espinal.
- Inyectar 100 l de PTX por vía intraperitoneal (ip), dos veces por ratón, la primera 1-2 h después de la inmunización y la segunda en 24 h.
- A los ratones de control, inyección de CFA sin PLP (2 porciones de 100 l), además de PTX sin PLP.
- Ratón manipulación después de la inmunización
- Pesar los ratones cada dos días hasta el día 7, y luego pesarlos todos los días.
NOTA: Los ratones pierden aproximadamente 1 - 2 g de peso corporal durante EAE. El descenso marca el inicio de la EAE. - Evaluar los síntomas clínicos diariamente desde el día 7 de acuerdoing de los sistemas de puntuación estándar (es decir, Puntuación 0: no hay cambios evidentes en las funciones motoras; puntuación de 0,5: parálisis distal de la cola; puntuación 1: parálisis completa de la cola; puntuación de 1,5: paresia leve de una o ambas patas traseras; puntuación 2: paresia grave de las patas traseras; puntuación de 2,5: parálisis completa de una pata trasera; puntuación 3: parálisis completa de ambas patas traseras; anotar. 3.5: parálisis completa de las patas traseras y la parálisis de una pierna delante eutanasia a los ratones con una puntuación de 3,5 o superior para > 12 h.
- Pesar los ratones cada dos días hasta el día 7, y luego pesarlos todos los días.
- Curso y el tiempo de formación de imágenes EAE
- Realizar la primera formación de imágenes en el inicio de la enfermedad, cuando los ratones alcanzan las puntuaciones> 1, lo que ocurrirá alrededor días 10 a 12 después de la inmunización.
- Realización de la segunda imagen en el pico, que se alcanzará 1 o 2 días después de los síntomas iniciales se desarrollan y tendrá una duración de 1 - 3 días.
NOTA: Posteriormente, los ratones se recuperará por completo dentro de los 7 a 10 días. Imaging durante los intervalos todavía puede mostrar fugas vasculares,pero los indicadores de inflamación debe ser negativo.
2. bioluminiscente y imágenes de infrarrojo cercano de la neuritis óptica y la inflamación cerebral
- Configuración del sistema de imagen
- Realizar imágenes in vivo con cualquier equipo que permite el análisis de bioluminiscencia y señales de infrarrojo cercano.
- Mantenga ratones bajo 2 - anestesia con isoflurano al 2,5% durante todos los procedimientos de formación de imágenes.
- La posición de uno o dos ratones uno junto al otro en el aparato utilizando los suministros de gas medias. Coloque la columna vertebral superior en el centro.
- Utilice dos ratones simultáneamente, una por grupo, para la evaluación de los efectos de la medicación para comparar pares. Esto es importante para bioluminiscente de imágenes.
- Proteger el sitio de la inmunización con un paño negro y tomar una imagen de la fotografía y la línea de base para evaluar el correcto posicionamiento del ratón / ratones. Utilice los botones B-foco con una distancia de 6,5 cm a la cámara para todas las imágenes.
- Inyección y de formación de imágenes de la sonda de la inflamación bioluminiscente
- Utilice la configuración del sistema en vivo de imágenes: Epi-BLI, Em filtro abierta, Ex bloque de filtro, fstop 1, se va a agrupar 8, se centran B = 6,5 cm, anuncio de exposición 120 s; tomar una imagen de referencia.
- Inyectar 100 ip l del reactivo quimioluminiscente listo para su uso (40 mg / ml). Mezclar bien antes de llenar la jeringa.
- Capturar imágenes de bioluminiscencia 5, 10 y 15 min después de la inyección. El curso temporal del pico bioluminiscente se diferencia entre los animales.
NOTA: El pico se producirá de 5 - 10 min después de la inyección; una disminución en 15 min indica que no se necesitan más imágenes. Utilizar pares de ratones de los grupos control y de tratamiento para eliminar sesgos menores debido a diferentes cursos de tiempo. - Rellene descripciones relevantes para el experimento. Observar un cuadro de diálogo pop-up de forma automática; que incluye información, tal como la cepa de ratón, el sexo, punto de tiempo, momento de la inyección de la sonda, grupo, etc. Guarde los archivos o en todocarpeta ne; tendrán etiquetas de tiempo y todas las descripciones.
- Inyección y obtención de imágenes de nanopartículas fluorescentes en el infrarrojo cercano para la acreditación integridad
- Utilizar imagen de epifluorescencia infrarrojo cercano en el B-enfoque (distancia: 6,5 cm). Los máximos de excitación / emisión de las nanopartículas fluorescentes pegilados son 675/690 nm. Capturar dos imágenes en diferentes longitudes de onda, en Ex640 / Em700 y Ex675 / Em720; utilizar un 2-s de la exposición, se va a agrupar 8, y fstop 2. Tomar una imagen de línea de base.
- Inyectar 70 l de nanopartículas fluorescentes infrarrojos pegilado iv a través de la vena de la cola e imaginar los ratones 3 hy 24 h después de la inyección utilizando la configuración anterior. Mezclar la solución bien antes de llenar la jeringa.
- Se inyecta cloruro de sodio al 0,9% en los ratones de control, que serán necesarios para evaluar la especificidad de la señal.
- Inyección y obtención de imágenes de la sonda fluorescente del infrarrojo cercano para la actividad de MMP
- Afeitarse o depilarse la cabeza yuregión de la columna vertebral pper con cautela un día antes de tomar la imagen de referencia. La piel no debe ser herido.
- Utilizar imagen de epifluorescencia infrarrojo cercano en el B-enfoque (distancia: 6,5 cm). Los máximos de excitación / emisión de la sonda activable MMP son 680/700 nm. Capturar dos imágenes en diferentes longitudes de onda, en Ex640 / Em700 y Ex675 / Em720; utilizar un 1-s de la exposición, se va a agrupar 8, y fstop 2. Tomar una imagen de línea de base.
- Añadir 200 l de 1x PBS al tubo 1,5 ml de la solución lista para usar (20 nmol / 1,5 ml en 1 x PBS) de manera que será suficiente para 10 ratones; mezclar bien antes de llenar la jeringa.
NOTA: El volumen suministrado no se tiene en cuenta que un poco de volumen se pierde durante el llenado de la jeringa y la inyección. - Inyectar 150 l de la sonda a través iv la vena de la cola 24 h antes de formación de imágenes. Inyectar PBS sólo en los animales de control para evaluar la especificidad de la señal.
- A las 24 h después de la inyección, tomar Epi-FL imágenes por lo menos en dos longitudes de onda, Ex640 / Em700 y Ex 675 / Em720, con la configuración explicada anteriormente (1-s exposición, el enfoque B, se va a agrupar 8, y fstop 2).
NOTA: El uso de dos longitudes de onda permite la desmezcla espectral restando la señal inespecífica.
3. Los análisis de imagen
- Análisis de bioluminiscencia (BLI)
- Haga doble clic en el software para abrirlo.
- En la barra de menú superior, haga clic en el icono del explorador de archivos, vaya al directorio de la carpeta del experimento, y seleccionarlo; esto abrirá todos los archivos en la carpeta en una tabla.
- Configurar las columnas que muestran las descripciones pertinentes al experimento.
- Para el control de calidad, haga doble clic en un archivo de un ratón no respondedor sin síntomas de EAE y / o un ratón ingenuo para comprobar la especificidad de las señales de EAE.
NOTA: No debe haber ninguna señal en los ratones no tratados previamente y mínima de la señal en los ratones que no respondieron.- Compruebe la imagen de la línea de base antes de la inyección de la proser para cada ratón como un control adicional de la especificidad de la señal; que debe ser negativo.
- Para seleccionar una imagen, haga doble clic en el primer archivo del primer ratón de EAE y comprobar la intensidad bioluminiscente (LUT gama de barras) y la localización. Compruebe todas las imágenes una por una. Cierre el archivo con la intensidad más baja para cada ratón (es decir, mantener 2 de cada 3 imágenes por cada ratón).
- Ajuste de la imagen y la exportación
- Haga doble clic en el primer archivo de ser cuantificados. Observar una nueva ventana emergente. En "Opciones" (menú superior), personalizar las etiquetas que se mostrarán en cada imagen.
- En la paleta de herramientas a la derecha, vaya a "Ajuste de imagen". Por defecto, las intensidades mínimas y máximas se establecen en "auto" y se muestran en pseudocolor arco iris. Seleccione "manual" para cambiar la configuración si es necesario.
NOTA: Por ejemplo, todas las imágenes exportadas pueden tener barras idénticas LUT (mínimos y máximos) idénticos que sean fácilmente comparables.El ajuste de los mínimos y máximos no tiene impacto en los resultados cuantitativos. - Haga clic en la exportación de imágenes, seleccione png, el directorio y un nombre de imagen
- La cuantificación de regiones de interés (ROI)
- Ir a la función "retorno de la inversión" en la paleta de herramientas. Seleccione el método de retorno de la inversión (círculo, rectangular, auto o manos libres) y el número de regiones de interés. Observe la ventana pop-up retorno de la inversión en la ventana de imagen.
- Con el ratón, ajustar el tamaño y la posición. Utilizar umbrales de ROI idénticos para todas las imágenes si se utiliza la herramienta de auto-retorno de la inversión. Utilice áreas idénticas para todas las imágenes si los tamaños y posiciones de ROI se definen de forma manual (por ejemplo, los ROI circulares).
- Haga clic en "medir RO.I. Observar una nueva ventana emergente. Personalizar las columnas (por ejemplo, nombre de archivo, el número de animales, grupo, experimento, área, los recuentos totales, recuentos promedio, los recuentos SD, mínimo y máximo que cuenta, área, tiempo punto, el tiempo de inyección de sonda, etc.). Guardar los ajustes personalizados. Cuando ready, seleccionar todo (Ctrl + A), y copiar y pegar la tabla en una hoja de cálculo.
- Exportar la imagen como un png con las regiones de interés en su lugar. Guarde y cierre el archivo de imagen.
- Repetir el procedimiento (pasos 3.1.6 - 3.1.7) para todos los archivos de imágenes que necesitan ser cuantificados. Copiar todas las cuantificaciones de ROI en la hoja de cálculo.
NOTA: En este caso, los resultados se pueden ordenar por grupo, punto en el tiempo, etc. y se analizaron estadísticamente. Utilice el recuento total de señales de bioluminiscencia en el rendimiento de la inversión para los análisis estadísticos.
- El análisis de infrarrojo cercano (NIR) de nanopartículas fluorescentes
- Uso de los controles en el software, ajustar el umbral de la imagen.
NOTA: Esto no tiene ningún impacto en el resultado cuantitativo. - comparar visualmente las imágenes captadas a Ex / Em 675/720 y Ex / Em 640/700 para evaluar la especificidad de la señal.
- Utilizar las imágenes captadas a Ex / Em 675/720 para el análisis cuantitativo (máximo de excitación: 680 nm). Definir regiones de interés, para lo cual se puede utilizar la herramienta de auto-retorno de la inversión. Ajuste del umbral de auto-retorno de la inversión y utilizarlo para todas las imágenes. Cuantificar la eficiencia total radiante en regiones de interés (véase el paso 3.1).
- Uso de los controles en el software, ajustar el umbral de la imagen.
- El análisis de infrarrojo cercano (NIR) de la sonda sensible a la proteasa
- El uso de controles de software, ajustar el umbral de la imagen.
NOTA: Esto no tiene ningún impacto en el resultado cuantitativo. Realizar desmezcla espectral de la autofluorescencia. La herramienta de desmezcla se implementa en imagen viva. La auto-desmezcla utiliza el Ex / Em 640/700 como el específico y 675/720 como la imagen de auto-fluorescente. - Seleccione la imagen sin mezclar y definir las regiones de interés, como se describió anteriormente. Utilice la eficiencia total radiante en regiones de interés para los análisis cuantitativos y estadísticos.
- El uso de controles de software, ajustar el umbral de la imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lapso de tiempo de bioluminiscencia de la neuritis óptica
La señal de bioluminiscencia de la sonda era el más fuerte inflamación alrededor de los ojos y se produjo exclusivamente en ratones con EAE con neuritis óptica. Una señal se produjo ni en los ratones no EAE ni los ratones no inyectados con la sonda de la inflamación. La señal desapareció cuando los ratones se recuperó. Por lo tanto, la señal es específica para la neuritis óptica, y el pico de la señal es paralelo a la cima de las puntuaciones de EAE clínicos. La Figura 1 muestra dos ejemplos de ratones SJL / J proyectado en días 10 y 14 después de la inducción de EAE. La señal bioluminiscente fue el más alto en el día 10 y desapareció cuando los ratones comenzaron a recuperarse. Los cursos de tiempo de las puntuaciones clínicas acertaron la desaparición de la señal bioluminiscente (ejemplo-1) o precedidas (ejemplo 2) la disminución de las puntuaciones.
Figura 1. Tiempo de golf de la neuritis óptica y Resultados clínicos en ratones EAS-SJL / J. Imágenes bioluminiscentes de neuritis óptica se capturaron 10 min después de la inyección de la sonda de la inflamación (100 ip l) durante la 1 st llamarada de la enfermedad en / J ratones SJL dos en diferentes puntos temporales después de la inmunización. Las imágenes bioluminiscentes (panel izquierdo) se capturaron 10 y 14 días después de la inmunización y se presentan como superposiciones de fotografía arco iris pseudocolor. bares Lut van desde el azul (baja) a rojo (alto bioluminiscencia). Barra de escala: 1 cm. El panel derecho muestra una barra gráfica de los conteos totales de bioluminiscencia individuales en regiones de interés (media ± desviación estándar de 3 imágenes cada uno) y la evolución temporal de las puntuaciones de EAE clínicos. Las flechas rojas marcan los días de formación de imágenes. Haga clic aquí para ver una mayor cincorsión de esta figura.
Evaluación de la eficacia del tratamiento
La inflamación de la sonda
Los efectos de la medicación (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d) 5 se muestran en la Figura 2. Se presentan cinco ejemplos de las imágenes bioluminiscentes en cada grupo. Las puntuaciones en el grupo de vehículo y el tratamiento fueron heterogéneos, pero en todos los ratones, la señal bioluminiscente en el ojo que muestra la inflamación en el nervio óptico fue menor en el grupo de medicación (Figura 2A). La cuantificación de los recuentos totales bioluminiscentes en regiones de interés confirmó significativa la eficacia del tratamiento (Figura 2B, con los diagramas de caja de los recuentos totales bioluminiscentes, t-test, p <0,05 no pareado de 2 colas). Los resultados de las imágenes de acuerdo con el efecto terapéuticos de la medicación en función de las puntuaciones clínicas y manifestaciones histopatológicas de la EAE en la médula espinal y del nervio óptico 5.
Figura 2. eficacia de los fármacos en ratones EAE-SJL / J Uso bioluminiscente de imágenes. ratones SJL / J recibieron vehículo o medicamento (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d) desde el día 5 después de la inmunización. Las imágenes fueron capturadas después de la inyección de la sonda de la inflamación (100 l ip) en el pico 1 st EAE, n = 10 por grupo. EAE desarrolla en 7/10 en ambos grupos, y EAE no respondedores fueron sin señal. A) Imágenes de bioluminiscencia en ratones vivos Captured 5 - 15 min después de la inyección ip de 100 l de la sonda de la inflamación se presentan como superposiciones de fotografía arco iris pseudocolor. bares LUT van desde el azul (baja) a rojo (alta intensidad). Barra de escala: 1 cm. El pico individualde los recuentos totales bioluminiscentes en regiones de interés se utilizó para la cuantificación. ROI se restringieron a la cabeza. Los sitios de inyección del PLP se protegieron con un paño negro. B) Los diagramas de caja que muestran la cuantificación de los recuentos totales en regiones de interés. El cuadro representa el rango intercuartil, la línea es la mediana, y los bigotes muestran el mínimo hasta el máximo. Los recuentos totales difirieron significativamente entre los grupos (prueba t no pareada 2 caras, P <0,05), mostrando una reducción de la neuritis óptica y la encefalitis en ratones que recibieron la medicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nanopartículas fluorescentes pegilado
imágenes de epifluorescencia de las nanopartículas en el infrarrojo cercano revelaron fugas vasculares alrededor de los ojos y en el cerebro, tanto en el tratamiento groups (Figura 3A, 2 ejemplos). Las partículas se distribuyen muy lentamente de la sangre en el espacio intersticial, a excepción de los sitios de inflamación, en el que el tinte se acumula, lo que permite una evaluación de la acreditación integridad. La fuga fue evidente a las 3 h y 24 h después de la inyección de las nanopartículas, pero era más fuerte en el punto de tiempo más tarde. No había ninguna señal específica en ratones no EAE o ratones no inyectados con nanopartículas (panel derecho). Por lo tanto, la señal era específica. El análisis cuantitativo de la eficiencia radiante en regiones de interés (Figura 3B) no reveló diferencias significativas entre los grupos de tratamiento (n = 3 por grupo, no pareado de 2 colas t-test, p <0,05).
Figura 3. Evaluación de la barrera hematoencefálica interrupción con pegilado fluorescente nanopartículas. SJL / J ratones recibieron vehículo o medicamento (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) desde el día 5 después de la inmunización. Las imágenes fueron capturadas 3 h y 24 h después de la inyección de nanopartículas-infrarrojo cercano marcado (70 l iv) durante el pico primero EAE, n = 3 por grupo. EAE no respondedores fueron sin señal. La herramienta de auto-ROI se utilizó para la cuantificación de la eficiencia radiante. Las regiones de interés se limita a la cabeza. Los sitios de inyección de PLP se protegieron. A) Imágenes de epifluorescencia ejemplares de ratones vivos, capturados 3 hy 24 h después de la inyección de nanopartículas. Imágenes de ratones sin EAE o sin la inyección de nanopartículas se utilizaron como controles de imagen. Barra de escala: 1 cm. bares LUT van de color rojo oscuro (baja) a amarillo (alta intensidad). B) Los gráficos de barras que muestran la cuantificación de la eficiencia radiante en regiones de interés (media ± DE). Los grupos de tratamiento no difirieron significativamente (prueba t no pareada 2 caras). Por favor, haga clic aquí para v IEW una versión más grande de esta figura.
Metaloproteinasa de la matriz sensible sonda
Después de restar la auto-fluorescencia, las imágenes de la sonda de MMP proteasa activable revelaron la inflamación en el cerebro y la médula espinal en ratones EAE (Figura 4A, ejemplos de 4 ratones por grupo). No había señal en ratones no inyectados con la sonda, y una señal débil se produjo en un ratón EAE sin síntomas clínicos (no respondedores). Imágenes en la figura 4 se muestra la señal en Ex / Em 640/700 restado por la imagen en Ex / Em 675/720. Las diferencias entre los tratamientos fueron revelados sólo después del análisis cuantitativo de la eficiencia radiante en auto-ROI después de desmezcla espectral (Figura 4B, la prueba t no pareada de 2 colas, n = 6 y 4, P <0,05).
iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
Figura 4. Evaluación de la actividad de las metaloproteinasas con sonda de imagen MMP-sensible infrarrojo cercano. ratones SJL / J recibieron vehículo o medicamento (R-flurbiprofeno 5 mg / kg / d) desde el día 5 después de la inmunización. Las imágenes fueron capturadas 24 h después de la inyección de la sonda (150 l iv) en la primera pico EAE, n = 6 y 4. Los sitios de inyección de PLP se protegieron. EAE no respondedores y los ratones sin inyecciones de sonda de MMP se utilizaron como controles. Cada 2 imágenes fueron capturadas en Ex / Em 640/700 nm (señal específica) y 675/720 nm (autofluorescencia). Con la herramienta de desmezcla espectral, la auto-fluorescencia se restó y, posteriormente, se utilizó la herramienta de auto-ROI para identificar los sitios de la actividad MMP específica. La eficiencia radiante total se utiliza para la cuantificación. A) imágenes de epifluorescencia ejemplar en ratones vivos capturados 24 h después de la inyección de la sonda. Las imágenes son el resultado de desmezcla espectral (UMX). Barra de escala: 1 cm. barra de LUTs gama de color rojo oscuro (baja) a amarillo (alta intensidad). B) Los diagramas de caja que muestra la cuantificación de la eficiencia total radiante en el rendimiento de la inversión. El cuadro representa el rango intercuartil, la línea es la mediana, y los bigotes muestran el mínimo hasta el máximo. El asterisco indica una diferencia significativa entre los grupos (prueba t no pareada 2 caras, P <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La presente video muestra técnicas para la bioluminiscencia y fluorescencia en el infrarrojo cercano de imágenes in vivo de la EAE en ratones SJL / J. Se demuestra que la formación de imágenes de bioluminiscencia utilizando una sonda inflamación sensible muestra principalmente neuritis óptica, y la cuantificación de acuerdo con la evaluación clínica de la gravedad de EAE y los efectos de la medicación. Sin embargo, el método de formación de imágenes de bioluminiscencia no fue capaz de detectar la inflamación de la médula espinal lumbar, que es un sitio principal de EAE manifestación 17, probablemente porque la señal es absorbida por la columna vertebral.
La formación de imágenes en el infrarrojo cercano es más sensible, pero a expensas de alta interferencia con auto-fluorescencia, lo que no ocurre con bioluminiscencia. El tiempo de exposición de NIR es mucho más corto (1 - 2 s) en comparación con BLI (2 - 5 min), lo que hace NIR el método preferido para la serie de tiempo con que cambian rápidamente la intensidad de señal.
Los pasos críticos conen el Protocolo y limitaciones de la técnica
Las señales del sitio de inmunización interfieren con la formación de imágenes de la médula espinal en EAE, pero esto puede eludirse mediante la localización de los dos sitios de inyección en la base de la cola, que no era inferior a los lugares de inyección recomendados (cuello y la base de la cola). Sin embargo, es necesario para proteger los sitios de inyección con un paño negro.
Para imágenes de bioluminiscencia, es crucial para capturar una serie temporal de imágenes, debido a la cinética difieren entre los animales. Para evitar sesgos provocados por la cinética, la imagen de pares de control (por ejemplo, un vehículo o de tipo salvaje) y el verum (por ejemplo, drogas o transgénicos) ratones es ventajosa. Según el fabricante, la señal debe ser estable durante 30 minutos. Sin embargo, en la EAE, se observó una cinética más rápida y más transitorios, con picos que se producen en 5 a 10 min y una disminución sustancial en 15 min.
Para imágenes de infrarrojo cercano, el manufacturer recomienda el ajuste Ex / Em para una sonda específica. Sin embargo, era útil para ejecutar una serie de filtros inicialmente y para capturar imágenes siempre por lo menos en dos combinaciones de excitación / emisión, que se corresponde fielmente con el reportado máximos Ex / Em y luego puede usarse para desmezcla espectral de señales inespecíficas.
Es importante la utilización de ratones blancos, como SJL / J, porque la luz y fluorescencia son muy absorbidos por la piel negro. ratones negros tienen que ser afeitado con cautela en la cabeza y volver un día antes de exponer. Las lesiones cutáneas deben ser evitados, ya que aparecen como manchas inflamatorias e interferir con la formación de imágenes del cerebro o la médula espinal. Para imágenes NIR, el fabricante recomienda la depilación de todos los ratones, incluso los ratones blancos. Incluso después del afeitado, la cabeza y la espalda resultados en ratones negros eran menos convincentes que con ratones blancos (no se muestra). Para el modelo de EAE primaria-progresiva en ratones C57BL6, los ratones C57BL6 blancos, que están disponibles comercialmente, pueden ser una alternativo. , ratones inmunocompetentes SKH1 sin pelo son útiles para la formación de imágenes en el infrarrojo cercano, pero no EAE, debido a que estos ratones tienen una base genética albinos y no se desarrollan de forma fiable la EAE (puntuación máxima: 0,5 - 1). bioluminiscente de imágenes utilizando la sonda de la inflamación en estos ratones reveló varios puntos inflamatorios en la piel (no mostrado) donde se pierden los folículos pilosos.
NIR de formación de imágenes de la actividad de la proteasa reveló cerebro y la inflamación de la médula espinal, pero las señales se superponen por auto-fluorescencia, lo que requiere desmezcla espectral antes del análisis cuantitativo. Por lo tanto, las imágenes NIR era menos robusto que imágenes de bioluminiscencia y era más caro. Sin embargo, el uso de sondas activables de la proteasa puede ser útil para la evaluación de fármacos que se dirigen específicamente metaloproteinasas de la matriz.
Ventajas y desventajas
Las diferentes técnicas de imagen son complementarias y abordar cuestiones específicas. Las ventajas de Bioluminescent imágenes son asequibles (alrededor de 20 euros / ratón); una falta de auto-bioluminiscencia, que pudiera interferir con la señal; alta especificidad; conveniente inyección ip y análisis de imágenes; y la robustez y fiabilidad. Las desventajas son largos tiempos de exposición y la absorción de la señal por negro de piel y hueso.
Ventajas de NIR son la disponibilidad más amplia de sondas marcadas con NIR, facilidad de encargo etiquetado NIR, tiempo de exposición corto, y alta sensibilidad. Las desventajas son los altos costos (50 - 100 euros / ratón), absorción por la piel, la fuerte interferencia con autofluorescencia, y la necesidad de desmezcla espectral y procesamiento de imágenes antes del análisis.
Un número de sondas están disponibles que detectan los sitios de inflamación, ya que son activados por enzimas pro-inflamatorias que están regulados al alza en los sitios de inflamación (por ejemplo, peroxidasas o las metaloproteinasas) debido a la infiltración de células inmunes. Algunas de estas sondas también detectará cadors demuestran infiltración de células inmunes en el microambiente tumoral o la liberación de enzimas por el propio tumor (por ejemplo, MMP). Las sondas que se acumulan en el tejido debido a la fuga capilar detectarán perturbaciones en la BBB, pero también en otros sitios de la inflamación y el cáncer.
Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes
La combinación de "proyección de imagen, más llagas clínicos" fue superior a "sólo" las puntuaciones para la evaluación del estado de la enfermedad y la detección de los efectos del medicamento. La señal de bioluminiscencia alrededor de los ojos también está de acuerdo con estudios histopatológicos previos que muestran la destrucción de la mielina y los infiltrados de células inmunes en el nervio óptico 5. Aproximadamente 2/3 de los pacientes con EM desarrollan episodios de neuritis óptica. Hasta el momento, no existen métodos fiables y no invasivas para cuantificar la neuritis óptica en ratones, excepto la resonancia magnética de difusión (MRI) y op vivirtica tomografía de coherencia (OCT), que son técnicamente exigente 18. Octubre se ha introducido en EAE como un método que muestra cambios en la retina y la atrofia durante EAE, lo que sugiere una reacción autoinmune en el nervio óptico 19.
En comparación con el método descrito en este manuscrito, OCT es un factor de estrés mayor para los ratones, ya que requiere anestesia profunda. La lectura no es una visualización directa del nervio óptico 19.
imágenes de infrarrojo cercano de nanopartículas fluorescentes era útil para visualizar la ruptura de la BBB, que es otra característica de la EAE y MS. Además de MRI 20, 21, no hay ningún método no invasivo para el seguimiento in vivo de BBB integridad. Esto sería muy útil, ya que los fármacos experimentales y fito-medicamentos actúan específicamente apretando la barrera 22, 23, que normalmente impide el reclutamiento de linfocitos excesiva en el SNC 24. Prevención del acoplamiento de leucocitos o la transmigración a través de la acreditación y reduciendo su permeabilidad es una estrategia eficaz en el tratamiento de la EM 25, y las imágenes de nanopartículas puede ayudar a evaluar la eficacia de los fármacos candidatos. Hasta el momento, las partículas son caros. La microscopía intravital es otra técnica que se utiliza para visualizar la integridad BBB 26, pero normalmente requiere anestesia de larga duración, profundidad (por ejemplo, con ketamina y xilazina) a causa de la craneotomía y no permite re-despertar de los ratones, por lo tanto, la prevención de los análisis de evolución en el tiempo. Sin embargo, la microscopía intravital proporciona imágenes de alta resolución en el celular a niveles subcelulares, que no es alcanzable con imágenes in vivo.
Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar la técnica
En resumen, la formación de imágenes techniques presentados en el presente video de ayuda para evaluar los cursos individuales de la enfermedad y controlar los efectos de la medicación, que eran en parte no revelada por las puntuaciones clínicas solos. Las técnicas están de acuerdo con los principios 3 "R" de reemplazo, reducción y refinamiento en experimentos con animales y son útiles herramientas adicionales en la investigación de fármacos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) y el programa de financiación de la investigación "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) del Estado de Hessen, Centro de Investigación de Medicina Traslacional y Farmacología TMP y el Else Fundación Kröner-Fresenius (EKFS), Grupo de Investigación de Formación de Investigación traslacional Innovación - Pharma (TRIP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AngioSpark-680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10149 | Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity |
| MMP-sense 680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10126 | Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation |
| XenoLight RediJect Inflammation Probe | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | 760535 | Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation |
| PLP139-151/CFA emulsion | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| Pertussis Toxin | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| IVIS Lumina Spectrum | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | Bioluminescence and Infrared Imaging System | |
| LivingImage 4.5 software | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | CLS136334 | IVIS analysis software |
| Isoflurane | Abbott Labs, Illinois, USA | 26675-46-7 | Anaesthetic |
References
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
- Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
- Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
- Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
- Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
- Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
- Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
- Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
- Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
- Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
- Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
- Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
- Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
- Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
- Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
- Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
- Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
- Andresen, V., et al.
- Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).
