Summary
وتمثل الثقافات شريحة هيبوكامبال أورجانوتيبيك (أوهسك) في المختبر نموذجي الذي يحاكي الوضع في فيفو جيد جداً. هنا نحن تصف المستندة إلى فيبرتوم تحسن تشريح البروتوكول للحصول على شرائح ذات جودة عالية للاستخدام في تقييم إمكانات محصن من مواد جديدة أو السلوك البيولوجي للخلايا السرطانية.
Abstract
في الثقافات شريحة هيبوكامبال أورجانوتيبيك (أوهسك) والخصائص المورفولوجية والوظيفية لكل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية حفظت جيدا. هذا النموذج مناسبة لمعالجة المسائل البحثية المختلفة التي تشمل الدراسات المتعلقة نيوروبروتيكشن، التجارب الكهربية في الخلايا العصبية، الشبكات العصبية أو غزو الورم. هندسة هيبوكامبال ونشاط الخلايا العصبية في الدوائر مولتيسينابتيك بخير المصانة في أوهسك، حتى ولو إجراء تشريح نفسه في البداية الآفات ويؤدي إلى تشكيل ندبة الدبقية. تشكيل ندبة يغير يفترض أن الخصائص الميكانيكية والسلوك انتشارية من الجزيئات الصغيرة، إلخ. شرائح تسمح برصد العمليات يتوقف الوقت بعد إصابة في الدماغ دون جراحة الحيوان، والدراسات المتعلقة بالتفاعلات بين مختلف أنواع الخلايا المستمدة من الدماغ، إلا وهي أستروسيتيس و microglia والخلايا العصبية تحت الفسيولوجية والمرضية على حد سواء شروط. جانبا متناقضة في هذا النموذج هو عدم وجود تدفق الدم وخلايا الدم المناعية. أثناء تطور الإصابة العصبية، تهاجر الخلايا المناعية من الدم تلعب دوراً هاما. كما تلك الخلايا مفقودة في شرائح، يمكن ملاحظة عمليات المتأصلة في الثقافة دون تدخل خارجي. وعلاوة على ذلك، أن تكوين البيئة الخارجية المتوسطة يتم التحكم التحديد في أوهسك. وثمة ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو انخفاض عدد الحيوانات يضحي بالمقارنة مع الإعداد القياسية. يمكن الحصول على أوهسك عدة من الحيوان واحدة مما يجعل الدراسات المتزامنة مع علاجات متعددة في الحيوان واحد ممكن. لهذه الأسباب، أوهسك مناسبة تماما لتحليل تأثيرات العلاجات الوقائية الجديدة بعد تلف الأنسجة أو أثناء غزو الورم.
بروتوكول قدم هنا وصف أسلوب إعداد من أوهسك التي تتيح توليد استنساخه بدرجة عالية، وكذلك الحفاظ على الشرائح التي يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من البحوث التجريبية، مثل دراسات غزو نيوروبروتيكشن أو الورم.
Introduction
أوهسك نموذجا جيدا تتسم في المختبر دراسة الخصائص الفسيولوجية والمرضية على حد سواء من الخلايا العصبية وأستروسيتيس وميكروجليا1. من السهل التحكم في بيئة خارج الخلية، ورصد التغيرات الخلوية والمورفولوجية بعد المحفزات المختلفة. منظمة هيبوكامبال الخلايا العصبية وصلاتهم يتم الحفاظ عليها جيدا بعد إعداد2،3. من مزايا عدة، السماح أوهسك برصد غزو الإصابات وورم الدماغ دون جراحة الحيوان. يمكن الحصول على أوهسك ستة إلى ثمانية من دماغ القوارض وحيدة. أوهسك وبالتالي يساعد على خفض عدد الحيوانات إلى حد كبير والسماح باختبار عدة تركيزات المخدرات أو التلاعبات الجينية أو نماذج مختلفة من الآفة في الحيوان نفسه. في فحوصات المستندة إلى شريحة، يمكن التحكم الظروف التجريبية بدقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة رصد التنمية يتوقف الوقت للحالات المرضية مثل الأضرار الثانوية قبل الوقت الفاصل بين التصوير.
في بروتوكول معين، أنشأته أصلاً ستوبيني et al. 4خطوات التحضير موصوفة وهي أبرز معالم مورفولوجية هامة لاختيار الشرائح المناسبة. نوصي بإعداد الفئران بعد الولادة يوم 7-9 أو الفئران بعد الولادة يوم 4-5. في هذه الفترات، وإظهار أوهسك بمقاومة قوية للصدمات الميكانيكية وقدرة عالية على إعادة تنظيم الدوائر العصبية. وفي المقابل، الاستعدادات من الفئران الجنينية أو الكبار سرعة تغيير بنيتها وتفقد مورفولوجيا أورجانوتيبيك بهم أثناء زراعة وبالتالي فهي أقل ملاءمة لدراسة العمليات الطويلة الأجل في البحوث الأساسية5،6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11-آخر نقطة حرجة لأن معدل البقاء على قيد الحياة من أوهسك هو سمك الشريحة نفسها كما نشر وهكذا إمدادات المواد الغذائية المحدودة12،،من1314.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت تجارب على الحيوانات وفقا لسياسة الأخلاقيات والسياسة المتعلقة "استخدام الحيوانات" في "أبحاث علم الأعصاب" كما وافقت بالمجتمعات المحلية مجلس التوجيه 2010/63/الأوروبي في البرلمان الأوروبي و مجلس الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي-
1-إعداد أدوات ووسائط الثقافة
- لإعداد أوهسك استخدام المجموعة من الأدوات التالية: اثنين مقص صغير، ملاقط منحنى اثنين، واحد الملاقط مع تلميح جيد، ثلاث شفرات (اثنين من الحجم 11، واحدة من حجم 15)، ثلاثة أصحاب المبضع، جولة تصفية ورقات (القطر: 35 ملم)، أجار، وشفرة حلاقة واحدة، واحدة معدلة ماصة باستور، وتعديل أحد ماصة باستور دون تلميح. تعقيم كل المواد في اﻷوتوكﻻف قبل الاستخدام ( الشكل 1).
- تزن 5 ز أجار وتذوب في 100 مل مقطر من الماء. أن الحل لمدة 20 دقيقة في 121.7 درجة مئوية في الجيش الشعبي الكوري 210.8 في اﻷوتوكﻻف تعقيم. توزيع الحل 3 مل أجار السائل في أطباق بتري 60 ملم باستخدام ماصة زجاجية معقمة، تسمح بترسيخ ح 5، وتغطي مع الفيلم البارافين البلاستيك لتفادي التلوث وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. كتل أجار ضرورية لاستقرار العقول أثناء إجراء تشريح.
- وسائل الإعلام
- جعل 200 مل من إعداد متوسطة (pH 7.35) تتألف مل 198 الوسيلة الأساسية الحد الأدنى (MEM) و 2 مل حل لام الجلوتامين (تركيز نهائي 2 مم). إعداد الحل اليوم لإعداد وسائل الإعلام وتخزينها في 4 ° C. إعداد
- 100 مل المتوسط الثقافة تتألف من 49 مل MEM، 25 مل هانكس ' متوازن حلول الملح (هبس)، ومصل الحصان العادي 25 مل (v/v) (NHS)، 1 مل حل لام الجلوتامين (التركيز النهائي 2 مم)، 100 ميكروغرام الأنسولين، الجلوكوز 120 ملغ، 10 ملغ ستربتوميسين ، 10,000 يو البنسلين، و 800 مكغ فيتامين (ج) وكما ذكرت سابقا. الحارة المتوسطة (37 درجة مئوية)، وقم بضبط قيمة pH الأس الهيدروجيني 7.4 والعقيمة عامل تصفية (0.2 ميكرون حجم المسام). كرر الإجراء (الاحماء، ضبط الأس الهيدروجيني، إلخ.) كل يوم الثاني قبل تغيير المتوسطة. استخدام المتوسط على الأكثر لمدة أسبوع واحد عند تخزينها في 4 ° C.
- ملء طبق بتري 35 ملم واحد مع إعداد متوسطة لتخزين الدماغ. ضع اثنين فارغة لجمع الأنسجة على حزمة تبريد في منطقة عمل أطباق بيتري.
2. إعداد والتقطيع مع فيبرتوم
- استخدام العقول من الفئران يوم 7-9 القديمة أو يوم 4-5 الفئران القديمة لإعداد أوهسك وفقا ستوبيني et al. 4 بعد قطع الرأس للحيوانات، إزالة الجلد من الجمجمة مع المقص. إدخال شفرة مقص غرامة ماغنوم ثقبة
- وفتح الجمجمة بالقطع على طول المحور (الجبهة) والذيلية روسترال (مرة أخرى). جعل اثنين تخفيضات عمودي إلى أول واحد، حيث أن المقص نقطة نحو الإذن اليمنى واليسرى، على التوالي (" تي-شق ")-
- فتح الجمجمة بعناية مع الملقط غرامة، اهتماما لا لإصابة في الدماغ. استخدام مشرط (حجم شفرة 11) لقص الجزء الأكثر روسترال من القطب أمامي والمخيخ-
- عن طريق ملعقة، إزالة الدماغ ووضعها بعناية في صحن بتري مليئة بإعداد متوسطة ( الشكل 2). ضع الدماغ على صاحب العينة وإصلاحه مع الغراء cyanoacrylate الطبية. استخدم قطعة أجار لضمان استقرار الميكانيكية-
- تشريح الأنسجة أفقياً في 350 ميكرون سميكة أوهسك استخدام انزلاق فيبرتوم.
- تقييم شرائح بصريا باستخدام مجهر. تجاهل أوهسك ذات نوعية منخفضة فورا. من المهم أن تتخذ فقط من تلك الشرائح مع سليمة سيتوارتشيتيكتوري المعزولة من الجزء الأوسط من الحصين (انظر الأرقام 3 و 4) بين الظهرية والحصين البطني.
- فصل منطقة هيبوكامبال وقشرة انتورهينال استخدام مشرط (جولة بليد حجم 15؛ الشكل 3). يجب الحفاظ على قشرة المسار وانتورهينال بيرفورانت-
- أوهسك بين ستة وثمانية تم الحصول عليها من كل الدماغ. نقل الشرائح 2-3 في خلية واحدة على إدراج الثقافة (المسام حجم 0.4 ميكرومتر) ووضعه في بئر واحدة من طبق الثقافة 6-البئر الذي يحتوي على 1 مل الثقافة المتوسطة الواحدة وكذلك-
- احتضان الأطباق 6-جيدا في 35 درجة مئوية في جو هوميديفيد تماما مع 5% (v/v) CO 2 وتغيير مستنبت الخلية كل يوم الثاني-
ملاحظة: إجراء تجارب الخاص بك في يوم 6 في المختبر (div). ردود الفعل الالتهابية المرتبطة بإجراء تشريح تختفي يوم 6. في هذه المرحلة، وتظهر خلايا microglial مورفولوجيا متشعب مرة أخرى وقد نضجت باتصالات متشابك.
3. تقييم "نوعية الأنسجة"
- التثبيت، وضع العلامات والتصور من الخلايا العصبية تردي في أوهسك
- بعد إجراء التجارب، احتضان أوهسك مع يوديد propidium ميكروغرام/مل 5 (PI) ح 2 قبل التثبيت، في ترتيب وصمة عار في نويات الخلايا العصبية تردي.
تنبيه: PI مادة مسرطنة مشتبه فيها، دائماً ارتداء معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) مثل القفازات. - أغسل أوهسك مع المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (درجة الحموضة 7.4) وإصلاحها مع حل 4% (v/v) بارافورمالدهيد (PFA) ل 24 h.
تنبيه: منهاج عمل بيجين مادة مسرطنة سامة والمشتبه فيهم. تعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية- - أغسل أوهسك في إدراج مع 1 مل برنامج تلفزيوني واستخدام فرشاة عامل تركيب أجهزة لفصل شرائح من الغشاء.
- تسمية أوهسك بصبغة 4 IB في صفيحة 24-جيدا ( الشكل 5).
- بعد إجراء التجارب، احتضان أوهسك مع يوديد propidium ميكروغرام/مل 5 (PI) ح 2 قبل التثبيت، في ترتيب وصمة عار في نويات الخلايا العصبية تردي.
- التوصيل لتجارب غزو الورم فلوريسسينتلي باستخدام تسمية الخلايا المفردة
- 24 ساعة قبل البدء التجربة، قم بتسمية الخلايا السرطانية باستخدام سوكسينيميديل اسيتات كاربوكسيفلوريسسين صبغة الفلورسنت إستر (كفدا SE).
- فصل وعدد الخلايا السرطانية باستخدام دائرة نويباور.
- ريسوسبيند الخلايا في المتوسط، مثل أن 10 ميليلتر من تعليق يحتوي على عدد الخلايا المطلوب (الخلايا عادة 50,000 أو 100,000).
- تطبيق 10 ميليلتر من تعليق خلية على ثقافة شريحة وتسمح للخلايا بغزو لمدة 3 أيام-
- في نهاية التجربة، إصلاح الثقافات شريحة باستخدام 4% (v/v) منهاج عمل بيجين ح 24، وتسمية الثقافات المشتركة مع بي لآخر 24 ساعة لتصور سيتوارتشيتيكتوري-
تنبيه: منهاج عمل بيجين مادة مسرطنة سامة والمشتبه فيهم. تعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية- - جبل ثقافات المشارك على زلة غطاء لمزيد من التحليل باستخدام وسائل الإعلام المتزايدة.
4. تقييم "تجارب أوهسك"
تحليل في أوهسك مع ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (كلسم). للمسمى كشف PI، تتحول الخلايا العصبية أو بي المسمى سيتوارتشيتيكتوري استخدام الضوء أحادي اللون للطول الموجي λ = 543 نانومتر وعصابة انبعاثات تمرير عامل التصفية للأطوال الموجية λ = 585-615 نانومتر. لوصفت كفدا الخلايا السرطانية أو IB 4 microglia، استخدم إثارة الطول موجي λ = 488 نانومتر. لكلا النوعين التجريبية، سجل z-مكدس مع 2 ميكرومتر سميكة الشرائح الضوئية والمستخدمة لتقييم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الدراسات نيوروبروتيكتيون: لتحديد الأضرار العصبية، وعدد الأنوية PI الإيجابية و IB4 إيجابية كان يعول microglia في كل القسم الثالث الضوئية من طبقة الخلايا الحبيبية (جكل) المغزلي المسنن (DG). لإجراء التجارب على غزو الورم، استخدمت الشدة القصوى z-الإسقاط من المكدس لحساب المساحة المشمولة بالخلايا السرطانية، كتدبير للغزو، وتصور أنماط مختلفة من الغزو (الشكل 6).
في عنصر التحكم غير المعالجة أوهسك (CTL)، ظلت الخلايا العصبية يتم الحفاظ عليها جيدا. ولوحظت في جكل من المدير العام تقريبا لا بي إيجابية الخلايا العصبية نوى (الشكل 5A). في طبقة الجزيئية، كانت تتفرع غالبية خلايا microglial. في جكل من المديرية العامة، فقط تم اكتشاف عدد قليل جداً IB4 خلايا microglial الإيجابية (الشكل 5A). بعد الحضانة مع 50 ميكرومتر N-الميثيل-د-الأسبارتيك حمض (نمدا) قوية زيادة في عدد نويات الخلايا العصبية الإيجابية PI (الشكل 5B) وتم اكتشاف IB4 خلايا microglial الإيجابية (الشكل 5B) بالمقارنة مع التحكم أوهسك. يمكن تحديد أرقام أعلى من microglia أميبية وخلايا بي إيجابية في المديرية العامة (الشكل 5) تحت ظروف التحكم أوهسك التالفة قبل أقل جودة. علاج الشرائح التالفة مسبقاً مع نمدا أدى إلى تدمير سيتوارتشيتيكتوري المديرية العامة وعدد مرتفع جداً من الخلايا الموت إيجابية PI ينتشر إلى هيلوم ومنطقة CA3 (الشكل 5).
الدراسات غزو الورم: شرائح تعامل مع الخلايا 50,000 الخطين الخلية جليوبلاستوما U138 (الشكل 6A) و LN229 (الشكل 6B) لمدة ثلاثة أيام. في كلتا الحالتين سيتوارتشيتيكتوري الثقافات شريحة بقيت سليمة وتم الحفاظ على أمونيس قرن والمدير العام. وعلاوة على ذلك، كل خلية خطوط أظهر السلوك غزو متميزة. في حين شكلت خلايا U138 الجولة، اختلافاً واضحا والأورام (الشكل 6A)، خلايا LN229 بنيت شبكة ورم داخل ورم واحد الماغنيسيوم وكثيراً ما يصعب التمييز بين. عند النظر في مقدار كتلة الورم في الثقافات شريحة، عثر اختزاع أعلى للخلايا LN229 عند مقارنتها مع الخلايا U138.
رقم 1: أدوات تشريح والمواد- لإعداد شريحة الثقافات، مجموعة مناسبة من أدوات التشريح والمواد المطلوبة كما هو موضح. المجموعة تضم ثلاثة المشارط بريش صغيرة قابلة للصرف، ملعقة واحدة، مقص غرامة اثنين، الملقط ثلاثة، ماصة باستور عادي واحد، ماصة باستور واحد دون تلميح، أجار، أطباق بتري، ورق الترشيح، حزمة التبريد والمتوسطة إعداد، والطبية cyanoacrylate الغراء. يجب أن يعقم قبل استخدام أدوات التشريح ووضعها في حزمة بلاستيك لإبقائه في جو معقم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مكان تكوين هيبوكامبال في المخ الفئران. تشكيل هيبوكامبال، سيظهر بخط منقط أسود بنية ثنائية محاطة بقشرة الدماغ والمهاد. تضخمات الحصين في القرن الأفريقي الزمانية البطين الجانبي. الحصين بيلامينار، تتألف من أمونيس قرن (الحصين السليم) والمسنن المغزلي (أو لفافة المسنن)، مع أحد الصفيحة طوى داخل أخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تصور الفئران أوهسك. هو تصور شريحة الدماغ كاملة تحتوي على أوهسك مجهر لتقييم نوعية الأنسجة. يتم الاحتفاظ بالشرائح في طبق بتري مليئة بإعداد تبريد متوسطة (أ، ب). تكبير شريحة الدماغ. الحصين سليمة (المفوض السامي) وقشرة entorhinal مرئية على اليسار والجانب الأيمن للصورة (ج). يتم فصل أوهسك عن بقية المخ. طبقة الخلايا الحبيبية (جكل) المدير العام، الفروع أممونيس قرن CA1 و CA3، منطقة نقير (مرحبا)، قشرة انتورهينال (المفوضية الأوروبية) وطبقة الجزيئية (ML) بوضوح مميزة (د). ج، د: شريط المقياس = 4 مم.
الشكل 4: يعتمد تغييرات في وقت أوهسك.
مباشرة بعد الإعداد، تبدأ ميكروجليا وأستروسيتيس لتشكيل ندبة الدبقية. ويلاحظ من 1-3 أيام في المختبر (div) الدباق وذمة تشكيل. التقسيم الطبقي لتشكيل هيبوكامبال والمديرية العامة لم تعد مرئية. على المستوى الخلوي، عرض أوهسك في الدرجة 5 تخفيضاً في عدد الخلايا المنشط. في الدرجة 6، تقريبا أي ذمة غير موجود والشريحة أرق، وقد نجا من المناطق التي شملتها في الدوائر العصبية الذاتية. يمكن الآن استخدام أوهسك للتجارب. مقياس بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تقييم لنوعية الأنسجة التي كلسم. كما كشفت عنها كلسم، لوحظ الحفاظ على الخلايا العصبية جيدة في عنصر التحكم غير ليسيونيد أوهسك (CTL). تقريبا لا بي إيجابية الخلايا العصبية نوى (أحمر) وبضعة IB4 microglial إيجابية الخلايا فقط (الأخضر) موجودة في طبقة الخلايا الحبيبية (جكل) المدير العام (أ). على النقيض من أوهسك غير ليسيونيد، زيادة كبيرة في عدد الخلايا إيجابية4 PI و IB مرئياً في جكل من نمدا ليسيونيد أوهسك (ب). يرجى ملاحظة مورفولوجية المدير العام، خلايا microglial المنشط وعدد كبير من الأنوية PI الإيجابية في أوهسك قبل التالفة (ج، د). أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: التصور لغزو الورم كلسم. تطبيق PI (باللون الأحمر) بعد التسميات التثبيت سيتوارتشيتيكتوري أوهسك، بينما كفدا (باللون الأخضر) ويوضح ورم الخلايا الغازية الشريحة. هو تصور عملية غزو الخلايا U138 بعد ثلاثة أيام وقت الغزو. ورم واحد الماغنيسيوميتم تمييزها الواضح (A). وفي المقابل، شكلت خط الخلية جليوبلاستوما LN229 شبكة ورم (ب). أشرطة = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول إعداد أوهسك. هذا النموذج يسمح لاختبار القدرات الذاتية وردود الفعل من أنسجة المخ بعد تطبيق المحفزات الفسيولوجية والمرضية. بالإضافة إلى تحليلات لمعلمات الكهربية، يمكن أن يكون أوهسك ليسيونيد ويمكن تحديد آثار الضرر في جميع أنواع الخلايا. من الممكن للعلاج بالمواد المختلفة ووصف مفصل للعمليات ليسيونينج أو الشفاء في غياب الضامة، والخلايا الليمفاوية.
The most خطوات حاسمة للنجاح في إعداد وتثقيف هي: 1) العمل تحت ظروف معقمة، 2) تعد وسائل الإعلام بشكل صحيح، النظر في درجة الحرارة ودرجة الحموضة، و 3) تطوير المهارة اليدوية اللازمة أثناء التعامل مع أوهسك.
الصفات المميزة أوهسك
بسبب مورفولوجيا غير معدلة من الخلايا العصبية وعلى في فيفو--مثل منظمة، تسمى الشرائح أورجانوتيبيك. أوهسك تتكون من الطبقة الحبيبية pyramidale، والطبقة، تتألف من أمونيس قرن الهرمية (CA1, CA2, CA3) والخلايا الحبيبية المديرية العامة. أجزاء من الحصين الغاية ورودها، وإنهاء الإسقاطات الزبائ الألياف في طبقات متميزة بطريقة غير متداخلة. افيرينسيس بين انتورهينال اللحاء (الطريق بيرفورانت)، المدير العام، CA3 و CA1 الخلايا العصبية تظل على حالها بعد الإعداد وتتصرف وظيفيا مشابهة لتلك في فيفو. سيظهر كما سبق، تنمية الأشجار الجذعية، المشبك أنشطة الشبكة وتشكيل الخلايا الحبيبية في أوهسك قابلة للمقارنة لشرائح الحادة التي تم الحصول عليها من وقت مطابقة عناصر التحكم14،،من1516.
وقد درست oligodendrocytes وأستروسيتيس في أوهسك بالضوء والمجهر الإلكتروني. عرض oligodendrocytes توزيع المكاني أورجانوتيبيك، بما في ذلك مختلف أنواع فرعية المورفولوجية17،18. أيضا، أصبح محاور عصبية myelinated خلال الأسبوعين الماضيين الأولى في المختبر. افترض بعض الباحثين أن الترجمة طبقة محددة من أستروسيتيس غائبة في الثقافات شريحة، ونعتقد أن أستروسيتيس لا تصل إلى من نضج كامل في المختبر. هذا الجانب لا يمكن تماما الإجابة، حيث لا تزال مفقودة علامات محددة لجميع خطوات التنشيط من أستروسيتيس1،،من1920.
في أول 3 أيام بعد الإعداد، الاستجابة مع الهجرة وانتشار خلايا microglial وتتراكم على سطح الشريحة حيث أنها تشكل ندبة الدبقية جنبا إلى جنب مع أستروسيتيس. تبدو كافة الخلايا في حالة تنشيط عاليا. ومع ذلك، تغيير خلايا microglial في الطبقات الداخلية من أوهسك وبين الدرجة 3 و 6، على مورفولوجيا أميبية نحو نموذج متشعب، تتميز بالأجهزة الخلوية الصغيرة ونتوءات هيولى غرامة التفريع طويلة تمتد في جميع الاتجاهات21 ،22.
أبلغ تعبير مماثلة وتوزيع مستقبلات الغلوتامات في أنسجة البالغين و2،أوهسك23. تواتر التيارات متشابك والتيارات متشابك مصغرة وتواتر جابايرجيك التيارات في أوهسك (div 7 و 14 و 21) لا تختلف اختلافاً كبيرا مقارنة بالأعمال التحضيرية الحاد في الأيام التالية للولادة 14 أو 15 على التوالي. وفي المقابل، تواتر الإشارات جلوتاماتيرجيك أعلى في أوهسك من شرائح الحادة15.
مقارنة بين أساليب إعداد مختلفة
إعداد الأنسجة الجنينية وفي وقت مبكر بعد الولادة من السهل جداً، بسبب معدلات البقاء على قيد الحياة خلية جيدة في المختبر. فينبغي أن يعتبر أن الخلايا العصبية في هذه المرحلة المبكرة، لا تزال الهجرة والنشطة مما يؤدي إلى فقدان المنظمة أورجانوتيبيك لشرائح1. بعد 7-9 أيام بعد الولادة، يتم إنشاء بعض اتصالات متشابك في الفئران. خلال التالي 2-3 أسابيع في المختبر ناضجة نهايات13. واحدة من مزايا هذا النموذج المقدم هو مقاومته للصدمات الميكانيكية أثناء الإعداد واللدونه عالية سبب سن ال14،،من1الحيوانات (7-9 أيام)24. تجدر الإشارة إلى أن الشرائح حساسة للغاية للتلاعب الميكانيكية بالصكوك. قد يسبب حتى زاوية خاطئة لتقطيع القطع انحدر من ألياف الخلايا العصبية المسؤولة عن أنتيروجرادي أو زوال العصبية إلى الوراء. إعداد الثقافات شريحة من الحيوانات الكبار لأغراض طويلة الأجل صعبة ولا تزال غير ثابتة. إظهار هذه أوهسك انحطاط ضخمة بعد وقت قصير من إعداد يفترض أن سبب فقدان اللدونة1. ومع ذلك، هناك قوي بحاجة لطريقة إعداد يسمح للعمل مع شرائح الكبار.
لأساليب إعداد عدة، هو شرائح الأنسجة قصت طازجة لسمك 300-400 ميكرون، استخدام مروحية أنسجة لقص الحصين معزولة. وكثيراً ما يؤدي هذا الأسلوب السريع تلف الأنسجة على نطاق واسع. هي عوامل حاسمة لنوعية أوهسك سمكها النهائي والوقت الذي يتم الاحتفاظ بها في المختبر. لقد تحققت نتائج أفضل مع أعلى معدلات البقاء على قيد الحياة عن 300-400 ميكرون شرائح سميكة. شرائح أكثر سمكا تتحول الطبقات العليا زمن الثقافة بسبب نشر القيود1. وتستخدم أوهسك اعتماداً على الأسئلة العلمية، مباشرة بعد إعداد أو بعد عدة أيام في الثقافة. ولذلك، على مر السنين العديد من تقنيات زراعة أنشئت، مثل أنابيب الرول الأسلوب1،13 أو شريحة ثابتة تقنيات4.
الخروج من أساليب إعداد مختلفة نحن مقتنعون بأن استخدام تقنية واجهة جنبا إلى جنب مع فيبرتوم هو الإجراء الأكثر دقة والأقل ضررا لإعداد أوهسك بتاريخ. مواصلة تحسين هذا الأسلوب باستخدام الأغشية المسامية. أوهسك الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد والبقاء متماسكاً شكلياً ووظيفيا لمدة أشهر، ويمكن تقييم بصريا أثناء فترة زراعة25.
تطبيقات
يمكن إعداد أوهسك من نوع البرية والحيوانات المحورة وراثيا14،26. البقاء على قيد الحياة لمدة أشهر، وتوفير خيارات للتجارب الطويلة الأجل12،13. وتستخدم أوهسك لمعالجة المسائل الفيزيولوجية والدوائية والمورفولوجية والتنموية14،27 تحت درجة عالية قياسيةايزد شروط مثل تطبيق المزمن من نيوروثيرابيوتيكس أو الخلايا الجذعية العلاج26،،من2728. التحقيق في الجوانب الإنمائية لاتصال الخلايا العصبية أو العمليات المتصلة بانتقال متشابك، اللدونة متشابك، آثار الصرع المزمن من الأشواك الجذعية الخلايا الهرمية، أو تمثل الخلايا كافة حقول إضافية 2930،،،من3132.
غلوتامات والابتدائي العصبي ضادات مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك دور مركزي في اكسسيتوتوكسيسيتي. تحدث الآفات اكسسيتوتوكسيك خلال الأمراض العصبية مثل السكتة الدماغية، ومرض الزهايمر المرض، وفيروس نقص المناعة البشرية العصبية وإصابات الدماغ الرضية وإصلاح آليات14،24. تطبيق يضع مستقبلات الجلوتامات NMDA، وحمض α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic (امبا)، أو حمض كينك أوهسك يقلد انتقائية ومنطقة محددة من الخلايا العصبية وفاة26،28،33 ،34. وعلاوة على ذلك، كانت استجابة الخلايا الدبقية بإصابة الخلايا العصبية مثلاًوالهجرة microglial والبلعمه في أوهسك سابقا تم تحليلها3،35. يمكن التنبؤ بتأثير microglia خلال الآفة قبل استنفاد الدوائية لهذه الخلايا كلودروناتي bisphosphonate36.
تطبيق هام كذلك تنشأ محاكاة ظروف في فيفو للتحقيقات لغزو الورم باستخدام أوهسك. الماغنيسيوم شكلتها خطوط الخلايا الدبقي كانت قادرة على غزو ثقافات شريحة، ظاهرة كانت الأنواع المتداخلة37. يشبه نمط تسلل منتشر من خطوط الخلايا التي تستخدم النمط الملاحظ في فيفو37. وباﻹضافة إلى ذلك، الماغنيسيوم جليوبلاستوما الابتدائي مزروع في أوهسك أبقى غزوهم المحتملة والخلايا الجذعية حرف على مدى عدة أيام في المختبر38. وهكذا، يسمح النموذج رصد أنماط الغزو والتفاعلات بين الخلايا العصبية الأنسجة والخلايا السرطانية التي تتوافق مع تلك التي لوحظت في فيفو37،38. بالمقارنة مع الكولاجين أو هلام استناداً إلى نماذج (مثلاً)39، استخدام أوهسك يبدو أكثر فائدة لتحليلات بشأن غزو خبيث وورم في الدماغ. الوسط الفيزيولوجية، بما في ذلك أنواع الخلايا الدبقية والخلايا العصبية، والمصفوفة خارج الخلية، لا تزال سليمة.
وعلاوة على ذلك، تسمح أوهسك دراسة التفاعلات المباشرة بين الخلايا السرطانية واحد وأنسجة المخ تحت ظروف خاضعة للرقابة. على سبيل المثال، تم العثور على خلايا microglial تعزيز قدرات الخلايا السرطانية لدخول الدماغ بتشكيل هياكل التوجيهية لغزو35.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل أثر التعديلات الخلوية عابرة والدائمة في عمليات غزو. تعبير مستقر جين سرطان القولون ورم خبيث المرتبطة 1 (MACC1) في الخلايا الدبقي كان مرتبطاً مع زيادة انتشار واجتياح40. تغيير صلابة الخلايا في خطوط الخلايا جليوبلاستوما عابرة كانت مرتبطة ارتباطاً مباشرا مع خصائص خطوط الخلية41الغازية. وبالتالي احتمال أن تستخدم أوهسك وورم الخلايا الثقافات المشارك لاختبار، الاستنساخ من الملاحظات السريرية، وغزو الورم النموذجي والصورة تحت ظروف درجة عالية من التحكم وموحدة للمخدرات.
بعد دراسات في الثقافات الخلية الأولية، أوهسك هي الخيار المنطقي التالي لإجراء تجارب في نظام أكثر تعقيداً لتقريب الظروف في فيفو . حقل آخر للاهتمام بشرائح الدماغ هو فحص العقاقير العلاجية المحتملة قبل إجراء الاختبار في فيفو. شرائح الدماغ تسمح للرصد، ومحاكاة للإصابات تحت مراقبة المراقب ودون جراحة الحيوان. ويمكن الحصول على ما يصل إلى 8 أوهسك وهو خفض عدد الحيوانات اللازمة إلى حد كبير. فمن الممكن الحصول على نتائج في نفس الحيوان تحت ظروف مشابهة ولكن مختلفة أو شروط متعددة. وهكذا، أوهسك أداة قوية لمراقبة التغيرات المورفولوجية والخلوية والجزيئية بين أمور أخرى أثناء فترة الآفة والتنمية الضرر الثانوي وينتشر الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر أستي كريستين تأييدها مع تسجيل الفيديو وغضبان شليد لمساعدته التقنية الممتازة. وأيد جرابيك Urszula فكز البرنامج رو 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H.
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
