Summary
Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.
Abstract
In colture hippocampal fetta organotipiche (OHSC), le caratteristiche morfologiche e funzionali di neuroni e cellule gliali sono ben conservate. Questo modello è adatto per affrontare questioni di ricerca diversi che coinvolgono studi sulla neuroprotezione, esperimenti elettrofisiologici sui neuroni, reti neuronali o l'invasione del tumore. L'architettura hippocampal e attività neuronale nei circuiti multisinaptici sono ben conservati in OHSC, anche se la stessa procedura per affettare inizialmente lesioni e conduce alla formazione di una cicatrice gliale. La formazione della cicatrice presumibilmente altera le proprietà meccaniche e comportamento diffusivo di piccole molecole, ecc. Fette di consentono il monitoraggio dei processi dipendenti tempo dopo il trauma cranico senza chirurgia animale e gli studi sulle interazioni tra vari tipi di cellule di cervello-derivato, vale a dire gli astrociti, microglia e neuroni sotto sia fisiologiche che patologiche condizioni. Un aspetto ambivalente di questo modello è l'assenza di flusso di sangue e le cellule immunitarie del sangue. Durante la progressione della lesione di un neurone, migrazione di cellule immuni dai giochi un ruolo importante di sangue. Come quelle cellule mancano in fette, i processi intrinseci nella cultura possono essere osservati senza interferenze esterne. Inoltre, in OHSC la composizione dell'ambiente medio-esterno è controllata con precisione. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è il più basso numero di animali sacrificati rispetto alle preparazioni standard. OHSC diversi possono essere ottenuti da un animale, rendendo possibile la simultanei studi con trattamenti multipli in un animale. Per questi motivi, OHSC sono ben si adatta per analizzare gli effetti di nuove terapie protettive dopo danno tissutale o durante l'invasione del tumore.
Il protocollo presentato qui descrive un metodo di preparazione di OHSC che permette di generare altamente riproducibili, ben conservato fette che possono essere utilizzati per una varietà di ricerca sperimentale, come studi di invasione del tumore o di neuroprotezione.
Introduction
OHSC sono un modello ben caratterizzati in vitro per studiare proprietà fisiologica e patologica di neuroni, astrociti e microglia1. È facile controllare l'ambiente extracellulare e monitorare i cambiamenti morfologici e cellulari dopo vari stimoli. L'organizzazione dei neuroni ippocampali e le loro connessioni sono ben conservati dopo preparazione2,3. Fuori parecchi vantaggi, OHSC consentire il monitoraggio dell'invasione del tumore e lesioni di cervello senza chirurgia degli animali. Sei-otto OHSC ottenibile da un singolo cervello del roditore. OHSC consentono pertanto significativamente ridurre il numero di animali e test più concentrazioni nella droga, manipolazioni genetiche o modelli differenti della lesione dello stesso animale. Nelle analisi basate su fetta, condizioni sperimentali possono essere controllate con precisione. Inoltre, può essere facilmente monitorato lo sviluppo dipendente dal tempo di condizioni patologiche come danni secondari da formazione immagine di time-lapse.
Nel protocollo specificato, originariamente costituito da Stoppini et al. 4, le operazioni di preparazione sono descritte e importanti punti di riferimento morfologici per la selezione delle fette appropriati vengono evidenziati. Si consiglia la preparazione postnatale giorno 7-9 ratti o topi postnatale giorno 4-5. In questi periodi, OHSC mostrano una robusta resistenza a traumi meccanici e un elevato potenziale di riorganizzazione dei circuiti neuronali. Al contrario, preparati dai ratti embrionali o adulti rapidamente cambiare la loro struttura e perdono la loro morfologia organotipiche durante la coltivazione e quindi sono meno adatti per lo studio dei processi a lungo termine in ricerca di base5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. un altro punto critico per il tasso di sopravvivenza di OHSC è lo spessore della fetta stessa, come la diffusione e quindi l'apporto nutritivo sono limitata12,13,14.
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Protocol
gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo criteri di etica e la politica di uso di animali nella ricerca in neuroscienza, come approvato dall'europeo comunità Consiglio direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio dell'Unione europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.
1. preparazione degli strumenti e mezzi di coltura
- per la preparazione di OHSC utilizzare il seguente set di strumenti: due piccole forbici, due Pinzette curve, una pinzetta con punta sottile, tre lame (due di dimensioni 11, uno di dimensioni 15), tre titolari di bisturi, tondo di carta da filtro (diametro: 35 mm), agar, una lama di rasoio, uno non modificato pipetta Pasteur, e uno per volta pipetta Pasteur senza un suggerimento. Sterilizzare tutti i materiali in autoclave prima dell'uso ( Figura 1).
- Pesare 5 g di agar e dissolverlo in 100 mL di acqua distillata. Sterilizzare la soluzione per 20 min a 121,7 ° C a 210,8 kPa in autoclave. Distribuire la soluzione di liquido agar 3 mL in piastre di Petri 60-mm utilizzando una pipetta di vetro sterile, lasciarlo solidificare per 5 h, coprire con la pellicola di plastica paraffina per evitare contaminazione e conservare a 4 ° C fino al successivo utilizzo. Blocchi di agar sono necessari per stabilizzare il cervello durante la procedura d'affettatura.
- Media
- fare 200 mL di terreno preparazione (pH 7,35) costituito da 198 mL di terreno minimo essenziale (MEM) e 2 mL di soluzione di L-Glutammina (concentrazione finale di 2 mM). Preparare la soluzione il giorno della preparazione media e conservarla a 4 ° C.
- Preparare 100 mL di terreno di coltura costituito da 49 mL MEM, 25ml Hanks ' equilibrato soluzioni saline (HBSS), 25 mL (v/v) di siero di cavallo normale (NHS), 1 mL di soluzione di L-Glutammina (concentrazione finale di 2 mM), 100 µ g insulina, glucosio 120 mg, streptomicina 10 mg , 10.000 U penicillina e 800 µ g di vitamina C come riportato in precedenza. Riscaldare il mezzo (37 ° C), regolare il valore di pH al filtro pH 7,4 e sterile (dimensione dei pori di 0,2 µm). Ripetere la procedura (riscaldamento, regolazione del pH, ecc.) ogni secondo giorno prima di cambiare il mezzo. Utilizzare il mezzo al massimo per una settimana se conservato a 4 ° C.
- Riempire una scatola di Petri 35 mm con preparazione mezzo per memorizzare il cervello. Posizionare due capsule di Petri vuota per raccogliere il tessuto su un pacchetto di raffreddamento nell'area di lavoro.
2. Preparazione e affettare con un vibratomo
- uso cervelli dai ratti di 7-9 ° giorno vecchio o 4-5 gg vecchi topi per la preparazione di OHSC secondo Stoppini et al. 4 dopo la decapitazione di animali, togliere la pelle dal cranio con le forbici.
- Introdurre la lama di una forbice bene il foro occipitale e aprire il cranio di taglio lungo l'asse (anteriore) (posteriore) rostrale caudale. Fare due tagli perpendicolari ad esso, cosicché le forbici puntino verso l'orecchio sinistro e destro, rispettivamente (" T-incisione ").
- Apre il cranio accuratamente con una pinzetta, facendo attenzione di non danneggiare il cervello. Utilizzare un bisturi (dimensione lama 11) per tagliare la parte più rostrale del palo frontale e il cervelletto.
- Per mezzo di una spatola, rimuovere il cervello e inserirlo con cautela di Petri riempito con il mezzo di preparazione ( Figura 2). Posizionare il cervello sul portacampioni e fissarlo con colla del cianoacrilato medico. Utilizzare i pezzi di agar per assicurare la stabilizzazione meccanica.
- Sezionare il tessuto orizzontalmente a 350 µm spessore OHSC utilizzando una scorrevole vibratome.
- Valutare le fette otticamente utilizzando un microscopio binoculare. Scartare immediatamente OHSC di bassa qualità. È importante prendere solo quelli fette con intatto cytoarchitecture isolato dalla parte centrale dell'ippocampo (Vedi figure 3 e 4) tra la dorsale e l'ippocampo ventrale.
- Separare la regione ippocampale e nella corteccia di entorhinal usando un bisturi (tondo lama taglia 15; Figura 3). Deve essere preservata la corteccia di pathway ed entorinale perforant.
- Sei-otto OHSC sono ottenuti da ogni cervello. 2-3 fette di trasferimento nell'inserto di cultura di una cella (poro taglia 0,4 µm) e posizionarlo in un pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti contenenti 1 mL di coltura per pozzetto.
- Incubare i piatti 6 pozzetti a 35 ° C in atmosfera umidificata completamente con 5% (v/v) di CO 2 e modificare il terreno di coltura cellulare ogni secondo giorno.
Nota: Il tuo esperimenti al giorno 6 in vitro (div). Reazioni infiammatorie associate alla procedura per affettare scompaiono di giorno 6. In questa fase, le cellule microgliali mostrano una morfologia ramificata nuovamente e connessioni sinaptiche hanno fatto maturare.
3. Valutazione della qualita ' del tessuto
- fissazione, etichettatura e visualizzazione di degenerazione neuroni in OHSC
- dopo aver eseguito gli esperimenti, incubare la OHSC con ioduro di propidio (PI) di 5 µ g/mL per 2 h prima della fissazione, in ordine a macchiare i nuclei dei neuroni in degenerazione.
Attenzione: PI è un sospetto cancerogeno, indossare sempre dispositivi di protezione individuale (PPE) ad esempio guanti. - Lavare il OHSC con 0.1 M tampone fosfato (pH 7,4) e fissarle con una soluzione al 4% (v/v) di paraformaldeide (PFA) per 24 h.
Attenzione: PFA è un tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa e indossare PPE. - Lavare il OHSC in inserti con 1 mL di PBS e utilizzare un pennello rigger per separare le fette dalla membrana.
- Etichetta OHSC con IB 4 colorante in una piastra a 24 pozzetti ( Figura 5).
- dopo aver eseguito gli esperimenti, incubare la OHSC con ioduro di propidio (PI) di 5 µ g/mL per 2 h prima della fissazione, in ordine a macchiare i nuclei dei neuroni in degenerazione.
- Conduzione di esperimenti di invasione tumorale utilizzando fluorescente etichettati celluli
- 24 h prima dell'inizio di un esperimento, etichettare le cellule del tumore usando la tintura fluorescente Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl estere (SE CFDA).
- Detach e contare le cellule del tumore utilizzando una camera di Neubauer.
- Risospendere le cellule in mezzo, tale che 10 µ l di sospensione contiene il numero di cella desiderata (normalmente 50.000 o 100.000 cellule).
- Applicare 10 µ l della sospensione delle cellule sulla cultura fetta e permettono alle cellule di invadere per 3 giorni.
- Alla fine dell'esperimento, correggere le culture fetta utilizzando 4% (v/v) PFA per 24 h ed etichettare le co-culture con PI per altre 24 ore per visualizzare la citoarchitettura.
Attenzione: PFA è un tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa e indossare PPE. - Montare il co-colture su un vetrino coprioggetto per ulteriori analisi utilizzando i supporti di montaggio.
4. Valutazione di OHSC esperimenti
analizzare il OHSC con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM). Per rilevazione di PI etichettati, degenerando neuroni o il PI etichettato cytoarchitecture utilizzare luce monocromatica di lunghezza d'onda λ = 543 nm e una banda di emissione passare filtro per lunghezze d'onda λ = 585-615 nm. Per CFDA etichettato le cellule del tumore o IB 4 microglia, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di λ = 488 nm. Per entrambi i tipi sperimentali, registrano un z-stack con 2 µm spessore ottico fette e utilizzati per la valutazione.
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Representative Results
Studi di neuroprotezione: Per determinare il danno neuronale, il numero di nuclei positivi PI e IB4 positivo microglia in ogni terza sezione ottica di strato delle cellule del granello (GCL) del giro dentato (DG) è stata contata. Per esperimenti di invasione tumorale, la z-proiezione di intensità massima dello stack è stata usata per calcolare l'area coperta dalle cellule del tumore, come una misura di invasione e di visualizzare i flussi di invasione diversi (Figura 6).
Nel controllo non trattato OHSC (CTL), neuroni è rimasto ben conservati. Nel GCL della DG sono stati osservati quasi non PI un neurone nuclei positivi (Figura 5A). Nello strato molecolare, la maggior parte delle cellule microgliali era ramificata. Nel GCL della DG, solo pochissimi IB4 positivo microglia (Figura 5A) sono stati rilevati. Dopo incubazione con acido di 50 µM N-metilico-D-aspartico (NMDA) un forte aumento del numero di nuclei neuronali positivi PI (figura 5B) e le cellule microglial positivo di4 IB (figura 5B) è stato rilevato rispetto al controllo OHSC. Pre-danneggiato OHSC di qualità inferiore possono essere identificati da un numero più elevato di microglia ameboidi e le cellule positive PI della DG (Figura 5) in condizioni di controllo. Trattamento pre-danneggiati fette con NMDA hanno portato alla distruzione di DG citoarchitettura e un numero molto elevato di cellule morte positivo PI diffondendo l'ILO e la regione CA3 (Figura 5).
Studi di invasione del tumore: Fette sono stati trattati con 50.000 cellule di due linee di cellule di glioblastoma U138 (Figura 6A) e LN229 (Figura 6B) per tre giorni. In entrambi i casi la citoarchitettura delle culture fetta è rimasto intatto e il DG e il cornu ammonis sono state conservate. Inoltre, entrambi cellula ha mostrato invasione distinto comportamento. Mentre le cellule U138 formano rotondi, chiaramente distinti tumori (Figura 6A), le cellule LN229 costruito una rete di tumore all'interno di sferoidi singolo tumore ed erano spesso difficili da distinguere. Quando guardando la quantità di massa di tumore nelle culture della fetta, una maggiore invasività per le cellule di LN229 è stata trovata quando rispetto alle cellule U138.
Figura 1: materiali e strumenti di dissezione. Per la preparazione di culture della fetta, un insieme appropriato di materiali e strumenti di dissezione è richiesto come mostrato. Il set comprende tre bisturi con piccole lame intercambiabili, una spatola, due forbici bene, tre pinze, una pipetta Pasteur normale, una pipetta di Pasteur senza punta, agar, capsule di Petri, carta da filtro, un pacchetto raffreddante, medio di preparazione e medical colla del cianoacrilato. Gli strumenti di dissezione devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso e posti in un imballaggio di plastica per tenerlo in un ambiente sterile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: posizione della formazione hippocampal nel cervello del ratto. La formazione hippocampal, indicata dalla linea tratteggiata nera è una struttura bilaterale racchiusa tra la corteccia cerebrale e il talamo. I rigonfiamenti di ippocampo in corno temporale del ventricolo laterale. L'ippocampo è bilaminare, composto il cornu ammonis (ippocampo adeguato) e il dentato circonvoluzione (o fascia dentata), con una lamina arrotolata all'interno di altro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: visualizzazione del ratto OHSC. Una fetta di cervello intero contenente OHSC è visualizzata da un binocolo per valutare la qualità del tessuto. Fette sono tenuti in una capsula Petri riempito con il mezzo di preparazione raffreddato (A, B). Ingrandimento della fetta del cervello. L'ippocampo intatto (HC) e corteccia di entorhinal sono visibili a sinistra e a destra dell'immagine (C). OHSC è separato dal resto del cervello. Strato delle cellule del granello (GCL) della DG, i sottocampi di ammonis cornu CA1 e CA3, la regione di hilus (HI), la corteccia entorinale (CE) e lo strato molecolare (ML) sono chiaramente distinguibili (D). C, D: barra della scala = 4 mm.
Figura 4: Tempo dipendente cambia in OHSC.
Direttamente dopo la preparazione, la microglia e astrociti cominciano a formare una cicatrice gliale. Dal 1-3 giorni in vitro (div) l'edema e il gliosis formazione sono osservati. La stratificazione di formazione hippocampal e DG non è più visibile. A livello cellulare, OHSC su 5 div visualizzare una riduzione del numero delle cellule attivate. A 6 div, quasi nessun edema è presente, la fetta è più sottile e le aree incluse nei circuiti neuronali intrinsechi sono sopravvissuti. OHSC può ora essere utilizzato per gli esperimenti. Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: valutazione della qualità del tessuto da CLSM. Come rivelato da CLSM, una buona conservazione di un neurone è osservata nel controllo non-lesi OHSC (CTL). Praticamente nessun PI positivi nuclei neuronali (rossi) e solo pochi IB4 positivo cellule microglial (verde) si trovano nello strato delle cellule del granello (GCL) della DG (A). In contrasto con non-lesi OHSC, un forte aumento del numero di cellule positive di4 PI e IB è visibile nel GCL di NMDA-lesi OHSC (B). Si prega di notare la morfologia della DG, cellule della microglia attivata e un gran numero di nuclei positivi PI in pre-danneggiato OHSC (C, D). Bar = 50 µM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: visualizzazione dell'invasione del tumore da CLSM. PI (in rosso) applicata dopo le etichette di fissazione della citoarchitettura di OHSC, mentre CFDA (in verde) illustra le cellule del tumore che invade la fetta. Il processo di invasione delle cellule U138 è visualizzato dopo tre giorni di tempo di invasione. Sferoidi singolo tumoresono chiaramente distinguibili (A). Al contrario, la linea cellulare di glioblastoma LN229 formato una rete di tumore (B). Bar = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il presente protocollo descrive la preparazione di OHSC. Questo modello consente di testare delle capacità intrinseche e reazioni del tessuto cerebrale dopo l'applicazione di stimoli fisiologici e patologici. Oltre alle analisi dei parametri elettrofisiologici, OHSC può essere leso e gli effetti di danni su tutti i tipi di cellule possono essere determinati. Trattamento con sostanze diverse e la descrizione dettagliata di lesioning processi o guarigione in assenza di macrofagi e linfociti è possibile.
Le fasi critiche per una corretta preparazione e coltura sono per: 1) lavorare in condizioni sterili, 2) preparare il supporto correttamente, considerando la temperatura e pH e 3) sviluppare la manualità necessaria durante la manipolazione di OHSC.
Caratteristiche della OHSC
a causa della morfologia inalterata delle cellule neuronali e la loro in vivo-come l'organizzazione, le fette sono chiamate organotipiche. Il OHSC consistono di strato pyramidale e strato granuloso, composto di cellule granulari DG e piramidale cornu ammonis (CA1, CA2, CA3). Parti dell'ippocampo sono altamente ordinate e le proiezioni di fibra afferente terminano in strati distinti in un modo non sovrapposte. La efferences tra corteccia entorinale (la via di perforant), DG, neuroni CA3 e CA1 rimangono intatti dopo la preparazione e comportarsi funzionalmente simili a quelli in vivo. Come precedentemente indicato, lo sviluppo di alberi dendritiche, attività di formazione e rete di sinapsi delle cellule granulari in OHSC sono paragonabili a fettine acute ottenuti da tempo abbinato controlli14,15,16.
Oligodendrociti e astrociti sono stati studiati in OHSC da luce e da microscopia elettronica. Oligodendrociti visualizzare una distribuzione spaziale di organotipiche, tra i quali diversi sottotipi morfologici17,18. Inoltre, gli assoni diventano myelinated durante la prima di due settimane in vitro. Alcuni autori postulato che la localizzazione specifica di strato degli astrociti è assente nelle culture della fetta e credono che gli astrociti non raggiungono una piena maturazione in vitro. Questo aspetto non può essere pienamente risposto, dal momento che gli indicatori specifici per tutte le fasi di attivazione dei astrocytes mancano ancora1,19,20.
Nei primi 3 giorni dopo la preparazione, le cellule microgliali risponderanno con proliferazione e la migrazione e si accumulano sulla superficie della fetta dove si forma la cicatrice gliale insieme con gli astrociti. Tutte le cellule sembrano essere in uno stato altamente attivato. Tuttavia, negli strati interni del OHSC e tra 3 e 6 div, cellule microglial cambiano loro morfologia ameboide verso una forma ramificata, caratterizzata da piccoli corpi cellulari e lunga ramificazione protrusioni citoplasmatiche bene estesi in tutte le direzioni21 ,22.
Simile espressione e la distribuzione dei recettori del glutammato sono stati segnalati in tessuto adulto e OHSC2,23. La frequenza delle correnti sinaptiche, le correnti sinaptiche in miniatura e la frequenza di GABAergic correnti in OHSC (7, 14 e 21 div) non siano significativamente diverse rispetto ai preparati acute su giorni postnatali 14 o 15 rispettivamente. Al contrario, la frequenza dei segnali glutamatergic è maggiore nei OHSC rispetto a fettine acute15.
Confronto tra diversi metodi di preparazione
La preparazione del tessuto embrionale e precoce postnatale è abbastanza facile, a causa della cella buona sopravvivenza tariffe in vitro. Dovrebbe essere considerato che in questa fase iniziale, le cellule neuronali sono ancora migratori e attivo che conduce ad una perdita di organizzazione organotipiche di fette1. Dopo 7-9 giorni postnatali, vengono stabilite alcune connessioni sinaptiche in ratti. Durante il prossimo 2-3 settimane in vitro le sinapsi maturano13. Uno dei vantaggi del modello presentato è la sua resistenza al trauma meccanico durante la preparazione e la sua plasticità elevata a causa dell'età dei animali (7-9 giorni)1,14,24. Si deve ricordare che le fette sono altamente sensibili alle manipolazioni meccaniche di strumenti. Anche l'angolo sbagliato di affettare può causare inclinazione taglio delle fibre neuronali responsabili anterograda o retrograda morte neuronale. La preparazione di colture di fetta da animali adulti per scopi a lungo termine è impegnativo e ancora non stabilito. Tali OHSC mostrano una massiccia degenerazione poco dopo la preparazione, presumibilmente a causa della perdita di plasticità1. Tuttavia, c'è un forte bisogno di per un metodo di preparazione che permette per il lavoro con fette di adulti.
Per diversi metodi di preparazione, il tessuto appena asportato è affettato ad uno spessore di 300-400 µm, utilizzando un elicottero di tessuto per tagliare l'ippocampo isolato. Questo metodo rapido frequentemente può provocare danni ai tessuti diffuso. Il loro spessore finale e il tempo che sono tenuti in vitrosono fattori critici per la qualità di OHSC. I migliori risultati con i più alti tassi di sopravvivenza sono stati raggiunti per fette spesse di 300-400 µm. In fette spesse gli strati superiori degenerano durante il tempo della coltura a causa di limitazioni di diffusione1. In base alle domande scientifiche, OHSC vengono utilizzati immediatamente dopo la preparazione o dopo diversi giorni di cultura. Pertanto, nel corso degli anni diverse tecniche di coltivazione sono stati stabiliti, come il rullo di avvolgimento tecnica1,13 o statici slice tecniche4.
Fuori diversi metodi di preparazione, siamo convinti che utilizza la tecnica di interfaccia insieme una vibratome è la procedura più precisa e meno dannosa per la preparazione di OHSC fino ad oggi. Questo metodo è ulteriormente migliorato utilizzando membrane porose. OHSC mantenere la loro struttura 3D, morfologicamente e funzionalmente intatto per mesi e può essere valutata visivamente durante il periodo di coltivazione25.
Applicazioni
OHSC può essere preparato da wild type e animali transgenici14,26. Essi sopravvivere per mesi e fornire opzioni per lungo termine esperimenti12,13. OHSC sono utilizzati per affrontare domande fisiologici, farmacologici, morfologica ed evolutiva14,27 sotto altamente standardized condizioni come applicazione cronica del neurotherapeutics o cellule staminali terapia26,27,28. L'indagine degli aspetti inerenti allo sviluppo della connettività di un neurone o processi legate alla trasmissione sinaptica, plasticità sinaptica, effetti dell'epilessia cronica delle spine dendritiche delle cellule piramidali, o neurogenesi tutti rappresentano ulteriori campi 29,30,31,32.
Glutammato, il principale neurotrasmettitore eccitatorio e recettori ionotropici del glutammato svolgono un ruolo centrale in excitotoxicity. Le lesioni excitotoxic verificano durante malattie neurologiche come ictus, malattia Alzheimer, neurotossicità HIV, trauma cranico e riparazione meccanismi14,24. Applicazione di agonisti del recettore del glutammato NMDA, acido α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic (AMPA) o acido kainic a OHSC imita selettiva e regione specifica di un neurone delle cellule morte26,28,33 ,34. Inoltre, la risposta delle cellule gliali alla lesione di un neurone ad es., microglial migrazione e fagocitosi in OHSC precedentemente sono stati analizzati3,35. L'influenza di microglia durante la lesione può essere prevista da svuotamento farmacologico di queste cellule dal bifosfonato clodronate36.
Una domanda importante ulteriore si pone che imita in vivo le modalità delle indagini dell'invasione del tumore usando OHSC. Sferoidi formate da linee cellulari di glioma sono stati in grado di invadere la fetta culture, un fenomeno che era specie sovrapposizione37. Il modello di infiltrazione diffusa delle linee cellulari utilizzati ha assomigliato al modello osservato in vivo37. Inoltre, sferoidi di glioblastoma primario impiantati nel OHSC tenuto loro invasione potenziale e della cellula formativa del carattere sopra parecchi giorni in vitro38. Così, il modello consente l'osservazione di modelli di invasione e interazioni tra tessuto neuronale e le cellule del tumore che corrispondono a quelle osservate in vivo37,38. Rispetto al collagene o gel base modelli (ad es.)39, l'uso di OHSC sembra più utile per analisi su invasione del tumore e metastasi nel cervello. Il milieu fisiologico, tra cui tipi di un neurone e glial cellule e matrice extracellulare, rimane intatto.
Inoltre, OHSC consentono lo studio dirette interazioni tra cellule tumorali singole e tessuto cerebrale in condizioni controllate. Ad esempio, le cellule microgliali sono state trovate per migliorare le funzionalità delle cellule del tumore di entrare nel cervello di formare strutture guida per invasione35.
Inoltre, può essere analizzato l'effetto di alterazioni cellulari transitorie e permanente sui processi di invasione. Un'espressione stabile di metastasi associata del colon cancro gene 1 (MACC1) in cellule del glioma è stata associata con un aumento della proliferazione e la successiva invasione40. L'alterazione transitoria di rigidità cellulare in linee cellulari di glioblastoma direttamente è stata correlata con le proprietà invasive della cella linee41. OHSC e tumore delle cellule co-colture quindi potenzialmente utilizzabile per droga test, riproduzione delle osservazioni cliniche e all'invasione del tumore modello e immagine in condizioni altamente controllate e standardizzate.
Dopo studi in colture cellulari primarie, OHSC sono la scelta più logica successiva per l'esecuzione di esperimenti in un sistema più complesso per approssimare le condizioni in vivo . Un altro campo di interesse in fettine di cervello è lo screening di farmaci terapeutici potenziali prima del test in vivo. Fette del cervello permettono di monitoraggio e che imita delle lesioni sotto controllo di osservatore e senza chirurgia degli animali. Fino a 8 OHSC possa essere ottenuta e il numero di animali necessari è ridotto significativamente. È possibile ottenere risultati nello stesso animale sotto impostazioni simili ma con differenti o più condizioni. Così, OHSC è un potente strumento per osservare tra gli altri i cambiamenti morfologici, cellulari, molecolari durante il periodo di lesione, sviluppo di danni secondari e diffusione del tumore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Christine Auste per il suo sostegno con la registrazione video e Chalid Ghadban per la sua eccellente assistenza tecnica. Urszula Grabiec è stato sostenuto dalle Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
