Summary

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Published: August 27, 2017
doi:

Summary

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Abstract

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC), sinir hücreleri ve gliyal hücreler morfolojik ve fonksiyonel özellikleri iyi korunmuş. Bu model dahil çalışmaları nöronlar, nöronal ağlar veya tümör işgali üzerinde Elektrofizyolojik deneyler neuroprotection üzerinde farklı araştırma soruları ele almak için uygundur. Hipokampal mimarisi ve multisynaptic devrelerde nöronal aktivite iyi OHSC, düz-se bile Dilimleme yordam başlangıçta lezyonlar ve gliyal yara oluşumuna yol açar korunmuş. Yara oluşumu muhtemelen mekanik özellikleri ve küçük moleküller, vbdiffusive davranışını değiştirir. Dilimleri Saat bağımlı süreçlerinin beyin hasarı hayvan cerrahi ve çeşitli beyin türetilmiş hücre tipleri, yani astrocytes, microglia ve fizyolojik ve patolojik altında nöronlar arasındaki etkileşimler çalışmaları olmadan sonra izleme izin koşullar. Bu model kararsız bir yönünü kan akımı ve bağışıklık kan hücreleri olmaması. Nöronal yaralanma ilerleme sırasında bağışıklık hücreleri kan oynamak önemli bir rol geçirme. Bu hücreleri dilimler halinde eksik olduğundan, içsel süreçleri kültür dış müdahale gözlenen. Ayrıca, OHSC orta-dış ortam bileşimi tam olarak kontrol edilir. Bu yöntem bir başka kurban hayvanların standart hazırlıkları için karşılaştırıldığında daha düşük sayıda avantajdır. Birkaç OHSC birden çok tedavileri ile eşzamanlı çalışmalar bir hayvan edinerek bir hayvandan elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı OHSC sonra doku hasarı veya tümör işgali sırasında yeni koruyucu tedavi etkilerini çözümlemek için uygundur.

Sunulan Protokolü burada üreten son derece tekrarlanabilir sağlar OHSC hazırlama yöntemi açıklar, iyi korunmuş deneysel araştırma, neuroprotection veya tümör işgali çalışmalar gibi çeşitli için kullanılan dilimler.

Introduction

OHSC nöronlar, astrocytes ve microglia1fizyolojik ve patolojik özelliklerini incelemek için iyi karakterize vitro modeli vardır. Hücre dışı ortam kontrol etmek ve hücresel ve morfolojik değişiklikler sonra çeşitli uyaranlara izlemek kolaydır. Hipokampal nöronlar organizasyonu ve bağlantıları sonra hazırlık2,3iyi korunmuş. Çeşitli yararları dışarı OHSC izin hayvan ameliyat olmadan beyin hasarı ve tümör işgalinin izleme. Altı ya da sekiz OHSC tek bir kemirgen beyinden elde edilebilir. OHSC bu nedenle önemli ölçüde hayvan sayısını azaltmak ve birden fazla ilaç konsantrasyonları, genetik manipülasyon veya farklı lezyon modelleri aynı hayvan test izin vermek için yardımcı olur. Dilim tabanlı deneyleri içinde deneysel koşullar tam olarak kontrol edilebilir. Ayrıca, ikincil hasar gibi patolojik durumlardan zaman bağımlı geliştirme kolayca zaman hata görüntüleme tarafından izlenebilir.

Başlangıçta Stoppini ve ark. tarafından kurulan belirli iletişim kuralı 4, hazırlık adımları açıklanmıştır ve uygun dilimleri seçimi için önemli morfolojik yerler vurgulanır. Doğum sonrası gün 7-9 fareler veya doğum sonrası 4-5 gün fareler hazırlanması tavsiye ediyoruz. Bu dönemlerde OHSC mekanik travmalar ve nöronal devreler yeniden yapılanma yüksek bir potansiyel güçlü bir direnç gösteriyor. Buna ek olarak, ürünleri embriyonik veya yetişkin fareler üzerinden hızla yapılarını değiştirmek ve onların organotypic Morfoloji ekimi sırasında kaybetmek ve bu nedenle temel araştırma5,6 ‘ uzun vadeli işlemler çalışmak için daha az uygun , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Difüzyon ve böylece besin kaynağı sınırlı12,13,14OHSC hayatta kalma oranı için başka bir kritik nokta dilim kalınlığı ‘s.

Protocol

hayvan deneyleri gerçekleştirilen etik ilke ve nörolojik araştırma hayvanlara kullanım ilkesi doğrultusunda Avrupa Toplulukları Konseyi yönergesi 2010/63/AB tarafından Avrupa Parlamentosu onaylanmış ve bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması üzerinde Avrupa Birliği Konseyi. 1. Kültür ortam ve aygıtlar hazırlık OHSC hazırlanması için aşağıdaki araç kümesi, kullanın: iki küçük makas, iki eğri cımbız, iyi bir ipucu ile bir cımbız ü?…

Representative Results

Neuroprotection çalışmaları: Nöronal hasar, PI olumlu çekirdek ve IB4 microglia dentat gyrus (DG) granül hücre Katmanı (un) her üçüncü optik bölümünde sayılan olumlu sayısını belirlemek için. Tümör işgali deneyler için maksimum yoğunluk z-projeksiyon yığının tümör hücreleri tarafından işgali ve farklı işgali desenleri (şekil 6) görselleştirmek için bir tedbir olarak bölgeyi hesaplamak için…

Discussion

Mevcut protokolünü OHSC hazırlanması açıklar. Bu model iç yetenekleri ve beyin dokusu reaksiyonları fizyolojik ve patolojik bir çekim gücü uygulamadan sonra test sağlar. Elektrofizyolojik parametrelerinin analizler, yanı sıra OHSC lesioned olabilir ve hasar etkisi tüm hücre türleri belirlenebilir. Farklı maddeler ve lesioning işlemler veya makrofajlar ve lenfositler yokluğunda şifa ayrıntılı açıklaması ile tedavi mümkündür.

The Most kritik adımlar için bir başa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Christine Auste onun desteğiyle video kayıt ve stadyum Ghadban onun mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Urszula Grabiec, Roux Programm FKZ 29/18 tarafından desteklenmiştir.

Materials

6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 Vector Labs FL-1201  
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200

References

  1. Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
  2. Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
  3. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  5. Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
  6. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
  7. Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  8. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
  9. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  10. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  11. Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
  12. Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
  13. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  14. Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
  15. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
  16. Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
  17. Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
  18. Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
  19. Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
  20. Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
  21. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  22. Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
  23. Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
  24. Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
  25. Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
  26. Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
  27. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
  28. Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
  29. He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
  30. Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
  31. Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
  32. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
  33. Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
  34. Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
  35. Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
  36. Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
  37. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
  38. Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
  39. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
  40. Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ‘ unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
  41. Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).

Play Video

Cite This Article
Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).

View Video