Summary
Organotypic гиппокампа ломтик культур (страховой) представляют собой модель в пробирке , которая моделирует ситуацию в естественных условиях очень хорошо. Здесь мы описываем, основанных на vibratome улучшение нарезки протокол для получения фрагментов высокого качества для использования в оценке нейропротекторной потенциал новых веществ или биологическое поведение опухолевых клеток.
Abstract
В культурах гиппокампа срез organotypic (ОАО) хорошо сохранились Морфологические и функциональные характеристики нейронов и глиальных клеток. Эта модель подходит для решения различных исследовательских вопросов, которые включают исследования по нейропротекции, электрофизиологические эксперименты на нейроны, нейронных сетей или прорастание опухоли. Гиппокампа архитектуры и активности нейронов в multisynaptic цепи хорошо сохраняется в страховой, хотя сама процедура нарезки первоначально поражений и приводит к формированию глиальный рубец. Формирование рубца изменяет предположительно механических свойств и диффузионного поведение малых молекул и др. Фрагменты позволяют контролировать время зависимых процессов после травм головного мозга без животных хирургия и исследования по вопросам взаимодействия между различными типами клеток мозга, полученных, а именно астроциты, Микроглия и нейронов под физиологических и патологических условий. Двойственные аспектом этой модели является отсутствие кровотока и иммунных клеток крови. При прогрессировании нейронных травмы перенос иммунные клетки из крови играют важную роль. Поскольку эти клетки отсутствуют в фрагменты, внутренние процессы в культуре может наблюдаться без внешнего вмешательства. Кроме того в страховой точно контролируется состав средне внешней среды. Еще одним преимуществом данного метода является меньшее количество жертвенных животных, по сравнению с стандартным препаратов. Несколько OHSC можно получить из одного животного, возможность одновременного исследования с несколько процедур в одном животном. По этим причинам страховой хорошо подходят для анализа воздействия новых защитных терапии после повреждения тканей или во время вторжения опухоли.
Протокол представил здесь описывается метод подготовки страховой, которая позволяет генерировать высокую воспроизводимость, хорошо сохранились фрагменты, которые могут быть использованы для целого ряда экспериментальных исследований, как нейропротекторного эффекта или опухоль вторжения исследования.
Introduction
Страховой являются хорошо изученных в vitro модель для изучения физиологических и патологических свойства нейронов, астроциты и микроглии1. Это легко управлять средой внеклеточные и мониторинга сотовых и морфологические изменения после различные стимулы. Организация гиппокампа нейронов и их соединения хорошо сохранились после подготовки2,3. Из несколько преимуществ страховой позволяют контролировать вторжения травмы и опухоли головного мозга без животных хирургия. Шесть-восемь страховой можно получить от одного грызунов мозга. Страховой поэтому помочь существенно уменьшить количество животных и позволяют тестирования нескольких концентрации наркотиков, генетические манипуляции или различные поражения модели в то же самое животное. В основе ломтик анализов экспериментальных условиях может управляться точно. Кроме того время зависит от развития патологических состояний как вторичные убытки может легко контролироваться покадровой изображений.
В заданном протоколе, первоначально учрежденной Stoppini et al. 4подготовка шаги описываются и выделены морфологическая достопримечательности для отбора соответствующих фрагментов. Мы рекомендуем подготовку послеродовой 7-9 день крыс или мышей послеродовой день 4-5. В эти периоды страховой Показать надежный сопротивление механических травм и высокий потенциал для реорганизации нейронных цепей. В отличие от этого препараты от эмбриональных или взрослых крыс быстро изменить их структуру и теряют их морфология organotypic во время выращивания и поэтому меньше подходят для изучения долгосрочных процессов в фундаментальных исследований5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Другой критической точкой для выживаемости страховой является толщина среза, сам, как диффузии и, таким образом, питательных являются ограниченные12,,1314.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
животных эксперименты были проведены в соответствии с политикой этики и политики в области использования животных в неврологии исследований, утвержденных на европейских сообществ Совета Директива 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского союза о защите животных, используемых для научных целей.
1. Подготовка документов и средства массовой информации культуры
- для приготовления страховой используют следующий набор документов: две маленькие ножницы, две изогнутые пинцет, один пинцет с тонкой кончиком, три лезвия (два размера 11, один из размера 15), три скальпель держатели, раунд фильтр документов (диаметр: 35 мм), агар, одно лезвие бритвы, один неизмененной пипетка Пастера, и одно изменение пипетка Пастера без наконечника. Простерилизуйте все материалы в автоклаве до использования ( рис. 1).
- Весят 5 g агар и растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуйте решение для 20 минут 121.7 ° C на 210,8 кПа в автоклаве. Распространять 3 мл раствора жидкого агар в чашках Петри 60-мм с помощью стерильной стеклянной пипетки, позволяют ему затвердеть в течение 5 ч, накрыть пластиковой парафин фильм, чтобы избежать загрязнения и хранить при 4 ° C до дальнейшего использования. Агар блоки необходимы для стабилизации мозги во время нарезки процедуры.
- СМИ
- сделать 200 мл подготовка среды (рН 7,35) состоящая из 198 мл минимальные основные среды (MEM) и 2 мл раствора L-глютамин (конечная концентрация 2 мм). Подготовить решение на день подготовки средств массовой информации и хранить при 4 ° C.
- Подготовить 100 мл питательной среды, состоящий из 49 мл MEM, 25 мл Хэнкс ' сбалансированный солевых растворов (HBSS), 25 мл (v/v) нормальный лошадь сыворотки (ГСЗ), 1 мл раствора L-глютамин (конечная концентрация 2 мм), 100 мкг инсулин, глюкоза 120 мг, 10 мг стрептомицина , 10 000 U пенициллин и 800 мкг витамин С, как сообщалось ранее. Теплый среднего (37 ° C), настроить значение рН рН 7,4 и стерильного фильтра (размер пор 0.2 мкм). Повторите процедуру (разогрев, корректировка уровня pH и т.д.) каждый второй день перед изменением среды. Используйте средство на наиболее для одной недели при температуре 4 ° с.
- Заполнить один из 35-мм Петри с подготовки среднего для хранения в мозг. Место две пустые чашки Петри для сбора ткани на пачке охлаждения в рабочей области.
2. Подготовка и резка с Vibratome
- использования мозги от 7-9 день старых крыс или 4-5 день старых мышей для подготовки страховой согласно Stoppini и др. 4 после обезглавливания животных, снять кожу от черепа с ножницами.
- Привнести затылочного лезвие тонкой ножниц и откройте черепа путем разрезания вдоль оси хвостового (бэк) ростральной (Фронт). Сделать два отрубы перпендикулярно к первому, так что ножницы указывают на левое и правое ухо, соответственно (" T-разрез ").
- Аккуратно откройте черепа с тонкой щипцами, обращая внимание, чтобы не травмировать мозга. Использовать скальпель (размер 11 лезвия) сократить наиболее ростральной часть полюса лобной и мозжечке.
- С помощью шпателя, удалить мозга и поместите его тщательно в Петри, заполнены с подготовки среднего ( рис. 2). Поместите мозг на держатель образца и исправить ее с медицинской Цианакрилатный клей. Используйте кусочки агар для обеспечения механической стабилизации.
- Вскрыть ткани горизонтально в 350 мкм толщиной страховой, с использованием скользящей vibratome.
- Оценить ломтиками, оптически с помощью бинокулярный микроскоп. Немедленно отменить страховой низкого качества. Важно принимать только те фрагменты с нетронутыми cytoarchitecture, изолированный от средней части гиппокампа (см. рисунки 3 и 4) между дорсальной и вентральной гиппокампа.
- Отдельные области гиппокампа и entorhinal коры, с помощью скальпеля (Круглый Клинок размер 15; Рисунок 3). Перфорантных пути и entorhinal коры должна быть сохранена.
- Шести до восьми страховой получаются из каждого мозга. Переводить 2-3 ломтика на одну ячейку культуры вставка (поры размер 0,4 мкм) и поместите его в одной скважиной 6-ну культуры блюдо, содержащие 1 мл питательной среды на колодец.
- Инкубировать 6-ну блюда на 35 ° C в атмосфере полностью увлажненный с 5% (v/v) CO 2 и изменить ячейку культуры среднего каждый второй день.
Примечание: Проведение экспериментов на 6 день в пробирке (div). 6 день исчезают воспалительные реакции, связанные с процедурой нарезки. На данном этапе, снова показать разветвленная словотолкование клетки микроглии и созрели синаптических связей.
3. Оценка качества ткани
- фиксации, маркировки и визуализация вырождающихся нейронов в страховой
- после выполнения экспериментов, инкубировать страховой с 5 мкг/мл пропидий йодидом (PI) за 2 ч до фиксации, в порядок пятно ядер нейронов вырождающихся.
Предупреждение: PI является подозреваемых канцерогенов, всегда надевайте средства индивидуальной защиты (СИЗ) такие перчатки. - Мыть страховой с 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) и исправить их с 4% (v/v) раствором параформальдегида (PFA) за 24 ч.
Предупреждение: PFA является канцерогеном токсичных и подозреваемых. Работа под зонт и носить СИЗ. - Мыть страховой во вставках 1 мл PBS и использовать кисть монтера для разделения фрагментов от мембраны,.
- Этикетка страховой с IB 4 красителя в 24-ну пластины ( рис. 5).
- после выполнения экспериментов, инкубировать страховой с 5 мкг/мл пропидий йодидом (PI) за 2 ч до фиксации, в порядок пятно ядер нейронов вырождающихся.
- Проводимости опухоли вторжения экспериментов с использованием дневно помечены единичных клеток
- за 24 часа до начала эксперимента, ярлык опухолевых клеток с помощью флуоресцентного красителя Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl Эстер (CFDA SE).
- Отсоединение и количество опухолевых клеток с помощью камеры Нойбауэр.
- Ресуспензируйте клеток в среде, таким образом, что 10 мкл суспензии содержит номер нужной ячейки (обычно 50000 или 100000 клеток).
- Применять 10 мкл суспензии клеток на срез культуры и позволяют клеткам вторгнуться на 3 дня.
- В конце эксперимента, исправить фрагмент культур с помощью 4% (v/v) PFA за 24 ч и ярлык Сопредседатель культур с PI для еще 24 часа для визуализации cytoarchitecture.
Предупреждение: PFA является канцерогеном токсичных и подозреваемых. Работа под зонт и носить СИЗ. - Монтировать Сопредседатель культур на покрытие скольжения для дальнейшего анализа, с помощью средства монтажа.
4. Оценка экспериментов страховой
анализ страховой с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM). Для обнаружения PI помечены, вырождающихся нейронов или PI, помечены cytoarchitecture использовать монохроматического света длиной волны λ = 543 Нм и выбросов band фильтр для длин волн λ = 585-615 Нм. Для CFDA помечены опухолевых клеток или IB 4 микроглии, используйте возбуждения волны λ = 488 нм. Для обоих типов экспериментальных, записать z стек с 2 мкм толщиной оптического ломтиками и используется для оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Нейропротекции исследования: Чтобы определить повреждения нейронов, число Пи позитивные ядер и IB4 положительное, что было подсчитано микроглии в каждый третий раздел Оптический слоя клеток гранул (GCL) зубчатой извилины (ГД). Для опухоли вторжения экспериментов максимальная интенсивность z проекция стека была использована для расчета площадь опухолевых клеток, как мера вторжения и визуализировать различные вторжения шаблоны (рис. 6).
В необработанной управления страховой (CTL) нейроны оставался хорошо сохранились. В GCL ГД наблюдались практически не Пи позитивные нейрональных ядер (Рисунок 5A). В молекулярный слой большинство Микроглии клеток были разветвленное. В GCL ГД, лишь очень немногие IB4 положительных Микроглии клеток (Рисунок 5A) были обнаружены. После инкубации с N-метил D-аспарагиновой кислоты 50 мкм (NMDA) сильное увеличение числа Пи позитивные нейрональных ядер (Рисунок 5B) и IB4 положительных Микроглии клеток (Рисунок 5B) был обнаружен, когда по сравнению с контролем страховой. Предварительно поврежденной страховой низкого качества может быть идентифицирован выше числа Саркодовые Микроглия и PI клеток в ГД (рис. 5 c) в условиях контроля. Лечении предварительно поврежденных фрагментов с NMDA привели к разрушению ГД cytoarchitecture и очень большое количество PI положительное смерть клетки, распространяя в рубчик и CA3 региона (рис. 5 d).
Опухоль вторжения исследования: Ломтики относились с 50 000 клеток двух линий клеток глиобластомы U138 (рис. 6A) и LN229 (Рисунок 6B) в течение трех дней. В обоих случаях сохранились cytoarchitecture срез культур и ГД и корню ammonis были сохранены. Кроме того оба мобильных линий показали поведение отдельных вторжения. В то время как клетки U138 образуется круглые, четко опухоли (рис. 6А), LN229 клетки опухоли сеть в пределах одного опухоли сфероидов и зачастую трудно отличить. При взгляде на количество массы опухоли в ломтик культур, выше инвазивность для LN229 клеток был найден по сравнению с U138 клетками.
Рисунок 1: рассечение инструменты и материалы. Для подготовки срез культур требуется набор подходит рассечение инструментов и материалов, как показано. В комплект входят три скальпелей с небольшой сменные лезвия, один шпатель, две прекрасные ножницы, три щипцы, одной нормальной пипетка Пастера, один пипетка Пастера без наконечника, агар, Петри, фильтровальная бумага, охлаждающий пакет, подготовки среднего и медицинский Цианакрилатный клей. Рассечение инструменты должны быть газобетона перед использованием и помещены в пластиковый пакет, чтобы держать его в стерильной атмосфере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: расположение формирования гиппокампа в мозге крыс. Гиппокампа формирования, показано черной пунктирной линией является структурой двустороннего, окружена коры головного мозга и таламуса. Гиппокамп выпуклости в височной рога бокового желудочка. Гиппокамп является bilaminar, состоящий из корню ammonis (гиппокамп надлежащего) и зубчатой извилины (или фасции зубчатые), с одной пластиной, засучив внутри другого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Визуализация крыса страховой. Кусочек весь мозг, содержащие страховой визуализируется в бинокль, чтобы оценить качество ткани. Ломтики хранятся в чашке Петри, наполнен охлажденным подготовки среднего (A, B). Увеличение фрагмента мозга. Нетронутыми гиппокампа (HC) и entorhinal кору видны на левой и правой стороны изображения (C). Страховой отделена от остальной части мозга. Слоя клеток гранул (GCL) ГД, ammonis подполей корню СА1 и CA3, хилус региона (HI), entorhinal коры (EC) и молекулярный слой (мл), ясно distinguishable (D). C, D: шкала бар = 4 мм.
Рисунок 4: Время зависит от изменения в страховой.
Непосредственно после подготовки, Микроглия и астроциты начинают формировать глиальный рубец. От 1-3 дня в пробирке (div) глиоза и отек формирования наблюдаются. Стратификация гиппокампа формирования и ГД больше не является видимым. На клеточном уровне страховой на 5 div отображения сократить количество активированных клеток. На 6 div присутствует почти без отеков, срез тоньше, и области, включенные в встроенные нейронных цепей выжили. Страховой могут теперь использоваться для экспериментов. Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Оценка качества ткани, CLSM. Как показал CLSM, хороший нейрональных сохранение наблюдается в элементе не пораженного страховой (CTL). Практически не Пи позитивные нейрональных ядер (красный) и только несколько IB4 положительных Микроглии клеток (зеленый) находятся в слой клеток гранул (GCL) DG (A). В отличие от не пораженного страховой сильное увеличение числа Пи и IB4 позитивных клеток является видимым в GCL NMDA-пораженного страховой (B). Пожалуйста, обратите внимание на морфологию ДГ, activated Микроглии клеток и большое количество положительных ядер PI в предварительно поврежденной страховой (C, D). Бары = 50 µM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Визуализация прорастание опухоли в CLSM. Пи (в красном) применяется после фиксации этикетки cytoarchitecture страховой, а CFDA (в зеленом) иллюстрирует опухолевых клеток, вторжение на срез. Процесс вторжения U138 клеток визуализируется после трех дней времени вторжения. Сфероидов единый опухолиЭто ясно distinguishable (A). В противоположность этому линии клеток глиобластомы LN229 образовали сеть опухоли (B). Бары = 400 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий Протокол описывает подготовку страховой. Эта модель позволяет тестирование встроенных возможностей и реакции ткани головного мозга после применения физиологических и патологических стимулов. Помимо анализа электрофизиологические параметры страховой может быть пораженного и последствия ущерба на всех типов клеток может быть определено. Возможна обработка различных веществ и подробное описание процессов lesioning или исцеление в отсутствие макрофагов и лимфоцитов.
The Most критические шаги для успешной подготовки и культивирования являются: 1) работают в стерильных условиях, 2) подготовить СМИ правильно, считая температуры и рН и 3) разработать необходимые ручной dexterity во время обработки страховой.
Характеристики страховой
Из-за без изменений морфологии нейрональных клеток и их в естественных условиях-как организация, ломтики, называются organotypic. Страховой состоят из pyramidale и слой зернистого, состоящий из пирамидальных корню ammonis (СА1, Са2, CA3) и ГД гранулированных клеток. Части гиппокампа высоко приказал и прогнозы афферентные волокна прекратить в различных слоях неперекрывающимся способом. Efferences между entorhinal коры (перфорантных путь), ГД, CA3 и CA1 нейронов остаются нетронутыми после подготовки и ведут себя функционально похож на те в естественных условиях. Как уже показано, развития дендритных деревьев, синапса формирования и сетевой деятельности гранулированных клеток в страховой сопоставимы с острой фрагментов, полученных от времени соответствует контроль14,,1516.
Олигодендроциты и астроциты изучались в страховой света и электронной микроскопии. Олигодендроциты отображения organotypic пространственного распределения, в том числе различные Морфологические подтипы17,18. Кроме того аксоны стать среза в течение первых двух недель в пробирке. Некоторые авторы постулируется, что слой конкретных локализации астроциты, отсутствует в ломтик культур и считаем, что астроциты не доходят до полного созревания в пробирке. Этот аспект нельзя ответить полностью, поскольку конкретные маркеры для всех этапов активации астроциты до сих пор отсутствуют1,19,20.
В первые 3 дня после подготовки Микроглии клеток реагировать с миграции и пролиферации и накапливаются на поверхности среза, где они образуют глиальные шрам вместе с астроциты. Все клетки, как представляется, быть в состоянии-активированный. Однако во внутренних слоях страховой и между 3 и 6 div, Микроглии клеток изменить их Саркодовые морфологии к развитой форме, характеризуется малыми телами сотовой и длинные ветвящиеся тонкой цитоплазматических выступов, продлен во всех направлениях21 ,22.
Аналогичные выражения и распределение рецепторов глутамата были зарегистрированы в взрослых ткани и страховой2,23. Частота синаптического течений, миниатюрные синаптических течений и частота ГАМК, токи в страховой (7, 14 и 21 div) не значительно отличаются по сравнению с острой препаратов на послеродовых дней 14 или 15 соответственно. В отличие от частоты сигналов глутаматергические выше в страховой чем в острых фрагментов15.
Сравнение методов подготовки различных
Подготовка эмбриональных и раннем постнатальном ткани довольно легко, благодаря хорошей ячейки выживание ставки в пробирке. Следует учитывать, что на этой ранней стадии, нейрональные клетки, до сих пор перелетных и активный, ведущих к потере organotypic Организации ломтиками1. После 7-9 дней и послеродовой установлены некоторые синаптических связей в крыс. В течение следующих 2-3 недели в vitro синапсов Зрелые13. Одним из преимуществ представленной модели является его устойчивость к механической травмы во время подготовки и его высокой пластичностью ввиду животных (7-9 дней)1,14,24-летнего возраста. Необходимо отметить, что фрагменты являются весьма чувствительными к механических манипуляций инструментов. Даже Неправильный угол резки может привести к наклонной резки нейрональных волокон ответственных за антероградная или ретроградным гибели нейронов. Подготовка ломтик культур от взрослых животных для долгосрочных целей является сложной и до сих пор не созданы. Такие страховой показывают массивные дегенерации вскоре после подготовки предположительно из-за потери пластичности1. Тем не менее, существует настоятельная необходимость подготовки метод, позволяющий для работы с взрослого ломтиками.
Для нескольких методов подготовки свежезаваренным подакцизным ткани является ломтиками толщиной 300-400 мкм, используя ткани измельчитель сократить изолированных гиппокампа. Этот быстрый метод часто может привести к повреждению широко тканей. Критическими факторами для качества страховой являются их конечной толщины и время, когда они находятся в пробирке. Лучшие результаты с самыми высокими показателями выживания были достигнуты за 300-400 мкм толстых ломтиков. В толстые ломтики верхние слои перерасти во время культуры вследствие диффузии ограничения1. В зависимости от на научные вопросы страховой используются непосредственно после подготовки либо после нескольких дней в культуре. Таким образом с годами были созданы несколько методов культивирования, как ролик-Tube техника1,13 или статический фрагмент методы4.
Из различных подготовки методов мы убеждены в том, что использование метода интерфейса вместе с vibratome является наиболее точным и наименее повреждения процедуры подготовки страховой на сегодняшний день. Этот метод также улучшена с помощью пористых мембран. Страховой держать их 3D структура, сохранится морфологически и функционально для месяцев и визуально могут оцениваться в ходе периода выращивания25.
Приложения
Страховой могут быть приготовлены из дикого типа и трансгенных животных14,26. Они выживают для месяцев и предоставляют возможности для долгосрочных экспериментов12,13. Страховой используются для удовлетворения физиологических, фармакологических, морфологические и развития вопросы14,27 под высоко стандартized условий, таких как хронические применения neurotherapeutics или стволовой терапии26,27,28. Расследование аспектов развития нейронов подключения или процессов, связанных с синаптической передачи, синаптической пластичности, эффекты хронического эпилепсии дендритных шипиков пирамидальных клеток, или нейрогенез все представляют дополнительные поля 29,30,,3132.
Глутамат, первичной возбуждающих нейротрансмиттеров и ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов играют центральную роль в Эксайтотоксичность. Excitotoxic поражения происходят при неврологических заболеваниях, как инсульт, Альцгеймера болезни, ВИЧ нейротоксичности, черепно-мозговой травмой и ремонт механизмов14,24. Приложение агонистами рецепторов глутамата NMDA, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА) или Каиновая кислота страховой имитирует селективный и региона конкретные нейрональные клетки смерти26,28,33 ,34. Кроме того ответ глиальных клеток нейронных травмы например, микроглии миграции и фагоцитоз в страховой ранее были проанализированы3,35. Влияние микроглии во время поражения могут быть предсказаны фармакологических истощения этих клеток бисфосфонатов clodronate36.
Дальнейшие важные приложения возникает подражая в vivo условия для расследования прорастание опухоли с помощью страховой. Сфероидов, образуемой линиями клеток глиомы были способны вторжение срез культур, явление, которое перекрывающихся37видов. Диффузный инфильтрат шаблон клеточных линий используется напоминала наблюдаемый характер в vivo37. Кроме того основной глиобластома сфероидов имплантируется в страховой держали их вторжения потенциал и стволовых клеток характера через несколько дней в vitro38. Таким образом модель позволяет наблюдение вторжения шаблонов и взаимодействия между нейронной ткани и опухолевые клетки, которые соответствуют тем наблюдается в vivo3837,. По сравнению с коллагена или гель на основе модели (например)39, использование страховой кажется более полезным для анализа на вторжение опухоли и метастазов в головном мозге. Физиологические окружение, включая типы нейронов и глиальных клеток и внеклеточного матрикса, остается неизменным.
Кроме того страховой позволяют изучать прямого взаимодействия между одной опухолевых клеток и тканей мозга при контролируемых условиях. Например для расширения возможностей опухолевых клеток вступить в мозг, формируя руководящих структур для вторжения35были найдены Микроглии клеток.
Кроме того можно проанализировать влияние временных и постоянных клеточных изменений на процессы вторжения. Стабильная экспрессия гена метастазов связанные толстой кишки рак 1 (MACC1) в клеток глиомы был связан с увеличение распространения и последующего вторжения40. Временные изменения клеток жесткость в линии клеток глиобластомы был прямо коррелировала с инвазивные свойства клеток линии41. Страховой и опухолевых клеток совместно культур таким образом потенциально могут быть использованы для тестирования, воспроизведение клинических наблюдений, а также модель и образ прорастание опухоли в высоко контролируемых и стандартизированных условиях наркотиков.
После учебы в начальных клеточных культур страховой являются логическим следующим выбором для проведения экспериментов в более сложной системе для приближения условий в естественных условиях . Другое поле интерес в срезах головного мозга является скрининг потенциальных терапевтических препаратов перед тестированием в естественных условиях. Срезы мозга позволяют мониторинг и подражая травм под контролем наблюдателей и без животных хирургия. Можно получить до 8 страховой и значительно сократить количество необходимых животных. Это позволяет получить результаты в то же самое животное под аналогичные настройки, но с различными или несколько условий. Таким образом страховой является мощным инструментом, чтобы соблюдать среди прочих морфологических, сотовой, молекулярные изменения в течение периода поражения, развитие вторичного ущерба и распространения опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Christine Auste за ее поддержку с видео-записи и Гадбан Chalid за его прекрасную техническую помощь. Urszula Grabiec было поддержано FKZ программа ру 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
