Summary
Hippocampe organotypiques (CSST) représentent un modèle in vitro qui simule la situation in vivo très bien. Nous décrivons ici une base vibratome amélioré tranchage protocole pour obtenir des tranches de haute qualité devant servir à évaluer le potentiel neuroprotecteur de substances nouvelles ou le comportement biologique des cellules tumorales.
Abstract
Dans l’hippocampe organotypiques (CSST), les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des neurones et de cellules gliales sont bien conservés. Ce modèle est adapté pour répondre aux questions de recherche différentes qui impliquent des études sur la neuroprotection, expériences électrophysiologiques sur les neurones, les réseaux neuronaux ou invasion tumorale. L’architecture de l’hippocampe et l’activité neuronale dans les circuits de multisynaptic sont bien conservées dans CSST, même si la procédure de trancher elle-même initialement des lésions et conduit à la formation d’une cicatrice gliale. La formation de cicatrices modifie sans doute les propriétés mécaniques et le comportement de diffusion de petites molécules, etc.. Tranches de permettent le suivi des processus dépendants du temps après traumatisme crânien sans chirurgie animale et les études sur les interactions entre les divers types de cellules encéphales, nommément astrocytes, la microglie et les neurones sous tant physiologiques que pathologiques conditions. Un aspect ambivalent de ce modèle est l’absence de flux sanguin et immunitaire des cellules sanguines. Au cours de la progression de la lésion neuronale, la migration des cellules immunitaires d’après la pièce de sang un rôle important. Comme ces cellules manquent en tranches, on peuvent observer les processus intrinsèques dans la culture sans ingérence extérieure. En outre, à la CSST la composition de l’environnement du milieu extérieur est contrôlée avec précision. Un autre avantage de cette méthode est la diminution du nombre d’animaux sacrifiés par rapport aux préparations standards. Plusieurs CSST peut provenir d’un animal permettant des études simultanées avec des traitements multiples chez un animal. Pour ces raisons, la CSST sont bien adaptés pour analyser les effets de nouvelles thérapeutiques de protection après des lésions tissulaires ou au cours de l’invasion tumorale.
Le protocole présenté ici décrit une méthode de préparation de la CSST qui permet de générer très reproductible, bien conservé les tranches qui peuvent être utilisés pour une variété de recherches expérimentales, comme études invasion neuroprotection ou une tumeur.
Introduction
CSST sont un modèle bien caractérisés in vitro pour étudier les propriétés physiologiques et pathologiques des neurones, les astrocytes et les cellules microgliales1. Il est facile de contrôler l’environnement extracellulaire et de surveiller les changements morphologiques et cellulaires après divers stimuli. L’Organisation des neurones de l’hippocampe et leurs connexions sont bien conservées après préparation2,3. De plusieurs avantages, CSST permettent la surveillance de l’invasion de lésions et tumeurs cérébrales sans chirurgie animale. Six à huit CSST peut être obtenues d’un seul cerveau de rongeur. CSST contribue ainsi à considérablement réduire le nombre d’animaux et permettent de tester plusieurs concentrations du médicament, des manipulations génétiques ou modèles de lésion différents chez le même animal. Dans les essais axés sur la tranche, conditions expérimentales peuvent être contrôlées avec précision. En outre, temps de développement dépendant d’états pathologiques comme dommages secondaires peuvent facilement être surveillés par imagerie de Time-lapse.
Dans le protocole donné, initialement créé par Stoppini et al. 4, les étapes de préparation sont décrites et morphologiques marquants pour la sélection des tranches appropriées sont mises en évidence. Nous vous recommandons la préparation des jours après la naissance, 7-9 rats ou des souris postnatal jour 4-5. Dans ces périodes, la CSST montrent une solide résistance aux traumatismes mécaniques et un potentiel élevé pour la réorganisation des circuits neuronaux. En revanche, préparations des rats adultes ou embryonnaires rapidement modifient leur structure et perdent leur morphologie organotypique pendant la culture et sont donc moins adaptées pour l’étude des processus à long terme dans la recherche fondamentale5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. un autre point critique pour la survie de la CSST est l’épaisseur de la tranche lui-même comme la diffusion et donc l’apport en nutriments sont limitées12,13,14.
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Protocol
des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la politique d’éthique et de la politique sur l’utilisation des animaux dans la recherche en neurosciences, tel qu’approuvé par l’européen collectivités Conseil Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil de l’Union européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.
1. préparation des Instruments et des milieux de Culture
- pour la préparation de la CSST, utiliser l’ensemble des instruments suivants : deux petits ciseaux, deux pinces courbées, une pince à épiler avec une pointe fine, trois lames (deux de taille 11, une de taille 15), trois titulaires de bistouri, tour de papier-filtre (diamètre : 35 mm), agar, une lame de rasoir, un non modifié de pipette Pasteur et une pipette Pasteur sans une pointe de modification. Stériliser tous les matériaux dans un autoclave avant utilisation ( Figure 1).
- Peser 5 g de gélose et dissoudre dans 100 mL d’eau distillée. Stérilisez la solution pendant 20 min à 121,7 ºC à 210,8 kPa en autoclave. Distribuer le 3 mL de solution d’agar liquide dans des plats de Pétri de 60 mm à l’aide d’une pipette de verre stériles, autorisez-le à solidifier pendant 5 h, pellicule de paraffine en plastique pour éviter toute contamination et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure. Blocs de gélose sont nécessaires pour stabiliser le cerveau au cours de la procédure de tranchage.
- Media
- faire 200 mL du milieu préparation (pH 7,35) constitué d’un milieu essentiel minimal (MEM) 198 mL et 2 mL de solution de L-glutamine (concentration finale de 2 mM). Préparer la solution le jour de la préparation des médias et de conserver à 4 ° C.
- Préparer 100 mL de milieu de culture composée de 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' balanced solutions salines (HBSS), 25 mL (v/v) de sérum de cheval normal (NHS), 1 mL de solution de L-glutamine (concentration finale de 2 mM), 100 µg d’insuline, glucose de 120 mg, streptomycine 10 mg , 10 000 U la pénicilline et 800 µg vitamine C comme indiqué précédemment. Chauffer le milieu (37 ° C), ajuster le pH à filtre pH 7,4 et stérile (taille des pores 0,2 µm). Répéter la procédure (échauffement, ajustement du pH, etc..) tous les deux jours avant de changer le support. Utiliser le support au plus une semaine lorsqu’il est conservé à 4 ° C.
- Remplir une boîte de Petri 35 mm avec support de préparation pour stocker le cerveau. Placer deux boîtes de Pétri vide pour recueillir le tissu sur un paquet de refroidissement dans la zone de travail.
2. Préparation et trancher avec un Vibratome
- utilisation cerveaux de rats vieux de 7 à 9 jours ou 4 à 5 jours des souris âgées pour la préparation de la CSST selon Stoppini et al.. 4 après décapitation d’animaux, enlever la peau du crâne avec des ciseaux.
- Introduire la lame de ciseaux fine dans le trou occipital et ouvrir le crâne en coupant l’axe caudal rostral (retour) (avant). Faire deux coupes perpendiculaire au premier, pour que les ciseaux pointent vers l’oreille gauche et droite, respectivement (" T-incision ").
- Ouvrir avec précaution le crâne avec une pince fine, attention ne pas à blesser le cerveau. Utiliser un scalpel (taille de lame 11) pour couper la partie rostrale plus du pôle frontal et le cervelet.
- Au moyen d’une spatule, enlever le cerveau et le placer soigneusement dans la boîte de Pétri remplie de moyen de préparation ( Figure 2). Positionner le cerveau sur le porte-échantillon et le fixer avec de la colle cyanoacrylate médicale. Utilisez les pièces de gélose pour assurer la stabilisation mécanique.
- Disséquer les tissus horizontalement en 350 µm CSST épaisse à l’aide d’un coulissant vibratome.
- Évaluer les tranches optiquement à l’aide d’un microscope binoculaire. Jeter immédiatement CSST de piètre qualité. Il est important de prendre seulement ces tranches avec intact cytoarchitecture isolée de la partie médiane de l’hippocampe (voir Figures 3 et 4) entre la dorsale et l’hippocampe ventral.
- Séparer la région de l’hippocampe et le cortex entorhinal, à l’aide d’un scalpel (tour de taille de lame 15 ; la figure 3). Le cortex entorhinal et de voie de perforante doit être préservé.
- Six à huit CSST sont prélevés sur chaque cerveau. 2-3 tranches de transfert dans l’insert de culture d’une seule cellule (pore taille 0,4 µm) et le placer dans une cupule d’une boîte de 6 puits culture contenant 1 mL de milieu de culture par puits.
- Incuber les paraboloïdes 6 à 35 ° C dans une atmosphère complètement humidifiée avec 5 % (v/v) de CO 2 et changer le milieu de culture cellulaire chaque deuxième jour.
Remarque : Effectuer vos expériences au jour 6 in vitro (div). Des réactions inflammatoires associées à la procédure de tranchage disparaissent par jour 6. À ce stade, les cellules microgliales réafficher une morphologie ramifiée et connexions synaptiques ont mûri.
3. Évaluation de la qualité des tissus
- Fixation, étiquetage et visualisation de la dégénérescence des neurones en CSST
- après avoir effectué les expériences, incuber le CSST avec 5 µg/mL d’iodure de propidium (PI) pendant 2 h avant la fixation, dans ordre de colorer les noyaux de neurones dégénérescentes.
ATTENTION : PI est une substance cancérogène, portez toujours des équipement de protection individuelle (EPI) tel que des gants. - Laver le CSST avec tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) et fixez-les avec une solution à 4 % (v/v) de paraformaldéhyde (PFA) pendant 24 h.
ATTENTION : PFA est un cancérogène toxique et suspects. Travailler sous hotte aspirante et porter les EPI. - Laver le CSST à inserts avec 1 mL de PBS et utilisez une brosse de gréeur pour séparer les tranches de la membrane.
- Label le CSST avec colorant 4 IB dans une plaque 24 puits ( Figure 5).
- après avoir effectué les expériences, incuber le CSST avec 5 µg/mL d’iodure de propidium (PI) pendant 2 h avant la fixation, dans ordre de colorer les noyaux de neurones dégénérescentes.
- Conduction d’expériences d’invasion tumorale à l’aide de fluorescent étiqueté monocellules
- 24h avant le début d’une expérience, numéroter les cellules tumorales en utilisant le colorant fluorescent carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFDA SE).
- Détacher et compter les cellules de la tumeur en utilisant une chambre Neubauer.
- Remettre en suspension les cellules dans un milieu, telle que 10 µL de suspension contient le nombre de cellule désiré (normalement 50 000 ou 100 000 cellules).
- Appliquer 10 µL de la suspension de cellules dans la culture de la tranche et laisser les cellules d’envahir pendant 3 jours.
- à la fin de l’expérience, fixer les cultures de la tranche à l’aide de 4 % (v/v) : PFA pendant 24 h et étiqueter les co-cultures avec PI un autre 24 h à visualiser la cytoarchitecture.
ATTENTION : PFA est un cancérogène toxique et suspects. Travailler sous hotte aspirante et porter les EPI. - Monter les co-cultures sur une lamelle couvre-objet pour une analyse plus approfondie à partir du support de montage.
4. Évaluation des expériences de la CSST
analyser le CSST avec un confocal laser scanning microscope (CLSM). Détection de PI étiqueté, dégénérescence des neurones ou le PI étiqueté cytoarchitecture utiliser une lumière monochromatique de la longueur d’onde λ = 543 nm et une bande d’émission passent de filtre pour les longueurs d’onde λ = 585-615 nm. Pour le CFDA mention des cellules tumorales ou IB 4 cellules microgliales, utiliser une longueur d’onde d’excitation de λ = 488 nm. Pour les deux types expérimentaux, enregistrer une z-pile avec 2 tranches optique µm et utilisé pour l’évaluation.
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Representative Results
Études de Neuroprotection : Pour déterminer les dommages neuronaux, le nombre de noyaux positifs PI et IB4 positif la microglie dans chaque troisième section optique de la couche de cellules de granules (GCL) du gyrus denté (DG) a été comptée. Pour des expériences d’invasion tumorale, la z-projection d’intensité maximale de la pile a été utilisée pour calculer la superficie couverte par les cellules tumorales, en guise d’invasion et de visualiser les modèles différents invasion (Figure 6).
Dans le témoin non traité CSST (CTL), neurones est resté préservés. Dans la GCL de la DG presque aucun PI positifs noyaux neuronaux (Figure 5 a) ont été observés. Dans la couche moléculaire, la majorité des cellules microgliales était ramifiée. Dans la GCL de la DG, seulement très peu IB4 positif microglies (Figure 5 a) ont été détectés. Après incubation avec l’acide de N-méthyl-D-aspartique 50 µM (NMDA) une forte augmentation du nombre de noyaux neuronaux positifs de PI (Figure 5 b) et microglies IB4 positive (Figure 5 b) a été détectée par rapport au contrôle CSST. CSST préalablement endommagé de moins bonne qualité peut être identifié par un nombre plus élevé de la microglie amiboïde et cellules positives PI de la DG (Figure 5) dans des conditions de contrôle. Traitement des tranches préalablement endommagés avec NMDA conduit à destruction de DG cytoarchitecture et un très grand nombre de cellules de mort positive PI s’étendre à l’hile et de la région CA3 (Figure 5).
Études d’invasion tumorale : Tranches ont été traités avec 50 000 cellules des deux lignées de cellules de glioblastome U138 (Figure 6 a) et LN229 (Figure 6 b) pendant trois jours. Dans les deux cas la cytoarchitecture des cultures tranche est restée intacte et le DG et le cornu ammonis furent conservées. En outre, tous les deux montrées un comportement distinct invasion de lignées de cellules. Tandis que les cellules U138 forment ronds, nettement distincts des tumeurs (Figure 6 a), les cellules LN229 ont construit un réseau de tumeur dans les sphéroïdes tumeur unique et étaient souvent difficiles à distinguer. Quand on regarde le montant de la masse tumorale dans les cultures de la tranche, une invasivité plus élevée pour les cellules de LN229 a été trouvée par rapport aux cellules U138.
FIGURE 1 : outils de Dissection et de matériaux. Pour la préparation des cultures de la tranche, une gamme appropriée d’instruments de dissection et matériaux est nécessaire comme indiqué. L’ensemble comprend trois bistouris à petites lames interchangeables, une spatule, deux des ciseaux fins, trois pinces, une pipette de Pasteur normal, une pipette Pasteur sans pointe, agar, Pétri, papier filtre, un paquet de refroidissement moyen de préparation et medical colle cyanoacrylate. Les outils de dissection doivent être stérilisés avant usage et logé dans un emballage en plastique pour le garder dans une atmosphère stérile. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
FIGURE 2 : emplacement de la formation hippocampique du cerveau de rat. La formation hippocampique, illustrée par la ligne pointillée noire est une structure bilatérale délimitée par le cortex cérébral et le thalamus. Les bourrelets de hippocampe dans la corne temporale du ventricule latéral. L’hippocampe est bilaminaire, consistant en le cornu ammonis (hippocampe appropriée) et le gyrus gyrus (ou fascia gyru), avec un limbe enroulé à l’intérieur de l’autre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
FIGURE 3 : visualisation de rat CSST. Une tranche de cerveau entier contenant la CSST est visualisée en jumelles pour évaluer la qualité du tissu. Tranches sont conservés dans une boîte de Pétri remplie de milieu de la préparation refroidie (A, B). Grossissement de la tranche de cerveau. L’hippocampe intact (HC) et le cortex entorhinal sont visibles à gauche et à droite de l’image (C). CSST est séparée du reste du cerveau. La couche de cellules de granules (GCL) de la DG, sous-champs cornu ammonis CA1 et CA3, la région du hile (HI), le cortex entorhinal (EC) et la couche moléculaire (ML) sont clairement reconnaissables (D). C, D: Echelle = 4 mm.
FIGURE 4 : Modifications dépendantes de l’heure en CSST.
Directement après la préparation, la microglie et les astrocytes commencent à former une cicatrice gliale. De 1 à 3 jours in vitro (div) gliose et oedème formation sont observés. La stratification de la formation hippocampique et DG n’est plus visible. Au niveau cellulaire, CSST div 5 affiche une réduction du nombre des lymphocytes activés. À 6 div, presque aucun œdème n’est présent, la tranche est plus mince et les domaines inclus dans les circuits de neurones intrinsèques ont survécu. CSST peut maintenant être utilisé pour les expériences. Echelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
FIGURE 5 : évaluation de la qualité des tissus par CLSM. Tel que révélé par CLSM, une bonne préservation neuronale est observée dans le contrôle non lésés CSST (CTL). Pratiquement aucun noyaux neuronaux (rouges) chez les positifs de PI et seulement quelques IB4 positif les cellules microgliales (verts) sont trouvent dans la couche de cellules de granules (GCL) de la DG (A). Contrairement à la CSST non lésés, une forte augmentation du nombre de PI et IB4 cellules positives est visible dans la GCL de NMDA-lésés CSST (B). Veuillez noter la morphologie de la DG, les cellules microgliales activés et un grand nombre de noyaux positifs PI à la CSST avant endommagé (C, D). Barres = 50 µM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
FIGURE 6 : visualisation d’invasion tumorale par CLSM. PI (en rouge) appliqués après les étiquettes de fixation la cytoarchitecture de la CSST, CFDA (en vert) illustre les cellules tumorales envahissent la tranche. Le processus d’invasion des cellules U138 est visualisé après trois jours de temps de l’invasion. Sphéroïdes tumeur uniquesont clairement reconnaissables (A). En revanche, la lignée de cellules de glioblastome LN229 formé un réseau de tumeur (B). Barres = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le présent protocole décrit la préparation de la CSST. Ce modèle permet de tester les capacités intrinsèques et les réactions du tissu cérébral après l’application de stimuli physiologiques et pathologiques. En plus des analyses des paramètres électrophysiologiques, CSST peut être lésé, et les effets de dégâts sur tous les types de cellules peuvent être déterminés. Traitement avec différentes matières, la description détaillée des procédés de lésion ou de guérison en l’absence des macrophages et des lymphocytes est possible.
The Most les étapes essentielles pour un succès de la préparation et de la culture sont à : 1) travailler dans des conditions stériles, 2) préparer les médias correctement, compte tenu de la température et le pH et 3) développer la dextérité manuelle nécessaire lors de la manipulation de la CSST.
Caractéristiques de la CSST
En raison de la morphologie non altérée des cellules neuronales et leur en vivo-comme l’organisation, les tranches sont appelés organotypique. Le CSST se composent de la couche pyramidale et strate granuleuse, composée du pyramidal cornu ammonis (CA1, CA2, CA3) et DG de cellules granulaires. Parties de l’hippocampe sont très ordonnées et les projections de la fibre afférente se terminent par couches distinctes d’une manière non chevauchantes. Les efferences entre le cortex entorhinal (la voie perforante), DG, CA3 et CA1 neurones restent intacts après la préparation et de se comporter fonctionellement semblables à ces in vivo. Comme précédemment indiqué, développement des arbres dendritiques, activités de formation et réseau de synapse des cellules granulaires de CSST sont comparables aux tranches aiguës fois détectée contrôles14,15,16.
Oligodendrocytes et astrocytes ont été étudiés à la CSST par tant de lumière et de la microscopie électronique. Oligodendrocytes affichent une répartition spatiale organotypique, y compris les différents sous-types morphologiques17,18. En outre, les axones sont myélinisées durant la première quinzaine in vitro. Certains auteurs l’hypothèse que la couche de la localisation spécifique des astrocytes est absente dans les cultures de tranche et de croire que les astrocytes n’atteignent pas une pleine maturation in vitro. Cet aspect ne peut y répondre pleinement, puisque des marqueurs spécifiques pour toutes les étapes d’activation des astrocytes sont toujours portés disparus,1,19,20.
Dans les 3 premiers jours après la préparation, les cellules microgliales répondent avec migration et prolifération et s’accumulent à la surface de la tranche où ils forment la cicatrice gliale et astrocytes. Toutes les cellules semblent être dans un état fortement activés. Toutefois, dans les couches internes de la CSST et entre 3 et 6 div, les cellules microgliales changent leur morphologie amiboïde vers une forme ramifiée, caractérisée par petits corps cellulaires et de longues ramifications fines protubérances cytoplasmiques étendus dans toutes les directions21 ,,22.
Expression semblable et la distribution des récepteurs de glutamate ont été signalés dans les tissus adultes et CSST2,23. La fréquence des courants synaptiques, les courants synaptiques de la miniature et la fréquence des GABAergique courants dans les CSST (7, 14 et 21 div) ne sont pas significativement différents par rapport aux préparations aiguës sur 14 ou 15 jours respectivement. En revanche, la fréquence des signaux glutamatergiques est plus élevée dans la CSST qu’en tranches aiguë15.
Comparaison des méthodes de préparation différentes
La préparation du tissu postnatal embryonnaire et le début est assez facile, à cause de la cellule bonne survie taux in vitro. On devrait considérer qu’à ce stade précoce, les cellules neuronales sont toujours migrateurs et active conduisant à une perte d’organisation organotypique de tranches1. Après 7 à 9 jours après la naissance, certaines connexions synaptiques chez les rats sont établies. Pendant le prochain 2-3 semaines in vitro les synapses mature13. Un des avantages du modèle présenté est sa résistance aux traumatismes mécaniques au cours de la préparation et à sa grande plasticité en raison de l’âge des animaux (7-9 jours)1,14,24. Il faut mentionner que les tranches sont très sensibles aux manipulations mécaniques par des instruments. Même le mauvais angle de découpage peut causer la pente coupe des fibres neuronales responsables antérograde ou rétrograde mort neuronale. La préparation des cultures de la tranche des animaux adultes à des fins à long terme est difficile et toujours pas établie. Ce CSST montrent une dégénérescence massive peu après la préparation, probablement en raison de la perte de plasticité1. Néanmoins, il y a un grand besoin d’une méthode de préparation permettant de travailler avec tranches adultes.
Pour plusieurs méthodes de préparation, le tissu fraîchement excisé est en tranches d’une épaisseur de 300-400 µm, utiliser un hachoir de tissu pour couper l’hippocampe isolé. Cette méthode rapide fréquemment peut entraîner des lésions tissulaires généralisée. Des facteurs critiques pour la qualité de la CSST sont leur épaisseur finale et le temps qu’ils sont conservés in vitro. Les meilleurs résultats avec les taux de survie plus élevés ont obtenu pour 300-400 µm tranches épaisses. En tranches plus épaisses couches supérieures dégénèrent pendant le temps de la culture en raison de limitations de diffusion1. Selon les questions scientifiques posées, CSST sont utilisés directement après préparation ou après plusieurs jours de culture. Par conséquent, au cours des années plusieurs techniques de culture ont été créés, comme le Tube d’enroulement technique1,13 ou tranche statique techniques4.
Des méthodes de préparation différents, nous sommes convaincus qu’en utilisant la technique de l’interface avec un vibratome est la procédure plus précise et moins dommageable pour la préparation des CSST à ce jour. Cette méthode est encore améliorée par l’utilisation de membranes poreuses. CSST garder leur structure 3D, rester morphologiquement et fonctionnellement intacte pendant des mois et peuvent être visuellement évalués au cours de la période de culture25.
Applications
CSST peut être préparé à la fois sauvage et animaux transgéniques14,26. Elles survivent pendant des mois et des options pour12,13de l’expériences à long terme. CSST sont utilisés pour traiter les questions physiologiques, pharmacologiques, morphologiques et développement14,27 sous très standardisée orageux application chronique de neurotherapeutics ou cellules souches thérapie26,27,28. L’étude des aspects relatifs au développement de la connectivité neuronale ou procédés liés à la transmission synaptique, la plasticité synaptique, effets d’épilepsie chronique des épines dendritiques des cellules pyramidales, ou neurogenèse tous représentent des champs supplémentaires 29,30,31,32.
Glutamate, le neurotransmetteur excitateur principal et récepteurs de glutamate ionotropiques jouent un rôle central dans l’excitotoxicité. Excitotoxique des lésions se produisent au cours des maladies neurologiques comme les accidents vasculaires cérébraux, maladie d’Alzheimer, neurotoxicité VIH, traumatisme crânien et réparation mécanismes14,24. Application des agonistes des récepteurs de glutamate NMDA, l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic (AMPA) ou l’acide kaïnique CSST imite sélective et région des cellules neuronales spécifiques mort26,28,33 ,,34. En outre, réponse de cellule gliale aux lésions neuronales par exemple, migration des microglies et phagocytose en CSST ont été précédemment analysées3,35. L’influence des microglies au cours de la lésion peut être prédite par déplétion pharmacologique de ces cellules par le bisphosphonate clodronate36.
Une application le plus importante pose imitant en vivo modalités des enquêtes d’invasion tumorale à l’aide de la CSST. Sphéroïdes formés par les lignées de cellules de gliome étaient capables d’envahir les cultures de la tranche, un phénomène qui a des espèces qui se chevauchent de37. Le modèle de l’infiltration diffuse des lignées cellulaires utilisées ressemblait le patron observé in vivo37. En outre, glioblastome primaire sphéroïdes implantés dans CSST gardé leur invasion potentielle, et le caractère de cellules souches pendant plusieurs jours en vitro38. Ainsi, le modèle permet l’observation des motifs de l’invasion et les interactions entre les tissus neuronaux et les cellules tumorales qui correspondent à ceux observés en vivo37,,38. En comparaison de collagène ou de gel (par exemple) des modèles basés sur39, l’utilisation de la CSST semble plus avantageux pour les analyses sur l’invasion tumorale et des métastases dans le cerveau. Le milieu physiologique, y compris les types de cellules neuronales et gliales et la matrice extracellulaire, reste intact.
De plus, la CSST permettent étudie les interactions directes entre les cellules de tumeur unique et de tissu cérébral dans des conditions contrôlées. Par exemple, les cellules microgliales trouvées pour améliorer les capacités des cellules tumorales à pénétrer dans le cerveau en formant les directeurs de structures pour invasion35.
En outre, l’effet des altérations cellulaires transitoires et permanentes sur les processus d’invasion peut être analysé. Une expression stable de gène de cancer du colon métastases associées 1 (MACC1) dans les cellules de gliome a été associée à une prolifération accrue et l’invasion subséquente40. L’altération transitoire de la rigidité de la cellule en lignées de cellules de glioblastome est directement corrélée avec les propriétés invasives des cellules lignes41. CSST et tumeur cellules co-cultures donc potentiellement utilisable pour la reproduction des observations cliniques et à l’invasion de tumeur modèle et image dans des conditions très contrôlées et standardisées, le dépistage des drogues.
Après des études dans des cultures cellulaires primaires, CSST sont le choix logique suivant pour réaliser des expériences dans un système plus complexe, rapprochant les conditions in vivo . Un autre domaine d’intérêt dans des tranches de cerveau est le dépistage de drogues thérapeutiques potentiels avant l’essai in vivo. Tranches de cerveau permettant un contrôle et imitant des blessures sous le contrôle de l’observateur et sans chirurgie animale. Jusqu'à 8 CSST peut être obtenu et le nombre d’animaux nécessaires est considérablement réduit. Il est possible d’obtenir des résultats dans le même animal sous paramètres similaires, mais avec différents ou plusieurs conditions. Ainsi, la CSST est un outil puissant d’observer entre autres des changements morphologiques, moléculaires et cellulaires au cours de la période de la lésion, le développement de dommages secondaires et la propagation de la tumeur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier Christine Auste pour son soutien avec l’enregistrement vidéo et Chalid Ghadban pour son excellente assistance technique. Urszula Grabiec était soutenue par le Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
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