Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

Published: August 27, 2017 doi: 10.3791/55359
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Anatomy, University of Otago
* These authors contributed equally

Summary

Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.

Abstract

בתרבויות organotypic פרוסה בהיפוקמפוס (OHSC), המאפיינים פונקציונלי מורפולוגיים של שני נוירונים ותאי גלייה הם השתמרה היטב. מודל זה מתאים פונה שאלות מחקריות שונות הכרוכות מחקרים על neuroprotection, אלקטרופיזיולוגיות ניסויים הנוירונים, רשתות עצביים או גידול הפלישה. האדריכלות בהיפוקמפוס ואת פעילות. עצבית ב מעגלים multisynaptic הם טוב שמור ב OHSC, למרות הנוהל עם פרוסות עצמה בתחילה נגעים ומובילה היווצרות צלקת גליה. היווצרות צלקת משנה יש להניח את תכונות מכניות וההתנהגות דיפוזיה של מולקולות קטנות, וכו '. פרוסות לאפשר פיקוח על תהליכי תלויות זמן לאחר פגיעה מוחית ללא ניתוח בעלי חיים, וכן מחקרים על אינטראקציות בין סוגי תאים במוח-derived שונים, כלומר האסטרוציטים, מיקרוגלייה ו נוירונים תחת פיזיולוגיים ופתולוגיים תנאים. היבט אמביוולנטי של מודל זה הוא העדר זרימת דם ותאי דם חיסוניים. במהלך ההתקדמות של הפגיעה העצבית, העברת תאים חיסוניים מהמחזה דם תפקיד חשוב. כאשר תאים אלה חסרים לפרוסות, התהליכים מהותי בתרבות ייבחנו ללא הפרעה חיצונית. יתר על כן, ב- OHSC ההרכב של הסביבה בינוני-חוץ נשלטת בצורה מדויקת. יתרון נוסף של שיטה זו הוא המספר הנמוך יותר של חיות שהקריבה עצמה לעומת סוגי הפינויים הסטנדרטיים. ניתן להשיג את מספר OHSC מחיה לחיה ביצוע מחקרים בו זמנית עם מספר טיפולים אפשריים חיה אחת. מסיבות אלו, OHSC מתאימים היטב כדי לנתח את ההשפעות של הרפוי מגן חדש לאחר נזק לרקמות או במהלך הפלישה הגידול.

פרוטוקול שהוצג כאן מתאר שיטת הכנה OHSC המאפשרת יצירת מאוד לשחזור, ישמרו פרוסות יכול לשמש למגוון רחב של מחקר ניסיוני, כמו מחקרים הפלישה neuroprotection או גידול.

Introduction

OHSC הם מודל מאופיין היטב במבחנה ללמוד מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים, האסטרוציטים מיקרוגלייה1. קל יותר לשלוט בסביבה חוץ-תאית ולעקוב אחר השינויים הסלולר מורפולוגי אחרי גירויים שונים. הארגון של נוירונים בהיפוקמפוס והקשרים שלהם הם שנשתמרו לאחר הכנה2,3. מתוך מספר יתרונות, OHSC לאפשר פיקוח על הפלישה פציעה, גידול במוח ללא ניתוח בעלי חיים. 6-8 OHSC ניתן להשיג מוח מכרסמים יחיד. OHSC ולכן הם מסייעים באופן משמעותי להפחית את מספר בעלי החיים ולאפשר בדיקות סמים ריכוזים מרובים, שינויים גנטיים או מודלים שונים הנגע אותה חיה. במבחני המבוסס על פרוסה, תנאים ניסיוני יכול להיות דווקא נשלט. בנוסף, זמן פיתוח תלות של מצבים פתולוגיים כמו נזקים משניים יכול בקלות יהיה פיקוח על ידי הדמיה בצילום מואץ.

בפרוטוקול נתון, שנוסדה במקור על ידי Stoppini. et al. 4, ההכנה המתוארת, ציוני מורפולוגי החשובים לבחירת פרוסות המתאים מודגשים. אנו ממליצים על הכנת כמחנכת יום 7-9 חולדות או עכברים כמחנכת ביום 4-5. בתקופות אלה, OHSC מראים התנגדות חזקה טראומות מכני ובעל פוטנציאל גבוה רה-ארגון של מעגלים עצביים. לעומת זאת, גלמי חולדות עובריים או למבוגרים במהירות לשנות את המבנה שלהם מאבדים מורפולוגיה organotypic שלהם במהלך הטיפוח-תרגול ואת ולכן מתאימים פחות לימוד לטווח ארוך בתהליכי מחקר בסיסי5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. עוד נקודה קריטית עבור שיעור הישרדות של OHSC הוא עובי הפרוסה עצמה כמו דיפוזיה ובכך אספקת מזונם הם מוגבלים12,13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים בוצעו על פי מדיניות של האתיקה ומדיניות השימוש בבעלי חיים במחקר מדעי המוח כפי שאושר על-ידי באירופה קהילות המועצה דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי, מועצת האיחוד האירופי בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות.

1. הכנה של מכשירים ומדיה תרבות

  1. עבור הכנת OHSC להשתמש בערכת הבאה של מכשירים: שני מספריים קטנים, שני פינצטה מעוקל, פינצטה אחד עם טיפ בסדר, שלושה להבים (שניים בגודל 11, אחד בגודל 15), שלושה בעלי אזמל, לעגל מסנן המסמכים (קוטר: 35 מ מ), אגר, סכין גילוח אחד, אחד יבוצעו בהם שינויים פסטר פיפטה, 1 שונה פסטר פיפטה ללא טיפ. לעקר את כל החומרים ב החיטוי לפני השימוש ( איור 1).
  2. שוקל 5 g אגר, להמיס במים 100 מ ל מזוקק. לעקר את הפתרון עבור 20 דקות ב 121.7 ° C ב kPa 210.8 ב החיטוי. להפיץ את הפתרון אגר נוזלי 3 מ"ל ב 60-מ מ פטרי באמצעות פיפטה של זכוכית סטריליים, לאפשר לו לחזק עבור 5 שעות, לכסות עם פרפין פלסטיק הסרט כדי למנוע זיהום ולאחסן ב 4 ° C עד להמשך השימוש. קוביות אגר יש צורך לייצב את המוח במהלך ההליך עם פרוסות.
  3. מדיה
    1. להפוך 200 מ"ל של המדיום הכנה (pH 7.35) המורכב מ ל 198 בינוני חיוני מינימלי (מאמ) ו- 2 מ לגלוטמין פתרון (ריכוז סופי 2 מ מ). להכין את הפתרון ביום של מדיה הכנה ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס
    2. להכין 100 מ של המדיום תרבות המורכב מ ל 49 גברתי, 25 מ ל הנקס ' מאוזנת פתרונות מלח (HBSS), 25 מ ל (v/v) סוס רגיל סרום (NHS), 1 מ לגלוטמין פתרון (ריכוז סופי 2 מ מ), אינסולין µg 100, 120 מ"ג גלוקוז, סטרפטומיצין 10 מ ג , 10,000 U פניצילין, µg 800 ויטמין C כפי שדווח בעבר. לחמם את המדיום (37 מעלות צלזיוס), התאם את ערך ה-pH pH 7.4 וסטרילי מסנן (0.2 µm גודל הנקבוביות). חזור על הפעולות (מתחמם, התאמת חומציות, וכו ') בכל יומיים לפני שינוי המדיום. השתמש המדיום לכל היותר שבוע אחד כאשר הוא מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס
  4. למלא אחד 35 מ מ צלחת פטרי עם הכנה בינונית כדי לאחסן את המוח. במקום שתי צלחות פטרי ריק עבור איסוף הרקמה על חבילת קירור באזור העבודה.

2. הכנה, Slicing עם Vibratome

  1. שימוש המוח בת 7-9 יום חולדות או 4-5 יום עכברים הישן להכנת OHSC על פי Stoppini et al. 4 אחרי עריפת ראש של בעלי חיים, מסירים את העור של הגולגולת עם מספריים.
  2. להציג את להב מספריים בסדר לתוך נקב המאגנום ופתח את הגולגולת על ידי גזירה לאורך הציר סימטרית (קבלה) rostral (חזרה). יצירת שני חתכים בניצב הראשונה, כך המספריים הצבע לכיוון האוזן ימינה ושמאלה, בהתאמה (" T-החתך ").
  3. פתח את הגולגולת בזהירות עם מלקחיים בסדר, תשומת לב לא לפגוע במוח. השימוש באזמל (גודל להב 11) לחתוך את החלק rostral ביותר של הקוטב חזיתית ואת המוח הקטן.
  4. אומר על ידי מריבה, מסירים את המוח ואז מניחים אותה בזהירות צלחת פטרי עם הכנה בינונית ( איור 2). מקם את המוח על המחזיק הדגימה ותקן אותה באמצעות דבק רפואי דבק מגע. להשתמש את החלקים של אגר כדי להבטיח מייצב מכני.
  5. לנתח את הרקמה אופקית על 350 מיקרומטר עבה OHSC באמצעות vibratome הזזה של.
  6. להעריך את פרוסות באמצעות מיקרוסקופ דו-עינית אופטית. להתעלם OHSC של איכות נמוכה באופן מיידי. חשוב לקחת רק את הפרוסות עם שלם cytoarchitecture מבודד מן החלק האמצעי של ההיפוקמפוס (ראה דמויות 3 ו- 4) בין מהראש ההיפוקמפוס הגחון.
  7. נפרדים של ההיפוקמפוס, קליפת entorhinal באמצעות אזמל (סיבוב הלהב גודל 15; איור 3). מסלול perforant קליפת המוח entorhinal חייב להישמר.
  8. OHSC 6-8 התקבלו כל המוח. להעביר 2-3 פרוסות לתוך תא אחד תרבות הוספה (נקבוביות בגודל 0.4 מיקרומטר) ולמקם אותו אחד טוב של מנה 6-ובכן תרבות המכיל 1 מ"ל בינוני תרבות לכל טוב.
  9. דגירה הכלים 6-ובכן 35 ° C באווירה humidified באופן מלא עם 5% (v/v) CO 2 ולשנות המדיום התרבות התא בכל יום שני-
    הערה: לנהל את הניסויים שלך ב 6 יום במבחנה (div). תגובות דלקתיות המשויך ההליך עם פרוסות נעלמים ביום 6. בשלב זה, תאים microglial להראות מורפולוגיה כחוד שוב, קשרים סינפטיים הבשילו.

3. הערכת איכות רקמת

  1. יציבות, תיוג והדמיה של נוירונים המתנוונת ב- OHSC
    1. לאחר ביצוע הניסויים, דגירה של OHSC עם 5 יודיד propidium µg/mL (PI) כבר שעתיים לפני קיבוע, ב כדי להכתים את הגרעינים של נוירונים המתנוונת.
      התראה: פאי הוא קרצינוגן חשד, תמיד ללבוש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כגון כפפות.
    2. לרחוץ את OHSC עם מאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4) ותקן אותן עם פתרון 4% (v/v) של paraformaldehyde (PFA) עבור ה 24
      התראה: PFA הוא קרצינוגן רעיל, החשודות. לעבוד תחת מכסה המנוע fume וללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי.
    3. לרחוץ את OHSC ב מוסיף עם 1 מ"ל PBS ולהשתמש במברשת חבלה פרוסות להפריד הקרום.
    4. לתייג את OHSC עם צבע 4 ליברות לתוך צלחת 24-טוב ( איור 5).
  2. הולכה של הגידול הפלישה ניסויים באמצעות fluorescently שכותרתו תאים בודדים
    1. 24 שעןת לפני תחילת הניסוי, תווית לתאי הגידול באמצעות succinimidyl diacetate Carboxyfluorescein של הפלורסנט אסתר (CFDA SE).
    2. ניתוק ולספור את תאי הגידול באמצעות תא נויבאואר.
    3. Resuspend התאים מדיום, כך µL 10 של השעיה מכיל את מספר התאים הרצוי (בד כ 100,000-50,000 תאים).
    4. החל µL 10 של התליה תא אל התרבות פרוסה ולאפשר את התאים לפלוש במשך 3 ימים.
    5. בסוף הניסוי, לתקן את התרבויות פרוסה באמצעות 4% (v/v) מחברים עבור 24 שעות ולאחר תווית התרבויות שיתוף עם PI עבור עוד 24 שעות ביממה כדי להמחיש את cytoarchitecture.
      התראה: PFA הוא קרצינוגן רעיל, החשודות. לעבוד תחת מכסה המנוע fume וללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי.
    6. הר התרבויות שיתוף על תגית כיסוי לצורך ניתוח נוסף באמצעות התקשורת הרכבה.

4. הערכה של ניסויים OHSC

לנתח את OHSC עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM). זיהוי של פאי שכותרתו, מושחת נוירונים או החוקר הנקרא cytoarchitecture להשתמש אור מונוכרומטי λ אורך גל = 543 nm ו להקת פליטה לעבור סינון עבור אורכי גל λ = nm 585-615. עבור CFDA שכותרתו תאים סרטניים או מיקרוגלייה 4 ליברות, השתמש של גל עירור של λ = 488 ננומטר. לשני סוגי ניסיוני להקליט z-מחסנית עם 2 מיקרומטר אופטי פרוסות עבות ומשמש להערכה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקרים Neuroprotection: כדי לקבוע נזקים עצביים, מספר גרעינים חיובי PI ו ליברות4 חיובי נספר מיקרוגלייה בכל מקטע אופטי השלישי של השכבה תא גרגר (שזכתה) של הכישור משוננת (ג'י). לניסויים הפלישה הגידול, בעוצמה מירבית z-ההקרנה של הערימה שימש לחישוב השטח המכוסה תאים סרטניים, כאמצעי של הפלישה וכדי להמחיש דפוסים שונים הפלישה (איור 6).

הפקד אינו מטופל OHSC (CTL), נוירונים נשארו שהשתמרה היטב. ב שזכתה של די. ג'י נצפו כמעט אין PI חיובי עצביים גרעינים (איור 5A). שכבה מולקולרית, הרוב המכריע של תאים microglial היו וביורוקרטים. ב שזכתה של די. ג'י, רק מעט מאוד ליברות4 microglial חיובי תאים (איור 5A) אותרו. לאחר דגירה עם 50 מיקרומטר N-מתיל-D-אספרטית (NMDA) חזק להגדיל את מספר גרעינים עצביים חיוביים PI (איור 5B), תאים microglial חיוביים4 ליברות (איור 5B) זוהה בהשוואה שליטה OHSC. OHSC מראש פגום של איכות נמוכה ניתן לזהות לפי מספרים גבוהים יותר של מיקרוגלייה amoeboid, בתאים די. ג'י (איור 5C) בתנאים בקרה חיובית PI. בטיפול לפרוסות פגומות מראש עם NMDA הובילה להרס של די. ג'י cytoarchitecture, מספר גבוה מאוד של תאים מוות חיובי PI הפצת hilum ואזור CA3 (איור 5D).

הגידול הפלישה מחקרים: פרוסות שטופלו 50,000 תאים של הקווים תא גליובלסטומה שני U138 (איור 6A) ו LN229 (איור 6B) למשך שלושה ימים. בשני המקרים cytoarchitecture של התרבויות פרוסה נותרו ללא פגע, את ammonis cornu, את די. ג'י נשתמרו. יתר על כן, שניהם תא קווים הראו התנהגות ברורים הפלישה. בעוד U138 תאים נוצר גידולים עגול, נבדל ברור (איור 6A), תאים LN229 נבנה רשת הגידול בתוך גידול יחיד spheroids, היו לרוב קשה להבחין. כאשר מסתכלים על כמות מסת הגידול בתרבויות פרוסה, invasiveness גבוה יותר עבור תאים LN229 נמצאה בהשוואה U138 תאים.

Figure 1
איור 1: ניתוח כלים וחומרים. עבור הכנה של תרבויות פרוסה, ערכה מתאימה של דיסקציה כלים וחומרים נדרש כפי שמוצג. הסט כולל שלושה ואזמלי מנתחים עם להבים להחלפה קטן, מרית אחת, שני מספריים בסדר, מלקחיים שלושה, אחד נורמלי פסטר פיפטה, פיפטה פסטר אחד ללא עצה, אגר, צלחות פטרי, נייר סינון, pack קירור, הכנה בינונית, רפואי דבק מגע, דבק. כלי ניתוח חייבים להיות בלוק לפני השימוש והניח באריזת פלסטיק כדי לשמור על אווירה סטרילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מיקום של היווצרות בהיפוקמפוס במוח עכברוש. היווצרות בהיפוקמפוס, המוצגת על ידי הקו המקווקו שחור הוא מבנה דו צדדיים התחומה על ידי קליפת המוח התלמוס. ההיפוקמפוס מתנפח לתוך הקרן הטמפורלי של החדר הלטראלי. ההיפוקמפוס הוא bilaminar, המורכב של ammonis cornu (ההיפוקמפוס נאות) לבין משוננת הפיתול (או fascia משוננת), עם אחד פרופריה מגולגל בתוך זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ויזואליזציה של עכברוש OHSC. פרוסה כל המוח המכיל OHSC הוא מדמיין מאת משקפת כדי להעריך את איכות רקמת. פרוסות נשמרים בצלחת פטרי מלא בינוני הכנה מקורר (A, B). ההגדלה של הפרוסה המוח. היפוקמפוס נפגע (HC), entorhinal קליפת גלויים בצד ימין וגם בצד ימין של התמונה (C). OHSC מופרד משאר חלקי המוח. השכבה תא גרגר (שזכתה) של די. ג'י, cornu ammonis שדות משנה CA1, CA3, באזור hilus (איץ ' אי), קליפת entorhinal (EC), השכבה המולקולרית (ML) הם ניתן להבחנה ברורה (D). C, D: סולם בר = 4 מ מ.

Figure 4
איור 4: פעם משתנה תלוי ב- OHSC.
ישירות לאחר ההכנה, מיקרוגלייה האסטרוציטים מתחילים ליצירת צלקת גליה. מ- 1-3 ימים במבחנה (div) gliosis ובצקת היווצרות שנצפו. השיכוב של היווצרות בהיפוקמפוס, די. ג'י אינה גלויה. ברמה התאית, OHSC על 5 div להציג ירידה במספר התאים מופעל. ב 6 div, כמעט אין בצקת קיים, הפרוסה דק יותר, האזורים הכלולים של מעגלים עצביים מהותי שרדו. כעת ניתן להשתמש OHSC על הניסויים. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הערכת איכות רקמת מאת CLSM. כפי CLSM, שימור עצביים טוב הוא ציין בפקד שאינו-lesioned OHSC (CTL). כמעט אין PI חיובי עצביים גרעינים (אדום) ותאים רק כמה ליברות4 microglial חיובי (ירוק) נמצאים בשכבה תא גרגר (שזכתה) של די. ג'י (A). בניגוד OHSC lesioned, עלייה חזקה מספר תאים חיוביים4 PI ו ליברות מוצגת ב שזכתה של NMDA-lesioned OHSC (B). אנא שימו לב המורפולוגיה של DG, תאים microglial הופעל ומספר רב של PI גרעין חיובי ב- OHSC מראש פגום (C, D). ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ויזואליזציה של הגידול לפלישה CLSM. PI (באדום) להחיל לאחר התוויות קיבוע של cytoarchitecture של OHSC, בעוד CFDA (בירוק) מדגים את תאי הגידול פולשים הפרוסה. התהליך הפלישה של תאים U138 הוא מדמיין לאחר שלושה ימים של זמן הפלישה. גידול יחיד spheroidsהם ניתן להבחנה ברורה (A). לעומת זאת, הקו תא גליובלסטומה LN229 הקימו רשת הגידול (B). ברים = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת OHSC. דגם זה מאפשר בדיקה של תגובות של רקמת המוח ויכולות מהותי לאחר היישום של גירויים פיזיולוגיים ופתולוגיים. מלבד ניתוחים של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיות, OHSC יכול להיות lesioned, ההשפעות של נזק על כל סוגי תאים יכול להיקבע. טיפול עם חומרים שונים על תיאור מפורט של תהליכי lesioning או ריפוי, בהעדר מאקרופאגים לימפוציטים אפשרי.

The most שלבים קריטיים עבור הכנה מוצלחת ו culturing הן: 1) לעבוד בתנאים סטריליים, 2) להכין את המדיה בצורה נכונה, בהתחשב טמפרטורה, pH, ו 3) לפתח את מיומנות ידנית את הצורך במהלך הטיפול OHSC.

מאפייני OHSC

בגלל המבנה שההודעה של תאים עצביים שלהם אין ויוו-כמו ארגון, הפרוסות נקראים organotypic. OHSC מורכבות שכבה pyramidale, הרובד granulosum, המורכב של ammonis cornu פירמידה (CA1, CA2, CA3) ותאים DG פרטנית. חלקים של ההיפוקמפוס מאוד מסודרות ולסיים ההקרנות סיבים מביא בשכבות מובהק בדרך שאינם חופפים. Efferences בין entorhinal קליפת (מסלול perforant), די. ג'י, הנוירונים CA3 ו CA1 להישאר ללא פגע לאחר ההכנה ולהתנהג באופן פונקציונלי הדומה האלה vivo בתוך. כאמור המוצגות, התפתחות הדנדריטים, היווצרות סינפסה ופעילויות ברשת של התאים פרטנית OHSC הן דומות פרוסות חריפה המתקבל הזמן התאימו פקדים14,15,16.

Oligodendrocytes להפוך, האסטרוציטים נחקרו ב OHSC על ידי אור והן מיקרוסקופ אלקטרונים. Oligodendrocytes להפוך להציג התפוצה המרחבית של organotypic, כולל תתי סוגים מורפולוגיים שונים17,18. בנוסף, האקסונים להיות סיבי העצב במהלך שבועיים קודם חוץ גופית בתוך. יש מחברים הניחו כי שכבה מסוימת לוקליזציה של האסטרוציטים הוא נעדר בתרבויות פרוסה ומאמינים כי האסטרוציטים לא להגיע עם התבגרות מלאה במבחנה. היבט זה אין אפשרות לענות באופן מלא, מאז סמנים ספציפיים עבור כל השלבים ההפעלה של האסטרוציטים עדיין חסרה1,19,20.

בשלושת הימים הראשונים לאחר ההכנה, תאים microglial להגיב עם ההגירה והתפשטות ולצבור על פני השטח פרוסה שם הם יוצרים את הצלקת גליה יחד עם האסטרוציטים. כל התאים נראים במצב מופעל מאוד. עם זאת, בשכבות הפנימיות של OHSC ובין div 3 עד 6, תאים microglial לשנות שלהם מורפולוגיה amoeboid לכיוון טופס כחוד, המאופיינת על ידי גופים הסלולר קטן בליטות מסעף זמן בסדר cytoplasmic מורחב לכל הכיוונים21 ,22.

ביטוי דומה והפצה של רצפטורים גלוטמט דווחו ב רקמות למבוגרים ו-2,OHSC23. התדירות של זרמי סינפטית, הזרמים סינפטית מיניאטורי, התדירות של GABAergic זרמי ב- OHSC (div 7, 14, 21) הם לא שונים באופן משמעותי לעומת ההכנות חריפה בימים כמחנכת 14 או 15 בהתאמה. לעומת זאת, התדירות של אותות glutamatergic הוא גבוה יותר OHSC מאשר פרוסות חריפה15.

השוואה בין שיטות הכנה שונה

הכנת הרקמה כמחנכת עובריים ותחילת הוא די קל, בגלל המחירים הישרדות תא טוב חוץ גופית בתוך. זה יש לקחת בחשבון כי בשלב מוקדם זה, תאים עצביים הם עדיין נודדות ופעיל, מוביל לאובדן של הארגון organotypic של פרוסות1. לאחר 7-9 ימים לאחר הלידה, נוצרים קשרים סינפטיים בחולדות. במהלך ה הבא 2-3 שבועות במבחנה הסינפסות בוגרת13. אחד היתרונות של מודל הציג הוא עמידותו לטראומה מכנית במהלך ההכנה שלה פלסטיות גבוהה בגלל גילו של חיות (7-9 ימים)14,1,, או24. יש לציין כי הפרוסות רגישים מאוד מניפולציות מכני על ידי כלי נגינה. אפילו את הזווית הלא נכון ששיספתי עלול לגרום העליה חיתוך סיבים עצביים אחראית anterograde או רטרוגרדית פטירתו עצביים. הכנת פרוסה תרבויות מחיות למבוגרים עבור מטרות ארוכות טווח הוא מאתגר, עדיין לא הוקמה. OHSC כזה להראות ניוון מסיבית זמן קצר לאחר הכנת ככל הנראה בשל האובדן פלסטיות1. בכל זאת, יש חזקה הצורך שיטת הכנה המאפשר עבודה עם פרוסות למבוגרים.

עבור מספר שיטות הכנה, רקמת נכרת טרי הוא פרוסות בעובי של 300-400 מיקרומטר, באמצעות מסוק רקמות לחתוך ההיפוקמפוס מבודד. שיטה מהירה זו עלולה לגרום לעתים קרובות נזק לרקמות נרחבת. גורמים קריטיים על האיכות של OHSC הם עובי הסופי שלהם ואת הזמן שהם שמרו במבחנה. התוצאות הטובות ביותר עם שיעורי ההישרדות הגבוהים הושגו לפרוסות בעובי 300-400 מיקרומטר. פרוסות עבה להידרדר השכבות העליונות במהלך הזמן תרבות בשל מגבלות דיפוזיה1. בהתאם השאלות המדעיות שאל, OHSC משמשים ישירות לאחר ההכנה, או לאחר מספר ימים בתרבות. לכן, במהלך השנים מספר טכניקות טיפוח הוקמו, כמו רולר-שפופרת טכניקה1,13 או טכניקות פרוסה סטטי4.

מתוך שיטות הכנה שונה אנו משוכנעים כי בטכניקה ממשק יחד עם vibratome הוא הליך המדויקת ביותר ופוגעים הפחות מתכוננת OHSC דייט. שיטה זו חל שיפור נוסף באמצעות ממברנות נקבובי. OHSC לשמור על מבנה תלת-ממדי שלהם להישאר מורפולוגית והן מבחינה תפקודית שלמים במשך חודשים, ניתן להעריך באופן חזותי במהלך הטיפוח-תרגול תקופתי25.

יישומים

ניתן להכין OHSC פראי סוג והן חיות הטרנסגניים14,26. לשרוד במשך חודשים והם מספקים אפשרויות עבור ניסויים ארוכי טווח12,13. OHSC משמשים כדי לענות שאלות פיזיולוגיות, תרופתי, מורפולוגיים התפתחותית14,,27 , תחת סטנדרט גבוההגן"כמו תנאים כגון יישום כרונית של neurotherapeutics או בתאי גזע לטיפול26,27,28. החקירה של היבטים התפתחותיים של קישוריות עצביים או תהליכים הקשורים הסינאפסית, פלסטיות סינפטית, אפקטים של אפילפסיה כרונית של הדנדריטים תאים כפירמידה, או כל נוירוג'נסיס מייצגים שדות נוספים 29,30,31,32.

גלוטמט, מוליך עצבי סינאפסות ראשי ו רצפטורים גלוטמט ionotropic לשחק תפקיד מרכזי excitotoxicity. Excitotoxic נגעים להתרחש במהלך מחלות נוירולוגיות כמו שבץ, אלצהיימר המחלה, איידס neurotoxicity, פגיעה מוחית טראומטית, תיקון מנגנונים14,24. יישום של אגוניסטים לקולטן גלוטמט NMDA, חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic (אמפא) או חומצה kainic OHSC מחקה סלקטיבית, אזור תאים עצביים מסוים המוות26,28,33 ,34. יתר על כן, תגובת תא גליה הפגיעה העצבית למשל, microglial העברה של phagocytosis ב OHSC כבר בעבר שנותחה3,35. ניתן לחזות את השפעת מיקרוגלייה בזמן הנגע על ידי דלדול תרופתי של תאים אלה על-ידי ביספוספנטים clodronate36.

יישום חשוב נוסף מתעוררת היה שווה ויוו תנאים חקירות הפלישה הגידול באמצעות OHSC. Spheroids הנוצרת על-ידי שורות תאים glioma מסוגלים התרבויות פרוסה, תופעה שהייתה חפיפה37מינים פולשים. התבנית ' מאטום לשקוף ' הסתננות של הקווים תא המשמשים דמה דוגמת שנצפה ויוו37. בנוסף, גליובלסטומה ראשי spheroids מושתל לתוך OHSC המשיך הפלישה שלהם פוטנציאל ותו תאי הגזע במשך מספר ימים במבחנה38. לפיכך, המודל מאפשר התבוננות הפלישה דפוסי ואינטראקציות בין עצביים רקמות ותאים סרטניים שתואמים לאלה שנמדדו ויוו37,38. בהשוואה קולגן או ג'ל מבוסס מודלים (למשל)39, השימוש OHSC נראה יותר מועיל עבור ניתוחים על הפלישה גרורות, גידול במוח. חצרו פיזיולוגיים, לרבות סוגי תאים עצביים, גליה, מטריצה חוץ-תאית, נשאר שלם.

יתר על כן, OHSC אפשר ללמוד אינטראקציות ישיר בין תאים סרטניים יחיד רקמת המוח בתנאים מבוקרים. לדוגמה, תאים microglial נמצאו כדי לשפר את היכולות של תאים סרטניים כדי להזין את המוח על ידי יצירת מבנים המנחה הפלישה35.

בנוסף, ניתן לנתח את השפעת שינויים הסלולר ארעי וקבוע על הפלישה תהליכים. ביטוי יציב של גרורות קשורים הגס סרטן ג'ין 1 (MACC1) בתאים glioma היה קשור עם התפשטות מוגברת, הפלישה עוקבות40. משינוי ארעית של נוקשות תא שורות תאים גליובלסטומה היה ישירות בקורלציה עם המאפיינים פולשנית של שורות תאים41. פוטנציאל ולכן ניתן OHSC גידול התא שותף תרבויות עבור בדיקות, רבייה של מחקרים קליניים, ועל מנת הפלישה הגידול דגם ותמונה בתנאים מתוקננים ונשלטת מאוד סמים.

לאחר מחקרים בתרבויות התא הראשי, OHSC הם הבחירה ההגיונית הבאה לביצוע ניסויים במערכת מורכבת יותר כדי לאמוד את התנאים ויוו . שדה נוסף עניין בפרוסות המוח היא הקרנת תרופות טיפוליות לפני בדיקה בתוך vivo. פרוסות המוח מאפשרים ניטור מחקה של פציעות בשליטה הצופה וללא ניתוח בעלי חיים. ניתן להשיג עד 8 OHSC, מספר החיות הצורך פוחת באופן משמעותי. זה אפשרי להשיג תוצאות אותה חיה תחת הגדרות דומות אבל שונות או תנאים מרובים. לפיכך, OHSC הוא כלי רב עוצמה כדי להבחין בין השאר שינויים מורפולוגיים, הסלולרית, מולקולריות במהלך תקופת הנגע, פיתוח של נזק משני והפצת הגידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות כריסטין Auste לתמיכה שלה עם הקלטת וידאו, Chalid Ghadban לסיוע טכני מעולה שלו. אורסולה Grabiec נתמכה על ידי רו Programm FKZ 29/18.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
  2. Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
  3. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  5. Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
  6. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
  7. Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  8. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
  9. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  10. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  11. Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
  12. Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
  13. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  14. Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
  15. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
  16. Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
  17. Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
  18. Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
  19. Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
  20. Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
  21. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  22. Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
  23. Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
  24. Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
  25. Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
  26. Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
  27. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
  28. Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
  29. He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
  30. Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
  31. Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
  32. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
  33. Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
  34. Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
  35. Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
  36. Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
  37. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
  38. Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
  39. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
  40. Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
  41. Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 126 החולדה העכבר פרוסה תרבויות המוח פרוסה תרבויות organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות יודיד propidium invasiveness
Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer,… More

Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter