Organotypic Hippocampus slice kulturer (OHSC) representerar en in vitro- modell som simulerar i vivo situationen mycket väl. Här beskriver vi en vibratome-baserad förbättrad skivning protokoll för att få hög kvalitet skivor för användning i bedömningen av nervskyddande potentialen i nya ämnen eller de biologiska beteenden av tumörceller.
I organotypic Hippocampus slice kulturer (OHSC) är morfologiska och funktionella egenskaper både neuron och gliaceller väl bevarade. Denna modell är lämplig för att hantera olika forskningsfrågor som berör studier på neuroprotektion, elektrofysiologiska experiment på nervceller, neuronala nätverk eller tumör invasion. Hippocampus arkitektur och neuronal aktivitet i multisynaptic kretsar är väl bevarad i OHSC, även om själva skivning förfarandet ursprungligen lesioner och leder till bildandet av ett gliaceller ärr. Ärrbildning förändrar förmodligen den mekaniska egenskaper och diffus beteende av små molekyler, etc. Segment tillåter övervakning av tid beroende processer efter hjärnskada utan djur kirurgi, och studier om samspelet mellan olika brain-derived celltyper, nämligen astrocyter, mikroglia och nervceller under både fysiologiska och patologiska villkor. En ambivalent aspekt av denna modell är frånvaron av blodflödet och blod immunceller. Under utvecklingen av den neuronala skadan, migrera immunceller från blod spela en viktig roll. Eftersom dessa celler saknas i skivor, kan inneboende processer i kulturen observeras utan yttre inblandning. Dessutom i OHSC kontrolleras sammansättningen av medium-yttre miljön exakt. En ytterligare fördel med denna metod är det lägre antalet offrade djur jämfört med standard preparat. Flera OHSC kan erhållas från ett djur som möjliggör samtidiga studier med flera behandlingar i ett djur. Av dessa skäl, OHSC är väl lämpade att analysera effekterna av nya skyddande therapeutics efter vävnadsskada eller under tumör invasion.
Det protokoll som presenteras beskriver här en förberedelse metod av OHSC som gör att generera mycket reproducerbara, väl bevarade skivor som kan användas för en mängd experimentell forskning, som neuroprotektion eller tumör invasion studier.
OHSC är en välkarakteriserad in vitro- modell för att studera både fysiologiska och patologiska egenskaper av nervceller, astrocyter och mikroglia1. Det är lätt att styra den extracellulära miljön och övervaka de cellulära och morfologiska förändringarna efter olika stimuli. Organisationen av hippocampus nervceller och deras anslutningar är väl bevarade efter beredning2,3. Ur flera fördelar att OHSC övervakning av hjärnan skada och tumör invasion utan djur kirurgi. Sex till åtta OHSC kan erhållas från en enda gnagare hjärnan. OHSC därför bidra till att avsevärt minska antalet djur och möjliggör testning flera läkemedelskoncentrationen, genetiska manipulationer eller olika lesion modeller på samma djur. Slice-baserade analyser styras experimentella förhållanden exakt. Tid beroende av utvecklingen av sjukdomstillstånd som sekundära skador kan dessutom enkelt övervakas av time-lapse imaging.
I protokollet givet, ursprungligen upprättades av Stoppini et al. 4, beskrivs förberedelserna och viktiga morfologiska landmärken för val av lämpliga skivor markeras. Vi rekommenderar utarbetandet av postnatal dag 7-9 råttor eller postnatal dag 4-5 möss. I dessa perioder, OHSC visar ett robust motstånd mot mekaniska trauman och hög potential för omorganisation av neuronala kretsar. Däremot preparat från embryonala eller vuxna råttor snabbt ändra deras struktur och förlorar sin organotypic morfologi under odling och är därför mindre lämpliga för att studera långsiktiga processer i grundforskning5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. en annan kritisk punkt för överlevnaden av OHSC är tjockleken på segmentet själv som diffusion och således näringstillförsel är begränsad12,13,14.
Protokolls beskriver beredning av OHSC. Denna modell tillåter testning av inneboende kapacitet och reaktioner av hjärnvävnaden efter tillämpningen av fysiologiska och patologiska stimuli. OHSC kan vara bort förutom analyser av elektrofysiologiska parametrar, och effekterna av skador på alla celltyper kan bestämmas. Behandling med olika ämnen och den detaljerade beskrivningen av lesioning processer eller läkning i avsaknad av makrofager och lymfocyter är möjligt.
The Most kritiska st…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Christine Auste för hennes stöd med videoinspelning och Chalid Ghadban för hans utmärkta tekniskt bistånd. Urszula Grabiec stöddes av de Roux Programm FKZ 29/18.
6-Well | Falcon | 35-3046 | |
Agar | Fluka | 5040 | |
Autoclav | Systec | DX-45 | |
CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
Glucose | Merk | 1083371000 | |
Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
U138 | ATCC | HTB-14 | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |