Summary

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Published: August 27, 2017
doi:

Summary

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Abstract

In colture hippocampal fetta organotipiche (OHSC), le caratteristiche morfologiche e funzionali di neuroni e cellule gliali sono ben conservate. Questo modello è adatto per affrontare questioni di ricerca diversi che coinvolgono studi sulla neuroprotezione, esperimenti elettrofisiologici sui neuroni, reti neuronali o l’invasione del tumore. L’architettura hippocampal e attività neuronale nei circuiti multisinaptici sono ben conservati in OHSC, anche se la stessa procedura per affettare inizialmente lesioni e conduce alla formazione di una cicatrice gliale. La formazione della cicatrice presumibilmente altera le proprietà meccaniche e comportamento diffusivo di piccole molecole, ecc. Fette di consentono il monitoraggio dei processi dipendenti tempo dopo il trauma cranico senza chirurgia animale e gli studi sulle interazioni tra vari tipi di cellule di cervello-derivato, vale a dire gli astrociti, microglia e neuroni sotto sia fisiologiche che patologiche condizioni. Un aspetto ambivalente di questo modello è l’assenza di flusso di sangue e le cellule immunitarie del sangue. Durante la progressione della lesione di un neurone, migrazione di cellule immuni dai giochi un ruolo importante di sangue. Come quelle cellule mancano in fette, i processi intrinseci nella cultura possono essere osservati senza interferenze esterne. Inoltre, in OHSC la composizione dell’ambiente medio-esterno è controllata con precisione. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è il più basso numero di animali sacrificati rispetto alle preparazioni standard. OHSC diversi possono essere ottenuti da un animale, rendendo possibile la simultanei studi con trattamenti multipli in un animale. Per questi motivi, OHSC sono ben si adatta per analizzare gli effetti di nuove terapie protettive dopo danno tissutale o durante l’invasione del tumore.

Il protocollo presentato qui descrive un metodo di preparazione di OHSC che permette di generare altamente riproducibili, ben conservato fette che possono essere utilizzati per una varietà di ricerca sperimentale, come studi di invasione del tumore o di neuroprotezione.

Introduction

OHSC sono un modello ben caratterizzati in vitro per studiare proprietà fisiologica e patologica di neuroni, astrociti e microglia1. È facile controllare l’ambiente extracellulare e monitorare i cambiamenti morfologici e cellulari dopo vari stimoli. L’organizzazione dei neuroni ippocampali e le loro connessioni sono ben conservati dopo preparazione2,3. Fuori parecchi vantaggi, OHSC consentire il monitoraggio dell’invasione del tumore e lesioni di cervello senza chirurgia degli animali. Sei-otto OHSC ottenibile da un singolo cervello del roditore. OHSC consentono pertanto significativamente ridurre il numero di animali e test più concentrazioni nella droga, manipolazioni genetiche o modelli differenti della lesione dello stesso animale. Nelle analisi basate su fetta, condizioni sperimentali possono essere controllate con precisione. Inoltre, può essere facilmente monitorato lo sviluppo dipendente dal tempo di condizioni patologiche come danni secondari da formazione immagine di time-lapse.

Nel protocollo specificato, originariamente costituito da Stoppini et al. 4, le operazioni di preparazione sono descritte e importanti punti di riferimento morfologici per la selezione delle fette appropriati vengono evidenziati. Si consiglia la preparazione postnatale giorno 7-9 ratti o topi postnatale giorno 4-5. In questi periodi, OHSC mostrano una robusta resistenza a traumi meccanici e un elevato potenziale di riorganizzazione dei circuiti neuronali. Al contrario, preparati dai ratti embrionali o adulti rapidamente cambiare la loro struttura e perdono la loro morfologia organotipiche durante la coltivazione e quindi sono meno adatti per lo studio dei processi a lungo termine in ricerca di base5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. un altro punto critico per il tasso di sopravvivenza di OHSC è lo spessore della fetta stessa, come la diffusione e quindi l’apporto nutritivo sono limitata12,13,14.

Protocol

gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo criteri di etica e la politica di uso di animali nella ricerca in neuroscienza, come approvato dall’europeo comunità Consiglio direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio dell’Unione europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. 1. preparazione degli strumenti e mezzi di coltura per la preparazione di OHSC utilizzare il seguente set di strumenti: due piccole forbici, due Pinzette cu…

Representative Results

Studi di neuroprotezione: Per determinare il danno neuronale, il numero di nuclei positivi PI e IB4 positivo microglia in ogni terza sezione ottica di strato delle cellule del granello (GCL) del giro dentato (DG) è stata contata. Per esperimenti di invasione tumorale, la z-proiezione di intensità massima dello stack è stata usata per calcolare l’area coperta dalle cellule del tumore, come una misura di invasione e di visualizzare i flussi di invasione divers…

Discussion

Il presente protocollo descrive la preparazione di OHSC. Questo modello consente di testare delle capacità intrinseche e reazioni del tessuto cerebrale dopo l’applicazione di stimoli fisiologici e patologici. Oltre alle analisi dei parametri elettrofisiologici, OHSC può essere leso e gli effetti di danni su tutti i tipi di cellule possono essere determinati. Trattamento con sostanze diverse e la descrizione dettagliata di lesioning processi o guarigione in assenza di macrofagi e linfociti è possibile.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare Christine Auste per il suo sostegno con la registrazione video e Chalid Ghadban per la sua eccellente assistenza tecnica. Urszula Grabiec è stato sostenuto dalle Roux Programm FKZ 29/18.

Materials

6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 Vector Labs FL-1201  
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200

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Cite This Article
Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).

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