Organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) representerer en i vitro modell som simulerer i vivo situasjonen veldig godt. Her beskriver vi en vibratome-basert forbedret kutting protokoll for å få høy kvalitet skiver for bruk i vurderingen neuroprotective potensialet i romanen stoffer eller biologisk atferd av kreftceller.
I organotypic hippocampus skive kulturer (OHSC) er de morfologiske og funksjonelle kjennetegnene både neurons og gliacellene godt bevart. Denne modellen er egnet for adressering ulike problemstillinger som involverer studier på neuroprotection, elektrofysiologiske eksperimenter på neurons, nevrale nettverk eller svulst invasjon. Hippocampus arkitekturen og neuronal aktivitet i multisynaptic kretser er godt bevart i OHSC, selv om kutting prosedyren selv opprinnelig lesjoner og fører til dannelsen av et glial arr. Arr-dannelse endres antagelig de mekaniske egenskaper og diffusive atferd av små molekyler, etc. Skiver tillate overvåking av tid avhengig prosesser etter hjerneskade uten dyr kirurgi og studier på interaksjoner mellom ulike hjerne-avledet celletyper, nemlig astrocyttene, microglia og neurons under både fysiologiske og patologiske forhold. En ambivalent aspekt av denne modellen er fravær av blodstrøm og blod immunceller. Under utviklingen av neuronal skade, overføring av immunceller fra blod spille en viktig rolle. Som disse cellene mangler i skiver, kan indre prosessene i kulturen sees uten ytre forstyrrelser. Videre i OHSC kontrollert sammensetningen av medium-eksterne miljøet presist. Enda en fordel med denne metoden er lavere antall ofret dyr sammenlignet med standard forberedelser. Flere OHSC kan fås fra en dyr gjør samtidige studier med flere behandlinger i en dyr mulig. For disse grunner, OHSC er godt egnet til å analysere effekten av nye beskyttende therapeutics etter vevsskade eller svulst invasjon.
Protokollen presentert beskriver her en forberedelse metode for OHSC som kan generere svært reproduserbare, godt bevart skiver som kan brukes til en rekke eksperimentell forskning, som neuroprotection eller tumor invasjonen studier.
OHSC er en godt karakterisert i vitro modell å studere både fysiologiske og patologiske egenskaper av neurons, astrocyttene og microglia1. Det er lett å kontrollere ekstracellulære miljøet og overvåke endres mobilnettet og morfologiske etter ulike stimuli. Organiseringen av hippocampus nevroner og deres tilkoblinger er godt bevart etter forberedelse2,3. Av flere fordeler, OHSC tillate overvåking av hjernen skader og tumor invasjonen uten dyr kirurgi. Seks til åtte OHSC kan fås fra en enkelt gnager hjerne. OHSC derfor bidra til betydelig redusere antall dyr og la teste flere narkotika konsentrasjoner, genetisk manipulasjon eller annen lesjon modeller i samme dyret. I sektor-baserte analyser, kan eksperimentelle forhold kontrolleres nøyaktig. I tillegg kan tid avhengig utviklingen av patologisk forhold som sekundær skader lett overvåkes av tidsinnstilt bildebehandling.
I den gitte protokollen, opprinnelig etablert av Stoppini et al. 4, forberedelsene er beskrevet og viktige morfologiske landemerker for valg av riktig skiver utheves. Vi anbefaler utarbeidelse av postnatal dag 7-9 rotter eller postnatal dag 4-5 mus. I disse periodene, OHSC viser en robust motstand mot mekanisk traumer og stort potensial for omorganisering av nevrale kretser. Derimot preparater fra embryonale eller voksen rotter raskt endre strukturen og mister sine organotypic morfologi under dyrking og er derfor mindre egnet for studerer langsiktige prosesser i grunnforskning5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. en annen kritisk punkt for overlevelse av OHSC er tykkelsen på sektoren seg som spredning og dermed næringsstoff levering er begrenset12,13,14.
Nåværende protokollen beskriver utarbeidelsen av OHSC. Denne modellen gjør testing av iboende evner og reaksjoner av hjernevevet etter fysiologiske og patologiske stimuli. Foruten analyser av elektrofysiologiske parametere, OHSC kan være lesioned og effekten av skade på alle celletyper kan bestemmes. Behandling med forskjellige stoffer og den detaljerte beskrivelsen av lesioning prosesser eller helbredelse i fravær av makrofager og lymfocytter er mulig.
The Most avgjørende skritt for en…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Christine Auste for hennes støtte med video-opptak og Chalid Ghadban for hans utmerket kundestøtte. Urszula Grabiec ble støttet av Roux programmerbar FKZ 29/18.
6-Well | Falcon | 35-3046 | |
Agar | Fluka | 5040 | |
Autoclav | Systec | DX-45 | |
CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
Glucose | Merk | 1083371000 | |
Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
U138 | ATCC | HTB-14 | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |