Summary
Organotypic Hippocampus slice kulturer (OHSC) representerar en in vitro- modell som simulerar i vivo situationen mycket väl. Här beskriver vi en vibratome-baserad förbättrad skivning protokoll för att få hög kvalitet skivor för användning i bedömningen av nervskyddande potentialen i nya ämnen eller de biologiska beteenden av tumörceller.
Abstract
I organotypic Hippocampus slice kulturer (OHSC) är morfologiska och funktionella egenskaper både neuron och gliaceller väl bevarade. Denna modell är lämplig för att hantera olika forskningsfrågor som berör studier på neuroprotektion, elektrofysiologiska experiment på nervceller, neuronala nätverk eller tumör invasion. Hippocampus arkitektur och neuronal aktivitet i multisynaptic kretsar är väl bevarad i OHSC, även om själva skivning förfarandet ursprungligen lesioner och leder till bildandet av ett gliaceller ärr. Ärrbildning förändrar förmodligen den mekaniska egenskaper och diffus beteende av små molekyler, etc. Segment tillåter övervakning av tid beroende processer efter hjärnskada utan djur kirurgi, och studier om samspelet mellan olika brain-derived celltyper, nämligen astrocyter, mikroglia och nervceller under både fysiologiska och patologiska villkor. En ambivalent aspekt av denna modell är frånvaron av blodflödet och blod immunceller. Under utvecklingen av den neuronala skadan, migrera immunceller från blod spela en viktig roll. Eftersom dessa celler saknas i skivor, kan inneboende processer i kulturen observeras utan yttre inblandning. Dessutom i OHSC kontrolleras sammansättningen av medium-yttre miljön exakt. En ytterligare fördel med denna metod är det lägre antalet offrade djur jämfört med standard preparat. Flera OHSC kan erhållas från ett djur som möjliggör samtidiga studier med flera behandlingar i ett djur. Av dessa skäl, OHSC är väl lämpade att analysera effekterna av nya skyddande therapeutics efter vävnadsskada eller under tumör invasion.
Det protokoll som presenteras beskriver här en förberedelse metod av OHSC som gör att generera mycket reproducerbara, väl bevarade skivor som kan användas för en mängd experimentell forskning, som neuroprotektion eller tumör invasion studier.
Introduction
OHSC är en välkarakteriserad in vitro- modell för att studera både fysiologiska och patologiska egenskaper av nervceller, astrocyter och mikroglia1. Det är lätt att styra den extracellulära miljön och övervaka de cellulära och morfologiska förändringarna efter olika stimuli. Organisationen av hippocampus nervceller och deras anslutningar är väl bevarade efter beredning2,3. Ur flera fördelar att OHSC övervakning av hjärnan skada och tumör invasion utan djur kirurgi. Sex till åtta OHSC kan erhållas från en enda gnagare hjärnan. OHSC därför bidra till att avsevärt minska antalet djur och möjliggör testning flera läkemedelskoncentrationen, genetiska manipulationer eller olika lesion modeller på samma djur. Slice-baserade analyser styras experimentella förhållanden exakt. Tid beroende av utvecklingen av sjukdomstillstånd som sekundära skador kan dessutom enkelt övervakas av time-lapse imaging.
I protokollet givet, ursprungligen upprättades av Stoppini et al. 4, beskrivs förberedelserna och viktiga morfologiska landmärken för val av lämpliga skivor markeras. Vi rekommenderar utarbetandet av postnatal dag 7-9 råttor eller postnatal dag 4-5 möss. I dessa perioder, OHSC visar ett robust motstånd mot mekaniska trauman och hög potential för omorganisation av neuronala kretsar. Däremot preparat från embryonala eller vuxna råttor snabbt ändra deras struktur och förlorar sin organotypic morfologi under odling och är därför mindre lämpliga för att studera långsiktiga processer i grundforskning5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. en annan kritisk punkt för överlevnaden av OHSC är tjockleken på segmentet själv som diffusion och således näringstillförsel är begränsad12,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
djurförsök har utförts i enlighet med den politik av etik och principen om användning av djur i neurovetenskap forskning som godkänts av europeiska samhällen rådets direktiv 2010/63/EU Europaparlamentets och rådets för Europeiska unionen om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål.
1. beredning av instrument och kultur Media
- Använd följande uppsättning instrument för förberedelse av OHSC: två liten sax, två böjda pincetter, en pincett med en fin spets, tre blad (två av storlek 11, storlek 15), tre skalpell innehavare, runda filtrerpapper (diameter: 35 mm), agar, ett rakblad, en oförändrad Pasteur-pipett och en ändrades Pasteur-pipett utan ett tips. Sterilisera alla material i en autoklav innan användning ( figur 1).
- Väger 5 g agar och lös den i 100 mL destillerat vatten. Sterilisera lösningen för 20 min på 121,7 ° C vid 210.8 kPa i en autoklav. Fördela 3 mL flytande agar lösningen i 60 mm petriskålar med sterilt glas pipett, låt den stelna i 5 h, täcka med plast paraffin film för att undvika kontaminering och förvaras vid 4 ° C tills vidare användning. Agar block behövs för att stabilisera hjärnor under förfarandet för skivning.
- Media
- göra 200 mL av förberedelse medium (pH 7,35) bestående av 198 mL väsentliga minimalmedium (MEM) och 2 mL L-glutamin lösning (slutlig koncentration 2 mM). Förbereda lösningen på media förberedelsedagen och lagra den på 4 ° C.
- Bereda 100 mL odlingssubstrat som består av 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' balanserad saltlösningar (HBSS), 25 mL (v/v) normal häst serum (NHS), 1 mL L-glutamin lösning (slutlig koncentration 2 mM), 100 µg insulin, 120 mg glukos, 10 mg streptomycin , 10 000 U penicillin, och 800 µg vitamin C som tidigare rapporterats. Värm mediet (37 ° C), justera pH-värdet till pH 7,4 och sterila filter (0,2 µm porstorlek). Upprepa proceduren (uppvärmning, pH-justering, etc.) varannan dag innan du ändrar mediet. Använder medlet högst en vecka om den förvaras vid 4 ° C.
- Fylla en 35 mm petriskål med förberedelse medium att lagra hjärnan. Placera två tomma petriskålar för insamling av vävnaden på ett kylande pack i arbetsarean.
2. Förberedelse och Slicing med en Vibratome
- användning hjärnor från 7-9 dag gamla råttor eller 4-5 dagars gamla möss för OHSC beredning enligt Stoppini et al. 4 efter halshuggning av djur, ta bort huden från skallen med en sax.
- Införa bladet av en fin sax i foramen magnum och öppna skallen genom att skära längs kaudala (tillbaka) rostralt (front) axeln. Gör två skär vinkelrätt till den första, så att saxen pekar mot vänster och höger örat, respektive (" T-snitt ").
- Öppna skallen försiktigt med fin pincett, att inte uppmärksamma skadar hjärnan. Använd en skalpell (bladet storlek 11) för att skära mest rostralt delen av främre stolpen och cerebellum.
- Med hjälp av en spatel, ta bort hjärnan och placera den försiktigt i petriskål fylld med förberedelse medium ( figur 2). Placera hjärnan på preparathållaren och fixa det med medicinsk cyanoakrylat lim. Använd bitar av agar för att garantera mekaniska stabiliseringen.
- Dissekera vävnaden horisontellt i 350 µm tjock OHSC med en glidande vibratome.
- Utvärdera skivor optiskt med binokulära Mikroskop. Kassera OHSC av låg kvalitet omedelbart. Det är viktigt att ta bara dessa skivor med intakt cytoarchitecture isolerade från den mellersta delen av hippocampus (se figur 3 och 4) mellan den dorsala och ventrala hippocampus.
- Separat regionen hippocampus och entorhinal cortex med en skalpell (runda bladet storlek 15; (se figur 3). Perforant väg och entorhinal cortex måste bevaras.
- Sex till åtta OHSC erhålls från varje hjärna. Överför 2-3 skivor till en cell kultur Infoga (por storlek 0,4 µm) och placera det i en brunn i en 6-väl kultur maträtt som innehåller 1 mL odlingsmedium per brunn.
- Inkubera 6-väl rätterna vid 35 ° C i en fullständigt fuktad atmosfär med 5% (v/v) CO 2 och ändra cellodlingsmedium varannan dag.
Obs: Genomföra ditt experiment på 6-dagars i vitro (div). Inflammatoriska reaktioner i samband med förfarandet för skivning försvinna av dag 6. I detta skede mikrogliaceller Visa ett förgrenat morfologi igen och synapsförbindelser har mognat.
3. Utvärdering av vävnad kvalitet
- fixering, märkning och visualisering av degenererade nervceller i OHSC
- efter att ha utfört experimenten, inkubera i OHSC med 5 µg/mL propidium jodid (PI) för 2 h före fixering, i ordning att färga atomkärnor av degenererade nervceller.
FÖRSIKTIGHET: PI är misstänkt cancerframkallande, alltid bära personlig skyddsutrustning (PPE) såsom handskar. - Tvätta OHSC med 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) och fixera dem med en 4% (v/v) lösning av PARAFORMALDEHYD (PFA) för 24 h.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftiga och misstänkt cancerframkallande. Arbeta under spiskåpa och bära PPE. - Tvätta OHSC i skär med 1 mL PBS och använda en riggare pensel till separata skivor från membranet.
- Etikett OHSC med IB 4 färgämne i en 24-well platta ( figur 5).
- efter att ha utfört experimenten, inkubera i OHSC med 5 µg/mL propidium jodid (PI) för 2 h före fixering, i ordning att färga atomkärnor av degenererade nervceller.
- Överledning av tumör invasion experiment med fluorescently märkt enstaka celler
- 24 h före starten av ett experiment, namnge tumörcellerna med hjälp av fluorescerande färg Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl Ester (CFDA SE).
- Koppla och räkna tumörcellerna med hjälp av en Neubauer.
- Omsuspendera cellerna i medium, så att 10 µL av suspensionen innehåller antalet önskad cell (normalt 50 000 eller 100 000 celler).
- Applicera 10 µL cellsuspension på skiva kulturen och låt cellerna att invadera i 3 dagar.
- Vid slutet av experimentet, fixa slice kulturer använder 4% (v/v) PFA för 24 h och etikett samarbete kulturerna med PI för en annan 24 h att visualisera cytoarchitecture.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftiga och misstänkt cancerframkallande. Arbeta under spiskåpa och bära PPE. - Montera samtidig kulturer på ett täckglas för vidare analys med hjälp av montering medier.
4. Utvärdering av OHSC experiment
analysera OHSC med en confocal laser skanning Mikroskop (CLSM). För detektion av PI märkt, urartar nervceller eller PI märkt cytoarchitecture använda monokromatiskt ljus av våglängden λ = 543 nm och ett utsläpp band pass filter för våglängder λ = 585-615 nm. För CFDA märkt tumörceller eller IB 4 mikroglia, använda en magnetisering våglängden λ = 488 nm. För både experimentella typer, spela in en z-stack med 2 µm tjocka optiska skivor och används för utvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neuroprotektion studier: Att fastställa nervcellskador, numrera av PI positiva kärnor och IB4 positiva mikroglia i varje tredje optiska avsnitt i den granule cellager (GCL) av dentate gyrus (GD) räknades. För tumör invasion experiment används maximal intensitet z-projektionen av stacken för att beräkna området omfattas av tumörceller, som en invasion och att visualisera olika invasion mönster (figur 6).
I den obehandlade kontrollen OHSC (CTL) återstod nervceller välbevarad. I GCL GD observerades nästan ingen PI positiva neuronala atomkärnor (figur 5A). I molekylära lagret, var majoriteten av mikrogliaceller förgrenad. I GCL GD, endast mycket få IB4 positiva mikrogliaceller (figur 5A) upptäcktes. Efter inkubation med 50 µM N-metyl-D-asparaginsyra (NMDA) en stark ökning av antalet PI positiva neuronala atomkärnor (figur 5B) och IB4 positiva mikrogliaceller (figur 5B) upptäcktes jämfört med kontroll OHSC. Förväg skadade OHSC av lägre kvalitet kan identifieras vid högre numrerar av amoeboid mikroglia och PI positiva celler i GD (figur 5 c) kontroll villkor. Behandling av pre skadade skivor med NMDA ledde till förstörelsen av GD cytoarchitecture och ett mycket högt antal PI positiva död celler sprider sig till den hilum och CA3 region (figur 5 d).
Tumör invasion studier: Skivor behandlades med 50.000 celler av två glioblastoma cell linjer U138 (figur 6A) och LN229 (figur 6B) i tre dagar. I båda fallen cytoarchitecture av slice kulturer förblivit intakt och den cornu ammonis och GD bevarades. Dessutom cellinjer både visade distinkta invasion beteende. Medan U138 celler bildas runda, klart skilda tumörer (figur 6A), LN229 celler byggt en tumör nätverk inom enda tumör spheroids och var ofta svåra att skilja. När man tittar på mängden tumör massa i slice kulturer, hittades en högre invasivt för LN229 celler jämfört med U138 celler.
Figur 1: dissektion verktyg och material. För beredning av slice kulturer krävs en lämplig uppsättning dissektion verktyg och material som visas. Setet innehåller tre skalpeller med små utbytbara blad, en spatel, två fina sax, tre pincett, en normal Pasteur-pipett, en Pasteur-pipett utan spets, agar, petriskålar, filterpapper, en kyla pack, förberedelse medium och medicinsk cyanoakrylat lim. Dissektion verktygen måste vara Ånghärdad innan användning och placeras i en plast för att hålla det i en steril miljö. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: placering av hippocampus bildandet i råtthjärna. Hippocampus bildandet, visas med den svarta streckade linjen är en bilaterala struktur som omges av hjärnbarken och thalamus. Hippocampus buktar in i den laterala ventrikeln tidsmässiga horn. Hippocampus är bilaminar, bestående av den cornu ammonis (hippocampus korrekt) och dentate gyrus (eller fascia dentate), med en lamina rullas upp inuti den andra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: visualisering av råtta OHSC. En hela hjärnan skiva innehållande OHSC är visualiseras genom en kikare att bedöma vävnad kvalitet. Skivor hålls i en petriskål fylld med kylda beredningen medium (A, B). Förstoring av hjärnan segmentet. Intakt hippocampus (HC) och entorhinal cortex syns till vänster och höger sida av bilden (C). OHSC avskiljs från resten av hjärnan. Den granule cellager (GCL) GD, de cornu ammonis delfält CA1 och CA3, hilus regionen (HI), entorhinal cortex (EG) och det molekylära lagret (ML) är klart urskiljbara (D). C, D: skalstapeln = 4 mm.
Figur 4: Tid beroende av förändringar i OHSC.
Mikroglia och astrocyter börjar direkt efter beredning, att bilda ett gliaceller ärr. Från 1-3 dagar i vitro (div) ödem och gliosis formation observeras. Skiktningen av hippocampus bildandet och GD är inte längre synlig. På cellnivå, OHSC på 5 div visar en minskning av antalet aktiverade celler. På 6 div, nästan inga ödem är närvarande, slice är tunnare, och de områden som ingår i de inneboende neuronala kretsarna har överlevt. OHSC kan nu användas för experiment. Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: utvärdering av vävnad kvalitet av CLSM. Som framgick av CLSM, har en bra neuronala bevarande observerats i icke-bort kontrollen OHSC (CTL). Praktiskt taget finns ingen PI positiva neuronala atomkärnor (röd) och endast några IB4 positiva mikrogliaceller (grön) i den granule cellager (GCL) GD (A). I motsats till icke-bort OHSC är en stark ökning av antalet PI och IB4 positiva celler synlig i GCL av NMDA-bort OHSC (B). Observera morfologi av generaldirektoratet, aktiverade mikrogliaceller och ett stort antal PI positiva kärnor i förväg skadade OHSC (C, D). Barer = 50 µM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: visualisering av tumör invasion av CLSM. PI (i rött) tillämpas efter fixering etiketterna på cytoarchitecture av OHSC, medan CFDA (i grönt) illustrerar tumörcellerna invaderar segmentet. Processen invasion av U138 celler är visualiseras efter tre dagar invasion tid. Enda tumör spheroidsär klart urskiljbara (A). Däremot bildas glioblastoma cell linjen LN229 en tumör nätverk (B). Barer = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolls beskriver beredning av OHSC. Denna modell tillåter testning av inneboende kapacitet och reaktioner av hjärnvävnaden efter tillämpningen av fysiologiska och patologiska stimuli. OHSC kan vara bort förutom analyser av elektrofysiologiska parametrar, och effekterna av skador på alla celltyper kan bestämmas. Behandling med olika ämnen och den detaljerade beskrivningen av lesioning processer eller läkning i avsaknad av makrofager och lymfocyter är möjligt.
The Most kritiska steg för en framgångsrik beredning och odling är att: 1) arbeta under sterila förhållanden, 2) förbereda media korrekt, med tanke på temperatur och pH, och (3) utveckla den nödvändiga fingerfärdighet under hantering av OHSC.
Kännetecken för OHSC
På grund av neuronala celler oförändrat morfologi och deras in-vivo-liknande organisation, skivor kallas organotypic. OHSC består av de stratum pyramidale och stratum granulosum, består av pyramidformade cornu ammonis (CA1, CA2, CA3) och GD granulat celler. Delar av hippocampus beställs mycket och afferenta fibrer prognoserna avsluta i distinkta lager på en icke-överlappande sätt. Efferences mellan entorhinal cortex (perforant vägen), GD, CA3 och CA1 nervceller förbli intakt efter beredning och beter sig funktionellt liknar de i vivo. Som tidigare visat, utveckling av dendritiska träd, synaps bildandet och nätverk inom de granulära cellerna i OHSC är jämförbara med akut skivor från tid som matchade kontroller14,15,16.
Oligodendrocyter och astrocyter har studerats i OHSC av både ljus- och elektronmikroskopi. Oligodendrocyter visas en organotypic rumsliga fördelning, inklusive olika morfologiska subtyper17,18. Också, axoner blivit myeliniserade under de första två veckorna in vitro. Vissa författare postulerade att lager specifika localizationen av astrocyter är frånvarande i slice kulturer och tror att astrocyterna inte når en full mognad i vitro. Denna aspekt inte kan besvaras helt, eftersom specifika markörer för alla aktiveringen steg av astrocyter saknas fortfarande1,19,20.
I de första 3 dagarna efter beredning, mikrogliaceller svara med migration och spridning och ackumuleras på skiva ytan där de bildar gliaceller ärret tillsammans med astrocyter. Alla celler verkar vara mycket-aktiverat. Men i de inre skikten av OHSC och mellan 3 och 6 div ändra mikrogliaceller deras amoeboid morfologi mot ett förgrenat form, kännetecknas av små cellulära kroppar och långa förgrenade fina cytoplasmiska utsprång utvidgas i alla riktningar21 ,22.
Liknande uttryck och distribution av glutamatreceptorer har rapporterats i adult vävnad och OHSC2,23. Frekvensen av synaptic strömmar, miniatyr synaptic strömmarna och frekvensen av GABAergic strömmar i OHSC (7, 14 och 21 div) inte skiljer sig avsevärt jämfört med akut preparat på postnatal dagar 14 eller 15 respektive. Frekvensen av glutamatergic signaler är däremot högre i OHSC än i akut skivor15.
Jämförelse av olika beredningsmetoder
Beredning av embryonala och tidig postnatal vävnad är ganska lätt, på grund av bra cell överlevnad priser i vitro. Det bör övervägas att i detta tidiga skede, de neuronala cellerna är fortfarande flyttande och aktiva leder till en förlust av organotypic organisation i skivor1. Efter 7-9 postnatal dagar, är vissa synapsförbindelser hos råttor etablerade. Under de nästa 2-3 veckor i vitro mogna synapserna13. En av fördelarna med den presenterade modellen är dess motståndskraft mot mekanisk trauma under förberedelserna och dess hög plasticitet på grund av de djur (7-9 dagar)1,14,24års ålder. Det måste nämnas att skivor är mycket känsliga för mekaniska manipulationer av instrument. Även fel vinkel skivning kan orsaka Sned skärning av neuronala fibrer ansvariga för anterograd eller retrograd neuronala nedläggningen. Utarbetandet av slice kulturer från vuxna djur för långsiktiga syften är utmanande och ännu inte etablerade. Sådana OHSC visar en massiv degeneration strax efter beredningen förmodligen på grund av förlusten av plasticitet1. Det finns dock ett starkt behov för en förberedelse metod möjliggör arbete med vuxna skivor.
För flera beredningsmetoder, är nymalen exciderad vävnad skivad till en tjocklek på 300-400 µm, klipper isolerade hippocampus med en vävnad chopper. Detta snabb metod kan ofta resultera i utbredd vävnadsskada. Kritiska faktorer för kvaliteten på OHSC är deras slutliga tjocklek och den tid som de hålls i vitro. Bästa resultat med högsta överlevnaden har uppnåtts för 300-400 µm tjocka skivor. I tjockare skivor urarta de övre skikten under kultur på grund av diffusion begränsningar1. Beroende på de vetenskapliga frågorna, OHSC används antingen direkt efter beredning eller efter flera dagar i kultur. Därför under åren var flera odlingsteknik etablerade, som Roller-Tube teknik1,13 eller statiska slice tekniker4.
Ur olika beredningsmetoder är vi övertygade om att med hjälp av gränssnittet teknik tillsammans med en vibratome är det mest exakta och minst skadliga förfarandet för att förbereda OHSC datum. Denna metod förbättras ytterligare med hjälp av porösa membran. OHSC hålla deras 3D-struktur, bo morfologiskt och funktionellt intakt i månader och visuellt kan utvärderas under odling perioden25.
Applikationer
OHSC kan framställas från såväl vildtyp och transgena djur14,26. De överlever i månader och ger alternativ för långsiktiga experiment12,13. OHSC används för att behandla fysiologiska, farmakologisk, morfologiska och utvecklingsmässiga frågor14,27 under mycket standardized tillstånd såsom kronisk tillämpning av neurotherapeutics eller stamceller terapi26,27,28. Utredningen av utvecklingsmässiga aspekter av neuronala anslutnings- eller processer relaterade till synaptisk transmission, synaptisk plasticitet, effekter av kronisk epilepsi av Dendritutskotten pyramidala celler eller neurogenes alla representerar ytterligare fält 29,30,31,32.
Glutamat, den primära stimulerande neurotransmittorn och jonotropa glutamatreceptorer spelar en central roll i excitotoxicitet. Excitotoxic lesioner uppstår under neurologiska sjukdomar som stroke, Alzheimers sjukdom, HIV neurotoxicitet, traumatisk hjärnskada och reparation mekanismer14,24. Tillämpningen av glutamat-receptoragonister NMDA, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic syra (AMPA) eller kainic syra till OHSC härmar selektivt och regionen specifika neuronala cell död26,28,33 ,34. Dessutom glial cellssvar på neuronal skada t.ex., mikrogliala migration och fagocytos i OHSC tidigare har analyserat3,35. Påverkan av mikroglia under lesionen kan förutsägas genom farmakologiska utarmning av dessa celler av den bisfosfonat clodronate36.
En mer ytterligare viktig applikation uppstår symtom liknande i vivo bestämmelser för utredningar av tumör invasion med OHSC. Spheroids bildas av glioma cell linjer kunde invadera slice kulturerna, ett fenomen som var art överlappande37. Mönstret diffus infiltration av cellinjer används liknade de observerade mönstret i vivo37. Dessutom primära glioblastoma spheroids implanteras i OHSC höll sin invasion potentiella och stamceller karaktär över flera dagar in vitro-38. Således, modellen tillåter observation av invasion mönster och interaktioner mellan neuronal vävnad och tumörceller som motsvarar dem som observerats i vivo37,38. I jämförelse med kollagen eller gel verkar bygger modeller (t.ex.)39, användning av OHSC mer fördelaktigt för analyser på metastaser och tumör invasion i hjärnan. Den fysiologiska miljön, inklusive neuronala och gliaceller celltyper och extracellulär matrix, förblir intakt.
OHSC kan dessutom studera direkta interaktioner mellan enstaka tumörceller och hjärnvävnad under kontrollerade förhållanden. Till exempel befanns mikrogliaceller öka kapaciteten hos tumörcellerna att komma in i hjärnan genom att bilda vägledande strukturer för invasionen35.
Dessutom kan effekten av övergående och permanent cellulära förändringar på invasionen processer analyseras. Ett stabilt uttryck av metastaser associerade kolon cancer gen 1 (MACC1) i glioma celler var associerat med en ökad spridning och efterföljande invasionen40. Övergående förändring av cell stelhet i glioblastoma cell linjer var direkt korrelerad med den cell linjer41invasiva egenskaper. OHSC och tumör samtidig cellkulturer kan därför potentiellt användas för drogtester, reproduktion av kliniska observationer och att modellen och bild tumör invasion under mycket kontrollerade och standardiserade förhållanden.
Efter studier i primära cellkulturer, OHSC är nästa logiska valet för att utföra experiment i ett mer komplext system att approximera de in-vivo -villkor. Ett annat intresseområde i hjärnan skivor är screening av potentiella terapeutiska läkemedel före testning i vivo. Hjärnan skivor möjliggöra övervakning och härma skador under observatör kontroll och utan djur kirurgi. Upp till 8 OHSC kan erhållas och antalet nödvändiga djur minskas avsevärt. Det är möjligt att få resultat i samma djur under liknande inställningar men med olika eller flera villkor. Således, OHSC är ett kraftfullt verktyg att iaktta bland annat morfologiska, molekylära och cellulära förändringar under lesion period, utveckling av sekundära skador och tumören sprids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Författarna vill tacka Christine Auste för hennes stöd med videoinspelning och Chalid Ghadban för hans utmärkta tekniskt bistånd. Urszula Grabiec stöddes av de Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H.
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
