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Developmental Biology

Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation

doi: 10.3791/55373 Published: May 6, 2017

Summary

Die kardiale biowire Plattform ist eine in vitro - Methode verwendet , um durch die Kombination von dreidimensionaler Zellkultivierung mit elektrischer Stimulation humanen embryonale und induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (HPSC-CM) zu reifen. Dieses Manuskript zeigt den detaillierten Aufbau der Herzens biowire Plattform.

Abstract

Humanen pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (HPSC-CMs) haben eine viel versprechende Zellquelle und haben ermutigt, so die Untersuchung ihrer möglichen Anwendungen in der Herzforschung, einschließlich der Wirkstoffforschung, Krankheitsmodelle, Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Jedoch durch bestehende Protokolle produzierten Zellen zeigen eine Reihe von Unreife verglichen mit nativem Erwachsenen Kardiomyozyten. Viele Anstrengungen wurden unternommen, HPSC-CMs, mit nur mäßiger Reifung erreicht so weit zu reifen. Daher ist es ein engineered System, genannt biowire, wurde durch die Bereitstellung sowohl physikalische als auch elektrische Signale entwickelt HPSC-CMs zu einem reiferen Zustand in vitro zu führen. Das System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform HPSC-CMs in Kollagen Typ I entlang einer Naht starren Schablone gelieren zusammen in fluchtHerzGewebe (biowire) Samen, die mit einer progressiv ansteigenden Frequenz der elektrischen Feldstimulierung ausgesetzt wird. Im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen,stimulierte biowired einen verbesserten Reifegrad strukturellen und elektro Kardiomyozyten zeigen. Solche Änderungen sind abhängig von der Stimulationsrate. Dieses Manuskript beschreibt ausführlich die Gestaltung und Erstellung von biowires.

Introduction

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Zell-basierte Therapie ist eine der vielversprechendsten und untersuchten Strategien Herz-Reparatur / Regeneration zu erreichen. Es wurde von Herz-Tissue Engineering und der Co-Lieferung von Biomaterialien 1, 2 unterstützt. Die meisten verfügbaren Zellquellen haben in Tiermodellen für ihre potenziell positiven Auswirkungen auf beschädigt, krank oder im Alter von Herzen 3 untersucht worden. Insbesondere haben erhebliche Anstrengungen humanen pluripotenten Stammzellen (HPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten (HPSC-CM), eine potentiell unbegrenzte autologe Zellquelle für Herz-Tissue Engineering verwenden gemacht worden. HPSC-CMs kann mit mehreren etablierten Protokollen 4 hergestellt werden, 5, 6. Die erhaltenen Zellen fötale artige Phänotypen darstellen, mit einer Reihe von unreifen Eigenschaften im Vergleich zu erwachsenem ventrikulären Kardiomyocyten jedoch, 7, 8. Dies kann ein Hindernis für die Anwendung von HPSC-CMs als Modelle von adulten Herzgeweben in der Wirkstoffforschung und in der Entwicklung von adulten Herzkrankheitsmodellen 9 sein.

Um diese Einschränkung der phänotypischen Unreife zu überwinden, werden neue Ansätze wurden Kardiomyozyten Reifung zu fördern aktiv untersucht. Frühe Studien zeigten wirksame pro-Reifungseigenschaften in neonatalen Ratten - Kardiomyozyten über zyklische mechanische oder elektrische Stimulation 10 11. Gel Kompaktierung und zyklische mechanische Stimulation wurden ebenfalls 12 einige Aspekte der HPSC-CM Reifung verbessern gezeigt, 13, mit minimaler Verstärkung der elektrophysiologischen und Calcium Handhabungseigenschaften. Daher wurde durch die Bereitstellung sowohl strukturelle Cues und elektrisches Feld stimulatio ein Plattformsystem „biologische wire“ (biowire) genannt erdachtn die Reifung von HPSC-CMs 14 zu verbessern. Dieses System verwendet eine mikrofabrizierte Plattform ausgerichtet Herzgewebe zu schaffen, das auf elektrische Feldstimulation zugänglich ist. Dies kann dazu verwendet werden, um die strukturelle und elektroLaufZeit von HPSC-CMs zu verbessern. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer solchen biowires machen.

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Protocol

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1. Master Design und Herstellung

HINWEIS: Verwenden Sie weiche Lithographie zur Herstellung von Bauelementen. Machen einen zweischichtigen SU-8-Master für Polydimethylsiloxan (PDMS) Guß.

  1. Gestalten Sie das Gerät mit einem Design und Erstellung von Software (Abbildung 1A, links). Zeichnen jede Schicht des Master getrennt. Drucken der Vorrichtungskonstruktion auf zwei Photomasken bei 20.000 dpi, entsprechend den beiden Schichten des Master 15. Stellen Sie das Vorrichtungsmuster als transparent und die Umgebung so dunkel; die Masken werden als Vorlage dienen optisch das Vorrichtungsmuster auf SU-8 durch Lithographie übertragen (wie von anderen 15 beschrieben).
  2. Dispense etwa 4 ml von SU-8 50 auf die Mitte einer 4-Zoll-Siliziumwafer. Coat die SU-8 50 gleichmäßig auf dem Wafer mit einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung durch Verspinnen bei 2.000 Umdrehungen pro Minute (RPM) für 30 s verwendet. Backen der Wafer auf einer Heizplatte 95 ° C für 10 min. Belichten der Wafer mit ultraviolettem (UV) LiGht bei 200 mJ / cm 2 .
  3. Gießen Sie ca. 4 ml SU-8 2050 auf die Mitte des Wafers und drehen Sie sich bei 2500 U / min für 30 s. Auf der 95 ° C Heizplatte für 15 min aufbacken. Abkühlen auf Raumtemperatur (RT).
  4. Wiederholen Sie Schritt 1.3 zwei weitere Male.
  5. Bedecken Sie den beschichteten Wafer mit der ersten Schicht-Transparent-Photomaske. Setzen Sie den Wafer auf UV-Licht bei 270 mJ / cm 2 , um die erste Schicht zu machen. Auf der 95 ° C Heizplatte für 15 min aufbacken.
  6. Machen Sie die zweite Schicht von SU-8 2050, indem Sie Schritt 1.3 zweimal wiederholen.
  7. Richten Sie die Maske der zweiten Schicht auf die Funktionen der ersten Ebene mit einem Maskenausrichter aus. Dann mit UV-Licht bei 240 mJ / cm2 aussetzen. Bei 95 ° C für 15 min backen.
    HINWEIS: Die Belichtungszeit wird durch die erforderliche Gesamt-UV-Dosis und die am Tag vor der Verwendung gemessene UV-Licht-Ausgangsintensität bestimmt.
  8. Entwickeln Sie den Wafer durch Eintauchen in Propylenglykolmonomethyletheracetat (PGMEA) und Schütteln bei 200 U / min für 30 min auf einem Orbitalschüttler.
  9. Ortder Master in eine Petrischale und gießt vorsichtig die PDMS-Mischung (Base in einem Verhältnis von 10 bis Vernetzer: 1 nach Gewicht) auf der Mitte des Wafers. Decken Sie alle Funktionen und Luftblasen vermeiden.
  10. Wärme in einem Ofen bei 70 ° C für 2 h. Mit einem scharfen Messer um den Rand der PDMS biowire Vorlage schneiden (1A, rechts). Ziehen Sie die PDMS vom Master. Schneiden Sie das Gerät mit der Klinge. Setzen Sie die PDMS biowire Vorlage in einem Sterilisationsbeutel und Dampfautoklaven bei 121 ° C für 20 min.
  11. In einem Schrank biologischen Sicherheit (BSC) wird die PDMS biowire Vorlage in eine Petrischale. Pinzette benutzen zu halten , und ein Stück sterilen chirurgischen Seidennaht (6-0) in der Mitte des Kanals der PDMS Mikrotiterplatten zu montieren , indem sie in den Nuten an den beiden Enden des Kanals (1B-I) Seating.

2. Erstellung der elektrischen Stimulationskammer

  1. Bildet ein Paar von rechteckigen Polycarbonat Stücken (Länge x Breite x Dicke: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) und sie als den Rahmen der elektrischen Stimulationskammer (Abbildung 2).
  2. Bohren zwei 3 mm breite Löcher 2 cm voneinander entlang der Mittellinie jedes Polycarbonat Rahmenstück.
  3. Schneiden Sie zwei Stücke von 1,5 cm langen Kohlenstoffstangen. Bohren, um ein 1 mm breites Loch durch den Kohlestab etwa 3 mm vom Ende. Fädeln ein Platindraht durch den Kohlestab Loch ein und ziehen den Draht durch sie um den Kohlestab gewickelt wird. Befestigen eines Clips an das andere Ende des Platindrahtes für die spätere Verbindung mit dem elektrischen Stimulator.
  4. Setzen Sie die Kohlenstoffstäbe in das Polycarbonat Rahmenstücke. Platzieren Sie den zusammengebauten Rahmen mit den Kohlenstoffstäbe in eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen.
  5. Gießen 2 ml PDMS in den Brunnen. Unterzutauchen die Unterseite des Polycarbonat-Rahmen in PDMS PDMS, während das Oberflächenniveau hält nahe an, aber nicht den Boden der Kohlenstoffstäbe erreicht wird. Wärme in einem Ofen bei 70 ° C für 2 h.
  6. Nehmen Sie die elektrische Stimulation Kammer aus den sechs-Well Platte und sie in einer Sterilisationsbeutel für die Dampfsterilisation bei 121 ° C für 20 min.

3. Die enzymatische Dissoziation von HPSC-CMs

  1. Induce HPSC zur Differenzierung zu Kardiomyozyten unter Verwendung eines etablierten Protokolls 4.
    ANMERKUNG: In Kürze, erzeugen Kardiomyozyten über etablierte Embryoidkörper (EB) Protokolle in der Stamm Pro Medium durch die Supplementierung mit sequentieller bone morphogenetic protein 4, basischem Fibroblasten - Wachstumsfaktor, Activin A, die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und Dickkopf homolog 1 4. Verwenden Sie EBs von Tag 20-34 der Differenzierung biowires zu machen.
  2. Sammelt die EBs von der niedrigen Befestigungsplatte mit einer P1,000 Pipettierspitze und in ein konischen Rohr. Pellet durch Zentrifugation für 5 min bei 125 xg und RT. Überstand verwerfen und das Pellet mit vorgewärmten, 37 ° C Kollagenase Typ I, das 1% Desoxyribonuclease I (DNAse I). Inkubieren bei 37 ° C für 2 hfür die Verdauung.
  3. 5 ml vorgewärmtem, 37 ° C Waschmedium und Zentrifuge für 5 min bei 125 x g und RT. Überstand verwerfen. Das Pellet mit 2 ml Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung und Inkubation für 5 min bei 37 ° C.
  4. 1 mL Stop-Medium mit 3% (v / v) DNase I.
  5. Anhängen einer 20 g (0,9 mm) Nadel in eine 5-ml-Spritze und passieren die Suspension durch EB es 3-5 mal.
  6. 7 ml Waschmedium und Zentrifuge bei 280 × g für 5 min. Überstand verwerfen. Das Pellet in Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) und speichern Sie auf dem Eis. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Nehmen 0,5 x 10 6 Zellen und Pellet durch Zentrifugation bei 280 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand.
  7. Vorkühl- alle Gelkomponenten auf Eis, bevor sie in einem sterilen Röhrchen vermischen. Mischen Sie die folgenden Kollagengel Komponenten (Endkonzentration): 2,1 mg / ml Rattenschwanz-Kollagen Typ I, 24,9 mM Glucose, 23,8 mM NaH3 CO, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES und 10% extrazellulärer Matrix in 1x M199 Medium. Fügen Sie die Kollagen und extrazelluläre Matrix zuletzt. Mischen durch Pipettieren von oben und unten.
  8. Resuspendieren 0,5 x 10 6 Zellen mit 3,5 & mgr; l von Kollagengel und gut mischen.
  9. Verwenden Spitze einer Pipette P10 4 ul der Zellsuspension in den 0,5 cm langen Kanals (1B-II) hinzuzufügen. Justieren der Position der Naht mit einer sterilen Pinzette, falls erforderlich.
  10. Den Boden der Petrischale mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um sicherzustellen, das Gel nicht zu berühren. für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
  11. Ersetzen der PBS mit 12 ml Kulturmedium (zB Stamm Pro oder Medium durch die Zell Hersteller empfohlen), ausreichend , um die Zellen (1B-III) zu bedecken. Kultur in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 Woche. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.

4. Elektrische Stimulation für Biowire Anbau

  1. Imder BSC, 2 ml PBS zu jedem Well einer Sechs-Well-Platte, das eine elektrische Stimulator Kammer beherbergen wird. Verwenden einer sterilen Pinzette vorsichtig auf die im Autoklaven behandelt elektrische Stimulationsvorrichtung in das Bohrloch zu platzieren. Entsorgen Sie die PBS aus dem Brunnen.
  2. Deckt die Kohlenstoffstangen mit 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium. Verwenden einer sterilen Pinzette die biowires in der elektrischen Stimulationskammer zu montieren und zu orientieren sie senkrecht zu den Kohlenstoffstangen (Abbildung 2).
  3. Setzen Sie den Deckel auf der Oberseite der Sechs-Well-Platte, aber lassen Sie genügend Platindrähte außerhalb der Platte zu erreichen mit dem elektrischen Stimulator zu verbinden. Platzieren Sie die Sechs-Well-Platte in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und eine Verbindung des Platindrahtes mit dem elektrischen Stimulator.
  4. Stimuliert die biowires einen elektrischen Stimulator mit folgenden Einstellung verwendet: zweiphasige wiederholender Puls, 1-ms Pulsdauer, 3 V / cm und 1 Impuls pro Sekunde (PPS). Erhöhen Sie die PPS alle 24 h auf die folgenden Werte: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15 und 6. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.
  5. Beachten Sie die Kardiomyozyten Kontraktilität als Reaktion auf elektrische Stimulation unter einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
    HINWEIS: Nach einer Woche der Stimulation, die biowires reif wird (die Ergebnisse Abschnitt).

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Representative Results

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Das rationale für die Verwendung einer Naht in den Biowires dient als Vorlage für die Bildung von 3D-Konstrukten, die sich in einer Achse ausrichten und die Form von Herzfasern nachahmen. Wir zeigen, dass nach sieben Tagen Kultur im Biowire die Zellen das Gel um die Naht umgebaut haben (Abbildung 3A ). Die Zellen versammelten sich entlang der Achse der Naht, um ausgerichtetes Herzgewebe zu bilden (Abbildung 3 ). Nach 7 Tagen Vorkultur wurden die Biowires 7 Tage der elektrischen Feldstimulation unterworfen und zeigten ferner Eigenschaften, die mit der strukturellen und funktionellen Reifung von Kardiomyozyten kompatibel waren.

Menschliche PSC-CMs in Biowires zeigten eine starke Expression von kardialen kontraktilen Proteinen, sarkomeren α-Actinin und Actin (Abbildung 4A ). Wir beobachteten die sarkomere Streifenbildung des hPSC-CM kontraktilen Apparates und die Ausrichtung der myofibrilaren Strikturenentlang der Achse des Fadens. Dies ist qualitativ ähnlich die Struktur im erwachsenen Herzen (4A). Zweitens, im Vergleich zu denen von EBs, dieser biowired hESC-CMs angezeigt niedrigere Proliferationsraten (4B). Drittens zeigten die biowired HES-CMs Calciumhandhabungseigenschaften (Abbildung 5) und Kardiomyozyten Elektro Reifung (Abbildung 6) verbessert. In reifen Kardiomyozyten, die Behandlung mit Koffein bewirkt eine plötzliche Freisetzung von Ca 2+ aus dem Retikulum 8. Solche Ca 2+ -Transienten wurden elektrisch stimuliert HES-CMs, aber nicht in Zellen , die aus nicht-stimulierten Kontrollen (5A-C) gefunden. Die Reaktion auf Koffein in den elektrisch stimulierten Zellen im Vergleich zu nicht-stimulierten Kontrollen, zeigte eine signifikant höhere Amplitude der Stimulationsintensität in einer frequenzabhängig (5D und E). Inzwischen HPSC-CMsin biowires zeigte hERG Strom verbessert und Einwärtsgleichrichter Stroms (I k1) Dichten, die weiter durch elektrische Stimulation (6A und B) gesteigert wurde. Solche Verbesserungen in I k1 Strom sind in Übereinstimmung mit einer Induktions in Kaliumkanal - Gen nach innen (KCNJ2) der Proteinexpression in dem biowires (6C) beheben.

Ein weiterer wichtiger Parameter in Bezug auf die Reifung ist die Fähigkeit der Kardiomyozyten spontan zu schlagen, auch als Automatismus bekannt, die ein Zeichen von Unreife ist in Kardiomyozyten (atriale und ventrikuläre) 16 arbeiten. Automatismus war signifikant höher bei EB-abgeleitete Kardiomyozyten im Vergleich zur Kontrolle biowires (6D), die in biowires mit der vergleichbar war mit dem Schema 6-Hz unterzogen.

Nehmenn Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse , dass die Kultur in biowire mit elektrischer Stimulation förderte die strukturelle und elektro Reifung von HPSC-CMs 14.

Abbildung 1
Abbildung 1: Biowire Kultur - Plattform. (A) Schematische (links) und tatsächliche (rechts) PDMS - Form von biowire. Maßstabsbalken = 2 mm. (B) Um die biowire eingerichtet wurde eine Naht zentral in dem Kanal (I) angebracht ist . A HES-CM Suspension in Gel Kollagen Typ I wurde um das Nahtmaterial in dem Kanal (II) und inkubiert in Medium (III) ausgesät. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:Biowire wurde in der Elektrostimulation Kammer während der zweiten Woche der Kultivierung kultiviert. Die biowire wurde senkrecht zu den Kohlenstoffelektroden gelegt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Zell Remodeling und Gel Vertrag rund um die Naht nach dem 7. Tag der Vorkultur in Biowire. (A) Hellfeldbilder von hES-CMs auf angegebene Tagen nach der Vorkultur in der biowire Vorlage. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. (B) Quantifizierung der Gel Verdichtung an den angegebenen Tagen der Kultur (Mittelwert ± SD). (C) Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Masson Trichrom (MT) Anfärbung von biowire Abschnitte (die Doppelpfeile die Naht Achse repräsentieren). Maßstab baR = 100 & mgr; m. Diese Zahl wurde von Referenz 14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Physiology von Kardiomyozyten Cultured in der Biowire Platform. (A) Repräsentative konfokale Bilder von nicht-stimulierten (Kontrolle) und elektrisch stimuliert biowires (3 Hz und 6 Hz Regime) zeigt cardiomyocyte Ausrichtung und häufige Z-Scheiben (die Doppelpfeile stellen die Fadenachse). Grün, α-Actinin; rot, Aktin. Maßstabsbalken = 20 um. (B) Cardiomyocyte Proliferation in der biowires war niedriger als in dem EBs. Die Proliferation wurde für sarcomeric α-Actinin durch Doppelfärbung beurteilt und Ki67 (n = 3-4 pro Bedingung, durchschnittliche ±; Sd). *, **, #, und & stellen statistisch signifikante Unterschiede gegenüber EBd34 (Student's t- test) dar. Diese Zahl wurde aus Referenz 14 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Elektrische Stimulation geförderte Verbesserungen bei Ca 2+ Handhabungseigenschaften. ( AC ) Repräsentative Spuren der Ca 2+ -Ausgabe als Reaktion auf Koffein in nicht stimulierten Kontrollzellen (A) und Zellen, die dem 3-Hz-Regime ( B ) und dem 6 Hz-Regime ( C ) unterzogen wurden. ( D ) Koffein-induzierte Veränderung der Peak-Fluoreszenz-Intensität unter experimentellen Gruppen (Mittelwert ± sem nach Normalisierung der Peak-Fluoreszenz intensity vor der Verabreichung von Koffein; Steuerung im Vergleich zu 3 Hz, P = 1,1 x 10-6; Kontrolle gegen 6 Hz, P = 2,1 x 10-7; 3 Hz gegenüber 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (Kontrolle), n = 6 (3 Hz), und n = 9 (6 Hz) (Student-t - Test). (E) Repräsentative fluoreszierende Aufnahme von Ca 2+ Transienten vor und nach der Verabreichung von Koffein bei 5 mM (Pfeil) in die 6 Hz Regime unterworfen Zellen. Diese Zahl wurde von Referenz 14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6: Elektrischer Pacing Verbessert elektrophysiologischen Eigenschaften und Automatismus. Electrophysiologische Eigenschaften in einzelnen Kardiomyozyten aus biowires oder Embryoidkörpern isoliert (EVG) wurden mit einem Patch-Clamp aufgezeichnet. (A) tail hERG Stromdichte. (B) I K1 Stromdichte bei -100 mV gemessen. (C) Upregulation von Kaliumkanal nach innen gleichrichtenden Gen (KCNJ2). (D) Verhältnis von Zellen anzeigt spontane Schlagen (Automatizität) oder keine spontanen Schlagen (kein Automatismus). Die Daten in AD stellen den Mittelwert ± SEM Die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen durch den Student-t - Test analysiert wurden, Chi-Quadrat - Test und ANOVA (paarweise multiple Vergleiche, Holm-Sidak - Methode). Diese Zahl wurde von Referenz 14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<td colspan = „5“> vermeidet eine Beschädigung des Platindraht durch den Deckel leicht zu verdecken. Verwenden Sie Klebeband um den Deckel richtig auf der Platte zu sichern, falls der Deckel nicht vollständig schließt. Wenn die Türen schließen Inkubator, legen Sie den dünneren Abschnitt der Drähte von dem elektrischen Stimulator an den Punkten Türschließeinwandfreie Abdichtung des Inkubators zu gewährleisten.
Protokollschritt # Kritische Schritte
2.4 Legen Sie die Carbonstäbe 1 - 2 cm auseinander oder in der kleinstmöglichen Entfernung, um hochenergetische Stimulation und Zelltod zu vermeiden.
2.6 Testen Sie die Verbindungen zwischen dem Platindraht und dem Kohlenstoff, sobald die Stimulationskammer zum ersten Mal hergestellt ist. Verbinden Sie die Stimulationskammer mit dem elektrischen Stimulator und setzen Sie dann eine gewünschte Spannung ein. Legen Sie eine Volt-Blei auf jede der beiden Kohlenstoff-Stäbe. Die Ausgangsspannung aus der Stimulationskammer sollte die gleiche Spannung sein, die auf dem Voltmeter gelesen wird. Irgendwelche falschen Messwerte zeigen die mögliche Beschichtung des Platindrahts mit PDMS oder eine andere fehlerhafte Verbindung im System an.
3.1 Einzelzellen wurden verwendet, um den Biowire zu säen. Für die Dissoziation, die Inkubationn Mal mit Kollagenase ist kritisch und soll durch das Alter der Zellen und die Differenzierung Protokoll (EBs gegenüber Monolayern) bestimmt werden. In diesem Protokoll wird eine Inkubationszeit von 2 h für Tag empfohlen 21 EBs und 30 min für Monolayern. Für Zellen anderer Altersgruppen könnte die Collagenaseverdau Zeitoptimierung muß durch die Lebensfähigkeit der Zellen Überwachung und Kontraktionsfunktion nach der Verdauung.
3.3 Trypsin kann die Zellen schädigen; Somit begrenzen die Inkubationsdauer auf nicht länger als 5 min.
3.5 Vermeiden Verunreinigungen Einführen nur das Ende der Spritze die Spritze mit der Nadelspitze zu befestigen. Die Zahl der eintaucht wird durch das Fehlen von großen Klumpen von Zellen bestimmt. Minimieren Nadel Unterbrechung Zelltod zu vermeiden. Vermeiden Sie Blasenbildung. Bei sichtbaren Klumpen nach der Nadel Unterbrechung, verlängert die Inkubationszeit in Kollagenase in nachfolgenden Isolationen anstelle der ErhöhungInkubationszeit in Trypsin oder die Anzahl der eintaucht.
3.6 Entfernen Sie den Überstand vollständig vor der Zugabe von Gel. Restliches Medium kann das Verhältnis von Zellen zu verdünnen: Gel und beeinflusst Gelpolymerisation.
3.7 Pflegen Sie die Konzentrationen der Kollagen-Gel-Komponenten bei der Skalierung nach oben oder unten. Beachten Sie, dass Stammkonzentrationen nach dem Ansatz oder der Zubereitung der Reagenzien variieren.
3.11 Um sicherzustellen, dass PDMS Mikrotitervertiefungen am Boden der Petrischale bleiben, stellen Sie sicher, dass die Petrischale ist trocken und ein Paar von sterilen Pinzette verwenden, um die PDMS Mikrotitervertiefungen nach unten drücken.
4.2 Stellen Sie sicher, dass alle biowires vorhanden sind. Deckt das biowires vollständig mit Medium in der elektrischen Stimulationskammer. Alle anordnen biowires senkrecht zu den Kohlenstoffstangen.
4.3
4.4 Ziehen Sie den elektrischen Stimulator für die mittleren Veränderungen. Verwenden Sie einen P1000 nur den oberen Teil des alten Mediums zu entfernen und dann frisches Medium hinzuzufügen. Stellen Sie sicher, dass das biowires immer unter Medium getaucht.

Tabelle 1: Kritische Schritte in dem Protokoll.

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Discussion

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Dieses Manuskript beschreibt die Einrichtung und Durchführung der konstruierten Plattform, biowire, die Reifung von HPSC-CMs zu verbessern. Das Gerät kann in Standard-Mikrofabrikationsanlagen hergestellt werden und kann mit biowires gemeinsamen Zellkulturtechniken und einem elektrischen Stimulator erzeugt werden.

Unseres Wissens gibt es keine berichtete ähnliches Verfahren wie biowires. Diese Strategie zeigt, dass eine verbesserte Reifungseigenschaften auf der elektrischen Stimulationsregime abhängig waren, wie durch die höhere Reifungsstufe in den biowires auf die höhere Stimulationsfrequenz Ramp-up-Schema (6 Hz im Vergleich zu 3 Hz) unterzogen belegt. Kardiomyozyten in biowires zeigten weniger Automatismus und höhere Ströme und hERG I K1 verglichen mit EBs für 20 Tage (EBd20) kultiviert oder für 40-44 Tage (EBd44). EBd20 Kardiomyozyten repräsentiert die Zelleigenschaften vor ihrem Einbau in biowires, während EBd44 Kardiomyozyten kultiviert wurden 10 Tage longer als die biowire Kulturzeit und zeigt, dass auch bei längerer Zeit in Kultur in EB-Format, Kardiomyozyten konnten nicht gleichwertig Reifung Eigenschaften wie die durch elektrische Stimulation in biowires induziert erreichen. Doch die über biowires erhalten Kardiomyozyten sind noch nicht so ausgereift wie adulte Kardiomyozyten.

Mechanische Stimulation wurde vorgeschlagen, bei der Induktion von Strukturproteinen von HPSC-CMs wirksam zu sein. Allerdings führte mechanische Stimulation nicht zu elektro Reifung 12. Dies kann die Notwendigkeit, legt nahe, elektrische Stimulation und mechanische Beanspruchung zu kombinieren, nacheinander oder gleichzeitig, die terminalen Differenzierung in HPSC abgeleitete Kardiomyozyten zu induzieren. Die Kombination der elektrischen Stimulation mit anderen Verfahren, einschließlich der Lieferung von biochemischen Faktoren 17 und Ausrichtung der Zellen in 3D - Gewebe 18, eine effektivere pro-Reifung Strate zu erreichen könnte die Lage sein ,gy für zukünftige In - vivo - Studien.

Die Abmessungen der Vorrichtung biowire hier verwendet werden, sind 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (Länge x Breite x Höhe), aber es ist möglich, die Vorrichtung zu modifizieren, um mehr biowires zu machen. Allerdings ist die Höhe der biowires bis 0,3 mm (mit einem Radius von ~ 300 & mgr; m auf Gel Verdichtung), angesichts der Beschränkungen in der Sauerstoffzufuhr in größeren Gewebe beschränkt. Zur Überwindung dieser Einschränkung dickere Gewebe zu erzeugen, wäre ein Perfusionsverfahren 19 erforderlich. Trotzdem empfiehlt es sich, das Verhältnis von 0,5 x 10 6 Zellen / 0,5 cm von Draht in der Länge zu halten. Für längere biowires, Kollagengel Polymerisation kann länger dauern, und häufigere Mediumwechsel kann aufgrund der erhöhten Anzahl von Zellen benötigt werden. Außerdem sieht die gegenwärtige Einstellung der biowire Verwendung Seidennaht nicht für die Messung der Kontraktionskraft durch den seeded Kardiomyozyten erzeugt ermöglichen. Jedoch kann die Verwendung eines biologisch abbaubaren Naht makDas ist in Zukunft möglich.

Der Zelltyp, der verwendet wird, um den hier beschriebenen Biowire herzustellen, ist hESC-CM unter Verwendung der Hes2-Zelllinie 20 . Das Protokoll könnte auch hiPSC-Zelllinien ( zB CDI-MRB und HR-I-2Cr-2R) verwenden 14 . Die kardiomyogene Fähigkeit von verschiedenen menschlichen Stammzelllinien könnte unterschiedlich sein, und die Eignung für diese Plattform sollte experimentell bestimmt und die Bedingungen optimiert werden, wie benötigt. Es gibt mehrere kritische Schritte innerhalb des Protokolls (siehe Tabelle 1 ).

Darüber hinaus wurden die Biowires so konzipiert, dass sie in eine 6-Well-Platte passen, und das Beispiel hier zeigte die Herstellung eines Biowire. Es ist jedoch möglich, mehrere Biowires gleichzeitig in einer Vertiefung zu kultivieren und elektrisch zu stimulieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss-in-Hilfe unterstützt von der Herz-und Schlaganfall-Stiftung Kanada (G-14-0006265), Betriebskostenzuschüsse von der kanadischen Institutes of Health Research (137352 und 143066) und einem JP Bickell Gründungszuschuss (1.013.821 ) zu SSN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11825015 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4 inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

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References

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Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation
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Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).More

Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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