Summary

Maturazione di staminali umane cardiomiociti derivati ​​dalle cellule in Biowires Utilizzando Stimolazione Elettrica

Published: May 06, 2017
doi:

Summary

La piattaforma BIOWIRE cardiaco è un metodo in vitro utilizzato per maturare embrionale umano e cardiomiociti derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (HPSC-CM) combinando coltura cellulare tridimensionale con stimolazione elettrica. Questo manoscritto presenta la configurazione dettagliata della piattaforma BIOWIRE cardiaco.

Abstract

cardiomiociti derivati ​​dalle cellule staminali umane pluripotenti (HPSC-CMS) sono stati una fonte di cellule promettente e hanno così favorito l'esame delle loro potenziali applicazioni nel campo della ricerca cardiaca, tra cui la scoperta di farmaci, la modellazione della malattia, l'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Tuttavia, le cellule prodotte da protocolli esistenti mostrano una serie di immaturità rispetto ai cardiomiociti adulti ventricolare nativi. Molti sforzi sono stati fatti maturare HPSC-CM, con solo la maturazione moderata raggiunto finora. Pertanto, un sistema ingegnerizzato, chiamato BIOWIRE, è stato ideato prevedendo stimoli fisici ed elettrici di condurre HPSC-CM ad uno stato più maturo in vitro. Il sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per seminare HPSC-CM in collagene tipo I gel lungo un modello di sutura rigido da montare nel tessuto cardiaco allineata (BIOWIRE), sottoposto alla stimolazione campo elettrico con una frequenza progressivamente crescente. Rispetto ai controlli non stimolate,stimolati biowired cardiomiociti presentano un maggiore grado di maturazione strutturale ed elettrofisiologico. Tali cambiamenti dipendono dalla frequenza di stimolazione. Questo manoscritto descrive in dettaglio la progettazione e realizzazione di biowires.

Introduction

La terapia a base di cellule è una delle strategie più promettenti e studiati per raggiungere cardiaca riparazione / rigenerazione. E 'stato aiutato da ingegneria dei tessuti cardiaco e il co-fornitura di biomateriali 1, 2. La maggior parte delle fonti di cellule disponibili sono stati studiati in modelli animali per i loro effetti potenzialmente benefici sulla danneggiati, malati, o cuori di età compresa tra 3. In particolare, notevoli sforzi sono stati fatti per usare cellule staminali pluripotenti umane (HPSC) -derived cardiomiociti (HPSC-CM), una fonte di cellule autologhe potenzialmente illimitato per l'ingegneria tissutale cardiaco. HPSC-CM può essere prodotto utilizzando diversi protocolli stabiliti 4, 5, 6. Tuttavia, le cellule ottenute mostrano fenotipi fetali simile, con una serie di caratteristiche immaturi rispetto al cardiomiociti ventricolari adulti 7, </sup> 8. Questo può essere un ostacolo per l'applicazione di HPSC-CMS come modelli di tessuto cardiaco degli adulti nella ricerca scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo di modelli di malattia cardiaca per adulti 9.

Per superare questa limitazione di immaturità fenotipica, nuovi approcci sono stati attivamente studiati per promuovere la maturazione dei cardiomiociti. I primi studi hanno rivelato efficaci proprietà pro-maturazione in cardiomiociti neonatali di ratto tramite ciclico 10 meccanica o stimolazione elettrica 11. Compattazione gel e ciclica stimolazione meccanica stati mostrati anche di migliorare alcuni aspetti della HPSC-CM maturazione 12, 13, con un minimo aumento delle proprietà di manipolazione elettrofisiologiche e di calcio. Pertanto, un sistema piattaforma chiamata "wire biologica" (BIOWIRE) è stato ideato fornendo sia segnali strutturali e campo elettrico stimulation per migliorare la maturazione di HPSC-CM 14. Questo sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per creare tessuto cardiaco allineato che è suscettibile di stimolazione campo elettrico. Questo può essere usato per migliorare la maturità strutturale ed elettrofisiologico di HPSC-CM. Qui, descriviamo i dettagli di tale biowires.

Protocol

1. master e Fabrication Nota: utilizzare litografia soft per la fabbricazione di dispositivi. Fare un doppio strato SU-8 master per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio. Progettare il dispositivo utilizzando un design e redazione software (Figura 1A, sinistra). Disegnare ogni strato del maestro separatamente. Stampa il design del dispositivo su due fotomaschere a 20.000 dpi, corrispondenti ai due strati del maestro 15. Impostare il modell…

Representative Results

Il razionale per l'uso di una sutura nelle biowires è servire come stampo per la formazione di costrutti 3D che si allineano in un asse e imitano la forma di fibre cardiache. Abbiamo dimostrato che dopo sette giorni di coltura in BIOWIRE, cellule rimodellato il gel intorno la sutura (Figura 3A). Le celle assemblate lungo l'asse della sutura per formare in linea di tessuto cardiaco (Figura 3). Dopo 7 giorni di precoltura, i biowires sono stati so…

Discussion

Questo manoscritto descrive la configurazione e implementazione della piattaforma progettata, BIOWIRE, per migliorare la maturazione di HPSC-CM. Il dispositivo può essere realizzato in impianti di microfabbricazione standard e biowires può essere prodotto con tecniche di coltura cellulare comuni e uno stimolatore elettrico.

A nostra conoscenza, non esiste un metodo simile a quello riportato biowires. Questa strategia rivela che il miglioramento delle proprietà di maturazione sono dipenden…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione-in-aiuto del Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (137.352 e 143.066), e una borsa di studio fondazione JP Bickell (1.013.821 ) al SSN.

Materials

L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11150059 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media  Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

References

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Cite This Article
Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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