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Developmental Biology

Maturazione di staminali umane cardiomiociti derivati ​​dalle cellule in Biowires Utilizzando Stimolazione Elettrica

doi: 10.3791/55373 Published: May 6, 2017

Summary

La piattaforma BIOWIRE cardiaco è un metodo in vitro utilizzato per maturare embrionale umano e cardiomiociti derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (HPSC-CM) combinando coltura cellulare tridimensionale con stimolazione elettrica. Questo manoscritto presenta la configurazione dettagliata della piattaforma BIOWIRE cardiaco.

Abstract

cardiomiociti derivati ​​dalle cellule staminali umane pluripotenti (HPSC-CMS) sono stati una fonte di cellule promettente e hanno così favorito l'esame delle loro potenziali applicazioni nel campo della ricerca cardiaca, tra cui la scoperta di farmaci, la modellazione della malattia, l'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Tuttavia, le cellule prodotte da protocolli esistenti mostrano una serie di immaturità rispetto ai cardiomiociti adulti ventricolare nativi. Molti sforzi sono stati fatti maturare HPSC-CM, con solo la maturazione moderata raggiunto finora. Pertanto, un sistema ingegnerizzato, chiamato BIOWIRE, è stato ideato prevedendo stimoli fisici ed elettrici di condurre HPSC-CM ad uno stato più maturo in vitro. Il sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per seminare HPSC-CM in collagene tipo I gel lungo un modello di sutura rigido da montare nel tessuto cardiaco allineata (BIOWIRE), sottoposto alla stimolazione campo elettrico con una frequenza progressivamente crescente. Rispetto ai controlli non stimolate,stimolati biowired cardiomiociti presentano un maggiore grado di maturazione strutturale ed elettrofisiologico. Tali cambiamenti dipendono dalla frequenza di stimolazione. Questo manoscritto descrive in dettaglio la progettazione e realizzazione di biowires.

Introduction

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La terapia a base di cellule è una delle strategie più promettenti e studiati per raggiungere cardiaca riparazione / rigenerazione. E 'stato aiutato da ingegneria dei tessuti cardiaco e il co-fornitura di biomateriali 1, 2. La maggior parte delle fonti di cellule disponibili sono stati studiati in modelli animali per i loro effetti potenzialmente benefici sulla danneggiati, malati, o cuori di età compresa tra 3. In particolare, notevoli sforzi sono stati fatti per usare cellule staminali pluripotenti umane (HPSC) -derived cardiomiociti (HPSC-CM), una fonte di cellule autologhe potenzialmente illimitato per l'ingegneria tissutale cardiaco. HPSC-CM può essere prodotto utilizzando diversi protocolli stabiliti 4, 5, 6. Tuttavia, le cellule ottenute mostrano fenotipi fetali simile, con una serie di caratteristiche immaturi rispetto al cardiomiociti ventricolari adulti 7, 8. Questo può essere un ostacolo per l'applicazione di HPSC-CMS come modelli di tessuto cardiaco degli adulti nella ricerca scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo di modelli di malattia cardiaca per adulti 9.

Per superare questa limitazione di immaturità fenotipica, nuovi approcci sono stati attivamente studiati per promuovere la maturazione dei cardiomiociti. I primi studi hanno rivelato efficaci proprietà pro-maturazione in cardiomiociti neonatali di ratto tramite ciclico 10 meccanica o stimolazione elettrica 11. Compattazione gel e ciclica stimolazione meccanica stati mostrati anche di migliorare alcuni aspetti della HPSC-CM maturazione 12, 13, con un minimo aumento delle proprietà di manipolazione elettrofisiologiche e di calcio. Pertanto, un sistema piattaforma chiamata "wire biologica" (BIOWIRE) è stato ideato fornendo sia segnali strutturali e campo elettrico stimulation per migliorare la maturazione di HPSC-CM 14. Questo sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per creare tessuto cardiaco allineato che è suscettibile di stimolazione campo elettrico. Questo può essere usato per migliorare la maturità strutturale ed elettrofisiologico di HPSC-CM. Qui, descriviamo i dettagli di tale biowires.

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Protocol

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1. master e Fabrication

Nota: utilizzare litografia soft per la fabbricazione di dispositivi. Fare un doppio strato SU-8 master per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio.

  1. Progettare il dispositivo utilizzando un design e redazione software (Figura 1A, sinistra). Disegnare ogni strato del maestro separatamente. Stampa il design del dispositivo su due fotomaschere a 20.000 dpi, corrispondenti ai due strati del maestro 15. Impostare il modello dispositivo trasparente e la zona circostante scura; le maschere serviranno da modello per trasferire il disegno otticamente dispositivo sul SU-8 mediante litografia (come descritto da altri 15).
  2. Distribuire circa 4 mL di SU-8 50 sul centro di un wafer di silicio da 4 pollici. Coat SU-8 50 uniformemente sul wafer utilizzando un rivestitore rotazione mediante filatura a 2000 giri al minuto (rpm) per 30 s. Cuocere il wafer su una piastra riscaldante a 95 ° C per 10 min. Esporre il wafer a raggi ultravioletti (UV) lilotta a 200 mJ / cm 2.
  3. Versare circa 4 mL di SU-8 2050 sul centro del wafer e centrifuga a 2500 giri per 30 s. Cuocere sulla piastra C 95 ° per 15 min. Raffreddare a temperatura ambiente (RT).
  4. Ripetere il punto 1.3 altre due volte.
  5. Coprire il wafer rivestito con la trasparenza fotomaschera primo strato. Esporre il wafer di luce UV a 270 mJ / cm 2 per effettuare il primo strato. Cuocere sulla piastra C 95 ° per 15 min.
  6. Rendere il secondo strato di SU-8 2050 ripetendo passo 1,3 volte.
  7. Allineare la maschera secondo strato alle caratteristiche sul primo strato mediante un allineatore maschera. Poi, esporre a luce UV a 240 mJ / cm2. Cuocere in forno a 95 ° C per 15 min.
    NOTA: Il tempo di esposizione è determinato dalla dose di UV totale richiesta e l'intensità di uscita luce UV misurata il giorno prima dell'uso.
  8. Sviluppare il wafer immergendo in propilenglicole monometiletere acetato (PGMEA) e agitazione a 200 giri per 30 minuti in un agitatore orbitale.
  9. Postoil master in una piastra di Petri e con attenzione versare il composto PDMS (base a reticolante ad un rapporto di 10: 1 in peso) sul centro del wafer. Coprire tutte le caratteristiche ed evitare bolle d'aria.
  10. Il calore in un forno a 70 ° C per 2 ore. Utilizzare una lama tagliente per tagliare intorno al bordo della dima BIOWIRE PDMS (Figura 1A, destra). Sbucciare le PDMS dal master. Tagliare il dispositivo con la lama. Mettere il modello BIOWIRE PDMS in un sacchetto di sterilizzazione e autoclave a vapore a 121 ° C per 20 minuti.
  11. In un armadio biosicurezza (BSC), posizionare il PDMS BIOWIRE modello in una capsula di Petri. Utilizzare una pinzetta per tenere e montare un pezzo di sterile sutura chirurgica seta (6-0) al centro del canale del micropozzetto PDMS tali sedili nelle scanalature su entrambe le estremità del canale (Figura 1B-I).

2. Creazione della stimolazione elettrica Camera

  1. Fare un paio di pezzi di policarbonato rettangolari (lunghezza x larghezza x spessore: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) e usarli come la struttura della camera di stimolazione elettrica (Figura 2).
  2. Praticare due fori 3 millimetri larghezza 2 cm di distanza lungo la linea centrale di ogni pezzo di telaio in policarbonato.
  3. Tagliare due pezzi di 1,5 cm aste lungo carbonio. Praticare un foro 1 mm di larghezza attraverso l'asta di carbonio di circa 3 mm dall'estremità. Infilare un filo di platino attraverso il foro dell'asta del carbonio e serrare il filo avvolgendolo intorno all'asta carbonio. Collegare una clip all'altra estremità del filo di platino per la connessione in seguito con lo stimolatore elettrico.
  4. Inserire le barre di carbonio nelle parti del telaio del policarbonato. Posizionare il telaio assemblato con le barre di carbonio in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
  5. Versare 2 ml di PDMS nel pozzo. Immergere la parte inferiore dei telai policarbonato in PDMS mantenendo il livello di superficie PDMS vicino ma non raggiungere il fondo delle barre di carbonio. Il calore in un forno a 70 ° C per 2 ore.
  6. Prendere la camera di stimolazione elettrica dei seipiastra -well e metterlo in un sacchetto di sterilizzazione per la sterilizzazione a vapore a 121 ° C per 20 min.

3. enzimatica dissociazione di HPSC-CMS

  1. Indurre HPSC di differenziarsi in cardiomiociti utilizzano un protocollo stabilito 4.
    NOTA: Brevemente, generare cardiomiociti via corpo embrioide fissato (EB) protocolli stelo pro mezzo attraverso la supplementazione sequenziale con proteina ossea morfogenetica 4, fattore di crescita dei fibroblasti, activin A, fattore di crescita vascolare endoteliale, e Dickkopf omologo 1 4. Utilizzare EBs dal giorno 20-34 di differenziazione per fare biowires.
  2. Raccogliere EBS dalla piastra partire allegato con un puntale P 1.000 e trasferire in una provetta conica. Pellet per centrifugazione per 5 min a 125 xg ed RT. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet con pre-riscaldato a 37 ° C collagenasi tipo I contenente 1% deossiribonucleasi I (DNAsi I). Incubare a 37 ° C per 2 hper la digestione.
  3. Aggiungere 5 ml di pre-riscaldato a 37 ° C lavare medio e centrifugare per 5 min a 125 xg ed RT. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet con 2 ml di soluzione di tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C per 5 min.
  4. Aggiungere 1 ml di mezzo di arresto contenente 3% (v / v) DNasi I.
  5. Inserire un ago 20 G (0,9 mm) ad una siringa da 5 ml e passare la sospensione attraverso EB 3-5 volte.
  6. Aggiungere 7 ml di mezzo di lavaggio e centrifugare a 280 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in mezzo (IMDM) Iscove modificato da Dulbecco e memorizzare sul ghiaccio. Determinare il numero di cellule con un emocitometro. Prendere 0,5 x 10 6 cellule e pellet mediante centrifugazione a 280 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante.
  7. Pre-raffreddare tutti i componenti del gel su ghiaccio prima di loro miscelazione in una provetta sterile. Miscelare i seguenti componenti del gel di collagene (concentrazione finale): 2,1 mg / mL tipo coda di ratto collagene I, 24,9 mM glucosio, 23,8 mM NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES, e il 10% della matrice extracellulare in mezzo 1x M199. Aggiungere il collagene e la matrice extracellulare scorso. Mescolare pipettando su e giù.
  8. Risospendere 0,5 x 10 6 cellule con 3,5 ml di gel di collagene e mescolare bene.
  9. Utilizzare un puntale P10 aggiungere 4 ml di sospensione cellulare nel canale di 0,5 cm di lunghezza (Figura 1B-II). Regolare la posizione della sutura con pinza sterile se necessario.
  10. Coprire il fondo del piatto Petri sterile con tampone fosfato salino (PBS), facendo attenzione a non toccare il gel. Incubare a 37 ° C per 30 min.
  11. Sostituire la PBS con 12 ml di terreno di coltura (per esempio, stelo pro o terreno raccomandato dal produttore di celle), sufficienti a coprire le cellule (Figura 1B-III). Cultura in un incubatore a 37 ° C per 1 settimana. Cambiare il mezzo di ogni altro giorno.

4. La stimolazione elettrica per BIOWIRE coltivazione

  1. InBSC, aggiungere 2 ml di PBS a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti che ospiterà una camera stimolatore elettrico. Utilizzare pinzette sterili per posizionare delicatamente il dispositivo di stimolazione elettrica autoclavato nel pozzo. Eliminare il PBS dal pozzo.
  2. Coprire le barre di carbonio con 5 ml di terreno di coltura pre-riscaldato. Utilizzare pinzette sterili per montare i biowires nella camera di stimolazione elettrica e orientarli perpendicolari alle barre di carbonio (Figura 2).
  3. Posizionare il coperchio sulla parte superiore della piastra di sei pozzetti, ma lascia fili di platino sufficienti raggiungono all'esterno della piastra di connettersi con lo stimolatore elettrico. Posizionare la piastra sei pozzetti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e collegare il filo di platino allo stimolatore elettrico.
  4. Stimolare i biowires utilizzando uno stimolatore elettrico con le seguenti impostazioni: bifasica impulso ripetizione, durata dell'impulso 1-ms, 3 V / cm, e 1 impulso al secondo (PPS). Sollevare il PPS ogni 24 ore per i seguenti valori: 1.83, 2.66, 3.49, 40,82, 5,15 e 6. Cambiare il mezzo di ogni altro giorno.
  5. Osservare la contrattilità cardiomiociti in risposta alla stimolazione elettrica sotto un microscopio a ingrandimento 10X.
    NOTA: Dopo una settimana di stimolazione, i biowires diventa maturo (vedere la sezione risultati).

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Representative Results

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Il razionale per l'uso di una sutura nelle biowires è servire come stampo per la formazione di costrutti 3D che si allineano in un asse e imitano la forma di fibre cardiache. Abbiamo dimostrato che dopo sette giorni di coltura in BIOWIRE, cellule rimodellato il gel intorno la sutura (Figura 3A). Le celle assemblate lungo l'asse della sutura per formare in linea di tessuto cardiaco (Figura 3). Dopo 7 giorni di precoltura, i biowires sono stati sottoposti a 7 giorni di stimolazione del campo elettrico e le proprietà esposte ulteriormente compatibili con la maturazione strutturale e funzionale dei cardiomiociti.

Umano PSC-CM in biowires esposto forte espressione di proteine contrattili cardiache, sarcomerica α-actinina, actina (Figura 4A). Abbiamo osservato banding sarcomerica dell'apparato contrattile HPSC-CM e l'allineamento delle stenosi myofibrilarlungo l'asse della sutura. Questo è qualitativamente simile alla struttura nel cuore adulto (Figura 4A). Secondo, rispetto a quelle di EB, questi biowired hESC-CM visualizzata tassi di proliferazione inferiori (Figura 4B). In terzo luogo, il biowired hESC-CM esibivano migliorate proprietà di gestione di calcio (Figura 5) e cardiomiociti elettrofisiologia maturazione (Figura 6). In cardiomiociti maturi, trattamento con caffeina induce un rilascio repentino di Ca 2+ dal reticolo sarcoplasmatico 8. Tali Ca 2 + transitori sono stati trovati nella stimolato elettricamente hESC-CM, ma non in cellule di controllo non stimolate (Figura 5A-C). La risposta alla caffeina nelle cellule stimolate elettricamente, rispetto ai controlli non stimolati, ha rivelato un significativamente maggiore ampiezza di intensità in un modo dipendente dalla frequenza di stimolazione (Figura 5D e E). Nel frattempo, HPSC-CMSin biowires ha mostrato migliorata corrente e corrente interna raddrizzatore (I) K1 densità hERG, che è stato ulteriormente esaltate dalla stimolazione elettrica (Figura 6A e B). Tali miglioramenti in corrente I k1 sono conformi un'induzione di potassio interiormente rettificazione espressione genica canale proteina (KCNJ2) nei biowires (figura 6C).

Un altro parametro importante per quanto riguarda la maturazione è la capacità dei cardiomiociti battere spontaneamente, noto anche come automaticità, che è un segno di immaturità a lavorare cardiomiociti (atriale e ventricolare) 16. Automaticità era significativamente maggiore nei cardiomiociti EB-derivate rispetto al biowires controllo (Figura 6D), che era paragonabile a quella in biowires sottoposti al regime 6 Hz.

Prenderen insieme, questi risultati indicano che la cultura in BIOWIRE con stimolazione elettrica promosso la maturazione strutturale e elettrofisiologico HPSC-CM 14.

Figura 1
Figura 1: BIOWIRE Culture piattaforma. (A) Schema (a sinistra) e reale (destra) PDMS stampo BIOWIRE. bar scala = 2 mm. (B) Per impostare il BIOWIRE, una sutura è stato montato centralmente nel canale (I). Una sospensione hESC-CM in gel di collagene di tipo I è stato seminato attorno alla sutura nel canale (II) e incubate in terreno (III). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:BIOWIRE è stato coltivato nella stimolazione Camera elettrico durante la seconda settimana di coltivazione. La BIOWIRE stata posta perpendicolarmente agli elettrodi di carbonio. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Cell rimodellamento e Gel contraente intorno alla sutura dopo il giorno 7 di precoltura in BIOWIRE. (A) le immagini in campo chiaro di hESC-CMS giorni indicati di precoltura nel modello BIOWIRE. bar scala = 200 pm. (B) Quantificazione di gel compattazione giorni indicati di cultura (media ± deviazione standard). (C) ematossilina ed eosina (EE) e Masson tricromica (MT) colorazione delle sezioni BIOWIRE (frecce a doppia testa rappresentano l'asse sutura). ba scalar = 100 um. Questo dato è stato modificato dal riferimento 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Fisiologia di cardiomiociti Cultured nella Piattaforma BIOWIRE. (A) immagini confocali rappresentativi non stimolato (controllo) e biowires stimolate elettricamente (3 Hz e 6 i regimi Hz) risultati allineamento cardiomiociti e frequenti Z-dischi (frecce a doppia testa rappresentano l'asse sutura). Verde, α-actinina; rosso, actina. bar scala = 20 um. (B) la proliferazione Cardiomyocyte nelle biowires è stato inferiore a quello dei corpi elementari. Proliferazione è stata valutata mediante doppia colorazione per sarcomerica α-actinina e Ki67 (n = 3-4 a condizione, ± medi; sd). *, **, #, e & rappresentano differenze statisticamente significative rispetto al EBd34 (di Student t-test). Questo dato è stato modificato dal riferimento 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: La stimolazione elettrica Miglioramenti Promosso a Ca 2+ Gestione Proprietà. (AC) tracce rappresentativi di rilascio di Ca 2+ in risposta alla caffeina in cellule non stimolate di controllo (A) e le cellule sottoposte al trattamento di 3 Hz (B) e il regime di 6 Hz (C). (D) cambia caffeina-indotti di intensità di picco di fluorescenza tra i gruppi sperimentali (media ± sem dopo la normalizzazione del picco di fluorescenza iNtensity prima della somministrazione di caffeina; Controllo contro 3 Hz, P = 1,1 x 10 - 6 ; Controllo contro 6 Hz, P = 2,1 x 10 - 7 ; 3 Hz rispetto a 6 Hz, P = 0.003; N = 10 (controllo), n = 6 (3 Hz) e n = 9 (6 Hz) (prova t Studente). (E) Registrazione fluorescente rappresentativa di transitori Ca 2+ prima e dopo la somministrazione di caffeina a 5 mM (freccia) in cellule sottoposte al regime di 6 Hz. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 14 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: La stimolazione elettrica migliora le proprietà elettrofisiologiche e l'automazione. ElectrophysiologProprietà ici in cardiomiociti isolati da biowires o corpi embrionali (EBS) sono stati registrati con un patch clamp. (A) hERG coda densità di corrente. (B) I K1 densità di corrente misurata a -100 mV. (C) sovraregolazione di potassio interiormente rettificazione canale gene (KCNJ2). (D) Rapporto di cellule che mostrano battito spontaneo (automaticità) o nessun battito spontaneo (senza automaticità). I dati in AD rappresentano la media ± SEM delle differenze tra i gruppi sperimentali sono stati analizzati mediante t-test di Student, test chi-quadro, e ANOVA (confronti a coppie multipli, metodo Holm-Sidak). Questo dato è stato modificato dal riferimento 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

<td colspan = "5"> evitare danni al filo di platino coprendo il coperchio delicatamente. Utilizzare nastro adesivo per fissare il coperchio correttamente sul piatto nel caso in cui il coperchio non si chiude completamente. Quando la chiusura delle porte incubatore, posizionare la porzione più sottile dei fili dalla stimolatore elettrico nei punti di chiusura della porta per garantire una perfetta tenuta dell'incubatrice.
Protocollo passo # fasi critiche
2.4 Posizionare le barre di carbonio 1 - 2 cm di distanza o alla minima distanza possibile per evitare la stimolazione ad alta energia e la morte cellulare.
2.6 Verificare le connessioni tra il filo di platino e il carbonio una volta che la camera di stimolazione è fatto per la prima volta. Collegare la camera di stimolazione al elettrostimolatore e quindi impostare una tensione desiderata. Collocare un vantaggio volt su ciascuna delle due barre di carbonio. La tensione in uscita dalla camera di stimolazione deve essere la stessa tensione letta sul voltmetro. Eventuali letture errate indicano la possibile rivestimento del filo di platino con PDMS o un'altra connessione difettosa nel sistema.
3.1 Singole cellule sono stati usati per seminare il BIOWIRE. Per la dissociazione, l'incubation tempo con collagenasi è critica e deve essere determinata dall'età delle cellule e il protocollo di differenziazione (EBS contro monostrati). In questo protocollo, un tempo di incubazione di 2 ore è raccomandato per giorno 21 EBS e 30 min per monostrati. Per le cellule di altre età, il tempo di digestione collagenasi potrebbe aver bisogno di ottimizzazione, monitorando la vitalità delle cellule e la funzione contrattile post-digestione.
3.3 Tripsina può danneggiare le cellule; quindi, limitare la durata dell'incubazione a non più di 5 min.
3.5 Evitare di introdurre sostanze contaminanti tenendo solo la fine della siringa per fissare la siringa per la punta dell'ago. Il numero di tuffi è determinato dalla assenza di grumi macroscopici di cellule. Ridurre al minimo l'ago interruzioni per evitare la morte delle cellule. Evitare la formazione di bolle. In caso di ciuffi visibili dopo dell'ago interruzione, prolungare il tempo di incubazione in collagenasi in isolamenti successive invece di aumentare latempo di incubazione in tripsina o il numero di tuffi.
3.6 Rimuovere il surnatante completamente prima dell'aggiunta di gel. mezzo residuo può diluire il rapporto di cellula: gel e influenzare polimerizzazione del gel.
3.7 Mantenere le concentrazioni dei componenti del gel di collagene per scalare su o giù. Tenete a mente che le concentrazioni azionari possono variare a seconda del lotto o la preparazione dei reagenti.
3.11 Per garantire che PDMS micropozzetti rimangono alla parte inferiore della scatola di Petri, assicurarsi che la piastra di Petri è secco e utilizzare un paio di pinze sterili per spingere i PDMS micropozzetti giù.
4.2 Assicurarsi che tutti i biowires sono a posto. Coprire le biowires completamente con terreno nella camera stimolazione elettrica. Disporre tutti biowires perpendicolari alle barre di carbonio.
4.3
4.4 Scollegare lo stimolatore elettrico per le medie modifiche. Utilizzare un P1000 per rimuovere solo la parte superiore della vecchia medio e quindi aggiungere mezzo fresco. Assicurarsi che i biowires sono sempre sommersi sotto media.

Tabella 1: Critical Passi nel protocollo.

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Discussion

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Questo manoscritto descrive la configurazione e implementazione della piattaforma progettata, BIOWIRE, per migliorare la maturazione di HPSC-CM. Il dispositivo può essere realizzato in impianti di microfabbricazione standard e biowires può essere prodotto con tecniche di coltura cellulare comuni e uno stimolatore elettrico.

A nostra conoscenza, non esiste un metodo simile a quello riportato biowires. Questa strategia rivela che il miglioramento delle proprietà di maturazione sono dipendenti dal regime stimolazione elettrica, come dimostra il maggiore livello di maturazione ottenuto negli biowires sottoposti al tasso di stimolazione regime superiore accelerazione (6 Hz contro 3 Hz). Cardiomiociti in biowires dimostrato meno automaticità e correnti elevate hERG e K1 confrontati EB coltivata per 20 giorni (EBd20) o per 40-44 giorni (EBd44). EBd20 cardiomiociti rappresentano le proprietà delle cellule prima della loro incorporazione in biowires, mentre cardiomiociti EBd44 state coltivate 10 giorni longer del tempo cultura BIOWIRE e mostra che anche con tempo maggiore in coltura in formato EB, cardiomiociti non potevano raggiungere proprietà maturazione equivalenti a quelli indotti dalla stimolazione elettrica in biowires. Tuttavia, i cardiomiociti ottenuti tramite biowires non sono ancora maturo come cardiomiociti adulti.

stimolazione meccanica è stato suggerito per essere efficace nella induzione di proteine ​​strutturali del HPSC-CM. Tuttavia, la stimolazione meccanica non ha portato a maturazione elettrofisiologico 12. Ciò suggerisce la necessità di combinare la stimolazione elettrica e stress meccanico, in sequenza o contemporaneamente, per indurre la differenziazione terminale in cardiomiociti HPSC-derivati. La combinazione di stimolazione elettrica con altri metodi, tra cui la fornitura di biochimica fattori 17 e l'allineamento delle cellule in 3D tessuti 18, potrebbe essere in grado di raggiungere una più efficace strate pro-maturazionegy per il futuro studi in vivo.

Le dimensioni del dispositivo BIOWIRE usati qui sono cinque millimetri x 1 mm x 0.3 mm (lunghezza x larghezza x altezza), ma è possibile modificare il dispositivo per effettuare biowires più lunghi. Tuttavia, l'altezza delle biowires è limitata a 0,3 mm (con un raggio di circa 300 um su gel compattazione), date le limitazioni nella fornitura di ossigeno nei tessuti più grandi. Per superare questa limitazione di generare tessuti più spessi, un metodo di perfusione sarebbe necessario 19. Tuttavia, si raccomanda di mantenere il rapporto di 0,5 x 10 6 cellule / 0,5 cm di filo di lunghezza. Per biowires più lunghi, collagene gel di polimerizzazione può richiedere più tempo e più frequenti cambiamenti medi può essere necessaria a causa del maggior numero di cellule. Inoltre, la configurazione attuale del BIOWIRE con sutura di seta non consente la misura della forza di contrazione generata dai cardiomiociti seminati. Tuttavia, l'uso di una sutura biodegradabile può makE Questo possibile in futuro.

Il tipo cellulare utilizzato per effettuare la BIOWIRE qui descritto è hESC-CM utilizzando la linea cellulare HES2 20. Il protocollo potrebbe anche utilizzare linee cellulari hiPSC (ad esempio, CDI-MRB e HR-I-2Cr-2R) 14. La capacità cardiomyogenic di diverse linee di cellule staminali umane potrebbe essere diverso, e idoneità per questa piattaforma deve essere determinato sperimentalmente e le condizioni ottimizzate secondo necessità. Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo (vedi tabella 1).

Inoltre, i biowires stati progettati per adattarsi in una piastra da 6 pozzetti, e l'esempio qui mostrato la realizzazione di uno BIOWIRE. Tuttavia, è possibile cultura e stimolare elettricamente multipli biowires contemporaneamente in un pozzetto.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione-in-aiuto del Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (137.352 e 143.066), e una borsa di studio fondazione JP Bickell (1.013.821 ) al SSN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11825015 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4 inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

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References

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Maturazione di staminali umane cardiomiociti derivati ​​dalle cellule in Biowires Utilizzando Stimolazione Elettrica
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Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).More

Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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