L'incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Summary

Une fois sorti du corps, le tissu neuronal est fortement influencée par les conditions environnementales, ce qui conduit à une dégradation éventuelle du tissu après 6 à 8 heures. En utilisant une méthode d'incubation unique, qui surveille de près et régule l'environnement extracellulaire du tissu, la viabilité des tissus peut être considérablement prolongée pour> 24 h.

Abstract

Aiguë des préparations de tissus neuronaux, des tranches de cerveau et wholemount rétinienne, ne peuvent généralement être conservés pendant 6-8 heures après dissection. Cela limite la durée de l'essai, et augmente le nombre d'animaux qui sont utilisés pour l'étude. Cette limitation spécifiquement les impacts des protocoles tels que l'imagerie calcique qui nécessitent une pré-incubation prolongée avec des colorants de bain appliqués. la croissance bactérienne exponentielle dans les 3 - 4 h après le découpage en tranches est étroitement corrélée avec une diminution de la santé des tissus. Cette étude décrit un procédé pour limiter la prolifération des bactéries dans les préparations aiguës pour maintenir le tissu neuronal viables pendant des périodes de temps prolongées (> 24 h) sans avoir recours à des antibiotiques, des procédures stériles ou milieux de culture tissulaire contenant des facteurs de croissance. Par un cycle du fluide extracellulaire par irradiation UV et de maintenir le tissu dans une chambre de maintien de la commande à 15 - 16 ° C, le tissu ne montre aucune différence dans les propriétés électrophysiologiques, ou si de calciumgnaling par des colorants de calcium intracellulaire à> 24 h postdissection. Ces méthodes ne seront pas seulement prolonger le temps expérimental pour ceux qui utilisent le tissu neuronal aigu, mais permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux, et établira une norme d'or pour l'incubation de tissu neuronal aiguë.

Introduction

Électrophysiologie et d'imagerie fonctionnelle (calcium, tension colorants sensibles) sont deux des techniques expérimentales les plus couramment utilisés dans les neurosciences. Casse des préparations de tranche et wholemount rétinienne, qui sera examiné ici, fournissent un moyen d'examiner les propriétés électrophysiologiques et la connectivité synaptique sans contamination par des anesthésiques ou des relaxants musculaires. Des tranches de cerveau et de la rétine wholemount conservent leur intégrité structurelle, à la différence des cultures ou des homogénats cellulaires, permettant l'étude des circuits spécifiques et des réseaux cérébraux ^1. Les enregistrements de tissu isolé présentent des avantages par rapport aux enregistrements in vivo que les mouvements associés au rythme cardiaque et la respiration sont éliminés. De plus, la visualisation directe permet à des classes spécifiques de cellules à cibler, et l' application locale d'outils pharmacologiques ^{2, 3.}

enregistrements de patch-clamp et calcium colorant chargement dans wholemount rétinienne est compliquée par l'existence de l'Inner Limitation de la membrane (ILM), qui couvre la couche rétinienne Ganglion cellulaire (RGC) et empêche l'accès direct aux cellules. Typiquement, cette membrane est gratté avec une pipette en verre pour permettre une application directe d'une pipette de patch et la formation d'un joint d'étanchéité gigaohm sur une seule cellule. En outre, les colorants de calcium bain appliquée ne traversent pas la ILM et doivent soit être injectés sous cette membrane ^4, rétrogressivement transporté après l' injection au niveau du nerf optique ⁵ ou électroporation à travers le tissu ^6. En outre, lorsqu'on utilise un modèle de rongeur de la rétinite pigmentaire, le rd / rd souris, la MLI est plus épaisse et plus impénétrable. Ici, nous utilisons une technique pour éliminer l'ILM à la digestion enzymatique ^7, pour permettre à la fois du calcium omniprésent colorant chargement, et un accès direct à des cellules ganglionnaires de la rétine pour patch-clamp recordings ^8.

enregistrements réussis provenant soit des tranches de cerveau ou wholemount rétinienne dépendent de la dissection et l'incubation du tissu neuronal viable. Typiquement, le tissu est extrait le matin de l'expérience et mis en incubation dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour l'enregistrement. En général, le tissu reste viable pour les 6 - 8 h, à une dégradation importante qui suit cette fenêtre temporelle. Cependant, les deux tranches de cerveau et les préparations de rétines wholemount produisent habituellement plus de tissu que peuvent être enregistrées à partir de cette courte période de temps. Par conséquent, le tissu est souvent mis au rebut à la fin de la journée et de la dissection est achevée à nouveau les jours suivants. Cela signifie un autre animal est utilisé et ~ 2 h de la configuration et la dissection / coloration répétée. Le protocole suivant décrit une méthode pour prolonger la vie de tissu neuronal pendant plus de 24 h, ce qui signifie moins d'animaux sont utilisés, et le temps plus expérimental est disponible. Tissue viabilité wcomme évalué par l'enregistrement des propriétés électrophysiologiques et la dynamique de calcium, et ces propriétés ne se distinguaient pas entre <4 h et> 24 h postdissection.

Ces résultats indiquent que non seulement les propriétés des cellules individuelles intactes et fonctionnelles après une incubation prolongée, mais l'activité du réseau, tel qu'évalué par imagerie du calcium et des enregistrements électrophysiologiques, est inchangé> 24 h postdissection. En outre, nous montrons que les colorants de calcium dans les cellules peuvent rester pendant des périodes prolongées sans provoquer d'effets secondaires nuisibles. L'application de ce protocole démontre que l'activité fonctionnelle des neurones dans le tissu neuronal aiguë peut être maintenue pendant de longues périodes, une fois que l'environnement extérieur est très réglementé. En outre, comme la viabilité des tissus varie grandement entre les laboratoires en raison de protocoles d'incubation différents, cette méthode établit une norme d'or pour les paramètres idéaux qui devraient être appliqués pour réduire la variabilité de la santé de neu aiguëtissus ronal.

Protocol

Le protocole suivant décrit la préparation de C57BL / 6 et C3H / He (retinally dégénéré) un tissu neuronal de la souris, mais des techniques similaires peuvent être appliquées à d'autres espèces. Tous les animaux étaient en bonne santé et manipulé avec les conditions normales de température, d'humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, l'accès libre à la nourriture et de l'eau, et sans stimuli de stress destinés. Toutes les expériences ont été approuvées et effectuées en conformité avec comité de l'Université Western Sydney Animal Care et de l'éthique et selon l'utilisation des animaux et des lignes directrices de soins (Animal Research Authority # A9452, # A10396 et # A8967).

1. Cerveau Slice Préparation

1. Anesthésier l'animal par inhalation d'isoflurane (5%) et en utilisant une guillotine décapite des rongeurs. Retirer rapidement le cerveau, comme décrit précédemment ⁹ et le placer dans une solution physiologique glacée (aCSF) contenant (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 _CaCl2, 25NaHCO _3, 25 dextrose, et une solution saturée de carbogène (95% O _2/5% CO ₂ du mélange; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Couper des tranches de cerveau dans la région d'intérêt, de 300 um d'épaisseur avec un microtome vibrant.
3. Transférer les tranches à un système d'incubation intégré personnalisé qui surveille et contrôle les niveaux de pH (pH 7,2 à 7,4), le flux de carbogène et température comme décrit précédemment ^{10, 11.}
4. Régler la température de la chambre initiale à 35 ° C pendant 15 - 30 min, puis réduire lentement à 15 - 16 ° C , comme le montre la figure 1C. Puis incuber des tranches dans le système d'incubation jusqu'à ce que nécessaire, que ce soit pour l'électrophysiologie ou d'imagerie.
   NOTE: Si les tranches doivent être utilisés pour le calcium-imagerie, suivez les étapes ci-dessous avant le tissu de refroidissement ci-dessous RT.

2. Retinal Wholemount Préparation et intérieure Limitation Membrane Removal

1. Préparer des échantillons entiers rétiniens sous soit normalelaboratoire des conditions d'éclairage ou rouge lumière infrarouge / dim.
2. Euthanasier animaux par dislocation cervicale et les yeux immédiatement énucléer. Faire une petite incision le long de la ora serrata, et le lieu dans les deux médias Ames, ou LCRa contenant (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO _3, 3 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 glucose, 0,5 L-glutamine, et sature avec du carbogène (95% O _2/5% CO ₂ du mélange; ~ 300 mOsm; pH 7,4) à température ambiante.
3. Retirer immédiatement la cornée, le cristallin et vitreux en coupant le long de l'ora serrata avec de petits ciseaux et retirer la lentille et le vitré avec une pince. Placer le tissu dans le système d'incubation à la température ambiante.
   REMARQUE: le tissu rétinien peut être maintenue dans l'œilleton, après réduction lente de la température à 15 - 16 ° C, pendant> 24 h dans le système d'incubation jusqu'à ce que nécessaire.
4. Pour supprimer l'ILM, transférer l'œil-tasse contenant la rétine à un petit pot de verre contenant de la papaïne 30 U / ml, 1 mM de L-cystine, EDTA 0,5 mM et 0,005% DNase dans Earl's-Une solution saline équilibrée (BSS) à 37 ° C pendant 20 min. Appliquer 95% O _2/5% de CO ₂ à la solution à travers le couvercle mais ne pas bulle. En cas d'utilisation de tissus de jeunes animaux (<6 semaines), diluer la solution à demi-force.
   1. Arrêter la digestion enzymatique, en plaçant le tissu dans un ovomucoïde (10 mg / ml) et BSA (10 mg / ml), la solution pendant 10 min dans le BSS Earl. Laver soigneusement les tissus avec LCRa avant le transfert vers le système d'incubation et de réduire la température à 15 - 16 ° C.
5. Maintenir le tissu rétinien dans l'œil-tasse jusqu'à ce que nécessaire. Pour le transfert au microscope, isoler la rétine de l'œil-tasse et coupé en 4 morceaux avec une lame de rasoir. Si la rétine entière est nécessaire, faire quatre petites coupures dans la périphérie de la rétine pour lui permettre de reposer à plat.
   NOTE: Pour les expériences d'imagerie, la charge avec le calcium-colorants avant le transfert vers le système d'incubation, voir ci-dessous.

3. Le maintien de tissus dans l'incubateur

(Figure 1A, B).
1. Circulez LCRa à travers une deuxième chambre (chambre UVC, construit comme décrit précédemment ¹²⁾ isolé de la chambre principale et exposée à 1,1 W lumière UVC (254 nm, lampe UV 5W / 2P stérilisateur) pour irradier bactéries flottant dans la solution (Figure 1A). synchronisation de la lumière de contrôle UVC via une minuterie programmable à l'aide d'une fonction aléatoire qui est activée à des moments variant entre 15 et 26 min toutes les 15 - 30 min pour éviter un échauffement excessif de la LCRa.
2. Réglez le débit dans la chambre UVC à 12 mL / min comme indiqué précédemment ^12. Couvrir la chambre UVC avec une feuille d'aluminium pour empêcher l'éclairage UVC en dehors de la chambre, ce qui peut endommager le tissu neuronal.
   NOTE: Pour le tissu rétinien adapté à l'obscurité, appliquer une couverture sur mesure à la chambre principale pour exclure la lumière.
3. Utilisez une pompe péristaltique à Circulate la solution (LCRa) à travers les deux chambres et une plaque froide thermoélectrique Peltier glacière pour refroidir ou chauffer la chambre principale pour les températures souhaitées dans la plage de 0 - 50 ° C. Pour incubation optimale des tissus, utiliser 15 - 16 ° C pour la viabilité à long terme.

4. Calcium Dye Loading

1. Sélectionnez les colorants de calcium en fonction de la préférence du chercheur individuel. Ici, nous utilisons Fura-2 heures, Fluo-huit heures ou Fluo-quatre heures. Cependant, cette méthode peut être appliquée à d' autres colorants, ainsi: dissoudre les colorants de calcium dans le DMSO à une solution de 1 mM et 1% de copolymères séquencés (par exemple, l' acide-127 Pluronic) jusqu'à un volume final de 50 ul et de traitement par ultrasons pendant 10 min.
2. Ajouter une solution à LCRa à une concentration finale de 10 uM, les copolymères séquencés 0,01% pour des tranches de cerveau, et 20 uM (rétine), les copolymères séquencés 0,02% pour la rétine. Dans les rétines (papaïne traitées) et des tranches de cerveau de jeunes animaux, de la charge dans le bain pendant 45 minutes à 37 ° C (Fura-2 AM) ou à la température ambiante (Fluo-quatre heures; Fluo-8 AM).
   1. Pour les animaux adultes, (> 12 semaines) pipeter les colorants (50 pi) directement sur les tranches de cerveau, et maintenir pendant 75 minutes pour permettre une meilleure pénétration du colorant dans les couches profondes.
   2. Afin d'assurer une oxygénation adéquate de la tranche immergée pendant colorant incubation, préparer une chambre de chargement de verre avec un couvercle fermé (pot circulaire de diamètre 2,5 cm, 3,5 cm de hauteur) avec des colorants de calcium dilué dans 2,5 ml de LCRa. Oxygéner en continu avec 95% O _2/5% CO _2. Ne pas bulle.
3. Après charge de colorant, lavez le tissu avec LCRa et transfert vers le système d'incubation, réduire lentement la température à 15 - 16 ° C jusqu'à ce que l'utilisation expérimentale.

5. électrophysiologique Recordings et imagerie

1. Placer le tissu dans une chambre d'enregistrement immergée sous un microscope, et perfuser avec oxygénées LCRa à un débit de 4 d'écoulement - 5 ml / min, soit à température ambiante (~ 22 ° C) ou de la température physiologique (35 ° C). Hold le tissu en place à l'aide d'un rendu '' harpe '', en nylon ou en or fils tendus et collés sur une pièce en forme de U de fil d'or ou de platine.
2. Pour électrophysiologie:
   1. Préparer les pipettes d'enregistrement de 1,5 mm (1,19 mm de diamètre) en verre borosilicate à l'aide d'un extracteur micropipette pour obtenir une résistance finale de 5-6 MQ.
   2. Remplir la pipette avec 3 - 4 pi de solution interne comme décrit précédemment ¹³ et visualiser les cellules sous infrarouge contraste d' interférence différentiel (IR-DIC) à l' aide d' une caméra CCD. La solution intracellulaire doit être soigneusement adaptée à chaque expérience pour obtenir des résultats expérimentaux.
   3. Position de la pipette, tout en maintenant une pression positive appliquée à travers un orifice d'aspiration sur le porte-pipette sur la membrane d'une cellule à l'aide d'un micromanipulateur. Étant donné que le GIP a été retiré de la rétine, sans grattage de la membrane préalable est nécessaire. Une fois que la pipette est sur la cellule, appliquer négative doucela pression à la pipette pour obtenir un joint d'étanchéité gigaohm. Ensuite, la rupture de la membrane cellulaire par une brève quantité de pression négative.
   4. Faire la cellule entière enregistrements ou opérations courantes voltage-clamp en utilisant des techniques standard, le cas échéant.
3. Calcium-imagerie:
   1. Pour l'imagerie ratiométrique de Fura-2, utiliser une longueur d'onde de commutation de vitesse ultra-élevée pour fournir des longueurs d'onde d'excitation de 340 nm, et 380 nm. Passez la lumière émise à partir de cellules individuelles à travers un filtre d'émission de 510 ± 20 nm, et de capturer avec une haute sensibilité, un appareil photo numérique à haute vitesse.
   2. Pour une seule longueur d'onde d'excitation de Fluo-4, la lumière filtre d'excitation à travers un 460 - bande de filtre 490 nm de passage et la lumière émise par un 515 - 550 filtre passe-bande nm. Pour l'enregistrement le plus rapide et le plus sensible utiliser un appareil photo numérique à haute vitesse tels. Acquérir les images selon les besoins.
   3. Mesurer les modifications de fluorescence en fonction du temps, soit à une seule longueur d'onde (Fluo-4) ou en utilisant le rapport de la longueur d'ondeProcédé (Fura-2), tel que décrit ci- dessus ^{8, 14.}

Representative Results

une régulation stricte de la charge bactérienne et la température du LCRa pendant l'incubation est essentiel pour maintenir la viabilité des tissus neuronaux. Ceci peut être optimisée par l' irradiation avec de la lumière UV - C et en maintenant la température du LCRa à 15 - 16 ° C (figure 1). En outre, le LCRa paramètres timbre (APS; Figure 1C) fournit l'expérimentateur avec un enregistrement des conditions environnementales (pH et la température.), Offrant ainsi une norme d'or pour les paramètres lors de l' incubation de tissu neuronal, qui, si elle est suivie, permettra de réduire la variabilité entre les expériences.

Figure 1. Un système d' incubation qui permet le règlement serré de l' environnement tissulaire. A, diagramme schématique du système d'incubation constitué d'une plaque de refroidissement à effet Peltier, la chambre principale et la chambre de pompe péristaltique UVC. B,Vue de côté de la chambre principale indiquant les points de la LCRa entrée et de sortie, ainsi que les sondes d'entrée carbogène, température et de pH. Le tissu est placé sur le treillis comme indiqué. Toutes les sondes de mesure sont fixés sur le couvercle pour permettre une stabilité structurelle. C, ACSF paramètres décrivant Poinçon la température et le pH de la LCRa pendant l' incubation. D, Vue de dessus de la chambre principale montrant les trous de montage pour les sondes de mesure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La viabilité des tissus peut être mesurée au moyen de l' activité du réseau (figure 2), ainsi que diverses méthodes d'imagerie, y compris les réponses du calcium (figure 2B, C). Pour surveiller l'activité du réseau, nous avons appliqué LCRa contenant une forte concentration de chlorure de potassium (KCl, 30 mM) localement,ce qui a conduit à la dépolarisation des neurones et des cellules gliales dans le voisinage de l'application K ^+. Cette dépolarisation peut être observé par l'augmentation des transitoires calciques (figure 2B, C) et l' activité de dopage (figure 2D), qui sert également d'indicateur physiologique pour la viabilité des cellules. Nos résultats montrent que l' activité de dopage dans des tranches qui ont été incubées pendant> 24 h dans le système d'incubation est semblable à des tranches "fraîches" incubées pendant des périodes plus courtes (> 4 h; figure 2D). En outre, des neurones individuels viabilité, qui a été surveillée par des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires des deux propriétés de la membrane passive et active, y compris le potentiel membranaire de repos, une résistance d'entrée, la constante de temps, et un potentiel d'action est comparable aux paramètres rapportés dans la littérature ¹⁵ (figure 2E, F ).

Figure 2. électrophysiologique et calcium Propriétés des tranches du cerveau après une incubation prolongée. A, Image d'une tranche de cerveau prises 28 h après la coupe avec deux électrodes d'enregistrement extracellulaires utilisés pour mesurer l'activité du réseau. Une troisième électrode (marqué d'un astérisque) est utilisé pour gonfler 30 mM de KCl. B, Temps images de déchéance de tranches chargées avec Fluo-quatre heures pour> 24 h, représentant une augmentation des transitoires de calcium intracellulaire après l' application de bain de KCl. C, les transitoires de calcium intracellulaires suivants brève application de KCl (30 mM, 1 s). Rouge - signal moyen, Gris - traces de calcium dans des cellules individuelles comme indiqué dans B. D, l' enregistrement physiologique extracellulaires de l'activité du réseau avant et après l'application de KCl (flèches rouges) étaient en grande partie inchangée entre les tranches "frais" (<4 h postdissection) Et ceux qui ont été mis en incubation pendant> 24 h dans l'incubateur. Notez l'augmentation de l' activité de dopage immédiatement après l' application KCl indiquant les neurones viables qui répondent à augmenter dans [K ^+] avec dépolarisation. E et F, passif (E) et (F actives propriétés) de la membrane du neurone pyramidal suivantes 2 h (traces de bleu) ou 26 heures (des traces noires) d'incubation dans le système d'incubation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour fournir un accès direct aux cellules de la couche de cellules ganglionnaires de la rétine wholemount de souris rd / rd retinally dégénérés, l'ILM a été digéré par l'enzyme papaïne ^{7, 8.} Après digestion, RGC et les cellules amacrines déplacées peuvent être clairement visualisées under DIC illumination (figure 3A), et les cellules peuvent être ciblées pour les enregistrements de patch-clamp sans grattage préalable de l'ILM. Enregistrements représentatifs du courant provenant d' une pince RGC sont représentés sur la figure 3B. La dépolarisation de la cellule par l'intermédiaire de la pipette de patch a provoqué une action dose-dépendante de la production potentielle, ce qui indique la viabilité des cellules après un traitement à la papaïne.

Enlèvement du GIP a également permis à la coloration ubiquitaire de la couche des cellules ganglionnaires (GCL) avec Fura-2 heures (figure 3D) et les cellules ont répondu à 30 l' application mM KCI avec une forte augmentation du rapport 340/380 nm par rapport à F _0, ce qui signifie une grande augmentation de la concentration de calcium intracellulaire (figure 3E). Les taux de calcium revenu à la normale après stimulation et les cellules peuvent ensuite être stimulées pour produire une réponse d'amplitude similaire. En outre, ces réponses ne se distinguaient pas entre retinae enregistré à <4 h et> 24 h postdissection (Figure 3F, G).

Figure 3: Les enregistrements électrophysiologiques et calcium dans Retinal Wholemount. Un différentiel image de contraste d'interférence d'un enregistrement patch clamp à partir d' une cellule ganglionnaire de la GCL après digestion à la papaïne. B, les cellules conservent des réponses de dopage dépendant de la dose lors dépolarisée à 50, 100 et 150 Pa , respectivement. C & D, enlèvement de la membrane interne limitant avant l' application de bain de Fura-2 heures permet le chargement omniprésent des cellules ganglionnaires de la rétine, l' image prise avec 380 nm excitation. E, lorsque 30 mM KCI FCSA est appliquée, 85% des cellules colorées a répondu par une augmentation du rapport 340/380. F & G, L'augmentation de 340/380 rapport retourne à la ligne de base après 30 l' application mM KCl (barres rouges), Et les cellules répondent à une stimulation subséquente deux <4 h et> 24 h après dissection. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Cet article décrit une méthode d'incubation pour prolonger la viabilité du tissu neuronal aigu pour les expériences d'imagerie et électrophysiologiques, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux. Deux processus principaux régissent la détérioration du tissu neuronal au fil du temps: i) l' augmentation des niveaux de bactéries, et l'augmentation d' accompagnement dans l' endotoxine bactérienne libérée, et ii) excitotoxicité qui suit la procédure de tranchage traumatique ^10. Comme le tissu neuronal aiguë est sans défense de l'environnement, une réglementation stricte de l'environnement tissulaire par une surveillance étroite des niveaux de pH, de température et de bactéries est essentielle pour maintenir l'activité cellulaire, ainsi que l'intégrité du réseau. Dissection, et le traitement des tissus (papaïne de digestion, de calcium charge de colorant) peuvent prendre plus de 2 h pour terminer, ce qui provoque une réduction du temps expérimental. Cependant, étant donné que le tissu peut être conservé dans le système d'incubation pendant> 24 h sans perte mesurable in viabilité ^{7, 8,} cette préparation ne doit être terminée une fois pour obtenir> 24 h des résultats. Dans le cadre de la stratégie 3R (remplacement, réduction, raffinement) visant à fournir des principes directeurs pour l' utilisation éthique des animaux ^16, cette méthode aura un impact important sur la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ces types d'expériences.

Digestion de l'ILM du tissu wholemount rétinienne permet un ciblage facile des cellules dans la GCL pour les enregistrements de patch-clamp et omniprésent calcium charge de colorant par application de bain. Ces techniques sont particulièrement utiles pour les rétines dégénérée dans laquelle la MLI est beaucoup plus épaisse et plus difficile à rompre par grattage à l'aide d'une pipette en verre. En outre, la préparation de la papaïne fournit un moyen d'effectuer des enregistrements de cellules apparié en utilisant deux électrodes pour enregistrer à partir gap-jonctions cellules couplées dans le GCL, quelque chose qui n'a pas été possible auparavant. toutefois, Digestion à la papaïne a probablement des effets sur la physiologie de la rétine normale que l' expression du récepteur K ⁺ a été montré être modifiée dans les photorécepteurs après la dissociation ⁶ avec de la papaïne. Il est également possible que l'architecture de la rétine est affectée. Velte et Masland ont montré que bien que certains somas et dendrites RGC ont été endommagés par le traitement de la papaïne pour enlever l'ILM, ils pourraient réussir enregistrer à partir de RGC dendrites distale au soma dans la plupart des neurones, ce qui indique l'intégrité structurale des cellules et des processus ^5. Il est important, ce qui laisse la rétine attachée à l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et de la sclérotique, tel que décrit ci-dessus, isole la rétine externe de la diffusion de la papaïne et peut réduire les effets néfastes sur photorécepteurs segments extérieurs lorsque ce protocole est appliqué à WT rétines. Dans les deux cas, le traitement de la papaïne, ou grattage de la ILM, certains dommages cellulaires se produira, l'expérimentateur doit choisir la méthode appropriée pour le expérimquestion ental.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232