Summary
После удаления из организма, нервной ткани в значительной степени зависит от условий окружающей среды, что приводит к возможному ухудшению ткани после того, как 6 - 8 ч. Используя уникальный метод инкубации, который внимательно следит и регулирует внеклеточный среду ткани, жизнеспособность тканей может быть значительно расширена в течение> 24 ч.
Abstract
Острые препараты нервной ткани, мозг ломтиками и Wholemount сетчатки глаза, как правило, может сохраняться только в течение 6 - 8 ч после рассечения. Это ограничивает время эксперимента, а также увеличивает количество животных, которые используются в исследовании. Это ограничение конкретно влияет на протоколы, такие как изображения кальция, которые требуют длительной предварительной инкубации с ванной-прикладному красителей. Экспоненциальный рост бактерий в течение 3 - 4 ч после того, как нарезка тесно коррелировало с уменьшением здоровья ткани. В данном исследовании описан способ ограничения распространения бактерий в острых препаратах для поддержания жизнеспособных невральной ткани в течение длительного периода времени (> 24 ч) без необходимости антибиотиков, стерильных процедур или тканевой культуральной среде, содержащей факторы роста. Велосипедным внеклеточную жидкость через УФ-облучения и поддержание ткани в пользовательской удерживающей камере при 15 - 16 ° С, ткань не показывает никакой разницы в электрофизиологических свойств, или си кальцияgnaling через внутриклеточных красители кальция в> 24 ч postdissection. Эти методы не только продлить время эксперимента для тех, кто использует острый невральной ткани, но уменьшит количество животных, необходимых для завершения экспериментальных целей, и устанавливает золотой стандарт для профилактики острой инкубации нервной ткани.
Introduction
Электрофизиологии и функциональной визуализации (кальций, напряжение чувствительных красителей) являются одними из наиболее часто используемых экспериментальных методик в области неврологии. Мозговые препараты срезов и Wholemount сетчатки глаза, который будет рассмотрен здесь, служат средством изучения электрофизиологических свойств и синаптические соединения без загрязнения от анестетиков или мышечных релаксантов. Мозговые срезы и сетчатки глаза Wholemount сохраняют свою структурную целостность, в отличие от культур клеток или гомогенатах, что позволяет изучение конкретных цепей и сетей мозга 1. Записи из изолированной ткани имеют преимущества по сравнению с записями в естественных условиях , как движений , связанных с сердцебиением и дыханием устраняются. Кроме того, прямая визуализация позволяет определенные классы ячеек для адресных и местное применение фармакологических средств 2, 3.
Патч-зажим записи и известковоНМУ краситель загрузкой в Wholemount сетчатки глаза осложняется наличием внутренней ограничивающей мембраны (ILM), который покрывает слой ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и предотвращает прямой доступ к клеткам. Как правило, эта мембрана разгреб со стеклянной пипеткой для прямого применения заплатки пипеткой и формирования gigaohm печатью на одной ячейке. Кроме того, ванны с нанесенным красители кальция не пересекают ILM и либо должен быть введен под этой мембраной 4, ретроградно транспортируются после инъекции в зрительный нерв 5 или электропорации через ткань 6. Кроме того, при использовании грызуна модель пигментный ретинит, то й / й мышь, ILM толще и более непроницаемой. Здесь мы используем технику для удаления ILM с ферментативным расщеплением 7, чтобы обеспечить как вездесущий кальция краситель-налива, а также прямой доступ к ганглиозных клеток сетчатки для патч-зажим recordiNGS 8.
Успешные записи либо из срезов головного мозга или Wholemount сетчатки зависят от рассечения и инкубации жизнеспособной нервной ткани. Как правило, ткань извлекают утром эксперимента и инкубируют в искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) до тех пор, пока используется для записей. Как правило, ткань остается жизнеспособной в течение 6 - 8 ч, со значительным ухудшением следующего временного окна. Тем не менее, оба срезах мозга и Wholemount препараты сетчатке обычно производят больше ткани, чем может быть записан с в течение этого короткого периода времени. Следовательно, ткань часто отбрасываются в конце дня и рассечение завершается снова в последующие дни. Это означает, что используется другое животное и ~ 2 ч установки и рассечение / окрашивания повторяется. Следующий протокол описан способ продления срока службы нервной ткани в течение более 24 ч, а это означает меньше животных используются, и более экспериментальное время доступно. Ткань жизнеспособность шкак оценено посредством записи электрофизиологических свойств и динамики кальция, и эти свойства были неотличимы от <4 ч и> 24 ч postdissection.
Эти результаты указывают на то, что не только единичные свойства ячеек нетронутыми и функциональный после длительной инкубации, но сетевую активность, как оценено с помощью кальций-визуализации и Электрофизиологические записи, неизменна> 24 ч postdissection. Кроме того, показано, что красители кальция может оставаться в клетках в течение длительных периодов, не вызывая каких-либо отрицательных последствий. Применение этого протокола свидетельствует о том, что функциональная активность нейронов в острой нервной ткани может сохраняться в течение длительного времени после того, как внешняя среда сильно регулируется. Кроме того, как жизнеспособность тканей очень широк и варьируется между лабораториями в связи с различными протоколами инкубации, этот метод устанавливает золотой стандарт для идеальных параметров, которые должны применяться для снижения изменчивости в здоровье острого NeuRonal ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол ниже описывает получение C57BL / 6 и С3Н / Он (retinally вырожденный) мыши нервной ткани, но подобные методы могут быть применены к другим видам. Все животные были здоровы и обработаны с помощью стандартных условиях температуры, влажности, 12 ч цикл свет / темнота, свободный доступ к пище и воде, а также без каких-либо стрессовых стимулов, предназначенных. Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с Western Sydney University Уход за животными и комитет по этике и в соответствии с использованием животных и руководств по уходу (Animal Research Authority # A9452, # A10396 и # A8967).
1. Мозг Кусочек Приготовление
- Обезболить животное при вдыхании изофлуран (5%) и обезглавить с помощью грызуна гильотину. Удалить мозг быстро, как было описано выше 9 и поместить его в охлажденный льдом физиологический раствор (ACSF) , содержащий (в мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25Раствором NaHCO 3, 25 декстрозы, и его насыщают карбогена (95% O 2/5% смеси СО 2; 310 мОсм, рН 7,4).
- Вырезать срезах мозга, в области, представляющей интерес, 300 мкм с вибрирующим микротома.
- Перенесите ломтики в пользовательский встроенной системы инкубации , которая близко контролирует и регулирует уровень рН (рН 7,2 - 7,4), поток карбогена и температуры , как описано выше 10, 11.
- Установить начальную температуру в камере до 35 ° С в течение 15 - 30 мин, а затем медленно снижают до 15 - 16 ° C , как показано на фиг.1С. Затем инкубировать срезы в инкубационной системы до тех пор, пока это необходимо, либо для электрофизиологических или изображений.
Примечание: Если срезы, которые будут использоваться для кальция визуализации, выполните указанные ниже действия перед охлаждением ткани ниже комнатной температуры.
2. сетчатке Wholemount Подготовка и внутренняя пограничная мембрана для удаления
- Подготовка wholemounts сетчатки глаза под нормальным либолабораторные условия освещения или тусклый красный / инфракрасный свет.
- Эвтаназии животных путем смещения шейных позвонков и немедленно вылущивать глаза. Сделайте небольшой разрез вдоль зубчатый край, и место в любом Ames средах или ACSF , содержащего (мм): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 глюкозы, 0,5 L-глутамина, и насыщают карбогена (95% O смеси CO 2 2/5%; ~ 300 мОсм, рН 7,4), при комнатной температуре.
- Немедленно удалите роговицу, хрусталик и стекловидное путем разрезания вдоль зубчатый край с маленькими ножницами и удалением хрусталик и стекловидное с пинцетом. Поместите ткань в системе инкубации при комнатной температуре.
Примечание: ткани сетчатки может поддерживаться в наглазник, после снижения температуры до медленного 15 - 16 ° C, в течение> 24 ч в инкубационной системы до тех пор, пока это необходимо. - Чтобы удалить ILM, перенести наглазник, содержащую сетчатку в небольшой стеклянный сосуд, содержащий 30 Ед / мл папаин, 1 мМ L-цистин, 0,5 мМ ЭДТА и 0,005% ДНКазы в Earl's-Сбалансированный солевой раствор (BSS), при 37 ° С в течение 20 мин. Применить 95% O 2/5% CO 2 в раствор через крышку , но не пузырь. При использовании ткани от молодых животных (<6 недель), разбавьте раствор до вполсилы.
- Прекратить ферментативного пищеварения, помещая ткань в растворе овомукоид (10 мг / мл) и БСА (10 мг / мл) в течение 10 мин в ПБС Эрла. Вымойте ткань тщательно ACSF перед переносом в инкубационной системы и снизить температуру до 15 - 16 ° C.
- Поддерживать ткани сетчатки в глаза чашке, пока не понадобится. Для перевода в микроскоп, изолировать сетчатку от глаз чашку и разрезать на 4 части с бритву. Если требуется вся сетчатка, сделать четыре небольшие порезы на периферии сетчатки, чтобы позволить ему лежать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с изображениями, нагрузкой с кальциевой красителей перед переносом в инкубационной системы, смотрите ниже.
3. Поддержание ткани в инкубаторе
- Циркулируйте ACSF через вторую камеру (UVC камеры, построена как описано ранее 12) , выделенных из основной камеры и подвергаются воздействию 1,1 Вт UVC света (254 нм, 5 Вт / 2P стерилизатор УФ - лампа) для того , чтобы Eradiate бактерий , плавающих в растворе (рис 1А). Контроль УФС стробоскопа с помощью программируемого таймера с использованием случайной функции, который включается временами колеблется от 15 до 26 мин через каждые 15 - 30 мин, чтобы избежать чрезмерного нагрева ACSF.
- Установите скорость потока в камере УФС до 12 мл / мин , как сообщалось ранее 12. Крышка камеры UVC с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить UVC освещение снаружи камеры, которая может повредить нейронную ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения приспособленности к темноте ткани сетчатки, нанесите заказные крышку основной камеры, чтобы исключить свет. - Используйте перистальтический насос для циркуляциейТЕ раствор (ACSF) через две камеры и Пельтье термоэлектрический холодный пластинчатый охладитель либо охлаждать или нагревать основную камеру до желаемой температуры в диапазоне 0 - 50 ° C. Для инкубации оптимальной ткани, используют 15 - 16 ° C для долгосрочной жизнеспособности.
4. Кальций Dye Загрузка
- Выберите красители кальция на основе предпочтений отдельного исследователя. Здесь мы используем фура-2АМ, Fluo-8AM или Fluo-4 утра. Тем не менее, этот метод может быть применен к другим красители , а также: растворить красители кальция в ДМСО к блоку 1 мМ раствор и 1% сополимеров (например, Pluronic кислота-127) до конечного объема 50 мкл и разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
- Добавить решение ACSF до конечной концентрации 10 мкМ, 0,01% блок-сополимеры для срезов мозга, и 20 мкМ (сетчатка), 0,02% блок-сополимеры для сетчатки. В сетчатке (папаин лечение) и срезах мозга от молодых животных, загрузка в ванне в течение 45 мин при 37 ° C (фура-2 AM) или при комнатной температуре (Fluo-4 AM, FLuo-8 AM).
- Для взрослых животных (> 12 недель) пипеткой красители (50 мкл) непосредственно на срезах мозга, и поддерживать в течение 75 мин, чтобы обеспечить лучшее проникновение красителя в глубокие слои.
- Для того, чтобы обеспечить адекватную оксигенацию погруженной среза во время инкубации с красителем, получения стеклянной загрузочную камеру с закрытой крышкой (круглой баночке диаметром 2,5 см, 3,5 см высотой) с красителями кальция, разведенного в 2,5 мл ACSF. Кислородсодержащих соединений непрерывно с 95% O 2/5% CO 2. Не пузырь.
- После загрузки красителя, промойте ткань с ACSF и переход к системе инкубации, медленно снижают температуру до 15 - 16 ° C до экспериментального использования.
5. Электрофизиологические записи и обработки изображений
- Поместите ткань в затопленную камеру записи под микроскопом, и заливать с окисленной ACSF при скорости потока 4 - 5 мл / мин либо при комнатной температуре (~ 22 ° C) или физиологической температуре (~ 35 ° С). Хольd ткань на месте, используя выполненное на заказ '' арфа '', сделанный из нейлона или золотыми нитями растянутых и склеенных через U-образный кусок золота или платиновой проволоки.
- Для электрофизиологии:
- Подготовка записи пипеток от 1,5 мм (1,19 мм ID) боросиликатного стекла с использованием микропипетки съемник для достижения конечного сопротивления 5-6 МОм.
- Заполните пипетку с 3 - 4 мкл внутреннего раствора , как описано ранее 13 и визуализировать клетки под инфракрасным Дифференциальная интерференционного контраста (ИК-DIC) с помощью ПЗС - камеры. Внутриклеточное решение должно быть адаптировано для каждого эксперимента для достижения экспериментальных результатов.
- Позиция пипетка, сохраняя при этом положительное давление, подаваемое через всасывающее отверстие на держателе пипеток, на мембране клетки, используя микроманипулятора. Поскольку ILM была удалена из сетчатки, не требуется никакого предварительного мембранного соскоб. После того, как пипетка находится на клетке, нежный отрицательныйдавление в пипетке для достижения gigaohm уплотнения. Затем разрывают клеточную мембрану с коротким количеством отрицательного давления.
- Сделать цельноклеточная или напряжения по текущим-зажим записи с использованием стандартных методов в зависимости от обстоятельств.
- Кальций изображений:
- Для логометрической визуализации Fura-2, используют сверхвысокую скорость длин волн переключатель для обеспечения возбуждения длинами волн 340 нм и 380 нм. Pass, излучаемый свет от отдельных клеток через фильтр излучения 510 ± 20 нм, а также захватить с высокой чувствительностью, высокоскоростной цифровой камерой.
- Для одной длины волны возбуждения Fluo-4, фильтр возбуждения света через 460 - фильтр нижних частот 490 нм полосы и испускаемого света через 515 - фильтр нм полосы пропускания 550. Для самых быстрых и наиболее чувствительной записи использовать цифровую камеру высокоскоростной такой. Получение изображений по мере необходимости.
- Мера изменения флуоресценции в зависимости от времени, либо на одной длине волны (Fluo-4), или с использованием соотношения длин волнМетод (фура-2), как было описано выше 8, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жесткое регулирование бактериальной нагрузки и температуры ACSF во время инкубации имеет важное значение для поддержания жизнеспособности нервной ткани. Это может быть оптимизировано с помощью облучения UVC света и поддержания температуры ACSF при 15 - 16 ° С (рисунок 1). Кроме того, ACSF параметры штампа (APS; фиг.1С) обеспечивает экспериментатору с записью условий окружающей среды (рН и температура), таким образом предлагая золотой стандарт для параметров при инкубировании нейронную ткань, которая, если им следовать, уменьшит изменчивость между эксперименты.
Рисунок 1. Инкубационный система , которая позволяет жесткое регулирование ткани окружающей среды. А, Принципиальная схема системы инкубации , состоящей из охлаждающей пластины Пельтье, основной камеры, перистальтического насоса и UVC камеры. Б,Вид сбоку главной камеры, показывающий впускной и выпускной точки ACSF, а также впускные карбогена, температуры и рН зондов. Ткань помещается на сетке, как указано. Все измерительные зонды прикреплены к крышке, чтобы обеспечить структурную стабильность. C, ACSF Параметры штампа , описывающее температуру и рН ACSF во время инкубации. D, Вид сверху основной камеры , показывающий монтажные отверстия для измерительных зондов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Жизнеспособности тканей может быть измерена с помощью сетевой активности (рисунок 2), а также различные методы визуализации, в том числе ответы кальция (Фигура 2В, С). Для того, чтобы контролировать сетевую активность, мы применили ACSF, содержащий высокую концентрацию хлорида калия (KCl, 30 мМ) на местном уровне,что привело к деполяризации нейронов и глии в непосредственной близости от приложенного K +. Эта деполяризация может наблюдаться увеличение переходными кальция (Фигура 2В, С) и Прокалывание активности (рис 2D), который также служит в качестве физиологического показателя для жизнеспособности клеток. Наши результаты показывают , что пики активности в срезах, которые инкубировали в течение> 24 ч в инкубационной системы была похожа на «свежие» кусочки инкубировали в течение коротких периодов (> 4 ч; Рисунок 2D). Кроме того, индивидуальный нейрон жизнеспособность, которую контролировали посредством внутриклеточных электрофизиологических записи пассивных и активных свойств мембраны, включая мембранный потенциал покоя, входное сопротивление, постоянная времени, и потенциал действия была сравнима с параметрами , описанными в литературе 15 (рис 2E, F ).
Рисунок 2. Электрофизиологические и кальция Свойства мозга Ломтики после длительной инкубации. A, Изображение среза мозга принято 28 часов после того, как нарезка с двумя внеклеточного регистрирующих электродов , используемых для измерения сетевой активности. Третий электрод (отмеченные звездочкой), используется для слоеного 30 мМ KCl. B, Цайтраферы изображения срезов , загруженных с Fluo-4AM в течение> 24 ч, изображающие увеличение внутриклеточного кальция переходных процессов после применения ванны KCl. C, внутриклеточные Переходные процессы кальция после кратковременного применения KCl (30 мМ, 1 с). Красный - средний сигнал, серый - следы кальция в одиночных камерах , как показано в B. D, внеклеточной физиологической записи сетевой активности до и после применения KCl (красные стрелки) в основном не изменились между "свежих" срезов (<4 ч postdissection), И те, которые инкубировали в течение> 24 ч в инкубаторе. Обратите внимание на увеличение сразу же после того, как активность наблюдаются пики применения KCl с указанием жизнеспособных нейронов , которые реагируют на увеличение [K +] с деполяризации. E & F, Пассивный (Е) и активные (F) мембранные свойства пирамидальной нейрон следующие 2 ч (синие следы) или 26 ч (черные следы) инкубации в системе инкубации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Для того, чтобы обеспечить прямой доступ к клеткам ганглиозных клеток слоя Wholemount сетчатки retinally вырожденных мышей й / й, Ильм переваривали ферментом папаином 7, 8. После переваривания, ГКС и перемещенные амакринные клетки могут быть четко визуализируется ундэр DIC освещения (рис 3А), и клетки могут быть мишенью для патч-зажим записи без каких - либо предварительных соскоба из ILM. Типичные записи ток-зажим из RGC показаны на рисунке 3B. Деполяризация клетки через патч-пипеткой вызвало зависимое от дозы действие генерации потенциала, что указывает на жизнеспособность клеток после обработки папаином.
Удаление ILM также позволило повсеместное окрашивание слоя ганглиозных клеток (НКУ) фура-2АМ (рис 3D) , и клетки откликнувшихся на 30 мМ KCl приложения с большим увеличением коэффициента 340/380 нм по отношению к F 0, означающий большой увеличение внутриклеточной концентрации кальция (рис 3Е). Уровни кальция вернулись к исходному уровню после стимуляции и клетки могут быть впоследствии стимулируется производить подобную реакцию амплитуды. Кроме того, эти ответы были неразличимы между гetinae записан в <4 ч и> 24 ч postdissection (рис 3F, G).
Рисунок 3: Электрофизиологические и кальция Записи в сетчатке Wholemount. A, Дифференциальный интерференционный контраст изображения записи патч-зажим из сетчатки ганглиозных клеток в GCL после папаином. B, клетки сохраняют зависят от дозы реакции наблюдаются пики при деполяризованы с 50, 100 и 150 мкА соответственно. C & D, Удаление внутренней ограничивающей мембраны перед применением ванны Фура-2АМ позволяет вездесущи загрузку ганглиозных клеток сетчатки, изображение , полученное с 380 нм возбуждения. Е, когда 30 мМ КСl ASCF применяется, 85% окрашенных клеток отреагировали с увеличением коэффициента 340/380. F & G, Увеличение 340/380 соотношение возвращается к исходному уровню после 30 мМ KCl применения (красные полосы), И клетки реагируют на последующую стимуляцию как <4 ч и> 24 ч после рассечения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье описывается способ инкубации продлить жизнеспособность острой нервной ткани для работы с изображениями и электрофизиологических экспериментов, тем самым снижая число животных, необходимых для завершения экспериментальных целей. Два основных процесса определяют ухудшение состояния нервной ткани с течением времени: я) повышенные уровни бактерий, и сопровождающий увеличение бактериального эндотоксина выпущен, и II) экзитотоксичность , который следует за травматический процедуру нарезки 10. В острой нервной ткани является экологически беззащитным, плотно регуляция окружающей среды ткани на основе тщательного контроля уровня рН, температуры и бактерий имеет важное значение для поддержания клеточной активности, а также целостности сети. Препарирование и обработка ткани (папаином, погрузка краситель кальция) может принимать в течение 2 часов, чтобы закончить, вызывая уменьшение времени эксперимента. Тем не менее, так как ткань может храниться в системе инкубации в течение> 24 ч без измеримой потери Iп жизнеспособность 7, 8, этот препарат должен быть завершен один раз , чтобы получить> 24 ч результатов только. В рамках стратегии 3П (замена, восстановление, Доработка) , направленных на обеспечение руководящих принципов для этического использования животных 16, этот метод будет иметь большое влияние на сокращение количества животных , используемых в этих типах экспериментов.
Расщепление ILM сетчатки Wholemount ткани позволяет легко нацеливание клеток в GCL для патч-зажим записи и повсеместного загрузка красителя кальция путем применения ванны. Эти методы особенно полезны для вырожденного сетчатке, в котором ILM намного толще и труднее преодолеть путем соскоба со стеклянной пипеткой. Кроме того, препарат папаин обеспечивает способ для выполнения записи парных ячейки с использованием двух электродов для записи из зазора спая соединенных клеток в GCL, что-то, что не было ранее возможно. Однако, Папаином скорее всего , имеет некоторые эффекты на нормальной физиологии сетчатки глаза , как выражение К + рецептора Было показано , что может быть изменен в фоторецепторов следующей диссоциации с папаином 6. Также возможно, что архитектура ретиналь влияет. Velte и Masland показал , что , хотя некоторые ГКС СОСМ и дендриты были повреждены папаина обработки для удаления Ильм, они могли успешно выполнить запись с ГКС дендриты дистально по отношению к сому в большинстве нейронов, что указывает на структурную целостность клеток и процессов 5. Важно то, в результате чего на сетчатку, прикрепленный к пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и склеры, как описано выше, изолирует внешнюю сетчатку от диффузии папаина и может привести к снижению неблагоприятного воздействия на наружных сегментов фоторецепторов, когда этот протокол применяется к WT сетчатке. В обоих случаях, лечение папаин или соскоба из ILM, некоторые повреждения клеток будет происходить, экспериментатор должен выбрать наиболее подходящий метод для experimСИХИЧЕСКОЕ вопрос.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).
