Förlängd inkubation av akut neuronal vävnad för elektrofysiologi och kalcium-imaging

Summary

När bort från kroppen, neuronal vävnad påverkas i hög grad av miljöförhållanden, vilket leder till eventuell försämring av vävnaden efter 6-8 timmar. Med hjälp av en unik inkubation metod, som följer noga och reglerar den extracellulära miljön i vävnaden, kan vävnad livskraft avsevärt förlängas> 24 timmar.

Abstract

Akut neuronala vävnadspreparat, hjärnan skivor och retinal wholemount, kan oftast bara upprätthållas för 6-8 timmar efter dissektion. Detta begränsar den experimentella tid, och ökar antalet djur som används per studie. Denna begränsning specifikt påverkan protokoll såsom kalcium avbildning som kräver långvarig förinkubation med bad tillämpad färgämnen. Exponentiell bakterietillväxt inom 3 - 4 timmar efter skivning är tätt korrelerade med en minskning av vävnads hälsa. Denna studie beskriver en metod för att begränsa spridningen av bakterier i akuta preparat för att bibehålla livskraftiga neuronal vävnad under längre tidsperioder (> 24 h) utan behov av antibiotika, sterila förfaranden eller vävnadskulturmedia innehållande tillväxtfaktorer. Genom att cykla den extracellulära vätskan genom UV-bestrålning och hålla vävnaden i en anpassad uppehållskammaren vid 15 - 16 ° C, visar vävnads ingen skillnad i elektrofysiologiska egenskaper, eller kalcium signaling genom intracellulära kalcium färgämnen på> 24 timmar postdissection. Dessa metoder kommer inte bara förlänga experimentell tid för dem som använder akut neuronal vävnad, men kommer att minska antalet djur som krävs för att slutföra experimentella mål, och kommer att sätta en gold standard för akut neuronal vävnad inkubation.

Introduction

Elektro och funktionell avbildning (kalcium, spänningskänsliga färgämnen) är två av de vanligaste experimentella tekniker inom neurovetenskap. Brain skiva förberedelser och retinal wholemount, som kommer att undersökas här, tillhandahålla ett sätt att undersöka elektrofysiologiska egenskaper och synaptiska uppkoppling utan kontaminering från anestetika eller muskelavslappnande medel. Hjärnan skivor och retinal wholemount bibehåller sin strukturella integritet, till skillnad från kulturer eller cellhomogenat, vilket gör att utredningen av specifika kretsar och hjärnnätverk ^1. Inspelningar från isolerad vävnad har fördelar jämfört med in vivo-inspelningar som rörelser i samband med hjärtslag och andning elimineras. Dessutom möjliggör direkt visualisering specifika klasser av celler som skall riktade och lokal tillämpning av farmakologiska verktyg ^{2, 3.}

Patch-clamp inspelningar och calcium färg belastning i retinal wholemount kompliceras av förekomsten av inre avgränsande membranet (ILM), som omfattar näthinneganglieceller (RGC) skikt och förhindrar direkt tillgång till cellerna. Normalt är detta membran skrapas bort med en glaspipett för att tillåta direkt applicering av ett plåster pipett och bildandet av en gigaohm tätning på en enda cell. Dessutom har bad appliceras kalcium färgämnen inte korsa ILM och måste antingen injiceras under detta membran ^4, retrograd transporteras efter injektion i synnerven ⁵ eller elektro genom vävnaden ^6. Dessutom när man använder en gnagare modell av retinitis pigmentosa, är rd / rd musen ILM tjockare och mer ogenomträngligt. Här använder vi en teknik för att avlägsna ILM med enzymatisk spjälkning ^7, för att tillåta både allestädes närvarande kalcium färgämne lastning, och direkt tillgång till näthinneganglieceller för patch-clamp recordings ^8.

Framgångsrika inspelningar från antingen hjärnan skivor eller retinal wholemount beror på dissekering och inkubation av livskraftig nervvävnad. Typiskt vävnad utvinns på morgonen av experimentet och odlades i artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) tills det används för inspelningar. Vanligtvis vävnad förblir lönsamt för 6 - 8 timmar, med betydande nedbrytning efter denna tid. Men både hjärnan skivor och wholemount retinae preparat producerar oftast mer vävnad än vad som kan registreras inifrån denna korta tid. Följaktligen vävnad ofta kasseras vid slutet av dagen och dissektion är klar igen på efterföljande dagar. Detta innebär ett annat djur utnyttjas och ~ 2 timmar av installation och dissektion / färgning upprepas. Följande protokoll beskriver en metod för att förlänga livslängden för neuronal vävnad under mer än 24 h, vilket innebär färre djur utnyttjas, och mer experimentell tid är tillgänglig. Vävnadsviabilitet wenligt bedömning genom inspelning elektrofysiologiska egenskaper och kalcium dynamik, och dessa egenskaper var oskiljbara mellan <4 timmar och> 24 h postdissection.

Dessa resultat tyder på att det inte bara är encelliga egenskaper intakta och funktionella efter förlängd inkubation, men nätverksaktivitet, mätt med kalcium-avbildning och elektrofysiologiska inspelningar, är oförändrad> 24 h postdissection. Dessutom visar vi att kalcium färgämnen kan förbli i cellerna under längre tidsperioder utan att orsaka några skadliga effekter. Tillämpningen av detta protokoll visar att den funktionella aktiviteten av nervceller i akut neuronal vävnad kan upprätthållas under långa perioder, när den yttre miljön är hårt reglerad. Eftersom vävnadsviabilitet varierar kraftigt mellan laboratorier på grund av olika inkubation protokoll, denna metod fastställer en guldstandard för den perfekta parametrar som ska användas för att minska variationen i hälsa akut neuronal vävnad.

Protocol

Protokollet nedan beskriver framställningen av C57BL / 6 och C3H / He (retinally degenerera) mus neuronal vävnad, men liknande tekniker kan tillämpas på andra arter. Alla djur var friska och hanteras med standardförhållanden av temperatur, luftfuktighet, 12 h ljus / mörker-cykel, fri tillgång till mat och vatten, och utan avsedda stresstimuli. Alla experiment har godkänts och utförts i enlighet med Western Sydney University Djurvård och etikkommittén och i enlighet med användningen djur och riktlinjer vård (Animal Research myndigheten # A9452, # A10396 och # A8967).

1. Brain Slice Förberedelser

1. Söva djuret genom inandning av isofluran (5%) och decapitate med användning av en gnagare giljotin. Ta bort hjärnan snabbt, som beskrivits tidigare ⁹ och placera den i iskall fysiologisk lösning (aCSF) innehållande (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 _CaCl2, 25NaHCO _3, 25 dextros, och mättades med karbogen (95% _O2 / 5% _CO2 blandning; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Skär hjärnan skivor, i regionen av intresse, 300 | j, m tjockt med en vibrerande mikrotom.
3. Överför skivor till en specialbyggd inkubationssystemet som nära övervakar och styr pH-värden (pH 7,2-7,4), carbogen flöde och temperatur som tidigare beskrivits ^{10, 11.}
4. Set initial kammartemperaturen till 35 ° C under 15-30 min, och sedan långsamt minskar till 15-16 ° C, såsom visas i figur 1C. inkubera sedan skivor i inkubationssystemet tills de behövs, antingen för elektrofysiologi eller avbildning.
   OBS: Om skivor som är användas för kalcium-imaging, följa stegen nedan innan kylning vävnad under RT.

2. Retinal Wholemount Förberedelse och inre begränsnings Membrane Removal

1. Förbered retinala wholemounts antingen enligt normalalaboratorieljusförhållanden eller dim röd / infrarött ljus.
2. Avliva djuret genom cervikal dislokation och omedelbart enucleate ögon. Gör ett litet snitt längs ora serrata och plats i antingen Ames media, eller aCSF innehåller (mM): 125 NaCl, 25 NaHCOa _3, 3 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 glukos, 0,5 L-glutamin, och mätta med karbogen (95% _O2 / 5% _CO2 blandning; ~ 300 mOsm; pH 7,4), vid RT.
3. Omedelbart ta bort hornhinnan, linsen och glaskroppen genom att skära längs ora serrata med en liten sax och ta bort linsen och glaskroppen med pincett. Placera vävnaden i inkubationssystemet vid RT.
   OBS: Retinal vävnad kan upprätthållas i ögat-cup, efter reduktion långsam temperaturen till 15-16 ° C, under> 24 timmar i inkubationssystemet tills det behövs.
4. För att ta bort ILM, överföra ögonkoppen innehållande näthinnan till en liten glasburk innehållande 30 U / ml papain, 1 mM L-cystin, 0,5 mM EDTA och 0,005% DNas i Earl's-Balanserade saltlösning (BSS) vid 37 ° C under 20 min. Applicera 95% _O2 / 5% _CO2 till lösningen genom locket men inte bubbla. Om du använder vävnad från unga djur (<6 veckor), späds till halv styrka.
   1. Stoppa enzymatisk uppslutning, genom att placera vävnaden i en ovomukoid (10 mg / ml) och BSA (10 mg / ml) lösning under 10 min i Earls BSS. Tvätta vävnad noga med aCSF före överföring till inkubationssystemet och minska temperaturen till 15-16 ° C.
5. Bibehålla näthinnans vävnad i ögat-cup tills det behövs. För överföring till mikroskop, isolera näthinnan från ögat-cup och skuren i 4 bitar med ett rakblad. Om hela näthinnan krävs, gör fyra små snitt i periferin av näthinnan för att tillåta den att ligga plant.
   OBS: För avbildningsexperiment, last med kalcium-färgämnen före överföring till inkubationssystemet, se nedan.

3. Att upprätthålla Tissue i inkubatorn

(Figur 1A, B).
1. Cirkulera aCSF genom en andra kammare (UVC kammare, byggd som tidigare beskrivits ¹²⁾ isolerad från huvudkammaren och exponeras för 1,1 W UVC ljus (254 nm, 5W / 2P autoklav UV-lampa) för att eradiate bakterier flyter i lösningen (Figur 1A). Kontroll UVC timing via en programmerbar timer med ett slumpmässigt funktion som tänds vid tider varierande mellan 15 och 26 minuter varje 15-30 minuter för att undvika överhettning av aCSF.
2. Ställa in flödeshastigheten i UVC kammaren till 12 ml / min såsom tidigare rapporterats ^12. Täck UVC kammaren med aluminiumfolie för att förhindra UVC belysning utanför kammaren, vilket kan skada nervvävnad.
   OBS: För mörk anpassad näthinnan vävnad, tillämpa en skräddarsydd locket till huvudkammaren för att utesluta ljus.
3. Använd en peristaltisk pump till cirkulationste lösningen (aCSF) genom de två kamrarna och en Peltier termo kall plattkylare till antingen kyla eller värma huvudkammaren till de önskade temperaturerna i intervallet 0-50 ° C. För optimal vävnads inkubation, använder 15-16 ° C för långsiktig lönsamhet.

4. Kalcium Dye Loading

1. Välj kalcium färgämnen baserade på inställningen av den enskilde forskaren. Här använder vi Fura-02:00, Fluo-08:00 eller Fluo-04:00. Emellertid kan denna metod tillämpas på andra färgämnen samt: lös upp kalcium färgämnen i DMSO till en 1 mM lösning och 1% segmentsampolymerer (t.ex. pluronsyra-127) till en slutlig volym av 50 mikroliter och sonikeras under 10 min.
2. Lägg lösningen till aCSF till en slutlig koncentration av 10 | iM, 0,01% segmentsampolymerer för hjärnsnitt, och 20 ^ M (retina), 0,02% segmentsampolymerer för näthinnan. I retinae (papain behandlade) och hjärnan skivor från unga djur, last till badet under 45 minuter vid 37 ° C (Fura-2:00) eller vid rumstemperatur (Fluo-4:00; Fluo-8:00).
   1. För vuxna djur, (> 12 veckor) pipett färgämnena (50 mikroliter) direkt på hjärnan skivor och underhålla under 75 minuter för att medge bättre penetration av färgämnet i de djupa lagren.
   2. För att säkerställa tillräcklig syresättning av den nedsänkta skivan under färgämne inkubation, förbereda en glasladdningskammare med stängt lock (cirkulär burk med diametern 2,5 cm, 3,5 cm höjd) med kalcium färgämnen utspädd i 2,5 ml aCSF. Syre kontinuerligt med 95% _O2 / 5% _CO2. Inte bubbla.
3. Efter färgämne lastning, tvätta vävnaden med aCSF och överföring till inkubationssystemet långsamt sänka temperaturen till 15-16 ° C tills experimentell användning.

5. Elektrorecordings och Imaging

1. Placera vävnaden i en nedsänkt inspelning kammare under ett mikroskop, och BEGJUTA med syresatt aCSF med en flödeshastighet av 4 - 5 ml / min, antingen vid RT (~ 22 ° C) eller fysiologisk temperatur (~ 35 ° C). hold vävnaden på plats med hjälp av en specialtillverkad '' harpa '', gjord av nylon eller guldtrådar sträckta och limmade över en U-format stycke av guld eller platinatråd.
2. För elektrofysiologi:
   1. Förbereda inspelning pipetter från 1,5 mm (1,19 mm ID) borosilikatglas med användning av en mikropipett avdragare för att uppnå en slutlig resistans av 5-6 Mohm.
   2. Fyll pipetten med 3-4 mikroliter av intern lösning som tidigare beskrivits ¹³ och visualisera celler under infraröd Differential Interference Contrast (IR-DIC) med hjälp av en CCD-kamera. Den intracellulära lösning bör noggrant anpassas till varje experiment för att uppnå experimentella resultat.
   3. Position pipett, samtidigt som positivt tryck appliceras genom en sugport på pipetten hållaren, på membranet av en cell med hjälp av en mikromanipulator. Eftersom ILM har tagits bort från näthinnan, ingen tidigare membran skrapning behövs. När pipetten är i cellen, tillämpa mild negativatryck på pipetten för att uppnå en gigaohm tätning. Sedan brista cellmembranet med en kort mängd av negativt tryck.
   4. Gör helcells-ström- eller spänningskläm inspelningar med standardtekniker som är lämpligt.
3. Kalcium-imaging:
   1. För ratiometrisk avbildning av Fura-2, använda en ultrahög hastighet våglängd switcher för att ge exciteringsvåglängder av 340 nm och 380 nm. Pass emitterat ljus från enskilda celler genom en emissionsfilter av 510 ± 20 nm, och fånga med en hög känslighet, hög hastighet digitalkamera.
   2. För en enda excitationsvåglängd av Fluo-4, filter excitationsljus genom ett 460-490 nm bandpassfilter och emitteras ljus genom en 515-550 nm bandpassfilter. För den snabbaste och mest känsliga inspelning använda en hög hastighet digitalkamera sådan. Förvärva bilder efter behov.
   3. Mäta förändringar i fluorescens som en funktion av tiden antingen vid en enda våglängd (Fluo-4) eller med hjälp av våglängdsförhållandetmetoden (Fura-2), såsom tidigare beskrivits ^{8, 14.}

Representative Results

Strikt reglering av bakteriehalten och temperaturen hos den aCSF under inkubationen är väsentligt att upprätthålla neuronal vävnadslivsduglighet. Denna kan optimeras genom bestrålning med UVC ljus och bibehållande av temperaturen av aCSF vid 15-16 ° C (Figur 1). Dessutom parametrarna aCSF stämpel (APS, Figur 1C) ger försöks med en förteckning över de miljöförhållanden (pH och temp.), Vilket ger en guldstandard för parametrar när inkubation neuronal vävnad, som, om de följs, kommer att minska variationen mellan experiment.

Figur 1. En Incubation system som möjliggör Tight Reglering av Tissue miljö. A, Schematisk beskrivning av inkubation system som består av en kylande Peltier platta, huvudkammaren, peristaltisk pump och UVC kammare. B,Sidovy av huvudkammaren som visar inlopps- och utloppspunkterna i aCSF, liksom de karbogen inlopps-, temperatur- och pH-sonder. Vävnaden placeras på nätstrukturen såsom anges. Alla mätningssonder är fästa till locket för att tillåta strukturell stabilitet. C, aCSF Parametrar stämpel som beskriver temperaturen och pH-värdet för aCSF under inkubation. D, Top bild av huvudkammaren som visar monteringshålen för de mätsondema. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Vävnadsviabilitet kan mätas med hjälp av nätverksaktivitet (Figur 2), såväl som olika avbildningsmetoder, inklusive kalciumsvar (fig 2B, C). Att övervaka nätverksaktivitet, tillämpade vi aCSF innehåller en hög koncentration av kaliumklorid (KCl; 30 mM) lokalt,vilket ledde till depolarisering av neuroner och glia finnas i närheten av den applicerade K ^+. Denna depolarisation kan observeras av ökningen av kalcium transienter (Figur 2B, C) och tillsatta aktivitet (Figur 2D), som också fungerar som en fysiologisk indikator för cellviabiliteten. Våra resultat visar att tillsatta aktiviteten i skivor som inkuberades under> 24 h på inkubationssystemet liknade "färska" skivor inkuberades under kortare perioder (> 4 h; Figur 2D). Dessutom individuell neuron livskraft, som övervakades genom intracellulära elektrofysiologiska inspelningar för både passivt och aktivt membran egenskaper, inklusive den vilande membranpotential Ingångsresistans, tidkonstant och aktionspotentialens var jämförbar med parametrar som rapporterats i litteraturen ¹⁵ (Figur 2E, F ).

Figur 2. Elektro och kalcium egenskaper hjärnan skivor efter långvarig inkubation. A, bild av en hjärna skiva tagen 28 timmar efter skivning med två extracellulära registreringselektroder som används för att mäta nätverksaktivitet. En tredje elektrod (markerad med asterisk) används för att blåsa 30 mM KCl. B, Tidsförlopp bilder av skivor laddade med Fluo-04:00 för> 24 timmar, som visar en ökning av intracellulära kalcium transienter efter bad appliceringen av KCI. C, intracellulära kalcium transienter efter kort appliceringen av KCI (30 mM, 1 s). Röd - genomsnittlig signal, Grey - kalcium spår i enstaka celler som visas i B. D, Extracellulär fysiologisk inspelning av nätverksaktivitet före och efter appliceringen av KCI (röda pilar) var i stort sett oförändrad mellan "färska" skivor (<4 h postdissection) Och de som inkuberades under> 24 timmar i inkubatorn. Notera ökningen av tillsatta aktivitet omedelbart efter KCl ansökan indikerar livsdugliga neuroner som svarar på ökning av [K ^+] med depolarisation. E & F, Passive (E), och aktiva (F) membranegenskaper av pyramidala neuron Följande 2 h (blå traces) eller 26 h (svarta traces) inkubering i inkubationssystemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Att ge direktåtkomst till cellerna i ganglion cellager av wholemount näthinnan av retinally degenererade rd / rd-möss, var ILM ned av enzymet papain ^{7, 8.} Efter digestion kan RGC och fördrivna amakrina celler tydligt visualiseras under DIC belysning (figur 3A), och celler kan riktas för patch-clamp inspelningar utan någon föregående skrapning av ILM. Representativa ström clamp inspelningar från en RGC visas i figur 3B. Depolarisering av cellen via fläckpipetten orsakade dosberoende aktionspotentialen generation, vilket tyder på livskraften hos cellerna efter papain behandling.

Avlägsnande av ILM får också allestädes närvarande färgning av ganglion cellager (GCL) med Fura-02:00 (figur 3D) och celler svarade på 30 mM KCl ansökan med en stor ökning av 340/380 nm förhållande i förhållande till F _0, vilket innebär en stor ökning av intracellulär kalciumkoncentration (figur 3E). Kalciumnivåer återvände till baslinjen efter stimulering och cellerna kunde därefter stimuleras att producera en liknande amplitudsvar. Dessutom är dessa svar var omöjliga att särskilja mellan retinae registreras vid <4 timmar och> 24 h postdissection (figur 3F, G).

Figur 3: Elektro och kalcium Recordings i näthinnan Wholemount. A, differential interferens kontrast bild av en patch-clamp inspelning från en retinal ganglion cell i GCL efter papaindigestion. B, Celler behålla dosberoende spiknings svar när depolariseras med 50, 100 och 150 Pa respektive. C & D, avlägsnande av det inre begränsande membranet före bad tillämpning av Fura-02:00 tillåter överallt laddning av retinala ganglionceller, bild tagen med 380 nm excitation. E, När 30 mM KCl ASCF appliceras, svarade 85% av färgade celler med en ökning av 340/380 förhållande. F & G, Ökningen 340/380 förhållandet återgår till baslinjen efter 30 mM KCl ansökan (röda staplar), Och celler svarar på efterföljande stimulering både <4 h och> 24 timmar efter dissektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den här artikeln beskriver en inkubationstid metod för att förlänga livskraften hos akut neuronal vävnad för avbildning och elektrofysiologiska experiment, vilket minskar antalet djur som behövs för att slutföra experimentella mål. Två huvudprocesser styr försämring av neuronal vävnad med tiden: i) ökade bakterienivåer, och den åtföljande ökningen av bakteriell endotoxin släpptes och ii) excitotoxicitet som följer den traumatiska skiv förfarande ^10. Som akut neuronal vävnad är miljömässigt försvarslös, är nödvändig för att upprätthålla den cellulära aktiviteten liksom nätintegritet stram reglering av vävnads miljön genom noggrann övervakning av pH, temperatur och bakterienivåer. Dissektion, och vävnadsbehandling (papaindigerering, kalcium dye loading) kan ta över 2 h för att komplettera, vilket orsakar en minskning i experimentell tid. Eftersom vävnaden kan hållas i inkubationssystemet för> 24 h utan en mätbar förlust in livskraft ^{7, 8,} måste denna beredning endast fyllas en gång för att erhålla> 24 h resultat. Som en del av 3R strategi (Replacement, Reduction, Refinement) syftar till att ge riktlinjer för etisk användning av djur ^16, denna metod kommer att ha en stor inverkan på att minska antalet djur som används i dessa typer av experiment.

Digerering av ILM av retinal wholemount vävnad medger enkel inriktning av celler i GCL för patch-clamp inspelningar och allestädes närvarande kalcium färgämne lastning genom badet ansökan. Dessa tekniker är särskilt användbara för degenererade retinae där ILM är mycket tjockare och svårare att bryta genom skrapning med en glaspipett. Vidare ger papain beredningen ett sätt att utföra parade cell inspelningar med två elektroder för att spela in från gap-junction kopplade celler i GCL, något som inte varit möjligt tidigare. dockHar papaindigerering sannolikt vissa effekter på normal retinal fysiologi som K ⁺ receptor expression har visat sig vara förändrad hos fotoreceptorer efter dissociation med papain ^6. Det är också möjligt att retinal arkitektur påverkas. Velte och Masland visade att även om vissa RGC SOMAS och dendriter skadades av papain behandling för att avlägsna ILM, kan de framgångsrikt spela in från RGC dendriterna distalt om soma i de flesta neuroner, vilket indikerar den strukturella integriteten av cellerna och processer ^5. Viktigt, lämnar näthinnan fäst näthinnans pigmentepitel (RPE) och sklera, som beskrivits ovan, isolerar den yttre näthinnan från papain diffusion och kan minska eventuella negativa effekter på ljusmätare yttre segment när detta protokoll tillämpas på WT retinae. I båda fallen, papain behandling eller skrapning av ILM, vissa cellskada kommer att inträffa, måste försöksledaren välja metod är anpassad till den experimental fråga.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232