Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר

Published: May 3, 2017 doi: 10.3791/55418
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2
1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

Summary

כאן, אנו מתארים את ההתקנה, תוכנת ניווט, וניתוח נתונים עבור שיטה מרחבית מדויקת ובזמן של מדידת טוניק ושינויי גלוטמט תאי פאזית in vivo באמצעות מערכי microelectrode enzyme-linked (MEA).

Abstract

שיבוש עצבי הוא לעתים קרובות מרכיב מרכזי של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), משחק תפקיד פתולוגיה שבבסיס מחלת אלצהיימר, פרקינסון, דיכאון, וחרדה. באופן מסורתי, microdialysis כבר את הטכניקה הנפוצה ביותר (שיבח) כדי לבחון שינויים הנוירוטרנסמיטר המתרחשים הפרעות אלה. אבל בגלל microdialysis יש את היכולת למדוד איטיים 1-20 שינויים דקים על פני שטחים גדולים של רקמה, יש לו את החסרון של הפולשנות, פוטנציאל להרוס חיבור מהותי בתוך המוח יכולת דגימה איטית. טכניקה חדשה יחסית, מערך microelectrode (MEA), יש יתרונות רבים למדידת שינויים הנוירוטרנסמיטר ספציפיים בתוך אזורים במוח הבדידים כפי שהם מתרחשים, מה שהופך את גישה מדויקת במרחב ובזמן. בנוסף, באמצעות MEAs היא פולשנית, המאפשרת מדידה של שינויים הנוירוטרנסמיטר in vivo. במעבדה שלנו, אנו חהכבר יש מתעניינים במיוחד לשינויים הנוירוטרנסמיטר גלוטמט, הקשורים לפתולוגיה מחלת האלצהיימר. ככזה, השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש כדי להעריך שיבושים בהיפוקמפוס פוטנציאליים גלוטמט במודל של עכברים טרנסגניים של מחלת אלצהיימר. בקצרה, השיטה נהוגה כרוך ציפוי microelectrode רב באתר עם אנזים מאוד סלקטיבית של הנוירוטרנסמיטר עניין בשימוש באתרים המתייחסים לעצמו להפחית את רעשי רקע ואת interferents. לאחר ציפוי וכיול, את MEA ניתן לבנות עם micropipette והוריד לתוך אזור במוח של עניין באמצעות מכשיר stereotaxic. כאן, השיטה המתוארת כרוך בהרדמת RTG (TauP301L) 4510 עכברים באמצעות מכשיר stereotaxic כדי למקד תת אזורים (DG, CA1, ו CA3) של ההיפוקמפוס.

Introduction

מדידת שינויים הנוירוטרנסמיטר במוח הוא כלי חיוני עבור מדעני מוח לומדים מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כי מאופיינות לעתים קרובות הנוירוטרנסמיטר חוסר ויסות. למרות microdialysis בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC / EC) הייתה השיטה הנפוצה ביותר למדוד שינויים ברמות הנוירוטרנסמיטר תאיים 1, 2, 3, 4, ברזולוציה במרחב ובזמן של בדיקות microdialysis לא יכול להיות אידיאלי עבור נוירוטרנסמיטורים , כגון גלוטמט, כי מוסדר בחוזקה בחלל 5 התאים, 6. בגלל ההתקדמות בגנטיקה ודימות, ישנן שיטות נוספות שיכולות לשמש למיפוי גלוטמט in vivo. באמצעות כתבי ניאון גלוטמט מקודדים גנטיים (iGluSnFR) עלד הדמיה שני פוטונים, החוקרים מסוגלים לדמיין שחרור גלוטמט על ידי נוירונים האסטרוציטים הן במבחנה in vivo 7, 8, 9. יש לציין, זה מאפשר הקלטה משדה גדול יותר של נוף ואינו לשבש את החיבור המהותי של המוח. בעוד שיטות האופטיות החדשות אלה מאפשרות להדמיה של קינטיקה גלוטמט ומדידה של תגובות חושיות ומתחזקות פעילות עצבית, הם חסרים את היכולת לכמת את כמות הגלוטמט שטח תאי מוח באזורים דיסקרטיים.

שיטה חלופית היא מערך microelectrode enzyme-linked (MEA) שיכול למדוד באופן סלקטיבי רמות הנוירוטרנסמיטר תאיות, כגון גלוטמט, באמצעות ערכת הקלטה בהפניה עצמית. טכניקת MEA נוצלה בעבר ללמוד שינויי גלוטמט התאים הבאים מוחי טראומטיפציעה 10, 11, 12, הזדקנות 13, 14, מתח 15, 16, אפילפסיה 17, 18, 19 מחלת אלצהיימר, 20, ו הזרקה של 21 ויראלי לחקות ומייצג שיפור לעומת מגבלות המרחב והזמן הגלום microdialysis. בעוד microdialysis מגביל את היכולת למדוד בקרבת הסינפסות 22, 23, יש MEAs רזולוציה מרחבית גבוהה המאפשרת אמצעים סלקטיבית של זליגת גלוטמט תאי ליד הסינפסות 24, 25. שנית, ההחלטה הזמנית הנמוכה של microdialysis (1 - דק 20) מגבילה את היכולת לחקור אתדינמיקה מהירה של שחרור גלוטמט וסילוק המתרחשת האלפית השני כדי הטווח שני 26. בגלל הבדלי השחרור או השחרור של גלוטמט לא יכולים להיות ברורים במדדים של טוניק, נחים רמות גלוטמט, זה עשוי להיות חיוני כי שחרור גלוטמט וסילוק להימדד ישירות. MEAs לאפשר אמצעים כאלה עקב הרזולוציה הגבוהה הזמנית שלהם (2 הרץ) ומגבלות נמוכות של זיהוי (<1 מיקרומטר). שלישית, MEAs מאפשרים לבחון וריאציות תת-ב נוירוטרנסמיטורים בתוך אזור במוח מסוים, כגון בהיפוקמפוס חולדה או עכבר. לדוגמא, באמצעות MEAs אנחנו בנפרד יכולים למקד gyrus המשוננת (DG), קורנו ammonis 3 (CA3) ו קורנו ammonis 1 (CA1) של ההיפוקמפוס, אשר מחוברים באמצעות במעגל trisynaptic 27, לבחון הבדלים תת-ב גלוטמט התאי. בשל גודלו של בדיקות microdialysis (1 - 4 מ"מ אורך) ואת הנזק שנגרם על ידי השתלת 28 </ sup>, 29, הבדלים תת-קשים להתמודד. יתר על כן, המערכות האופטיות רק מאפשרות גירוי באמצעות גירויים חיצוניים, כגון גירוי שפם או הבהוב אור, אשר אינו מאפשר תת-גירוי 7. יתרון סופי של MEAs פני שיטות אחרות הוא היכולת ללמוד אזורי משנה אלה in vivo מבלי לשבש הקשרים החיצוניים ו פנימיים שלהם.

כאן, אנו מתארים כיצד מערכת הקלטה (למשל, FAST16mkIII) בשילוב עם MEAs, מורכב microelectrode ריבוי אתרי קרמיקה מבוססת, יכולה להיות מצופית באופן דיפרנציאלי על אתרי הקלטה כדי לאפשר להתערב סוכנים כדי להיות גילוי והסרה מן האות אנליטי. אנחנו גם להדגים ניתן להשתמש במערכים אלה ללימודי מבוססי amperometry של רגולציה גלוטמט in vivo בתוך DG, CA3, ואת אזורי המשנה בהיפוקמפוס CA1 של RTG הרדים (TauP301L) 4510 עכברים, מ נפוץמודל יד הבית של מחלת אלצהיימר. בנוסף, אנו מספקים אישור של רגישות מערכת MEA לדינמיקה המהירה של שחרור גלוטמט וסילוק ידי טיפול בעכברים עם riluzole, תרופה לראות במבחנה כדי להקטין שחרור גלוטמט ולהגדיל ספיגת גלוטמט 30, 31, 32, 33, והוכחת השינויים האלה בהתאמה in vivo במודל עכבר TauP301L.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ציפוי מערך microelectrode עם אנזימים או Layer מטריקס

  1. הכנת פתרון מטריקס חלבון
    1. תשקלי 10 מ"ג אלבומין בסרום שור (BSA) ולהעביר את הצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    2. הוספת 985 μL של מי DI אל הצינור המכיל microcentrifuge BSA. מערבבים את הפתרון על ידי תסיסה ידנית (re-בפיפטה באמצעות 1000 פיפטה μL ~ 3 פעמים, עד BSA הוא נמס).
      הערה: אין להשתמש מערבולת לערבב הפתרון מכיוון שהדבר עלול להציג אוויר לתוך התמיסה. כמו כן, להגדיר את פיפטה בנפח <1000 μL (למשל 700 μL) כדי למנוע החדרת בועות אוויר. הפתרון עשוי להיות ממוקם ב microcentrifuge במידת הצורך.
    3. לאחר פתרון BSA הוא נמס, מוסיפים 5 μL של פתרון glutaraldehyde 25%. מערבב את הפתרון על ידי צינור ההיפוך הסגור 3 - 5 פעמים. הפתרון שהתקבל הוא BSA 1% עם glutaraldehyde 0.125%.
    4. הקדש את solu מטריקס חלבוןtion עבור 5 דקות. הפתרון יופיע צהוב בהיר.
  2. הכנת פתרון האנזים הרצוי (למשל, מונואמין גלוטמט)
    1. הכן את פתרון מונואמין גלוטמט על ידי הוספת מים DI מסונן אל lyophilized, אנזים מטוהרים (למשל, 50 מים μL DI הוסיף 25 יחידות של מונואמין גלוטמט להניב 0.5 U / μL).
      הערה: פתרון המניות Aliquot (למשל, 1 μL) ולאחסן את aliquots במיכלים בגודל מתאים (למשל, 500 צינורות μL microcentrifuge) ב -20 מעלות צלזיוס. Aliquots ניתן לאחסן עד 6 חודשים בתנאים אלה.
    2. להוסיף 4 μL של פתרון BSA / glutaraldehyde אל הצינור aliquoted microcentrifuge המכיל מונואמין גלוטמט. מערבבים את הפתרון על ידי תסיסה ידנית (re-בפיפטה עם טפטפת 10 μL. פיפטה יש להגדיר נפח <5 μL). הפתרון שהתקבל הוא BSA 1%, glutaraldehyde 0.125% ו 0.1 מונואמין גלוטמט U / μL.השתמש פתרון לציפוי מיד.
      הערה: פתרון הציפוי מונואמין גלוטמט ניתן להשתמש רק בתוך 15 דקות. למרות מספר MEAs ניתן מצופה פתרון אחד מוכן, מומלץ שלא יעלה חלון זמן שמיש עבור מונואמין גלוטמט. מספר האלקטרודות שניתן מצופה בתוך 15 דקות להשתנות. באופן כללי, 4 עד 6 אלקטרודות יכולים להיות מצופים בכל פעם.
  3. ציפוי MEA
    1. בדרך כלל, מעיל וזוג האתר הקלטה (ים) על MEA עם האנזים הרצוי (מונואמין גלוטמט) וזוג שונים של האתר הקלטה (ים) ( "סנטינל" באתר (ים)) מצופה עם חלבון-מטריצה ​​פעילה.
    2. השתמשו microsyringes המילטון-קצה קהה (למשל 10 μL) כדי MEAs מעיל עם מונואמין L-גלוטמט או פתרון מטריקס חלבון פעיל (BSA + glutaraldehyde). הנהלים המשמשים ציפויי החלבון-מטריקס אנזים או לא פעילים זהים.
    3. נקו את המזרקים לפני ואחרי השימוש (3 שטיפות עםמי DI, 3 שטיפות עם מתנול, 5 שטיפות עם מי DI).
      הערה: מזרקים מוקדש משמשים להחלת מעילים של אנזים (מונואמין גלוטמט) או-מטריקס חלבון. אין להשתמש באותו מזרק לפתרון אחר. מומלץ לבצע ציפוי החלבון-מטריקס לפני ציפויי אנזים.
    4. צייר את מונואמין גלוטמט או מטריצת החלבון באמצעות 10 מזרק μL המילטון. לחץ בעדינות את הבוכנה לוותר חרוז קטן של פתרון בקצה המזרק (דמיינו באמצעות מיקרוסקופ לנתח).
    5. באמצעות מיקרוסקופ לנתח יכול למקד לאתרי הקלטת MEA, להחיל הפתרון באתרי ההקלטה המתאימים באמצעות פנייה באתרי ההקלטה בקצרה עם פתרון האגל / חרוז, מייצג שכבה אחת. שלוש שכבות מספיקות עבור שני-מטריקס חלבון ואת מעייל האנזים. שכבות עבות יכולות להפחית את הרגישות של MEA.
    6. הרם את אגל הפתרון ישר מעלה את אתרי הקלטות (כלומר syrinGE טיפ אסור לגרד פני השטח MEA).
    7. הגדרת טיימר עבור 1 דקות. זוהי הדרישה במינימום הזמן בין יישומי ציפוי לאתר ההקלטה (ים). אפשר MEAs מצופה אנזים לרפא על 4 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים.
    8. רשום את מספר מעילים מיושם, כמה זמן לקח כדי להחיל את ציפוי, מספר אלקטרודה, ואת שם ותאריך במחברת המעבדה.

גלוון 2. עם m-phenylenediamine הסלקטיביות משופר

  1. Dihydrochloride מ-phenylenediamine הכנה (MPD) פתרון
    הערה: פלייט שכבת הדרה, MPD, כדי למנוע חמצון של דופמין ומולקולות גדולות, interferent אחרים (למשל, חומצה אסקורבית), ובכך לשפר את הסלקטיביות של חיישן עבור גלוטמט / H 2 O 2 מעל מולקולות בפוטנציה-interferent אחרים.
    1. מדדו 50 מ"ל של 0.05 בופר פוספט M (PBS) בתוך בקבוק מדידה ולהעביר 50 מ"ל של 0.05M PBS על גדול יותר (150 מ"ל) בקבוק Erlenmeyer.
    2. שימוש בצינור מחובר למכל חנקן (למשל, באמצעות הצינורות חבר מפליט לחץ), לצרף קצה פיפטה (טיפ P200 למשל) עד הסוף הפתוח של הצינור. מניחים את צינורות עם קצה פיפטה מצורף פתרון PBS ולכסות הפתרון רופף עם parafilm. הפעל פתרון בועת חנקן בעדינות במשך 20 דקות.
    3. לשקול 0.045 גרם של MPD.
      זהירות: MPD הוא חומר קרצינוגני פוטנציאלית. שקילה של MPD צריכה להתבצע באמצעות סולם בתוך במנדף. יש להשתמש בכפפות ומסכה בעת שימוש MPD. ודא למכסת המנוע הוא פונקציונלי כי האבנט הוא משך אל רמת העבודה ההולמת. מיד משטחים נקיים שייתכן מזוהמים עם MPD כדי למנוע הכתמה קבע.
    4. לאחר מבעבע, להעביר את כל ה MPD לפתרון PBS-בגז דה. מכסים את פתיחת הבקבוק עם parafilm פתרון מערבולת בעדינות כדי לפזר MPD בתמיסה. הימנע aggressivדואר ערבוב או שימוש מערבולת מכיוון שהדבר עלול להציג גזים לתוך התמיסה.
    5. העבר הפתרון מבחנה 50 מ"ל. בר ומערבב אינו הכרחי.
  2. Electroplating האלקטרודה
    1. השג אלקטרודת הייחוס. השתמש אלקטרודות התייחסות מוקדשות MPD ציפוי בלבד. השתמש אלקטרודה התייחסות שונה עבור פרוצדורות כיול.
    2. מקם את זרוע הפלסטיק של בעל אלקטרודה הפניה מעל הכוס. בדקו בועות אוויר אלקטרודת זכוכית ההפניה (ייתכן שלא תוכל לראות). בעדינות קפיצית בקצה הדיסטלי של האלקטרודה ההתייחסות להסיר בועות אוויר בקצה.
    3. מניחים את האלקטרודה הפניה דרך הפתח בזרוע פלסטיק נמוך לתוך מבחנה המכילה PBS. ודא כי האלקטרודה התייחסות לא לפנות בתחתית הכוס.
    4. חבר את האלקטרודה התייחסות headstage (למשל 2 PA / mV) ולחבר (מחבר DIP למשל) MEA להיות צלחת MPDד אל headstage.
    5. מנמיכים את MEA לתוך התמיסה בכוס כזה רק כי קצה MEA הוא שקוע בפתרון. אין להטביע את טיפי MEA בנוזל מעבר "הבועה" השחורה (הבידוד השחור הממוקם מעל קצה MEA). פעולה זו עלולה לגרום נזק MEA.
    6. הפעל כיול "מבחן" כדי לאמת את הפונקציונליות של ערוצי אלקטרודה וחיבור אל headstage.
      הערה: למרות שהגדרות חומרה צריכות לשקף את הציוד בשימוש, פרטים הקשורים אנליטי / interferent סוג ואת הריכוז לא צריך להזין את הכיול "המבחן". מצב recoding צריך להיות "amperometry" ואת "V-מוחל" צריך להיות -0.7 V. אמת הקלטה אופיינית לכל הערוצים.
    7. לבטל על ידי בחירת "ביטול" כאשר קישוריות של כל האתרים הקלטה מאומתת. אין צורך לשמור את נתוני הכיול.
    8. בחר בסמל "גלוון" על שולחן העבודה. 'אל גלווןתפריט ol יופיע. בדוק את ההגדרות הנכונות מוזנות:
      משרעת PP: 0.25
      אופסט: -0.5
      תדירות: 0.05
      משך (דקות): 20
    9. בחר בלחצן "השהה" כדי להתחיל ציפוי. השדה הזמן שחלף צריך להתחיל לספור לאחור.
    10. בסיום (כל הזמן שחלף), בחר "אחר MEA" בתפריט הצץ להתחיל MPD ציפוי MEA נוסף. החלף את MEA מצופה עם MEA להיות מצופה MPD לחזור על התהליך אלקטרוליטי שימוש באפשרות אלקטרוליטי.
      הערה: מומלץ להשתמש בפתרון MPD מוכן לא יותר מ 2 פעמים או בתוך פרק 1 h זמן. כן פתרון חדש כדי להכין יותר מ 2 MEAs.
    11. בחר "תוכנת יציאה" כדי לסיים אלקטרוליטי. לשטוף טיפי אלקטרודה מצופה MPD עם מים די (כדי למנוע שאריות מלח) וחנות (24 ח) לפני הכיול.
    12. הסר את האלקטרודה ההתייחסות מהפתרון ולשטוף במי DI לפני הצבת לתוך הים המתאיםפתרון torage (למשל 3 M NaCl). ודא קצה האלקטרודה הפניה הוא שקוע בפתרון. לאט אלקטרודה הפנית זכוכית נמוכה לתוך הפתרון כדי למנוע פגיעה בזכוכית.
    13. השלך את הפתרון MPD במיכל פסולת מסוכנת שכותרתו כראוי.

3. כיול MEA עבור איתור גלוטמט סלקטיביות (איור 1) 21

  1. הכנת הפתרונות הדרושים כיול.
    הערה: עיין בטבלה 1.
  2. בצע כיול תחת בחישה מתמדת (סוללה מגנטית מופעלת בוחשת) בשעה 37 ° C. הפעל את כרית חימום או במחזור אמבט מים להשיג בר ומערבבים קטן. מערבבים לאט אבל מהר מספיק שכאשר תוספת נעשית (להלן), הרמה החדשה הגיעה במהירות.
  3. חברו את headstage (2 PA / mV) למערכת ההקלטה שליטה והכנס את קצה MEA לתוך 40 מ"ל של עורר 0.05 M PBS (להשתמש בכוס 50 מ"ל).
  4. חברו את rאלקטרודה eference. פליק בסוף כדי להבטיח שאין בועות אוויר.
  5. פתח את התוכנית להקלטה ולחץ על "כיול". ודא שההגדרות נכונות (לבדוק באתרי סנטינל שנבחרים כמו זה עשוי להשתנות עם אלקטרודות שונות), לבחור מספר MEA ולחץ על "התחל".
  6. אפשר 5 - 10 דקות עבור איזון; מתחילים פעם הבסיס התייצב (<0.004 נה / שינוי דק ').
  7. בחר "Baseline" ולהוסיף 500 μL של 20 חומצה אסקורבית מ"מ (interferent; הסופי [250 מיקרומטר]) ובחר "Interferent" (AA נחשב interferent המוח כולו) ברגע הנוכחי הגיע לרמה חדשה, יציבה, אם כל. אפשר 0.5 - 1 דקות בין תוספות. אם MEA הוא electroplated כראוי, כמעט ללא שינוי יש לשים לב.
  8. להוסיף 40 μL של 20 מ"מ L- גלוטמט ([מיקרומטר 20] הסופי) ופעם הנוכחי הגיע לרמה חדשה, יציבה, בנוסף סימן 1 st "אנליטי". חזור שלוש פעמים עבור סכום כולל של 3 glutamatתוספות דואר.
  9. להוסיף 40 μL DA. אל תבחר "אנליטי"; בחר "חומר מבחן" - DA אולי רק להיות interferent באזורים המכילים DA.
  10. להוסיף 40 μL פראוקסיד. אל תבחר "אנליטי"; בחר "חומר מבחן".
  11. לחץ על כפתור "עצור" ברגע כיול נגמר.
  12. כדי לקבוע את הפונקציונליות של MEA, לחץ על כרטיסיית החישוב ולהקליט את הפרמטרים הבאים במחברת מעבדה.
    1. עבור עיצוב MEA (3000 מיקרומטר 2) המשמשים כיולים אלה, להשתמש MEA עם שיפוע ≥ 0.004 נה / מיקרומטר אך המדרונות הנמוכים יכול לשמש בניסויים מסוימים. אם יש פחות הבדל 10% ב המדרון שבין מצופה אנזים ואתרי ללא ציפוי, ולאחר מכן להשתמש MEAs אלה לשחרור עורר בלבד או נקי / לבטל את MEA.
    2. השתמש גבול הגילוי (לוד) ≤ 1.5 מיקרומטר. אם לוד עולה 1.5 מיקרומטר, ולאחר מכן להשתמש MEAs אלה releas עוררדואר ספיג בלבד. אין להשתמש באלקטרודות אלה להקלטת רמות טוניק.
    3. השתמש סלקטיביות עבור אנליטי הרצוי (כלומר, גלוטמט) מעל interferent של> 20 יחידות שרירותיות. אם סלקטיביות היא פחות מ 20, אז נקי / לבטל את MEA.
    4. השתמש ליניאריות (R 2) של עקומת כיול של ≥ 0.90. אם הליניאריות פחות מ 0.90, אז נקיים או להשליך MEA.
  13. שמור את הקובץ עם # של MEA, תאריך, וראשי התיבות של כיול האדם.

4. להרכיב את micropipette

הערה: Micropipettes (זכוכית נימים) צריך עצה עם קוטר פנימי של 10 - 15 מיקרומטר.

  1. מניחים את micropipette מרכזי בקרב כל האתרים הקלטה ארבעה פלטינה הר 50-100 מיקרומטר מעל MEA באמצעות שעווה דביקה חמר.
  2. כדי לטעון את micropipette, להשתמש במזרק 1 מ"ל מלאים גלוטמט או פתרון KCl, A filte מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטרr, ואת ארוך 97 מ"מ, 28-מד מילוי פיפטה, רשאים למלא את micropipette. כלומר, להכניס את המחט בראש של micropipette ולמלא בתחתית של micropipette (סוף לכיוון MEA), מוודא שאין בועות.
  3. צרף את micropipette למערכת ולהוציא לחץ על 2 - 20 psi במשך כ 1 ים.

5. פלייט האלקטרודה התייחסות מיניאטורי in vivo השתמש

  1. הכן את פתרון ציפוי (50 גרם NaCl / 90 מ"ל 1 M HCl בכוס מ"ל 100 (אמבטיה ציפוי)) וחותכים האלקטרודה אמבטיה (~ 10 ס"מ אורך של פלטינה (Pt) חוט (~ 0.02" קוטר)).
  2. חותכים 10 - 15 ס"מ חתיכה ארוכה של חוט כסף מצופה טפלון (0.008" חשוף) ולהשתמש בסכין גילוח כדי לגרד ~ 1 ס"מ של ציפוי טפלון מקצה אחד של סוף חוט כסף.
  3. הלחמת סיכת זהב על קצה אחד ומקום קצה אחד של חוט כסף חשוף לאמבטית הציפוי.
  4. שימוש במתאם DC (להשתמש במתאם DC רק בעל תפוקה של ~ 9 -. 15 VDC מקסימום),מהדק את החוט "אדום" (+) אל חוטי כסף מוכן (אלקטרודה הפניה) בצד סיכת זהב. הצמד את "שחור" (-) תיל אל הקתודה אמבטיה Pt.
  5. חברו את מתאם DC. חפש את תהליך הציפוי הנכון - בועות אמורות להופיע בבית אלקטרודה האמבטיה; אלקטרודת ייחוס הופכת צבע כסוף / אפור.
    זהירות: אל תפעיל את המוביל [שחור (-) לעומת האדום (+)] - ציפוי אמבטיה ייהרס אם זו מתרחשת פתרון ציפוי טרי יצטרך להתבצע. פתרון רע יהפוך בצבע צהוב: אין להשתמש!
    הערה: התגובה ציפוי לוקח 2-5 דקות בדרך כלל: Ag 0 + Cl - → AgCl + e -
  6. בדוק את אלקטרודת הייחוס.
    1. גדר מודד את 100 - הגדרת 200 mV DC.
    2. מניחים אמת מידה (כלומר, אלקטרודה נבדק בעבר ידוע שזה עובד) אלקטרודה התייחסות 3 M NaCl ולבדוק כנגד אלקטרודת הייחוס מצופה החדש.
      הערה: אם לנוing אלקטרודה התייחסות חדשה, יש להשרות 3 M NaCl לפני השימוש (12 h מומלץ).
    3. מניחים את ההובלה "אדום" (+) על סיכת זהב של האלקטרודה הפניה להיבדק. מניחים את "שחור" - להוביל על אלקטרודה benchmark (). מגוון הודעה מקובל הוא ± 10 mV. 0 mV הוא אידיאלי על פני 2 אלקטרודות התייחסות.

6. כירורגיה בעלי חיים כללי להקלטות MEA

  1. הכנה לניתוח
    1. מניחים כלים לניתוח בחומר חיטוי אמש.
    2. הסר את הכלים מן החיטוי ולשטוף ביסודיות למקם את הכלים על משטח ניתוח סטרילי. קבל כרית חימום.
    3. כייל שתי אלקטרודות ולצרף את micropipette כמתואר נהלים 3 ו 4.
    4. הפוך את האלקטרודה התייחסות כמפורט בסעיף 5.
    5. הפוך 200 גלוטמט מיקרומטר ו 70 מ"מ KCl. עיין בטבלה 1.
    6. השג את החיה ולהקליט את משקלו על גיליונות הניתוח.
    7. הכן את ההרדמה ולהדליק את כרית החימום.
  2. בצע ניתוח MEA
    1. באמצעות isoflurane (זרימת 4% חמצן), להרדים את החיה בתא אינדוקציה עד קצב הנשימה ירד באופן משמעותי ובעל החיים אינו מגיב הבוהן או קמצוץ הזנב. קצב נשימת שיא ואת טמפרטורת גוף בכל 15 דקות.
    2. מניחים את החיה המכשיר stereotaxic באמצעות מוטות אוזן לייצב את הראש. ודא החיה מאובטחת הראש לא זז. מנמיכים את זרימת isoflurane ל -1.5 - 3% חמצן. ודא כי כרית החימום ממוקמת כראוי תחת בעלי החיים מוגדרים 37 ° C כדי לספק חום משלימה. אי אספקת חום משלימה עלול לגרום היפותרמיה עמוקה ומוות בטרם עת של החיה.
    3. החל משחת עין באמצעות מטוש צמר גפן סטרילי ולהקליט את קצב הנשימהטמפרטורת הגוף. באמצעות גוזם מופעל באמצעות סוללה נטענת, לגלח את החלק העליון של הראש. השתמש מספרי כירורגיות הקטנים כדי להסיר את הפרווה ליד האוזניים.
    4. בשלב זה, לשים על כפפות ניתוחים סטרילי. החל יוד ואז אלכוהול (שלוש פעמים) לקרקפת.
    5. באמצעות אזמל, עושה חתך ישר למטה באמצע הקרקפת ולהפיץ את העור באמצעות מלחציים כלב שור. קח טיפ כותנת סטרילי כדי לספוג את כל דם. להשתמש במי חמצן כדי להקל על המראה של גבחת ו למבדה.
    6. בדוק כי הראש ממוקם כראוי על ידי מדידת D / V ו קואורדינטות M / L של גבחת ו למבדה. שינויים לתאם צריכים להיות אפס אם הראש נמצא על מישור שטוח. התאם את סורגי ראש האוזן ככל שיידרש כדי להבטיח מטוס שטוח.
    7. מצא גבחת, ואפס את הקואורדינטות. באמצעות הקואורדינטות הרצויות, נע שמאלה וימינה ולעשות סימן באמצעות סמן קבע. באמצעות cauterizer / סמן, ליצור ריבוע גדול סביב סימן עם מספיק מקום כדי להגיעהאזור הרצוי.
    8. באמצעות כלי סיבובי סטרילי, לקדוח סביב הסימן המרובע. לספוג כל דם באמצעות מטוש צמר גפן סטרילי. ביסודיות ולחטא את המקדח לפני כל שימוש.
    9. צרף את MEA אל headstage ו רשאים למלא את פיפטה עם הפתרון הרצוי הראשון. הקפד להשאיר פער פיפטה בלי פתרון כל כך שהפתרון שגורש יכול להיבחן. צרף את הצינורות אל micropipette הזכוכית.
    10. הפעילו את הטנק חנקן ואת מפליט הלחץ (psi = 5, זמן = 0.6 s). מבחן (כפתור אדום ידני עיתונות) כדי להבטיח את פיפטה לא סתום לפני התחילה.
    11. כייל את micropipette. התחל 0 על reticle ומקום חתיכת סרט כחול על headstage כדי לציין את נקודת ההתחלה. הפעל את הקורא הדיגיטלי ולאפס את זה לאפס. רד 1 מ"מ (DV) ולספור את מספר קרציות הפתרון עבר על reticle. 10 קרציות צריכים להיות שווים 1 מ"מ (1 מ"מ = 250 NL), כך 1 tick = 25 NL.
    12. מניחים את האלקטרודה הפניה בתוךבמיקום מרוחק מן MEA כאלה שזה עדיין בקשר נוזלי עם המוח כדי להשלים את המעגל.
    13. מצא גבחת עם MEA מצורף אפס הקורא הדיגיטלי. הזז את MEA לקואורדינטות הרצויות. לאט לאט להוריד את MEA עד הקצה נוגע המוח. אפס את DV לתאם לאט לאט להוריד את MEA לתוך המוח.
    14. על תכנית ההקלטה, לחץ על האלקטרודה המכויל הרצוי ולאחר מכן לחץ על "בצע ניסוי." לאחר מכן, המערכת תתחיל להקליט רמות טוניק עבור אנליטי של עניין בעוד החיה הוא מורדם.
    15. זום לצייר שיסייעו בשמירת בסיס ולאפשר האלקטרודה אל בסיס עבור 20 - דקות 45.
    16. אחרי הבסיס הוא יציב, להגדיר את מפליט לחץ כדי 0.6 s ו- 5 psi ולחץ על הכפתור האדום על מפליט הלחץ להוציא. הקלט את הזמן ואת הלחץ, כמו גם נפח / קרציות עבר על גיליון ההזרקה (איור 2). בצע את כל הערות נדרשות (כלומר,פסגה גדולה, תופעות דילול, פיפטה סתום,-היקף o בסיס / רועש).
    17. עבור זריקות גלוטמט, לחכות 3 - 5 דקות בין זריקות. עבור KCl זריקות לחכות 1 - 2 דקות בין זריקות. להזריק באמצעות אותו בלחץ זמן לפחות 3 פעמים. שנת שעה וחזור. נסה לא לשנות לחץ אלא אם micropipette יש סתימה.
    18. אם micropipette יש סתימה, להגביר את הלחץ עד 30 psi.
    19. שיא מאזורי המוח הרצוי, חוזר משני צידי המוח באמצעות פתרונות שונים. קלט בסיס בכל אזור חדש עבור 20 דקות.
    20. קח את MEA עם micropipette המצורפת, לשטוף עם מים די ומשרים PBS לילה עד שכל הדם נעלם.
    21. להרדימו ולשמור את המוח בתוך שפופרת מראש שכותרתו ולאחסן במקפיא -80 ° C או לשמור בצד אחד עבור קיבוע. להרדימו, מנת יתר עם isoflurane (אינהלציה). בצע עריפה באמצעות מספריים כירורגיים לנתח את האזורים הרצויים.

7. MEAs מצופה ניקוי לאחר השימוש

  1. אל תנקה MEAs אם בשימוש. אם יש מוך או אבק על משטח נקי עם מתנול ולתת להתייבש במשך 24 שעות לפני הציפוי.
  2. הפעל באמבט מים (80 מעלות צלזיוס) ולספוג קצה MEA עבור 30 דקות. נגב בזהירות את קצה האלקטרודה עם כותנה היטה המוליך כדי להסיר כל פסולת כי ניתן להשאיר על קצה האלקטרודה. אין לקבל את "חלק הבידוד" השחור של MEA הרטוב.
  3. באמצעות שלושה sonicators שונה, יש להשרות את קצה MEA ב (1) Citrisolv, סוכן מסחרי ממס וסליקה (2) איזופרופיל, ו (3) מי DI עבור 5 דקות. נגב בזהירות את קצה האלקטרודה עם כותנה היטה המוליך כדי להסיר כל פסולת כי ניתן להשאיר על קצה האלקטרודה.
  4. בדוק את הטיפים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להבטיח את השכבות הוסרו בהצלחה.

ניתוח 8.

  1. כדי לנתח את הנתונים,ראשיתיצא הניסוי הרצוי על ידי לחיצה כפולה על הניסוי המוגמר ובחירת "נתוני הייצוא" מהתפריט הנפתח קובץ.
  2. לשמור את הנתונים האלו אל מיקום הקובץ הרצוי ולפתוח בתכנית הניתוח. לחץ על "פתח" בתכנית הניתוח ולבחור את הקובץ שנשמר לאחרונה.
  3. תן את התכנית כמה רגעים כדי להעלות את הקובץ ולאחר מכן לבדוק בניסוי תחת לשונית סמני אירוע. תחת פלט, לבדוק את התיבות עבור הפרמטרים הרצויים. לדוגמא, בסיס, משרעת, אזור שיא (שטח מתחת לעקומה), עליית T, ו- T 80.
  4. לחץ רענון ולאחר מכן לנתח לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני (זו עשויה להימשך מספר דקות). התכנית תיתן הנחיה לשמור את הקובץ במיקום הרצוי. לאחר השמירה, את הקובץ ניתן לערוך גיליון אלקטרוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעוד הטכנולוגיה הזו יכולה לשמש כדי למדוד שינויים glutamatergic איתות בסוגים רבים של מודלים בבעלי חיים, כגון פגיעה מוחית טראומטית, הזדקנות, מתח, ואפילפסיה, כאן אנו מדגימים כיצד הטכנולוגיה MEA יכול לשמש כדי לבחון שינויים glutamatergic במודל עכבר מהונדס של tauopathy האנושי 19, 20. RTG (TauP301L) 4510 העכבר מבטא את המוטציה P301L ב טאו הקשורים דמנציה פרונטו-טמפורלית ו פרקינסון קשורה כרומוזום 17, והוא נפוץ ללמוד פתולוגיה טאו הקשור למחלת האלצהיימר, tauopathies ניווניות ודמנציה פרונטוטמפורל. אנחנו גם מדגימים כי איתות glutamatergic ניתן לשנות על ידי התערבות פרמקולוגית. התייחסנו עכברים TauP301L עם riluzole, תרופה ה- FDA שינוי מחלה עבור טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) כי מודולציה איתות glutamatergic ידי ייצובלהשבית מצב תעלות נתרן מתח מגודר, מה שמוביל לירידת שחרור גלוטמט, וכן הגברה של ספיגת גלוטמט באמצעות עליית ביטוי טרנספורטר גלוטמט, שמוביל אישור גלוטמט מוגבר 30, 31, 32, 33.

בחרנו במערך הספציפי הזה למטרות הפגנתיות במשך ארבע סיבות. ראשית, הנתונים הזה מדגים את ההחלטה הזמנית של המערכת, כפי שמוצג על ידי היכולת שלנו למדוד את הדינמיקה המהירה של שחרור חלף ספיגה של גלוטמט. בנוסף, במודל חיה פרה-קליני זה מציג שינויי גלוטמט טוניק, שחרור גלוטמט, וסילוק גלוטמט, המאפשר דוגמא שינויים בכל מידה. שנית, ניצול במערך הזה, ברזולוציה מרחבית גבוהה המאפשר מדידה של הבדלים subregion סמוך להר הזיתים, DG, CA3nd CA1 של ההיפוקמפוס מודגם. שלישית, הנתונים הללו מאפשרים הפגנה של כמה התערבות פרמקולוגית יכול לשמש כדי להקל שינויי glutamatergic שנצפו במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים. לבסוף, כי יש מודל הפרה-קליני זו שינויי שחרור גלוטמט, את הצורך בפרשנות קפדנית של שחרור גלוטמט בנוכחות שחרור גלוטמט שינה יכול להיות מוסבר.

לאחר שהגיע בסיס יציב, כפי שצוין על ידי <0.004 נה / שינוי דק 'ב מדרון (10 - 20 דקות), ראשון מדדנו רמות גלוטמט טוניק (מיקרומטר) על ידי חישוב ממוצע רמות גלוטמט תאיות מעל 10 s לפני כל יישום של פתרונות. צפינו רמות גבוהות טוניק גלוטמט באזורי CA3 ו CA1 של עכברים TauP301L, ו riluzole משוחזר רמות גלוטמט טוניק לזה של פקדים (איור 3A). הבא, KCl נמסרה מקומית (באמצעות micropipette) לכל אחת משלוש תת-אזורים של אחד hemisphere כל 2 - 3 דקות. אחרי 10 אותות לשחזור, אשר מעידים על מערכת העצבית גלוטמט השלם 34, התוצאות היו בממוצע עבור כל קבוצה ואת משרעת הממוצעת בהשוואה. עקבות נציג (איור 3B) גילה גדל שחרור גלוטמט בעכברים TauP301L הבאים היישום של KCl בכל שלושת אזורי משנה (רק CA3 מוצג), אפקט חולץ על ידי טיפול riluzole (איור 3 ג).

את MEA אז הועבר בחצי הכדור ההפוכים ואפשר להגיע בסיס יציב (10 - 20 דקות) לפני גלוטמט אקסוגניים יושם לבחון אישור גלוטמט (איור 4). בהיקפים שונים (50 - 250 NL) של 200 פתרון גלוטמט סטרילי, מסוננים מיקרומטר יושמו לחלל תאיים כל 2 - 3 דקות, ואת השטח נטו מתחת לעקומה (AUC) שימש כמדד ספיגת גלוטמט. יישומים מהירים זה של הגלוטמט אל tשטח תאי שהוא מאפשר חיקוי של שחרור גלוטמט אנדוגניים ומדידה של ספיגת גלוטמט. מכיוון מובילי גלוטמט התערוכה מיכאליס-מנטן קינטיקה 35, מגוון של כרכים (50 - 250 NL) של גלוטמט אקסוגניים מוזרק לחשוף הבדלים ספיגת. לשם כך, כל חיה מקבלת 1 - 2 זריקות ב 50 במרווחים nL בתוך 50 - 250 טווח NL. למרות שאחד מהם תמיד צריך לאשר כי הנפח המוזרק לכל קבוצה בכל אזור אינו שונה סטטיסטית על p ≤ 0.05 רמה, הדרך הטובה ביותר להבטיח נטו AUC קשור ספיגים, ולא את כמות גלוטמט מיושמת או דיפוזיה, הוא להבטיח כי הן משרעת (איור 4A) ואת עליית T (מדד של דיפוזיה ממקור הנקודות (micropipette) על MEA באיור 4B) אינו שונה 10, 11, 19, 20. allo זהWS עבור "התאמת שיא" אמפליטודות (איור 4C) כך ההבדלים נטו AUC הם הניחו להיות עקב הבדלים ספיגים ולא את הסכום להחיל או דיפוזיה. התאמת שיא חשובה במיוחד כאשר יש חיות הבדלים קיימים שחרור גלוטמט. בגלל מגוון של כרכים מוזרקים, את השונות הם משרעת עליית T הן לרוב גדולות והוספת חיות נוספות אינו להקטין את השונות בשני המדדים הללו, כפי שהם נובעים מעצם העיצוב. מכיוון במשרעת עליית T היו דומות בין הקבוצות בכל אזור המשנה (איור 4A, 4B), אנו מניחים כי ההבדלים נטו AUC (איור 4C, 4D) נובעים מהבדלים ספיגת גלוטמט. Riluzole השתפר אישור גלוטמט בהשוואה לקבוצת הביקורת בכל שלושת אזורי המשנה (איור 4D). לבסוף, MEA עם micropipette מצורפת משמש מקומי להחיל צבע כדי לאשר מיקום MEA אחרי המוח חתך, כפי שמודגם באיור 3D.

נתונים אלה מצביעים על כך שטכנולוגית MEA היא מסוגלת למדוד שחרור הנוירוטרנסמיטר בתוך אזורי משנה הקטנות של ההיפוקמפוס 24, 25, בניגוד הטכניקות קודמות (למשל, microdialysis), אשר רשמו רק מאזורים מדגם גדולים ולעתים קרובות ניזוק מעגלים עצביים 28, 29. בנוסף, MEAs לספק לנו עם רזולוציה גבוהה זמנית למדידת קינטיקה המהירה של שחרור גלוטמט וסילוק 25.

איור 1
איור 1: In Vitro הכיול של microelectrode התייחסות עצמי מדידת השינוי הנוכחי (PA) באתר אוקסידאז גלוטמט (GluOx; אדום) לעומת אתר סנטינל (Sent; כָּחוֹל). חומצת אסקורבית interferents (AA: 250 מיקרומטר) ודופאמין (DA: 2 מיקרומטר) לא שינו את הנוכחי או בבית מונואמין גלוטמט או באתרי Sentinel. תוספת של גלוטמט (Glu: 20, 40, 60 מיקרומטר) המיוצר עלייה הנוכחית בשלבים באתר מונואמין גלוטמט, אבל שום שינוי באתר נטור. מי חמצן (H 2 O 2: 8.8 מיקרומטר) המיוצר עלייה נוכחית בשני האתרים. רגישות, מדרון, גבול של זיהוי, ו- R 2 ערכים חושבו לאחר הכיול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. גליון אלקטרוכימיה לדוגמא. גיליון זה כולל עמודות בזמן הזרקה או מספר הזרקה (זמן / TTL), קואורדינטות מוח (AP, מיליליטר, DV),כמות הלחץ המופעלת (חנקן), באורך של לחץ (זמן), ואת הנפח מוזרק על ידי מפליט הלחץ. כל הערות, כגון אותות מוזרים או סתימת micropipette יש לרשום בעמודת ההערות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תאיים טוניק ו אשלגן כלוריד (KCl) שחרור -evoked הגלוטמט DG, CA3, ו CA1 אזורים של ההיפוקמפוס. (א) אזורי CA3 ו CA1 של ההיפוקמפוס, רמות גלוטמט טוניק הוגדל באופן משמעותי בעכברי TauP301L שטופל רכב (Veh-TauP301L), אפקט המוחלש על ידי טיפול riluzole. (ב) הקלטות נציג בהתאמה Baseline של שחרור גלוטמט KCl עורר את CA3 הראה r טיפול iluzole (Ril-TauP301L) החלישה את הגידול המשמעותי משרעת של שחרור גלוטמט שנצפו בעכברים Veh-TauP301L. יישום מקומי של KCl (↑) המיוצר על עלייה חזקה ב גלוטמט תאיים כי חזר במהירות לרמות טוניק. (ג) גדל באופן משמעותי שחרור גלוטמט KCl עורר שנצפו בעכברים Veh-TauP301L של DG, CA3, ו CA1 לאחר יישום מקומי של KCl נחלש עם טיפול riluzole. (ד) Cresyl סגול מוכתם 20 מיקרומטר קטע בהיפוקמפוס מציג מיקום מסלולים MEA ב CA3 ו CA1 (ממוצע ± SEM; ** p <0.01 Veh-Control לעומת Veh-TauP301L, # p <0.05 Ril-Tau- P301L לעומת Veh-TauP301L, ## p <0.01 Ril-TauP301L לעומת Veh-TauP301L; n = 14 - 19 / קבוצה). נתון זה נדפס באישור John Wiley and Sons 19, 20.r קבל = "_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ספיגת גלוטמט בעקבות יישום אקסוגניים הגלוטמט DG, CA3, ו CA1 אזורים של ההיפוקמפוס. (א) משרעת של האות גלוטמט מקומי מיושמת היה דומה בקרב קבוצות בכל אזור. (ב) עליית T, אינדיקציה דיפוזיה גלוטמט מן micropipette, היה דומה בין הקבוצות בכל אזור. (ג) אותות גלוטמט נציג של CA3 מיישום המקומי של הגלוטמט Veh-פקדים, Veh-TauP301L, ועכברים Ril-TauP301L. (ד) טיפול Riluzole הפחית את העליות המשמעותיות בתחום נטו מתחת לעקומה (AUC) נצפתה בעכברים Veh-TauP301L בכל 3 אזורים של ההיפוקמפוס, המציין ספיגת גלוטמט השתפרו riluzole שטופלו Tעכברים auP301L (ממוצע ± SEM; * p <0.05 Veh-Control לעומת Veh-TauP301L, ** p <0.01 Veh-Control לעומת Veh-TauP301L, # p <0.05 Ril-TauP301L לעומת Veh- TauP301L, ## p <0.01 Ril-TauP301L לעומת Veh-TauP301L; n = 13 - 15 / קבוצה). נתון זה נדפס באישור John Wiley and Sons 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

0.05 M PBS 2 L מי DI:
חנות בכוס זכוכית עטופה ברדיד אלומיניום. תביאו את pH 7.4 עם KOH במידת הצורך. לאא 2 PO 4 · H 2 O: 2.8 גרם Na 2 HPO 4: כלוריד נתרן 11.34 גרם: 11.68 גרם
20 מ"מ חומצה אסקורבית 50 מ"ל מים DI:
הפוך טרי מדי יום. חומצת אסקורבית: 0.18 גרם
20 מ"מ L- גלוטמט 50 מ"ל מים DI:
הפוך שבועי טרי. מימה מלח מונוסודיום גלוטמט L-: 0.15 גרם
2 מ"מ דופמין הידרוכלוריד דופמין: 0.038 גרם
הפוך חודשי טרי. 0.1 M perchloric חומצה: 10 מ"ל תביאו נפח 100 מ"ל עם מים DI
8.8 מי חמצן מ"מ 50 מ"ל מים DI:
הפוך שבועי טרי. מי חמצן: 500 μL
70 אשלגן כלורי מ"מ 100 מ"ל מים DI:
הפכת את היום טרי של ניסוי. אשלגן כלורי: נתרן כלורי 0.08 גרם: כלוריד סידן 0.07 גרם: 0.004 גרם
200 μ; M גלוטמט 20 גלוטמט מ"מ: 100 μL
הפכת את היום טרי של ניסוי. מלח סטרילית: 10 מ"ל

טבלה 1: פתרונות כיול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכניקת MEA מאפשרת מדידה של קינטיקה המהירה של שחרור הנוירוטרנסמיטר ספיג במבחנה ובחי. לפיכך, הטכנולוגיה מייצרת מגוון רחב של פלט נתונים כולל רמות הנוירוטרנסמיטר טוניק, שחרור הנוירוטרנסמיטר עורר, וסילוק הנוירוטרנסמיטר. עם זאת, בגלל השימוש MEAs היא הליך מורכב יחסית, ישנם גורמים רבים שעלולים צריך להיות מותאם לשימוש מוצלח. לדוגמה, במהלך הכיול, אפשר לציין כי אין גל אות (מסך אוסצילוסקופ) או כי התגובות לגירויים הן מינימליות, או נעדר. ככל הנראה עקב תקלה במערכת, הפעלה מחדש של מערכת ההקלטה, או מחשב, עשוי לפתור את הבעיה. בנוסף, הבעיה יכולה להיות שגיאת חיבור. לפני הכיול, זה רלוונטי שיוודא את חיבורי אלקטרודה MEA ועיון מחוברים כראוי. התחליף של שקע DIP על headstage עשוי לפתור בעיות בחיבור MEA.אם MEA אינו לגמרי בתמיסה או אלקטרודה התייחסות במצב תחזוקתי רעוע משמש, אלה עשויים גם להפריע הקלטה במהלך הכיול. אות תגובות האטה במהלך הכיול היא בעיה נפוצה נוספת, אשר עשוי לנבוע עבה יותר תערובת BSA / glutaraldehyde צורך, או בר ומערבב בתנועות סיבוביות. במקרה interferents נותן אות במהלך הכיול, יתכן כי חלה טעות אלקטרוליטי (למשל לא electroplate מספיק זמן) שכבת הדרה MPD. במקרה כזה, לחזור על הליך אלקטרוליטי הוא הכרחי.

במהלך ניתוח, רמת הרדמה אחד עלולה שלא להספיק עבור כל העכברים; עכברים מסוימים עשויים לדרוש רמות גבוהות יותר של הרדמה "ללכת תחת" וכמה עכברים עשויים לדרוש פחות. זה חיוני כדי להתחיל ברמה נמוכה של הרדמה לאט להעלות אותו עד העכבר נמצא תחת הרדמה קלה. הרדמה עמוקה עשויה להיבדק פעם העכבר נמצא המכשיר stereotaxic ידיזנב או קמצוץ בוהן. בעת בחירת קואורדינטות עבור להשתיל את MEA, חשוב גם לציין ונכון עבור אטרופיה מוחית אפשרית שיכול להתרחש במודלים של בעלי חיים ניווניות רבים 36, 37, 38. בנוסף, קיים הכרח במהלך הניתוח כי דם אינו לצבור על MEA, כמו זה יכול להשפיע על מאפייני ההקלטה של ​​MEA ולגרום ברזולוציה זמנית איטית או אות תגובות ממוזערות באופן משמעותי. אם קרישי דם סביב האלקטרודה, פשוט להסיר את MEA ולשטוף עם מי מלח.

במהלך הקלטה, אחת הבעיות הנפוצות ביותר שיכול להתרחש הוא של אות רועשת. הפרעות מהתקנים אלקטרוניים אחרים, כגון תאורת עזר, מכשירים נוספים, ואימונים הם האשמים הסבירים בעיקר, ולכן עדיף להימנע לחבר אותם לאותו מעגל חשמלי ו / או שקע כמערכת ההקלטה. בנוסף, אם sys ההקלטה TEM אינו מעוגן כראוי, אחד יהיה לצפות תנודות על הסקופ של מערכת הקלטה, כמו גם רעש הנובע כל האתרים, ולא רק באתרי ההקלטה. מחצלת הארקת המליצה תחת מערכת ההקלטה חייבת להיות מחוברת לצינור מוארק כדי למנוע בעיות אלה. אם ייקבע כי כל אלה הם שגיאה, שגיאה עלולה לשקר עם אלקטרודה התייחסות, או MEA עצמה. כאשר נתקל בבעיות רעש, באמצעות MEA חדש, בשימוש כדי לאמת את הפעולה של המערכת יכולה להיות גישה לפתרון בעיות שימושית. אם ניתוק או החלפת תוצאות אלקטרודה התייחסות מועטה ללא שינוי, האלקטרודה הפניה או תאים חצי ייתכן וחלה תקלה. שינוי האלקטרודה ההתייחסות עשויה להיות הדרך היחידה לפתור את הבעיה. לאחר סיום הצריבה, יתרון הסופי של MEA הוא היכולת לנקות ולעשות בהם שימוש חוזר. MEAs ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כשלוש פעמים כל עוד MEA ממשיכה לתפקד כהלכה במהלך הכיול.

ss = "jove_content"> לסיכום, למרות בעיות עשויות להידרש מדי פעם, השימוש בטכניקה MEA הוא יתרון לבחינת שחרור ופינוי הנוירוטרנסמיטר מהר בתוך תת אזורים הרצוי של המוח. המחקרים הנוכחיים התמקדו השימוש בטכנולוגית MEA בעכברי TauP301L מורדמים לנצל את המתודולוגיה MEA לבחינת שחרור גלוטמט ו לספיגה תת אזורים של המסלול trisynaptic בהיפוקמפוס. מחקרים עתידיים יעסקו בנושאי טוניק ו phasic נוספים בעכברים ערים, כמו זו הייתה מאוד מועילה לקישור אירועים התנהגותיים לצעדים הדינמיים של טוניק ו גלוטמט פאזית בחולדות ערות ולאחרונה, פרימטים לא אנושיים ערים. בעוד הטכנולוגיה הזו פותח עבור מחקרים מדעיים בסיסיים, העתיד טומן בחובו הבטחה ליישום טכנולוגית ההקלטה למחקר קליני וניטור הנוירוכימיים תוך ניתוחי לטיפול והערכה של הפרעות מוחיות כגון מחלת פרקינסוןאפילפסיה nd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

GG הוא הבעלים הבלעדי של Quanteon, LLC שעושה מערכת הקלטה FAST-16 המשמש למדידות גלוטמט במחקר זה. JEQ הוא יועץ שילם עבור Quanteon.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), איגוד האלצהיימר (MNR; NIRG-12-242,187), גרנט הסנאט סגל מחקר WVU (MNR), ו WVU PSCOR גרנט (MNR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FAST-16mkIII-8 channel Quanteon 16mkIII
Microelectrode arrays CenMet W4 or 8-TRK
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A-3059 10 g (expires after 1 month)
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G-6257 100 mL (expires after 6 months)
Glutamate Oxidase US Biological or Sigma Aldrich G4001-01 or 100646 50 UI (expires after 6 months)
Hamilton Syringes Hamilton #80383 2 syringes
Methanol BDH UN1230 4 L
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) ACROS Organics 1330560250 25 g
Reference Electrodes (RE-5B) BAS MF-2079 3 electrodes
Battery-powered Magnetic stir plate Cole-parmer EW-04804-01 Can purchase from different supplier
Glutamate Sigma-Aldrich G-1626 100 g
Ascorbic Acid TCI 50-81-7 500 g
Dopamine Hydrochloride Alfa Aesar 62-31-7 5 g
Perchloric acid VWR UN2920 500 mL
Postassium chloride VWR 7447-40-7 1 kg
Sodium chloride VWR 7647-40-7 1 kg
Calcium Chloride MP 153502 100 g
Sodium Hydroxide BDH 1310732 500 g
Glass pressure ejection pipettes CenMet
Sticky wax Kerrlab 625 Can purchase from different supplier
Microsyringe World Precision Instruments MF28G-5
Modeling clay WalMart Can purchase from different supplier
Picospritzer III Parker
Silver wire AM systems #786500
Hydrochloric acid BDH 7647010 2.5 L
Platinum wire AM Systems 778000
Solder gun Lowes or Home Depot Can purchase from different supplier
Multimeter WalMart Can purchase from different supplier
PhysioSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
SomnoSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
Stereotaxic device Stoelting Can purchase from different supplier
Digital Lab Standard Stoelting Can purchase from different supplier
Meiji EMZ microscope Meiji EMZ-5
Drill Dremel Micro
Metricide Metrex 102800
Scalpel VWR Can purchase from different supplier
Surgery scissors VWR Can purchase from different supplier
Sterile cotton swabs Puritan 25806 Can purchase from different supplier
Eye ointment Puralube Vet Ointment Obtain from the vet
Iodine swabs VWR S48050 Can purchase from different supplier
Alcohol swabs Local drug store Can purchase from different supplier
Sterile surgery drape Dynarex 4410 Can purchase from different supplier
Sterile saline Teknova S5815 Can make own soltuion using filters
Hydrogen Peroxide (3%) Local drug store Can purchase from different supplier
Heating Pad WalMart Can purchase from different supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
  3. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
  4. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  5. Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
  6. He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
  7. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
  8. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  9. Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
  10. Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
  11. Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
  12. Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
  13. Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
  14. Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
  15. Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
  16. Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
  17. Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
  18. Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
  19. Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
  20. Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
  21. Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
  22. Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
  23. Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
  24. Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
  25. Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
  26. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
  27. Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
  28. Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
  29. Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
  30. Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
  31. Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
  32. Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
  33. Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
  34. Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
  35. Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  36. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
  37. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  38. Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).

Tags

Neuroscience גיליון 123, מערכי microelectrode חיישנים ביולוגיים מחלת אלצהיימר גלוטמט ההיפוקמפוס נוירוטרנסמיטורים טאו rTg4510
באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hunsberger, H. C., Setti, S. E.,… More

Hunsberger, H. C., Setti, S. E., Heslin, R. T., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models. J. Vis. Exp. (123), e55418, doi:10.3791/55418 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter