Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro
Summary
Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.
Abstract
La microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM), in combinazione con i protocolli chimici di compensazione, è diventata la norma d'oro per l'analisi di strutture a marchio fluorescente in grandi campioni biologici e si riduce alla risoluzione cellulare. Nel frattempo, la costante raffinazione dei protocolli sottostanti e la maggiore disponibilità di sistemi commerciali specializzati ci permettono di indagare sulla microstruttura di interi organi del mouse e permetterebbe anche la caratterizzazione del comportamento cellulare in vari approcci di immagini a cellule vive. Qui descriviamo un protocollo per la visualizzazione spaziale spaziale e la quantificazione della popolazione leucocitaria CD45 + nei cuori infiammati del topo. Il metodo utilizza un ceppo di topi transgenici (CD11c.DTR) che è stato recentemente dimostrato di essere un modello robusto e indicibile per lo studio dello sviluppo di miocardite fatale fulminante caratterizzato da aritmie cardiache letali. Questo protocollo comprende l'induzione del miocardite, intravitColorazione delle cellule mediate dall'anticorpo, preparazione dell'organo e LSFM con successiva elaborazione post-elaborazione di immagini assistite da computer. Anche se presentato come metodo altamente adattato per la nostra particolare questione scientifica, il protocollo rappresenta il progetto di un sistema facilmente regolabile che può anche orientare completamente differenti strutture fluorescenti in altri organi e anche in altre specie.
Introduction
Durante l'evoluzione della microscopia leggera, sono apparse molte forme specializzate, tutte sviluppate per minimizzare le limitazioni nel processo di visualizzazione di particolari campioni. Uno di questi è la microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM). In primo luogo sviluppato nel 1903 da Siedentopf e Zsigmondy 1 e trovando le prime applicazioni biologiche fondamentali nei primi anni 1990 2 , LSFM è divenuto lo strumento microscopico più potente fino ad oggi per la visualizzazione di grandi esemplari, come gli organi del topo intasati, con una risoluzione del segnale di fluorescenza Fino al livello cellulare. A causa di questi vantaggi, in combinazione con il suo potenziale per l'imaging a cellule vive, i metodi di natura denominati LSFM sono "il metodo dell'anno 2014 3 ".
Come suggerisce il nome, l'illuminazione del campione in un LSFM è condotta da fogli leggeri, orientati perpendicolarmente all'asse dell'obiettivo utilizzatoO la raccolta di emissioni e la formazione di immagini successive. Il foglio leggero viene generalmente generato sia concentrandosi su ampie fasce laser collimate con una lente cilindrica o con il rapido movimento laterale di fasci laser concentrati e concentrati in un solo piano orizzontale o verticale 4 , 5 . In questo modo, solo il piano focale delle ottiche di imaging viene illuminato, tipicamente con uno spessore di 1-4 μm. Di conseguenza, per un campione fluorescente posizionato nel piano di illuminazione, sia la generazione di luce sparsa che gli effetti della fotolibrazione dalle regioni superiori o inferiori al piano focale vengono eliminati o soppressi in modo significativo 6 , 7 . Poiché tutti i piani fuori fuoco non sono illuminati, in questi settori vengono omessi effetti di fotocolorazione. In contrasto con la microscopia standard confocale o multi-fotonica, i percorsi della luce illuminata e emessa sono separati l'uno dall'altro, quindi l'immagine finale di qual La funzione non dipende dalla messa a fuoco perfetta del fascio luminoso di eccitazione attraverso gli obiettivi. A seconda della questione sottostante, è quindi possibile utilizzare obiettivi con un campo di visibilità enorme (FOV) in modo che la più grande area possibile del piano illuminato possa essere ripresa senza che parte dei componenti si muovano nella direzione xy.
Nei moderni sistemi LSFM, un'immagine fluorescente della sezione ottica generata viene catturata su un dispositivo di accoppiamento altamente sensibile (CCD) o da telecamere a semiconduttore metallico-ossidi metallici (CMOS) complementari che sono in grado di acquisire l'intero campo di visualizzazione (FOV) In microsecondi. Pertanto, spostando il campione attraverso il foglio di luce e acquisendo immagini a z-step definite, è possibile ottenere le informazioni 3D complete di un esemplare in una ragionevole quantità di tempo 8 , 9 , rendendo questa tecnica applicabile a cellule vive Studi 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Tuttavia, anche se LSFM offre un metodo rapido, sensibile e fluorescente, la trasmissione della luce attraverso il campione è ancora un problema importante, specialmente quando i grandi campioni biologici sono l'obiettivo di un'analisi 3D. La trasmissione della luce è criticamente modificata dagli aspetti fisici dell'assorbimento e dalla dispersione della luce nelle interfacce di strutture con differenti indici di rifrazione 13 . Pertanto, quando si esegue l'esame di campioni diversi millimetri di dimensioni, LSFM è per lo più combinato con protocolli di compensazione per rendere i campioni otticamente trasparenti. Queste tecniche si basano sull'idea di rimuovere l'acqua dal rispettivo tessuto biologico e scambiandola con mezzi di immersione a base di solventi a base di acqua o (organica), scelti per adattarsi strettamente agli indici di rifrazione dei particolari componenti del tessuto bersaglio. Di conseguenza, la dispersione della luce laterale viene minimizzata e tutte le lunghezze d'ondaDella luce può passare molto più efficacemente attraverso il tessuto 13 . In molti casi, i campioni biologici trattati in questo modo appaiono macroscopicamente cristallini, che consentono di condurre LSFM, anche su interi organi del mouse, utilizzando lunghi obiettivi di ingrandimento a distanza di lavoro e di basso livello.
Qui presentiamo un protocollo di preparazione per l'imaging di grandi dimensioni in un microscopio a foglio leggero (vedi tabella dei materiali), che abbiamo stabilito per indagare l'infiltrato cardiaco cellulare in un modello murino di miocardite 15 . I topi CD11c.DTR esprimono il recettore della tossina della difterite primata (DTR) sotto il controllo del promotore CD11c 16 . Di conseguenza, le cellule in questi topi, che esprimono CD11c insieme al DTR, sono rese sensibili all'esotossina della difterite di Corynebacterium (tossina della difterite, DTX); Il trattamento sistemico di questi animali con DTX comporta un esaurimento di tutti i CD11c + ceLLS. CD11c è un integrin e, come ricettore di superficie cellulare per una varietà di diversi fattori solubili, è coinvolto nei processi di attivazione e di maturazione principalmente nelle cellule del linfociti monocitico 17 . Di conseguenza, il modello del mouse del CD11c.DTR è stato intensamente utilizzato per studiare il ruolo delle cellule dendritiche e dei sottosettori di macrofagi nel contesto di molte domande immunologiche diverse. Nel tempo, è stato riportato che i topi CD11c.DTR trattati sistematicamente con DTX possono sviluppare effetti collaterali avversi e possono mostrare elevati tassi di mortalità 18 , 19 . Recentemente siamo stati in grado di identificare la causa di morte 15 che descrive lo sviluppo della miocardite fulminante dopo l'applicazione intratracheale di DTX in questi animali. La sfida della tossina ha causato la distruzione cellulare, anche nelle parti centrali del sistema di trasmissione dello stimolo nel cuore. Questo è stato accompagnato da un massiccio CD45+ Leucociti infiltrano, portando finalmente ad aritmie cardiache letali. In questo caso, non solo era importante l'aspetto della popolazione leucocitaria, ma anche la sua distribuzione spaziale all'interno del cuore. Questa domanda sperimentale è una sfida per la moderna imaging microscopica, che abbiamo risolto con un approccio microscopico a fogliame leggero, supportato da una colorazione anticorpale intravitale e da un protocollo di depurazione ottica a base solvente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nella scienza della vita moderna, la visualizzazione microscopica dei processi biologici svolge un ruolo sempre più importante. In questo contesto, negli ultimi due secoli sono stati raggiunti molti sviluppi che aiutano a rispondere a domande indesiderabili fino a questo punto,. In primo luogo, c'è stata una chiara tendenza ad aumentare fondamentalmente la capacità di risoluzione dei microscopi leggeri. Con microscopia strutturata microscopia (SIM) 21 , 22</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca nel laboratorio di Gunzer è stata sostenuta dal Ministero federale tedesco per l'istruzione e la ricerca (sovvenzione n. 0315590 AD) e dalla Fondazione tedesca di ricerca (donazione GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Ringraziamo inoltre l'IMCES per il supporto tecnico e Sebastian Kubat per l'aiuto con la modellazione 3D dei cartoni animati.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
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