Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

doi: 10.3791/55450 Published: May 31, 2017

Summary

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Abstract

Kimyasal temizleme protokolleri ile birlikte, ışık saçlı floresans mikroskobu (LSFM), büyük biyolojik örneklerde flüoresan etiketli yapıların analizi için altın standart haline geldi ve hücresel çözünürlüğe indirgendi. Bu arada, temel protokollerin sürekli arıtılması ve uzmanlaşmış ticari sistemlerin artan kullanılabilirliği, tüm fare organlarının mikroyapısını araştırmamızı ve hatta çeşitli canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında hücresel davranışın karakterizasyonuna izin vermemizi sağlıyor. Burada, iltihaplı fare kalplerindeki CD45 + lökosit popülasyonunun mekansal tüm montaj görüntüsü ve miktarının belirlenmesi için bir protokolü açıklıyoruz. Yöntem ölümcül kardiyak aritmilerle karakterize fulminan ölümcül miyokardit gelişimi için son zamanlarda sağlam ve endüklenebilir bir model olarak hizmet ettiği gösterilmiş bir transgenik fare soyunu (CD11c.DTR) kullanmaktadır. Bu protokol miyokardit indüksiyonu, intravitAl antikor aracılı hücre boyaması, organ hazırlığı ve LSFM'den sonra bilgisayar destekli görüntü sonrası işleme tabi tutulur. Belirli bilimsel sorunuz için oldukça uyarlanmış bir yöntem olarak sunulmasına rağmen, protokol, diğer organlarda ve hatta diğer türlerde bile tamamen farklı florasan yapıları hedefleyebilen kolayca ayarlanabilen bir sistemin planını temsil etmektedir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Işık mikroskopisinin gelişimi sırasında, birçoğu özel formlar ortaya çıktı, bunların hepsi belirli örnekler için görselleştirme sürecindeki sınırlamaları en aza indirmek için geliştirildi. Böyle bir yöntem, ışık saçlı floresan mikroskobu (LSFM) 'dir. İlk olarak 1903'te Siedentopf ve Zsigmondy 1 tarafından geliştirilmiş ve 1990'ların başında ilk temel biyolojik uygulamaları bulan 2 , LSFM, flüoresan sinyal çözünürlüğü ile bozulmamış fare organları gibi büyük örneklerin görselleştirilmesi için şimdiye kadarki en güçlü mikroskopik araç haline gelmiştir Hücresel seviyeye iner. Bu avantajlardan dolayı, canlı hücre görüntüleme potansiyeli ile birlikte Nature Methods LSFM "Yılın Metodu 2014 3 " olarak adlandırılmıştır.

Adından da anlaşılacağı üzere, bir LSFM'deki örnek aydınlatma, kullanılan objektifin eksenine dikey olarak yönlendirilmiş ışık saçak levhaları tarafından yürütülür.Veya emisyon ışık toplama ve müteakip görüntü oluşumu. Işık tabakası genellikle silikon lensli geniş, kollektrik lazer ışınlarına odaklanarak veya dar, odaklanmış lazer ışınlarının hızlı yatay hareketiyle sadece bir yatay veya dikey düzlem 4 , 5'de oluşturulur. Böylece görüntüleme optiklerinin sadece odak düzlemi, tipik olarak 1-4 μm kalınlıkta aydınlatılır. Sonuç olarak, aydınlatma düzlemine yerleştirilen bir flüoresan numune için hem dağınık ışık üretimi hem de odak düzleminin üstündeki veya altındaki bölgelerden gelen foto-ağartma etkileri elimine edilir veya büyük ölçüde bastırılır 6 , 7 . Odak dışına çıkan tüm düzlemler aydınlatılamadığından, bu alanlarda fotoblokaj efektleri ihmal edilir. Standart konfokal veya çoklu foton mikroskopisinin aksine, aydınlatılmış ve yayılan ışık yolları birbirinden ayrıdır, bu nedenle son görüntü niteliği Uyarı ışık ışınının hedefler boyunca mükemmel şekilde odaklanmasına bağlı değildir. Bu nedenle, altta yatan soruya bağlı olarak, aydınlatılmış düzlemin mümkün olan en geniş alanı, xy yönünde hareket eden herhangi bir bileşen parçası olmadan görüntülenecek şekilde muazzam bir görüş alanına sahip hedefleri (FOV) kullanmak mümkündür.

Modern LSFM sistemlerinde, üretilen optik bölümün flüoresan görüntüsü, tüm görüş alanını (FOV) elde edebilen oldukça hassas bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) veya tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kameralar üzerinde yakalanır. Mikrosaniye cinsinden. Bu nedenle, numuneyi ışık tabakası boyunca hareket ettirerek ve tanımlanmış z adımlarında görüntü elde ederek, bu tekniği canlı hücre için geçerli hale getiren makul bir süre 8 , 9 olan bir numunenin tam 3D bilgisini elde etmek mümkündür Çalışmalar 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .

Bununla birlikte, LSFM hızlı, hassas ve fluoresan dostu bir yöntem sunsa da, özellikle büyük biyolojik numuneler bir 3B analizi için hedef olduğunda, örnek üzerinden ışık iletimi hala önemli bir konudur. Işık iletimi, emilimin fiziksel yönleri ve farklı kırılma indeksleri olan yapıların ara yüzlerindeki ışık saçılımıyla eleştirel olarak modifiye edilmiştir 13 . Bu nedenle, görüntüleme örnekleri birkaç milimetre boyutunda olduğunda LSFM, çoğunlukla örnekleri optik olarak şeffaf hale getirmek için temizleme protokolleriyle birleştirilir. Bu teknikler, suyun ilgili biyolojik dokudan çıkarılması ve belirli hedef doku bileşenlerinin kırılma indekslerine dar bir şekilde uyacak şekilde seçilen su veya organik solvent bazlı daldırma ortamlarıyla değiştirilmesi fikrine dayanmaktadır. Sonuç olarak, yanal ışık saçılımı en aza indirilir ve tüm dalga boylarıIşığın dokudan daha etkin bir şekilde geçebileceğini 13 . Birçok durumda, bu şekilde tedavi edilen biyolojik örnekler makroskopik açıdan berrak görünür ve LSFM'nin tüm fare organlarında bile uzun çalışma mesafesi, düşük büyütme hedefleri kullanılarak gerçekleştirilmesini sağlar.

Burada, miyokardit 15'teki bir fare modelinde hücresel kardiyak infiltratı araştırmak için kurduğumuz ışık saçlı mikroskopta (materyal tablosuna bakınız) geniş örneklem görüntüleme için bir hazırlama protokolü sunulmaktadır. CD11c.DTR fareleri primat difteri toksin reseptörünü (DTR) CD11c promotor 16 kontrolü altında ifade eder. Sonuç olarak, DTR ile birlikte CD11c'yi eksprese eden bu farelerdeki hücreler, Corynebacterium difteri (difteri toksini, DTX) ekzotoksinine duyarlı hale getirilir; Bu hayvanların DTX ile sistemik olarak muamele edilmesi, tüm CD11c + ce'nin tükenmesine yol açarrf. CD11c, bir integrindir ve çeşitli farklı çözünür faktörler için bir hücre yüzeyi reseptörü olarak, esasen monositik soy 17 hücrelerinde aktivasyon ve olgunlaşma süreçlerinde yer alır. Sonuç olarak CD11c.DTR fare modeli, birçok farklı immünolojik soru bağlamında dendritik hücrelerin ve makrofaj alt kümelerinin rolünü incelemek için yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Zamanla, sistemik olarak DTX ile tedavi edilen CD11c.DTR farelerinin yan etkiler geliştirebileceği ve yüksek mortalite oranlarını 18 , 19 görüntüleyebildiği bildirildi. Son zamanlarda, bu hayvanlarda intratrakeal DTX uygulaması sonrasında fulminan miyokardit gelişimini tanımlayan temel ölüm nedenini tanımladık. Toksin uyarısı, kalpteki uyarıcı iletim sisteminin merkez kısımları da dahil olmak üzere hücresel yıkıma neden oldu. Buna büyük CD45 eşlik ediyordu+ Lökosit infiltratı, sonuç olarak öldürücü kardiyak aritmilere yol açar. Bu durumda, sadece lökosit popülasyonunun ortaya çıkışı değil, kalpteki mekansal dağılımı da önemli idi. Bu deneysel soru, intravital antikor boyama ve organik solvent bazlı optik temizleme protokolü tarafından desteklenen bir ışık levha mikroskopik yaklaşımla çözülen modern mikroskobik görüntüleme için bir sorundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan deneyleri, AB yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Essen'deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Almanya). Hayvanlar spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında kullanıldı ve muhafaza edildi.

1. Difteri Tehlikesi (DTX) ile Miyokardit İndüksiyonu

  1. DTX stok solüsyonunu 1 μg / mL çalışma solüsyonuna fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyrelterek miyokardın indüksiyonu için DTX solüsyonunu hazırlayın.
  2. Hasenberg ve diğerleri tarafından gösterildiği gibi, bu solüsyondan 100 μL, 8 ila 10 haftalık CD11c.DTR farelerine ( yaklaşık 5 ng / g vücut ağırlığı (bw)) intratrakeal (it) uygulayın . Bir fungal spor süspansiyonunun uygulanması için 20 .
    NOT: Toksin intraperitoneal olarak uygulanması, benzer bir indüksiyon ile sonuçlanabilirÖlümcül miyokardit. Bununla birlikte, bu yaklaşım ilk onaylanmalıdır.
    1. Bunun için hayvanlara 100 mg / kg bw ketamine ve 10 mg / kg bw xylazine'in intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi uygulanır.
    2. Derin narkoza (toe pinch test) ulaştıktan sonra, ağız boşluğundan 22 G'lik bir ven kateteri kullanarak hayvanları entübe edin. Hayvanları, küçük bir hayvan solunum cihazı ile dakikada 250 solunum ile ve nefes başına 250 μL solunum hacmi havalandırarak, aynı zamanda Hasenberg ve diğerleri tarafından gösterilen lens tüpünün doğru konumlandırılmasını kontrol edin . ark. 20 .
      NOT: Doğru yerleştirildiğinde, hayvanların nefes oranı uygulanan havalandırma ayarlarına göre değişir.
    3. Havalandırma sisteminin bağlantısını kesin ve kateterle akciğere kontrol olarak 100 μL DTX solüsyonu veya eşit miktarda PBS yerleştirin ve hayvanları 1 dakika daha havalandırmaya devam edin.
  3. Hayvanların anesteziden kurtulmasına ve genel sağlık durumunu ve vücut ağırlığını 4 gün boyunca izlemesine izin verin.
    NOT: Genetik zemine, fare suşuna veya başlangıç ​​ağırlığına bağlı olarak, miyokarditin şiddeti ve başlangıcı değişebilir ve önce belirlenmelidir.

2. Light-sheet Microscopy için Örnek Hazırlama

  1. Toksin uygulamasından 4 gün sonra, bir indüksiyon hücresini buharlaşmış% 2 izofluran / oksijen karışımı ile yıkayarak farelere anestezi uygulayın. Retro-yörünge uygulama yolunu kullanarak, intravenöz (iv) 50 ul PBS içerisinde 15 ug doğrudan etiketli bir anti-CD45 antikoru (klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) enjekte ederek, Doğru miktarda antikor.
    NOT: İstenen narkoz derinliğine, fareler yatıkken ve parmak ucu testine tepki vermediğinde ulaşılmıştır.
  2. Kuluçka 2 saat sonra, servikal çıkığı veKalpleri, 5 mL PBS / EDTA (5 mM) ile yerinde perfüze edin.
    1. Kalbi ortaya çıkarın ve perfüzyon solüsyonunu 21 G'lik bir kateter kullanarak sağ ventriküle enjekte edin. Yavaþ ve sabit bir basınçla besleyin ve aortayı kesip açtıktan sonra kanın boşaltılabileceğinden emin olun.
      NOT: Bu transkardiyal perfüzyon, organın nihai 3B görselleştirilmesini bozabilecek küçük hazırlık eserleriyle sonuçlanabilir. Bu nedenle, gelişmiş hayvan deneycileri, inferior vena kava yoluyla perfüzyon uygulayarak abdominal aortu çıkarabilir.
  3. Kimyasal fiksasyon için, 5 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile kalbe aynı boşluk boyunca kalp boşaltın. Kateteri yerinde tutun ve basitçe PFA ile doldurulmuş yeni bir şırınga takın. Yavaş ve sabit basınçlı bir gaz.
    NOT: Paraformaldehit oldukça toksiktir; Cilt, gözler ve diğer mukoza ile temasından kaçının.
    1. Tırtıklı forseps ile kalbi hafifçe kavrayın; puBiraz yükselterim; Ve gelen ve giden arterler ve damarlar da dahil olmak üzere tüm doku bağlantılarını keser. Daha fazla fiksasyon için organı% 4'lük bir PFA'da 4 saat daha saklayın.
  4. Organı kurutmak için kalbi, karanlıkta 4 ° C'de 12 saat süreyle% 50,% 70 ve iki kez artan etanol serisinde inkübe edin. Burada, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaş dönme hızıyla bir tüp rotatöründe sürekli dönmelerine izin veren siyah 5 mL polipropilen reaksiyon tüplerini kullanın.
  5. Kimyasal temizleme ile komple numune hazırlama. Kalpler şeffaf hale getirmek için, gece boyunca sürekli dönerken% 98 dibenzil eter (DBE) içinde inkübe edin.
    NOT: DBE gözleri, deriyi ve solunum sistemini tahriş eder.

3. Açık levha mikroskopisi

  1. LSFM'yi ışık saçlı mikroskop kullanarak uygulayın (materyal tablosuna bakın). Numuneyi, DBE dolu cu'ya mikroskopun standart numune tutucusuna yerleştirinVette, 30 mm x 30 mm x 15 mm'ye kadar olan numuneler için uygundur.
  2. Kurutulmuş ve temizlenmiş agaroz blokları kullanarak görüntü yakalama işlemi sırasında numuneyi yerine sıkıca tutun.
    1. Agaroz blokları hazırlamak için% 2 eritilmiş agaroz bir kalıba (15 mm x 15 mm x 5 mm) döküldü. Agaroz sertleşene kadar soğumasını bekleyin.
    2. Artan bir etanol serisinde kurutun (% 50,% 70 ve iki kez% 100). Agaroz blokları gece boyunca% 98 DBE'de inkübe edin. Agaroz, kullanılıncaya kadar DBE'de saklayın.
      NOT: Agaroz ağırlıklı olarak sudan oluştuğundan bloğun büyüklüğüne bağlı olarak her dehidrasyon aşamasındaki inkübasyon süreleri uzatılabilir.
      NOT: DBE gözleri, deriyi ve solunum sistemini tahriş eder.
    3. Gerektiğinde, keskin bir neşter kullanarak hazırlanan agaroz bloğu istenilen şekle getirin. Tipik olarak, numune adaptörünün kenarlarına yerleştirilecek prizma veya kama şeklindeki formları kesin.
      NOT: Agaroz bloklar elastik olduğu için,Küçük kuvvetle itildiğinde numune yerinde kalır.
  3. İlgili uyarılma ve emisyon filtresi ayarları ile ilgilenilen floresans sinyallerini (burada, otofloresans ve anti-CD45 antikor boyaması) tespit edin.
    1. Bağ dokusundan elde edilen otofloresans sinyalinin saptanması için, 488 nm'lik uyarım dalga boyunda (OPSL: 50 mW) 525/50 nm band geçiş filtresi kullanın; AF647 ile bağlanmış bir antikor ile CD45 boyaması 668 nm'de (bant geçiren filtre: 680/30 nm) ve 647 nm'lik bir uyarılma dalga boyunda (diyot lazeri: 50 mW) tespit edilmiştir.
    2. İki ayrı z-düzlemi arasındaki mesafe olarak 4 μm'yu seçin.

4. Görüntü Post-processing

NOT: Elde edilen dijital görüntü verileri, bilimsel bir 3B / 4D görüntü işleme ve analiz yazılımı ile daha da işlenmiştir (materyal tablosuna bakınız).

  1. Veri dosyalarının açılması ve ön ayarlanması.
  2. Analiz yazılımını başlattıktan sonra, sol üst köşedeki "Aşmak" düğmesini seçin. Görüntü yığınlarını açmak için "Dosya", "Aç" ı seçin ve ilk edinilen kanaldaki verileri içeren bir klasörü seçin. Edinilen diğer kanalları eklemek için "Düzenle" ve "Kanal Ekle" yi seçin.
    NOT: Veri boyutuna ve bilgisayar sistemine bağlı olarak, bu işlem birkaç dakika alabilir. Sunulan protokol, 2 alım kanalı için tüm aşamaları (otofloresans ve AF647) göstermektedir.
  3. "Düzenle" yi tıklayıp "Görüntü Özellikleri" ni seçerek x, y ve z voksel boyutlarını düzeltin. Yeni pencere açıldığında, parametreleri ayarlayın.
    NOT: Bu adım, kullanılan mikroskop sistemi ve belirli veri formatına bağlıdır. Doğru xyz değerleri daha sonraki boyut ve uzak ölçümler için kritik önem taşır. Çoğu durumda, bu parametreler mikrograf dosyalarında meta veri olarak saklanır. Ancak, eğer dosyaRmat, analiz yazılımı tarafından doğru şekilde yorumlanamaz, piksel boyutunu manuel olarak girmek önemlidir. X ve y boyutlarındaki piksel boyutu kamera piksel boyutuna, potansiyel olarak uygulanan bölme ve objektif ve nesnel büyütmeye bağlıdır. Z'deki piksel boyutu kendi kendini tanımlayan z adım boyutuna eşittir ( örn. 4 μm).
  • Kanal ayarlamaları
    1. Önce "Görüntü ayarı" nı ("Düzenle" ve "Ekran Ayarı Göster") açarak otofloresans sinyalini gri ölçeğe çevirin. Açılan tüm kanalları ve hepsinin ekran ayarlarını yeni bir pencere listeler; Varsayılan rengini değiştirmek için, otofluoresan kanalı seçin ve "beyaz" görüntü stilini seçin. Başlamak için "tamam" ı tıklayın.
    2. Siyah seviye ayarı için, "Görüntü ayarı" na dönün ve örnek düzeyi temsil etmeyen istenmeyen arka plan sinyallerini hariç tutmak için siyah seviye değerini ayarlayıns.
      1. Bunu yapmak için, kanal çubuğundaki sol üst üçgeni kullanın ve soldan sağa sürükleyin.
        NOT: Değişikliklerin hemen görselleştirilmesi sağlanacaktır. Sadece örnekten türetilmemiş sinyalleri bastırdığınızdan emin olun. Ek hesaplamalar için gürültü sinyalleri gerekebileceğinden zemin-siyah piksellerden kaçınmak için arka plandaki minimum değerler asla "0" olmamalıdır. Tüm siyah seviye değişikliklerinin görüntü elde ettikten sonra gerçekleştirildiğinden emin olun. Aksi takdirde, değerli numune bilgileri kaybolabilir. Siyah seviye ayarlaması sadece temsili amaçlara hizmet eder. Aynı görüntü ayarlarını farklı örneklerde kullanmak için, kanal listesinin altındaki "min" rakamsal alanına kesin değerler girilebilir. Bu, niceliksel analizler için çok yararlıdır.
    3. İlgili kanal yoğunluğunu ayarlamak için sağ üst üçgeni kullanarak veya kanalın altındaki "maksimum" rakamsal alana kesin değerler girerek yoğunluk ayarını yapınBen liste.
    4. Gama değerini artırmak veya azaltmak veya hassas değerleri girmek için kanal çubuğunun ortasındaki alttaki üçgeni sürükleyerek kontrast ayarı yapın.
    5. AF647 kanalını, otofloresans kanalına göre ayarlayın. Bir farklılık olarak, AF647 sinyalinin görselleştirmesini bir ısı haritası renk arama tablosuna ayarlayın. Adım 4.2.1'deki gibi bir yaklaşımla "ateş" kanal modunu seçerek bunu yapın.
      NOT: Genel sinyal yoğunlukları, otofloresan kanala kıyasla önemli ölüde düşük olduğundan, siyah seviyeler genellikle daha düşük değerlere ayarlanır. Otofloresan kanal gelince, bu kanalın parlaklığı genellikle artar.
    6. Doku yapılarını ayrıntılı olarak görselleştirmek için "karışım modu" nu seçin. Aynı parametre değerleriyle bir serideki tüm örnekleri analiz edin.
  • Sanal kırpma
    1. 3D sahne fuarından önce organı sanal olarak kesmek içinRt, oluşturulan 3D nesneye bir kırpma düzlemi uygulayın.
      1. Nesne listesinde "Kırpma Düzlemi" simgesini (makas) tıklayın. Resim görünümünün içinde sarı bir çerçeve ve bir manipülatör (beyaz işmili) görünecektir. İş milini fare ile inceltici uca döndürün, böylece kırpma düzleminin yönünü değiştirin ve istenen kırpma derinliğini seçmek için iş milinin kalın orta bölümünü hareket ettirin.
      2. Nesne listesinin altında ilgili onay kutularının işaretini kaldırarak çerçeve ve manipülatörü gizleyin ve istediğiniz anlık görüntüleri oluşturun.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Sunulan LSFM yaklaşımı, ciddi miyokarditin indüksiyonu üzerine murin kalplerindeki lökosit dağılımını ve miktarını analiz etmektedir. Şekil 1A , miyokardit indüksiyonu için transjenik CD11c.DTR farelerinin ön tedavi protokolünü açıklamaktadır. Bu aşama miyokarda lökositlerin alınması için gerekli tetikleyiciyi temsil eder. Başarılı bir DTX uygulamasından sonra, hayvanlar genel zayıflık, iştahsızlık ve 2-4 gün aralığında kilo kaybı gibi ciddi hastalık semptomları geliştirir. 4 gün sonra lökositler iv ile lekelenir . Dolaşımdan kanı çıkarmak için transkardiyal perfüzyona önce florokrom bağlı anti-CD45 antikorunun uygulanması. Başarılı bir şekilde gerçekleştirilirse, kalp ve diğer organlar beyazımsı renk alır. Ardından organ eksize edilir ve doku suyu artan bir etanol dizisi ve DBE'de nihai bir kuluçka ile DBE ile değiştirilir. Şekil 1B , zaman çizelgesini göstermektedirOrganın önemli ölçüde büzülmesine uğradığı bireysel inkübasyon adımlarının Kimyasal olarak temizlenen organ daha sonra standart mikroskop doku tutacağı üzerinde DBE dolu bir görüntüleme odasına aktarılır. 3D görüntü elde edilmesi sırasında organı dengeye getirmek için, şeffaf agaroz bloklarla sabitlenir. Numunenin ayrıntılı konumlandırılması Şekil 2'de görülmektedir. 2 kanaldan (otofloresans ve anti-CD45) oluşan toplam bir görüntü yığını edinimi yaklaşık 20-30 dakika sürer ve yaklaşık 16 GB'lık bir veri dosyası oluşturur. Son olarak, elde edilen veriler lökosit dağılımının bir ısı haritası görünümünde gösterildiği suni 3D render olarak analiz edilir. Şekil 3'te (üst sıra), DTX ile muamele edilmiş bir hayvanın kalbinin güçlü şekilde iltihaplanmış alanları, kırmızımsı / beyazımsı görünümleri ile algılanabilir. 3D modelin daha ayrıntılı bir çalışması, özellikle atriyovent gibi kardiyak iletim sisteminin bulunduğu bölgelerdeki lökosit konsantrasyonunu ortaya koymaktadır Ricular paketi ve Purkinje lifleri. Buna karşılık, PBS ile tedavi edilen hayvanların kalpleri bu iltihaplanma modelini hiç göstermez (alt sıra).

    Şekil 1
    Şekil 1: Difteri toksin kaynaklı miyokarditin indüksiyon ve numune hazırlama şeması. ( A ) Miyokardit gelişimi bununla indüklendi . Difteri toksini (100 ng / hayvan) uygulaması. 4 gün sonra, miyokardit tamamen gelişim göstermiş ve bir AF647-çift anti-CD45 antikoru (15 ug / hayvan) iv enjekte edilmiştir . CD45 + lökositleri saptamak için. Hayvanlar 2 saat sonra servikal çıkılarak sakrifiye edildi ve kalpler PBS / EDTA (5 mM) ve ardından% 4 PFA ile perfüze edildi. ( B ) Çıkarıldıktan sonra, organ artan bir etanol serisi ile dehidre edildi ve nihayet dibenzil eter içinde gece boyu inkübe edilerek temizlendi..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    şekil 2
    Şekil 2: Mikroskopta Örnek Yerleştirme Şeması. Kimyasal olarak temizlenmiş şeffaf kalp (4) numune tutacağı (2 ve 5) üzerine yerleştirildi ve temizlenmiş agaroz blokların (6) yardımı ile stabilize edildi. Bu yapı daha sonra DBE dolu cam küvete batırılmıştır (3). Alım için 5.5 mm'lik bir çalışma mesafesine sahip 0.5 NA'lik bir objektif mercek (1) kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

    Şekil 3
    Şekil 3: Tam veya Yasal Temsilci 3D İşaretleriHafif yaprak mikroskobu. CD11c.DTR fareleri intratrakeal olarak DTX (üst sıra) veya PBS (alt sıra) ile tedavi edildi. 4 gün sonra, CD45 + lökosit infiltrasyonu ile temsil edilen miyokardit gelişimi, flüoresan ışık saçlı mikroskopi ile görselleştirildi. CD45 + hücrelerini lekelemek için, AF647'ye bağlanmış bir anti-CD45 antikoru, fareleri feda etmeden önce 2 saat enjekte edildi. CD45 + infiltrat, ısı haritası renklerinde (mavi: düşük sinyal, beyaz: yüksek sinyal) gösterilirken, bağ dokusunun otofloresans sinyali gri renkte görüntülenir. Her satır, organın içindeki durumu gösteren 4 adet dijital olarak kırpılmış 3D görüntülerden oluşur. Kalbin ön kısmına göre kırpma derinliği, tek tek görüntülerin üstünde bildirilir. Şekil, Mann ve diğerleri tarafından değiştirildi. 15 . Ölçek çubuğu = 1 mm. Lütfen buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Modern yaşam biliminde, biyolojik süreçlerin mikroskopik olarak görselleştirilmesi gittikçe önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, son iki yüzyılda bu noktaya kadar adreslenemeyen sorulara cevap bulmaya yardımcı olan birçok gelişme sağlandı. Birincisi, ışık mikroskoplarının çözünürlük yeteneğini temelde arttırma eğiliminde olmuştur. Yapısal aydınlatma mikroskopisi (SIM) 21 , 22 , stimulated emission-depletion (STED) mikroskopi 23 ve foto aktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) 24 , 25 veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) 26 ile , bir zamanlar öngörülen çözünürlük sınırlaması nedeniyle Işık kırınımı 27 önemli ölçüde kırılmıştı. Sıklıkla hedeflenen ikinci sıkıntı, benzer bir ortamda hücresel davranışları gözlemlemektiDoğal durumu olabildiğince yakından takip edin. Bu bağlamda in situ veya in vivo görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesi zorunluydu. Kompleks biyolojik dokularda sınırlı ışık penetrasyon derinliğini aşmak için, 2-foton mikroskopi 28 , 29 bu araştırma alanında yeni standartlar belirlemiştir.

    Bununla birlikte, tüm bu mikroskopik teknikler genellikle paylaştığı bir özellik mümkün olan en iyi çözünürlüğü garanti etmek için yüksek NA hedeflerinin kullanılmasıdır. Mikro yapıları daha ayrıntılı olarak çözümlemesine rağmen, yüksek NA hedeflerinin kullanılması, çalışma alanının yanı sıra görüş alanı da önemli ölçüde kısıtlar. Sonuç olarak, çevreleyen çevre açısından biyolojik bağlam, çoğunlukla, sözcüğün gerçek anlamıyla odağın dışına çıkmaktadır. Bu boşluğu kapatmak için, LSFM gelişimi son zamanlarda hücresel boyutta floresan yapıları çözebilen bir mikroskopi tekniği sağlayarak ilgi kazanmıştır.Aynı zamanda 1 cm'den daha büyük boyutlu bir numunenin tüm 3D bilgilerini rahatça değerlendirmektir.

    Burada açıklanan protokol, tüm murin kalplerindeki bir hücresel lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ultra mikroskop nasıl kullanılacağının bir metodunu sunar. Bir CD11c.DTR fare modeli 30'da steril miyokarditin başarıyla indüklenmesinden sonra ilgili hayvan hayvanda 2 saat boyunca dolaşan bir florokrom bağlı anti-CD45 antikorunun bir IV enjeksiyonu alır. Prensipte, ölüm sonrası bir ölüm gerçekleştirmek suretiyle, organ fiksasyonu ve numune dehidrasyonu arasında boyama yapan bütün montaj antikoru mümkün olmalıdır. Ne yazık ki, bütün montajlı boyama çok daha uzun inkübasyon adımları gerektirir ve bu nedenle örnek oluşturma için gereken zamanı ( örneğin, 4-21 güne kadar) artırır 6,31. Dahası, bu intravital boyama yaklaşımı sadece hızlı değil aynı zamandaAntikorun doku penetrasyonu daha etkili olur ve tüm montaj boyası protokolüne kıyasla 9 . Mutlak boyama verimi belirlenmemiş olsa da, ortaya çıkan flüoresan sinyalinin dikkate değer derecede güçlü olması nedeniyle, lökosit popülasyonunun büyük bir kısmının etiketlenmesi beklenmektedir. Hem floresan proteinleri hem de antikor kendini etiketleyen sonraki temizleme işleminden sonra hayatta kalır ve her ikisi de uzun süre stabil kalır. Ayrıca, doku temizleme için çözücü bazlı bir maddenin kullanıldığı da belirtilmelidir. Bu, temizleme işlemini takiben bütünüyle monte boyama yaklaşımını büyük ölçüde engeller. Solvent bazlı doku temizleme, tersinir bir fenomendir; bu nedenle temizlenmiş dokunun, standart antikor boyama için genellikle kullanılan, su bazlı bir ortama (PBS gibi) aktarılması, saydam olmayan bir numuneye neden olur. Bu nedenle, organik çözücülerdeki standart dışı boyama protokolleri i Numune temizlendikten sonra tüm montaj boyama prosedürüne ihtiyaç duyulmaktadır.

    Sonraki kalp perfüzyonu, mümkün olduğunca fazla artık kanın yok edilmesi için kesinlikle gereklidir; çünkü kan, aşağıdaki adımlarda iyi temizlenmez ve görüntüleme sonuçlarını önemli ölçüde kötüleştirir. Yüreği çıkardıktan sonra, doku suyu artan bir etanol sırası ile çıkarılır. Bu aşama, kimyasal temizlemenin ilk kısmı olarak görülebilir. Fikir, seçilen numunenin ortalama refraktif indeksine (RI) daha iyi uyan daldırma ortamı ile doku suyunun yerini almaktır. DBE Ertuk ve ark.'nın protokolünü takiben daldırma ortamı olarak seçilmiştir . 32 , bazı değişikliklerle. DBE, 1.55 (nD20) kırılma indisine ve benzil alkol gibi diğer temizleyici ajanlarla karşılaştırıldığında: benzil benzoat (BABB; RI (nD20) = 1.56) 6 , 7 veya sakaroz (RI (nD20) = 1.44 )F "> 13, bu protokolde kullanılan floresan etiketleri en iyi şekilde korudu Benzer bir flüoresans koruması etil sinnamat (ECI) kullanılarak üretildi Nefretik böbreklerde glomerüllerin otomatik olarak ölçülmesi üzerine bir çalışmada kullanıldığını açıkladık 9. Kas Bir kere refrakter indeksi 1.382 ± 0.004 33 olduğu tahmin edilen doku, değerlendirdiğimiz tüm maddelerle eşit derecede temizlendi.9 Bu nedenle DBE seçimi için kritik faktör, floresans korumasıydı ve temizleme potansiyeli değildi. Bu pasif temizleme protokolüne geçtiğinde, bir elektroforetik akım yardımıyla lipidlerin uzaklaştırılmasının Ciddi derecede temizlenmiş dokulara neden olduğu aktif bir yöntem olan CLARITY 34 , 35'in kullanılması mümkün olmalıdır, ancak böyle bir suyun aksine Tabanlı temizleme yöntemi ile DBE silinmesi önemli bir sertleşme ile sonuçlanmaktadırDokuya, az miktarda küçülme eşlik etti. Bu, numunelerin kolay taşınmasını sağlar ve numunenin bir agaroz bloğuna yerleştirilmesi gibi görüntüleme için başka uyarlamalar gerektirmez. Bu nedenle, bu protokolün CLARITY gibi bir metoda aktarılması zor olabilir, ancak insanlar bu yaklaşımı kullanarak seçilen ultramikroskopun (materyal tablosuna bakınız) başarıyla kanıtlamıştır. Seçilen temizleme yöntemiyle endojen floresan sinyallerinin olası tahribatını dikkatle değerlendirmek önemlidir. CLARITY veya diğer etkin temizleme protokolleriyle hiç çalışmadığımız için, bu sistemlerde florokrom reaksiyonu hakkında yorum yapamayız. En kötü durum, bir sonraki tüm montaj antikor boyamanın gerçekleştirilmesi gerektiği şeklinde olacaktır.

    Bu yöntem, sıçan akciğerleri gibi diğer organlara kolayca ayarlanabilir; böbrekler; beyin; Ve hatta femur, tibia veya kalvaria gibi kemikler. Değerlendirme yapılırken Yeni doku bölgelerindeki uygulama potansiyelini ve / veya yeni flüoresan etiketleme stratejilerini en büyük zorluk protokolü flüoresanın hayatta kalacağı şekilde tasarlamaktır. Solvent bazlı daldırma ortamı 13 ve dehidrasyon ajanları 36 , florokromların bütünlüğü üzerinde doğrudan bir etkiye sahiptir. Çeşitli protokollerde oldukça kararlı görünen AlexaFluor türevlerinin kullanımı önerilir. Bununla birlikte, çoğu zaman, diğer florokromlar kullanılmalıdır. Bu durumda kesinlikle diğer temizleyici ajanların ( örneğin Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , metil salisilat 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 ve ECI 9 ) ve diğer dehidrasyon alternatifleri ( örn., Metanol ve tetrahidrofuran 13 ).

    Birçok LSFM yaklaşımında olduğu gibi şeffaf kalbin mikroskop altında konumlandırılması işlemi zorunludur. Ticari sistemler akciğer lobları, böbrekler veya kalpler de dahil olmak üzere fare organlarının büyüklüğünde numunelerin yüklenmesi için yeterli alan sağlar. Bununla birlikte, şu anda, bu numuneler için standartlaştırılmış örnek tutucuları mevcut değildir. Bu nedenle temizlenmiş ve yeniden şekillendirilmiş agaroz bloklar kullanarak bir montaj aparatı kurmak zorunda kaldık. Yine de, hareket eserlerinden dolayı belirli sayıda resim veri seti atılmak zorunda kaldı. Bu problem, burada kullanılan mikroskopun uzun kazanma süresine bağlı olarak da artmıştır. Potansiyel olarak, büyük veri setlerinin üretilmesi daha hızlı sistemlerden önemli ölçüde kazanç sağlayacak, ancak henüz daha hızlı bir mikroskop kullanma şansımız olmadı. Mikroskopumuz (bkz. Tablo oF materyalleri) bir zum mikroskop gövdesi etrafında yapıldı ve bir lazer modülü, 6.5 x 6.5 mm2'lik bir piksel boyutuna sahip bir sCMOS kamera ve 1.26X ila 12.6X arasındaki bir optik büyütme aralığına sahip algılama optiği ile donatıldı. Algılama optiklerinin merkezi kısmı çapraz olarak 1.7 ila 17.6 mm arasında değişen geniş bir görüş alanının gözlemlenmesine izin veren 5,5 NA'lık bir 0,5 NA'lık objektif lensdi. Bu, tüm fare kalbinin optik kesitlemesini gerçekleştirecek kadar büyüktü. 400 ila 800 nm arasındaki renk sapmalarının düzeltilmesi, objektifin mekanik ayarı ile sağlandı. Gerektiğinde, bilgisayar destekli post-processing sırasında kromatik düzeltmeler yapıldı. Bu sistemde de daha kalın örneklerde küresel sapmalar gözlenmemiştir ve bu nedenle düzeltilmesi gerekmez.

    Sonuç olarak, burada mekanik l temizleme ve analiz için sağlam bir protokol sunuyoruzIşık-tabakalı mikroskopi kullanılarak murin kalplerindeki eukosit dağılımı. Bu noktada, bu LSFM prosedürünün kılcal gibi ince doku yapılarını çözmesi pek mümkün olmadığını vurgulamak önemlidir. Bu bağlamda, bu LSFM, genel bağışıklık hücre dağılımını karakterize etmek ve organın içindeki potansiyel bağışıklık hücresi birikimlerini tanımlamak için çok uygundur. Bununla birlikte, LSFM'nin vaskülatür gibi küçük organ alt yapılarında hücresel lokalizasyonu analiz etmek ve ölçmek için mükemmel bir seçim olmadığı unutulmamalıdır. Bu gibi soruları cevaplamak için, LSFM, histoloji veya 2-foton mikroskobu gibi diğer yöntemlerle tamamlanmalıdır. Bu protokolün diğer sınırlamaları maksimum 3-4 renge kadar kısıtlamayı içerir; mavi kanal, otofloresans dışında diğer sinyaller için-sabit örnekler için kısıtlama ve 30 mm x 30 mm x 15 en çok örnek boyutu mm. Ayrıca DBE'nin kuvvetli kokusu ve akut toksisitesi de alınmalıdır.Hesaba katılmaz. Eğer son nokta sorunlu ise, alternatif bir temizleyici ajan olarak etil sinnamat kullanılabilir 9 . Bu mikroskopi tekniğini seçmenin en büyük avantajı, tüm organı bir kerede analiz edebilmesidir. Hematoksilin ve eozin boyalı, formalin ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş (FFPE) histolojik doku kesitlerinin geleneksel analizlerinde, her bir bölüm analiz edilmedikçe, önemli mekânsal alanları kaybetme olasılığı yüksektir. Üstelik, ışık levha mikroskopisi, her üç boyutlu düzlemde numunenin sanal olarak kesilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda, bu olasılığı, numuneyi yok etmeden ya da kesim artefaktlarına neden olmadan sunar. Gerekli görüldüğünde, sabit organ daha sonra belirli bölgeler üzerinde yüksek derecede çözüm bulmak için bir bağıntılı ışık ve elektron mikroskopisi yaklaşımı gibi daha ileri analizler için işlenebilir. Böyle bir çalışma için bir şablon Karreman ve ark.'nın çalışmasında bulunabilir . , Burada korelasyon bahisi2-fotonlu mikroskopi görüntü yığını ve üç boyutlu elektron mikroskobu verileri başarılı bir şekilde gösterildi. Bir diğer umut vaat eden yaklaşım, bu protokolün, yakın zamanda yayınlanmış, bir organik çözücüye dayanan ve standart bir LSFM 42 tarafından daha büyük organların araştırılmasına olanak tanıyan uDISCO yöntemi ile kombinasyonu olabilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

    Acknowledgments

    Gunzer laboratuarında yapılan araştırmalar Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (AD 0315590 no'lu hibe ile) ve Alman Araştırma Vakfı (hibe numarası GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) tarafından desteklendi. Teknik destek için IMCES'e, 3D karikatür modellemede yardım için Sebastian Kubat'a da teşekkür ediyoruz.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    diphtheria toxin Sigma Aldrich D0564
    phosphate buffered saline Biochrom L182-10
    ketamine [50 mg/mL] Inresa PZN 4089014
    xylazine [2 %] Ceva
    syringe Braun REF 9161502 Braun Omincan F 
    indwelt venous catheter  Becton Dickinson REF 381923 BD Insyte Autoguard
    small animal respirator Harvard Apparatus 73-0044 MiniVent
    anit-CD45 antibody (AF647) BioLegend 103124
    ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Carl Roth 8043.2
    catheter (21 G) BD Biosciences REF 387455 BD valu-set
    paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
    PE tube (5 mL) Carl Roth EKY9.1 Rotilabo
    ethanol Carl Roth 9065.4
    dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014
    tube rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 MACSmix
    agarose (low gelling) Sigma Aldrich A4018
    mold (15 x 15 x 5 mm) Tissue Tek 4566 Cryomold 
    light sheet microscope system LaVision Biotec Ultramicroscope 
    microscope body Olympus MVX10 
    objective Olympus 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
    sCMOS camera 5.5MP Andor Technology
    488 nm OPSL (50mW) laser Coherent
    647 nm  diode laser (50mW) Coherent
    3D image processing & analysis software Bitplane IMARIS Ver. 8.3
    transgenic mouse strain Steffen Jung et al. CD11c.DTR
    wt mouse strain Envigo Balb/c Ola Hsd J
    Laser Module LaVision Biotec
    MVPLAPO 2XC Objective Lens

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315, (1), 1-39 (1902).
    2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, (Pt 3), 229-236 (1993).
    3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2, (3), (2015).
    4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, (2), 023705 (2007).
    5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (5), pdb top78 (2010).
    6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1, (1), 36-42 (2008).
    7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
    8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223, (1), 7-20 (2012).
    9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. (2016).
    10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
    11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
    12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8, (12), 1047-1049 (2011).
    13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
    14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5, (10), 3311-3325 (2014).
    15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46, (8), 2028-2042 (2016).
    16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, (2), 211-220 (2002).
    17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25, (5-6), 415-425 (1997).
    18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175, (10), 6428-6435 (2005).
    19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22, (5), 561-570 (2005).
    20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
    21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366, (6450), 44-48 (1993).
    22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, (Pt 2), 82-87 (2000).
    23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, (11), 780-782 (1994).
    24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
    25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, (11), 4258-4272 (2006).
    26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, (10), 793-795 (2006).
    27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, (1), 413-418 (1873).
    28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401, (3), 273-294 (1931).
    29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
    30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. in press (2016).
    31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).
    32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, (11), 1983-1995 (2012).
    33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10, (4), 44014 (2005).
    34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
    35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9, (7), 1682-1697 (2014).
    36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10, (5), e0124650 (2015).
    37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, (11), 1481-1488 (2011).
    38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
    39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
    40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11, (3), 89-94 (2000).
    41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129, (2), 444-456 (2016).
    42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13, (10), 859-867 (2016).
    Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).More

    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter