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Developmental Biology

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

Abstract

Die genetischen und technischen Stärken haben die Zebrabärbling wirbel ein wichtiger Modellorganismus , in dem die Folgen von Gen - Manipulationen vorgenommen können während des schnellen Entwicklungszeit in vivo verfolgt werden. Mehrere Prozesse können einschließlich der Zellproliferation, der Genexpression, Zellmigration und Morphogenese untersucht werden. Wichtig ist, kann die Erzeugung von Chimären durch Transplantationen leicht durchgeführt werden, mosaic Kennzeichnung und Verfolgung einzelner Zellen unter dem Einfluß der Host-Umgebung ermöglicht. Zum Beispiel durch funktionelle Genmanipulationen des Wirtsembryo Kombination (zB durch Morpholino Mikroinjektions) und die Live - Darstellung, die Auswirkungen von extrinsischen, Zelle nichtautonomen Signale (von der gentechnisch veränderten Umgebung zur Verfügung gestellt) auf einzelnen transplantierten Spenderzellen beurteilt werden. Hier zeigen wir, wie dieser Ansatz verwendet wird, das Auftreten von fluoreszierenden Transgen-Expression als Proxy für den Zeitpunkt des Zellschicksals determin zu vergleichenation in verschiedenen genetischen Host-Umgebungen.

In diesem Artikel stellen wir das Protokoll für Mikroinjizierung Genaktivität Spenderzellen zu markieren und Knock-Down in Wirts Embryonen zu verursachen, eine Beschreibung des Transplantationstechnik verwendeten chimären Embryonen zu erzeugen, und das Protokoll für die Vorbereitung und in - vivo - Zeitraffer-konfokale läuft Bildgebungs mehrerer Embryonen. Insbesondere Multipositions-Bildverarbeitung ist entscheidend, wenn Timing von Ereignissen wie dem Ausbruch der Genexpression zu vergleichen. Dies erfordert die Datenerfassung von mehreren Kontroll- und Versuchs Embryonen gleichzeitig verarbeitet. Ein solcher Ansatz leicht für Studien der extrinsische Einflüsse in jedem Organ oder Gewebe der Wahl erweitert werden kann, zugänglich Bildgebung zu leben, vorausgesetzt, dass Transplantationen leicht nach etablierten embryonalen Schicksal Karten ausgerichtet werden können.

Introduction

Die Fähigkeit , wichtige Entwicklungsprozesse in einem in - vivo wirbel sichtbar zu machen , um die Herstellung der Zebrabärbling einen Schlüssel Modell für die Untersuchung normalen und Krankheitszuständen ( beschrieben in 1, 2) beigetragen hat. Insbesondere ist die neurale Netzhaut eine zugängliche Teil des zentralen Nervensystems. Die Netzhaut eignet sich für leicht Studien der Neurogenese führen aufgrund ihrer hoch organisierten, aber relativ einfache Struktur, und seine hochkonservierten Neuron - Typen über Vertebratenarten 3. Dynamik der zellulären Verhaltensweisen wie Proliferation, Zellzyklus Ausgang, asymmetrische Zellteilung, Schicksal Spezifikation, Differenzierung und neuronalen Schaltkreise Bildung kann über den gesamten Prozess von Retinogenese folgen, die in der zentralen Netzhaut des Zebrabärbling von 3 d postfertilization abgeschlossen ist ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.

Darüber hinaus können die funktionalen Anforderungen verschiedener Gene in jeder der oben genannten Stufen gleichzeitig in der Zebrabärbling Retina beurteilt werden, einen Vorteil gegenüber anderen Wirbel Modelle, in denen die Bereitstellung Phänotypen aus der Anwendung der Gen-Knockout-Techniken, kann sie nur auf Obduktion bewertet werden von Geweben fixiert. Insbesondere die Verwendung von transgenen Linien in dem wir die Expression von fluoreszierenden Proteinen als Reporter Transgenen in der Netzhaut zu visualisieren und zu überwachen, ermöglicht es uns, die zeitliche Auflösung der Genexpression zu erhalten, die die Entstehung eines bestimmten neuronalen Zelltyp zu Grunde liegt. Aufgrund der schnellen Entwicklung von Zebrabärbling können diese Ereignisse während der gesamten Entwicklungszeit visualisiert werden, wodurch tiefere Einblicke in die zeitliche Bedeutung der Genexpression Verhalten in Bezug auf neuronale Zellidentitätserfassung und Zellenbereitstellt.

Schließlich können diese Ansätze wirksam mit der Erzeugung von Chimären über Transplantationen in der Zebrabärbling kombiniert werden, was zu Einsichten in zwei wesentliche Aspekte der Genfunktion. Erstens Zellen transplantiert von einem Spender Embryo untersuchen, in denen ein bestimmtes Gen wurde umgeworfen, während sie in einem unbeschrifteten Wildtyp-Umgebung zu entwickeln, ermöglicht es uns, relevante Informationen über die Genfunktion in einem zellautonome Weise zu erhalten. Dies führt zu wichtigen Erkenntnissen über die Funktion der retinalen Schicksal bestimmenden Faktoren in den Vorläuferzellen sie in der Regel ausgedrückt in. Dies wird durch die Prüfung des Entwicklungsschicksal Ergebnis von Vorläufern exemplifiziert , die nicht mehr funktionsfähiges Protein aus diesen Genen erzeugen können 4, 6, 8, 9. Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass viele Schicksal bestimmenden Faktoren (zB Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) handeln Zelle-autonomously spezifische Retina-Nerven Schicksale zu treiben; der Mangel der Genexpression führt in erster Linie zu einem Schicksal Schalter, so dass die Zellen mit Gen lebensfähig bleiben , durch Knockdown eine alternative Zellschicksal 4, 6, 7, 10 übernehmen. Zweitens kann eine solche Chimären-Experimente verwendet werden, um zu beurteilen, wie Wildtyp-Vorläufern verhalten, wenn sie in verschiedenen genetischen Umgebungen zu entwickeln. Zum Beispiel durch die Entwicklung von WT - Zellen zu vergleichen , die in der Regel ein Gen von Interesse (und Reporter - Transgen) in einem WT gegen manipulierte Host - Umgebung (zB Gen - Knockout / Knockdown), die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Genexpression und Zellschicksal zum Ausdruck bringen kann beurteilt werden . Der Mangel an bestimmten Neuronentypen in der Host-Umgebung, zum Beispiel, sie Wildtyp-Vorläuferverhalten nicht autonom in einer Zelle Art und Weise ist, um Bias gezeigt zu beeinflussen Richtung in das unterrepräsentierte o Differenzierungsr fehlt neuron Typen 4, 7, 11, 12. Da die Netzhautneuronen in einer konservierten histogenic Reihenfolge durch die sequentiell zeitlich Expression spezifischer neuronaler Schicksal Determinante Gene (Schicksal Genexpression) ( beschrieben in 13) geboren, haben wir diese Methoden zu zeigen , wie der Zeitpunkt des Ausdrucks Schicksal Gen in Wildtyp - Vorläufern betroffen ist, wenn eine solche Vorläufern in Retina-Host-Umgebungen mit induzierten anomale Zellzusammensetzungen zu entwickeln. Hier erläutern wir diese Ansätze als Beweis dafür , wie die Kombination aus relativ Standard und weit verbreitete Techniken , um die Prüfung des Timing des Schicksals Genexpression ermöglicht retinalen Vorläufern 8 in der Entwicklung, 9.

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Ansatz, Zeitraffer-Bildgebung mit der Leichtigkeit proBildung Transplantation in der ex vivo Entwicklung Zebrafischembryo einzelne mosaik markierten Zellen während der gesamten Dauer der Entwicklungs Retinogenese zu folgen. Durch das Durchführen funktioneller Genmanipulationen entweder im Wirtsembryo, Spenderembryo, beide oder keines von beiden, kann man die Zelle Autonomie der Genfunktion bewerten. Dieser Ansatz kann in jedem anderen System weitgehend auf ähnliche Forschungsfragen angepasst werden, für die die einzelnen Komponenten hier skizzierten geeignet sind.

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Protocol

Alle Verfahren wurden nach der Australian National Health und Medical Research Council Verhaltenskodex der Bestimmungen durchgeführt für die Pflege und Verwendung von Tieren und wurden von den institutionellen Ethikkommissionen genehmigt.

1. Herstellung von Zebrabärbling

  1. Erwachsene Fische Paarung
    1. Richten Sie wachsene Fische als Paare (oder zwei Paare) in geeigneter Größe Zuchtbecken am Abend vor der Verwendung.
    2. Um die Weibchen vom Männchen getrennt zu halten, verwenden Sie einen Teiler, den Fisch zu ermöglichen, um zu sehen, aber nicht berühren.
    3. Am Morgen nach dem Einschalten der Beleuchtung, entfernen Sie die Trennwände und lassen die Fische ungestört zu paaren.
    4. Nach erfolgreicher Paarung setzen wachsene Fische wieder in ihre ursprüngliche Tanks.
      HINWEIS: Host und Donorstämme können die gleichen sein, zum Beispiel alle Wildtyp (WT) Stämme. (: GapRFP atoh7), Tg (atoh7: gapGFP) Für diese Studie wurden die Spender Embryonen aus den transgenen Linien Tg abgeleitet oderTg (vsx1: GFP) in denen die Expression von Faktoren Schicksal Determinante antreibende frühen oder späten neuralen Schicksal visualisiert werden jeweils 14, 15, 16. Um können die Auswirkungen von unterschiedlichen genetischen Umgebungen, Wirt Embryonen spezifische Mutanten oder morphants sein zu vergleichen, wie weiter unten beschrieben.
  2. Besamungs
    1. Verwenden Sie ein Teesieb die Eier aus dem Brutkasten zu sammeln. Prüfen Sie, ob Eier alle 15 Minuten die Zeit der Geburt zu ermitteln und sicherzustellen, dass Single-Zell-Stadium Embryonen für die nachfolgenden Schritte gesammelt.
    2. Spülen Embryonen mit E3 - Medium (5 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,4 mM CaCl 2, 0,9 mM MgCl 2 und 2% Methylenblau in destilliertem Wasser) und sie in Petrischalen mit ~ 40 ml E3 17 bei einer maximalen Dichte von 50 Eier pro 90 mm Durchmesser Petrischale.
    3. Beschriften Sie die Petrischalen mit dem Stamm Namen, Datum und Uhrzeit derGeburt. Verwenden Sie eine Pasteur Transferpipette alle Ablagerungen zu entfernen, während gerade die Embryonen unter dem Binokular.
    4. Halten Sie die Embryonen bei 28,5 ° C bis ca. 3 h postfertilization (HPF) für die Transplantation, oder fahren Sie mit Mikroinjektionen.
      HINWEIS: Bei Transplantationen, Ziel für Spender und Empfänger Embryonen bei ähnlichen Alters. Daher verwenden unterschiedliche Aufzucht Temperaturen zwischen 25 - 32 ° C nach Kimmel et al. 18 zu verlangsamen oder eine Kupplung von Embryonen zu beschleunigen , um den anderen passen.
    5. Halten ~ 20 der transgenen Spenderembryonen uninjizierten bei 32 ° C aus der Zeit der Sammlung bis Zeitraffer-Bildgebung (24-28 h später).
      HINWEIS: Diese werden schneller entwickeln als die experimentellen Kohorte und Fluoreszenzmarker früher auszudrücken. Sie können somit die Parameter verwendet werden, einzurichten (Laserleistung, Verstärkung) für die Bildgebung. In diesem speziellen Beispiel Bildgebung der experimentellen Kohorte beginnt Transgen-Expression vor der Anwendung (zu beurteilender genaue Zeitpunkt dieses Ereignisses).

2. Vorbereitung für Mikroinjektions

  1. Mikroinjektionsnadel Vorbereitung
    1. Mit einer Nadel Abzieher ziehen Nadeln aus jedem Borosilicatglas Kapillarrohr (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm lange Glaskapillare) in der Mitte zwei Nadeln von gleicher Länge zu erhalten. Ziel ist es für Nadeln, die mit langen Wellen hin verjüngen.
      HINWEIS: Beispieleinstellungen für die Nadel Abzieher hier verwendet werden, in die geliefert Materialliste.
    2. Lagern Sie die gezogen Nadeln in einer Petrischale und sichern, indem sie in einem Streifen von formbaren Kitt oder Klebeband drücken.
    3. Vor der Injektion bringen die Spitze der Nadel im Fokus unter einem Binokular und verwenden Zange an der Spitze offen, die Nadel zu brechen. Ziel für eine scharfe konische Spitze mit einer kleinen Öffnung (1C).
    2. <li> Morpholino Vorbereitung für Host-Embryonen
    1. Bestellen Morpholino-Oligonukleotide für das Gen von Interesse sowie eine Standard-Steuer Morpholin oder einem geeigneten 5-Basenpaar-Mismatch zu steuern, um Verfahrens- und Handhabungseffekte entwickelt.
      HINWEIS: Hier wird eine Übersetzung PTF1A morpholino mit der Sequenz 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'blockiert, die die Entwicklung der Zwischen geboren horizontal und amakrinen Zellen hemmt, und ein Standard-morpholino Steuer Zebrabärbling Targeting menschlichen beta-Globin-Intron-Mutation (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 wurden verwendet.
    2. Bereiten Sie eine 1 mM Morpholino-Stammlösung (~ 8-8,5 ng / nL) und bei Raumtemperatur lagern.
    3. Am Tag der Injektion, bei 65 ° C eine aliquote Menge (10 ul) Morpholin Wärme für 10 min, drehen kurz und auf Eis von 65 ° C abkühlen (nach dem es bei Raumtemperatur während des Betriebs gehalten werden kann). thist umkehren wird möglicherweise innerhalb der Morpholino Lösung Aggregation jede, die Wirksamkeit des Zuschlags verringern kann.
      1. Für PTF1A Morpholin und gleichwertigen Standard-Steuer Morpholino-, eine funktionierende Lösung von 6 ng / nL herzustellen, indem man die Morpholino-Stammlösung mit destilliertem Wasser verdünnt wird. Halten Sie bei RT.
        HINWEIS: Verwenden Sie 2 nL des Morpholin pro Embryo als PTF1A Morpholino erfordert einen relativ hohen Arbeitskonzentration von 12 ng pro Embryo wie zuvor 7 bestimmt. Für die meisten Morpholinos mit 2 - 5 ng pro Embryo ist wirksam, so verdünnen, um die Lager auf 2 - 5 ng / nL und injizieren 1 nL in jedem Embryo.
  2. fluoreszierende Histon Fusion Reporter Vorbereitung Konstrukte für Embryonen Kennzeichnung Spender
    ANMERKUNG: Um Spenderzellen innerhalb der Wirtsembryos zu unterscheiden / sichtbar zu machen, gibt es verschiedene Ansätze, um die Spenderembryo zu markieren, einschließlich Mikroinjektion von H2A-GFP (bei Verwendung von transgenen Spendern mitrot fluoreszierenden Reporter) oder H2B-RFP (wenn transgene Spender mit grün fluoreszierenden Reporter) mRNA in den Dotter der Single-Zell-Stadium Spender Embryo verwendet wird.
    1. Linearisieren mindestens 1 & mgr; g Plasmid, das das Reporter-DNA enthält.
      HINWEIS: Hier pCS2 + Plasmid (erzeugt und freundlicherweise von Prof. David Turner von der University of Michigan und Prof. Ralph Rupp vom Biomedizinischen Zentrum München zur Verfügung gestellt), die H2A-GFP oder H2B-RFP (erzeugt durch Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, University of London) wurde mit NotI Restriktionsenzymverdau linearisiert.
    2. Reinige DNA unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    3. Transkribieren mRNA im Handel erhältlichen Kits mit geeigneten Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für die pCS2 + Plasmid, verwenden Sie einen SP6-Polymerase-Kit.
    4. Reinige mRNA durch Isopropanolpräzipitation gefolgt von kommerziellen Kits oder Phenol-Chloroform-Extraktion unter Verwendung von nach Herstellerangabens. Verdünnen Sie die mRNA in Reinstwasser (20 - 30 & mgr; l), messen die Konzentration mit einem Spektralphotometer und bei -80 ° C.
    5. Am Tag der Injektion, eine Arbeitslösung von mRNA in sterilem Wasser mit einer Endkonzentration von 100 ng / ul und auf Eis halten vorzubereiten. Nicht verwendete mRNA Lager zurück bis -80 ° C.

3. Mikroinjektion von Morpholinos und / oder mRNA in Einzelzell-Stadium Embryos

HINWEIS: Mikroinjektionen werden verwendet , um alle Spenderzellen zu markieren und die verschiedenen Host - Umgebungen (Kontrolle und Knock-Down) und beinhalten Injektionen von mRNA oder Morpholino Antisense - Oligonukleotide 21 20, vorzubereiten.

  1. Laden und die Injektionsnadel Kalibrierung
    1. Backload die Injektionsnadel mit 3 ul der Morpholino und / oder Histon-fluoreszierendes Fusions mRNA Lösung Micropipettenspitzen.
    2. Schütteln Sie die solutIonen in Richtung der Spitze Injektionsnadel, bis es noch keine Blasen sind. Verwenden Injektionsnadeln mit einem inneren Glaseinsatz, so dass die Lösung wird in erster Linie an der Spitze durch Kapillarwirkung gezogen werden.
    3. Bringen Sie die Injektionsnadel an einer Halterung montiert in einem Mikromanipulator (3D manuelle Mikromanipulator) und eine gute Abdichtung im Rohrgehäuse gewährleisten.
    4. Schalten Sie die Strom- und Gasversorgung der Druck geregelt Mikroinjektors.
    5. Tauchen Sie die Nadelspitze in einem Tropfen Mineralöl in einer Schale (wenn ein graticule Okular) oder fahren Sie mit der Nadelspitze direkt über einem Mikrometer Folie, um das Tropfenvolumen zu kalibrieren. Messen der Einspritzmenge durch das Fußpedal gedrückt und stellen den Gasdruck und / oder die Dauer der Zeit, bis das Einspritzvolumen auf 1 nL äquivalent ist (125 & mgr; m Durchmesser).
      HINWEIS: Der Vorteil des Mikrometers Rutsche ist, daß die Messungen unabhängig von der Vergrößerung im Mikroskop verwendet wird, jedoch durch die Verwendung Okularstrichplatte instead, die Injektion Abfall und Maßstab können gleichzeitig im Fokus sein.
  2. Embryo Mikroinjektions
    1. Platzieren Sie einen Objektträger in einer Petrischale und die Verwendung einer Transferpipette Einzelzellenstadium Embryos entlang der Schiebekante zu deponieren. Richten Sie in einer einzigen Spalte eine Micropipettenspitze mit der Hälfte der dünner Spitze abgeschnitten. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich mit einer feinen Transferpipette Bewegungen während Injektionen (Abbildung 1A) zu verhindern.
    2. Senken Sie die Nadel in Richtung jedem Embryo, und dringen in das Chorion und Eigelb in einer glatten Hub (Abbildung 1B).
    3. Sobald die Nadelspitze in den Dotter, microinject zentriert durch das Fußpedal drücken. Injizieren 1 nL von H2A-GFP oder RFP H2B-mRNA in den Dotter eines einzelnen Zellstadium Spenderembryo (transgene). Inject 2 nL von Standard-MO oder PTF1A MO in den Dotter eines einzelnen Zellstadium Wirtsembryo Wildtyp durch das Fußpedal zweimal drücken. Erfolgreiche Injektionen können durch die Smal sichtbar gemacht werden l räumliche Verformung im Eigelb.
    4. Entfernen Sie die Injektionsnadel, bewegen Sie die Schüssel, die Embryonen mit dem nächsten Embryo in die richtige Position zu bringen und weiterhin die Injektion, bis die gesamte Spalte von Embryonen injiziert werden (50 - 60 Für Embryonen).
    5. Nachdem alle Embryonen eingespritzt wird, heben Sie die Schale in einem 30 bis - ° Winkel 45 und einen sanften Strom von E3 Medium (Squeeze-Flasche) verwenden, um die injizierten Embryonen in eine neue, saubere Petrischale zu übertragen.
    6. Platzieren Sie den Embryo Schale in einem Inkubator (entweder bei 28,5 ° C oder einer anderen Temperatur, um sicherzustellen, dass die Spender- und Aufnahme Embryonen bei äquivalenter Alters sind).
    7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.6 als notwendig ~ 100 Spender Embryonen zu erhalten oder ~ 200-250 Host-Embryonen.
    8. Bei 1 bis 2 HPF, überprüfen Sie die Embryonen unter einem Binokular und entfernen Sie alle unbefruchtete Eier, die nicht so weit fortgeschritten sind, um die 2- oder 4-Zellen-Stufen mit einer Pasteur-Transferpipette.

4. Vorbereitung für Transplantationen

ontent "> HINWEIS: Transplantationen verwendet werden chimären Embryonen zu erzeugen , um die Effekte der verschiedenen genetischen Host - Umgebungen ermöglicht innerhalb äquivalenten WT Donator Progenitoren 9, 22, 23 zu beurteilen.

  1. Spender Embryo-Auswahl
    1. Bei 3 HPF, überprüfen Sie die Spenderembryonen bei 2 - 5-fach Vergrößerung für die Kennzeichnung Signal unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wählen Sie gut entwickelte (symmetrische Zellmasse mit gleich großen Zellen) Embryonen mit einem starken Fluoreszenzsignal mit dem GFP-Plus-Filter (460-500 nm Anregung, 510 nm langen Pass Emission) oder Texas-Rot-Filter (540-580 nm Anregung, 610 nm lang~~POS=TRUNC) (1D). Die transgenen Reporter sind noch nicht zum Ausdruck gebracht.
  2. Agarose Injektion Platte und Petrischale Vorbereitung
    1. Gießen Agarose geschmolzen 2% verdünnt in E3 Medium in einen Durchmesser von 90 mm Petrischale und abkühlen lassen, bis das Gericht sicher istberühren. Hot Agarose kann sonst die Form verformen.
    2. Schwimmer eine Plastikform mit keilförmigen Vorsprüngen (6 x 25 / Schimmel) auf dem Agarose (2D, E). Vermeiden Sie Luftblasen durch eine Seite der Form auf die Agarose platzieren und langsam weiter unten auf der anderen Seite. Sicherstellen, dass die Form in der Schale oder in Richtung der Seite der tiefsten Stelle der keilförmigen Vorsprünge zentriert ist genügend Freiraum für die Transplantation Nadel zu ermöglichen.
    3. Lassen Sie die Agarose vollständig bei RT erstarren.
    4. Legen Sie die Agarose - Schale bei 4 ° C für 30 min und entfernen Sie die Formen durch sanft von einer Ecke anheben (zB mit einer Pinzette). Bereiten Sie Agarose Injektion Platten am Tag vor dem Experiment und lagern bei 4 ° C mit einem kleinen Volumen von E3 Medium und Paraffinfilm Dichtung zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen.
    5. Vor der Transplantation, füllen Sie die Agarose Injektion Platte mit E3 Medium und in einen 28,5 ° C Inkubator für mindestens 30 min.
      6. <li> Da dechorionated Embryonen Kunststoff-Stick, entweder Verwendung Glasschalen oder Beschichtung der Innenseite von Petrischalen (90 mm Durchmesser) mit einer dünnen Schicht von 2% Agarose in E3. Bereiten Sie ein Gericht für dechorionated Host Embryonen, ein Gericht für dechorionated Spenderembryonen und ein Gericht für alle 40 transplantierten Embryonen. Speichern Sie wie für die Einspritzplatte beschrieben (4.2.4).
  3. Transferpipette Vorbereitung
    1. Schneiden Sie die Spitze eines langen Form fein Glasspitze Pasteurpipette gezogen (2 ml Volumen, 230 mm Länge, 100 mm lange Spitze) auf eine Länge, die während drehen, bis die Spitze fällt für bequemes Rangieren (optional) durch Kratzen mit einem Diamantmesser erlaubt aus (1F).
    2. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt gerade ist. Feuerpolitur der Glastransferpipette durch Drehen der Schnittfläche in einem Bunsenbrenner glatten Enden zu erzeugen, um nicht die dechorionated Embryonen (1F) beschädigt werden .
      HINWEIS: Halten Sie die Pipettenspitze in der Flamme zu lange wkrank Ergebnis in der Öffnung für die Embryonen werden versiegelt oder zu klein zu werden.
  4. Dechorionating Blastulastadium Spender und Wirt Embryonen
    1. Dechorionate Embryonen entweder manuell mit zwei feinen Pinzette durch Aufreißen jedes Chorion , ohne den Embryo zu berühren, oder enzymatisch Protease unter Verwendung von 9 gleichzeitige schnelle dechorionation einer großen Anzahl von Embryonen zu ermöglichen.
      1. Bereiten Sie eine 100x Stammlösung von 50 mg / ml Protease-Mischung, stellen 100 & mgr; l-Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C.
      2. Füge 100 & mgr; l der Stamm Protease zu 10 mL E3 Medium (Endkonzentration von 0,5 mg / ml Protease).
      3. Platzieren Sie gut entwickelte Host und Spenderembryonen in zwei separaten kleinen Erlenmeyer-Glasbecher (10 ml) und so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen.
      4. 5 ml der 0,5 mg / ml Protease-Lösung zu jedem Becher und vorsichtig schwenken die Embryonen, während mit Blick auf sie unter einem Binokular. Achten Sie auf Anzeichen von Verformung des Chorion.
      5. Halten Sie wirbelnden. Sobald der erste Embryo aus dem Chorion (1D, Sternchen) ist, führen drei schnelle Spülungen mit E3 Medium durch Ausgießen der größte Teil der Flüssigkeit und Nachfüllen der Flasche , die die Protease - Lösung zu entfernen , indem Sie vorsichtig an der Seite in der E3 zu gießen. Nicht in dechorionated Embryonen in Kontakt mit der Luft in einem der nachfolgenden Schritte bis zum Ende der Transplantation (Abschnitt 5) zu kommen, da sie platzen wird. Lassen Sie ausreichend Lösung in dem Kolben zwischen Spülungen.
      6. Mit dem feuerpolierten Transferpipette Glas, übertragen Sie die Embryonen aus dem Erlenmeyer-Becher in Petrischalen aus Glas oder Agarose (2% in E3 Medium) beschichtet Plastikschalen. Gently Pipette während der Übertragung alle verbleibenden geschwächt Chorion zu entfernen.
  5. Transplantation Nadel Vorbereitung
    1. Mit einer Nadel Abzieher zwei Nadeln aus jeder Borosilikat dünnwandiger Glasrohr zu ziehen (1,0 mm Außendurchmesser/ 0,78 mm ID / 100 mm Länge) mit den gleichen Einstellungen wie die Mikroinjektionspipetten.
      HINWEIS: Beispiel Einstellungen für die Nadel puller hier verwendet werden, in der Materialliste geliefert. Transplantations Nadeln haben keine Glaseinsatz, da dies schädigt die in die Nadel gesaugt Zellen.
    2. Ziehen Nadeln im Voraus, lagern in einer Petrischale und sichern, indem sie in einen Streifen von formbaren Kitt oder Klebeband drücken.
    3. Vor der Transplantation bringen die Spitze der Nadel im Fokus unter einem Binokular und verwenden Zange an der Spitze offen, die Nadel zu brechen. Verwenden feinen Pinzette die Form der Nadel einzustellen , um eine Flöte-Form (2G), oder verwenden Sie alternative Methoden , um die Spitzenform 23 zu erzeugen , beschrieben , um zu zielen.

5. Chimera-Generation über Blastula Transplantation

  1. Transplantation Setup
    HINWEIS: Hier wird eine selbstorganisierende Transplantationsvorrichtung verwendet wurde (2A
  2. Montieren Sie die Transplantation Nadel in der gleichen Nadelhalter verwendet für Mikroinjektions oben (montiert auf Mikromanipulator, Schritt 3.1.3) (2A).
  3. Trennen Sie das Injizieren Schlauch, der das Ende der Mikropipette Halter auf den Druck geregelt Mikroinjektors für Mikroinjektionen verwendet verbindet. Befestigen der Einspritzschlauch, der auf eine 1 - ml - Spritze (2A, B) verbunden ist, die die Transplantation rig darstellt.
    1. Stellen Sie sicher, dass alle Anschlüsse dicht sind mit Paraffinfilm oder formbaren Kitt. Verhindern, dass Embryonen aus mit Luft in Berührung kommen, indem sichergestellt wird, dass es immer einige E3 Medium bei der Transplantation Nadel selbst ist. Betreiben Sie die Spritze manuell Zellen / Flüssigkeit in die und aus der Transplantation Nadel zu saugen.
  • Embryo Ausrichtung
    1. Übertragen Sie die Spenderembryonen mit der Glaspipette in die erste Säule der Agarose Form. Übertragen Sie die Host-Embryonen in den Spalten 2bis 6 der Agarose - Form (Figur 2F). Positionieren Sie die Embryonen mit der Pipette, so dass die Blastomere Seite nach oben zeigt.
  • Transplantation
    1. Die Transplantation Nadel auf eine Blastomere Zelle eines Spenders Embryo sanft ruhen und langsam etwa 20 saugen - 50 Zellen in die Transplantation Nadel (Abbildung 2H). Vermeiden Sie das Eigelb aufsaugt.
    2. Heben Sie die Transplantation Nadel aus dem Spender Embryo mit dem Mikromanipulator. Bewegen Sie die Agarose-Formschale auf der linken Seite und legen Sie die Transplantation Nadelspitze durch die Seite der Zellmasse in das Tier Pol des ersten Host-Embryo. Kaution von 5 bis 10 Zellen in der Nähe der Oberfläche nach dem Schicksal Mapping zeigt , dass dieser Bereich gibt Anlass zu der Vorderhirns / Augenfeld 24 (2i). Halten Sie die Nadelspitze in der E3 getaucht Medium während des gesamten Verfahrens.
  • Pflege von transplantierten Embryonen
    1. Entfernen Sie die Spenderembryonen einnd lassen Sie die Host-Embryonen in der Agarose-Form mit 1 - 2 h bei 28,5 ° C. Füllen Glas oder Kunststoff (beschichtet mit 2% Agarose) Petrischalen mit E3-Medium, enthaltend 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) Pigmentbildung zu verhindern, wie dies mit bildgebenden stören. Übertragen Sie die Host-Embryonen in diese Gerichte mit der feuerpolierten Glaspipette und Inkubation bei 28,5 ° CO / N.
      ACHTUNG: Handschuhe tragen, wenn PTU Handhabung.

    • 6. Live-Imaging-Setup

    HINWEIS: Die geringe Größe und optische Transparenz von Zebrabärbling mit der raschen Entwicklung kombiniert haben erlaubt es für in - vivo - Bildgebung von verschiedenen Zellen und Organe ein Schlüsselwirbel Modell zu werden. Imaging kann auf einer Vielzahl von Mikroskopen durchgeführt werden, die in Aufbau und Parameter unterscheiden. Nachfolgend wird eine geeignete konfokale Bildgebung Einrichtung zum Abbilden der Netzhautentwicklung 5, 8.

    1. chimärer EmbryoAuswahl
      1. Am 24. - 26. HPF schirmen die transplantierten Embryonen unter einem Fluoreszenz-Binokular gesunde gut entwickelte Embryonen auszuwählen, die die transplantierten Spenderzellen (H2A-GFP oder H2B-RFP markiert) in der Entwicklung Auge primordium zeigen.
      2. Nehmen Sie sich bis zu 40 Embryonen durch Pipettieren in eine neue Schale Montage und fügen 0,4 mg / ml Tricaine methanesulfate (MS222) die Embryonen zu betäuben.
        ACHTUNG: Handschuhe tragen, wenn MS222 Handhabung.
    2. Montage Embryonen
      HINWEIS: Verwenden Sie die geeigneten Einbauschale, je nachdem , ob die Darstellung auf einem invertierten 8 oder aufrechten Mikroskop (hier beschrieben) durchgeführt werden.
      1. Bereiten Sie ein paar 1,5 ml Kunststoffröhrchen mit 1 ml 1% niedriger Schmelz Agarose in 0,4 mg / ml MS222 in E3 Medium und halten Schmelze in einem 40 ° C Wasserbad.
      2. Saugen bis 5 Embryonen in eine Plastiktransferpipette und lassen Sie die Embryonen in der Spitze durch die Schwerkraft ansammeln. Berühren Sie die Transferpipetteauf die Oberfläche eines der vorbereiteten Rohre aus Kunststoff, enthaltend wodurch 1% niedrigschmelzende Agarose und 0,4 mg / mL MS222 die Embryonen in das Rohr zu sinken, während die Menge der E3 Übertragungs begrenzen.
      3. Berg Embryonen in einem Durchmesser von 90 mm Petrischale für die Bildgebung in aufrechten Mikroskop und Glasboden Petrischale (jeglicher Größe) für die Bildgebung in inverses Mikroskop. Verwenden Sie eine dauerhafte Markierung, um visuell teilen entweder Gericht in zwei Hälften zu Bild Geber in den WT-Hosts (auf einer Seite) oder morphant Gastgeber (andere Seite) im gleichen Experiment.
      4. Übertragen Sie die fünf Embryonen aus dem Agarose-Kunststoffrohr entweder Petrischale mit 0,5 bis 1 ml Agarose. Entfernen Sie überschüssige Agarose mit einer Transferpipette, so dass nur ein kleiner Tropfen (~ 200 bis 300 & mgr; l) bleibt. Wenn Bildgebung mit aufrechter Mikroskopie, vermeiden Embryonen innerhalb von 1 cm von der Petrischale Umfang platzieren. Das Eintauchen in Wasser Tauchlinse für die Bildgebung verwendet wird, kann nicht in der Lage sein , in diesem Bereich der Petrischale Wand (3A aufgrund zentriert werden </ Strong>).
      5. Verwenden Sie eine Microloading Pipette (mit der Spitze abgebrochen) die Embryonen auszurichten seitlich, bis die Agarose erstarrt. Für beide Arten von Gerichten werden die Embryonen richtig abgewinkelt seitlich , wenn die beiden Augen auf beiden Seiten des Kopfes vollständig überlappend sind (ausgerichtet in XY - Dimension) (3B). Für invertierte Mikroskopie Verwendung muß das Auge in der Nähe des Deckglases so nahe wie möglich an dem Deckglas gedrückt werden, Abbildungs ​​durch die z-Dimension innerhalb der Einschränkungen der möglichen Fokusebenen zu ermöglichen.
      6. Weiterhin Befestigungs fünf Embryonen zu einer Zeit in einzelne Agarose Tropfen. Verwenden Sie mehr 1% niedriger Schmelz Agarose zu verbinden die Agarose miteinander fällt und die Seite der Schale jede Verdrängen und seitliche Bewegung während der Bildgebung (3A) zu verhindern.
      7. Einmal vollständig verfestigten decken die Schale mit E3-Medium (enthaltend 0,003% PTU, 0,4 mg / mL MS222) vorgewärmt auf 28,5 ° C.
      8. Mit dem gleichen Ansatz in den Schritten 6.2.2- 6.2.8 montieren ~ 20 transgenen Embryonen bei 32 ° C (Schritt 1.2.5) in einer separaten Schale angehoben.
    3. Imaging-Parameter
      HINWEIS: Imaging das Auftreten von fluoreszierenden Transgene zu analysieren keine hohe räumliche intrazelluläre Auflösung erfordern. Es kann mit einem W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC M27 70-mm-Ziel bei 1,5 Zoom durchgeführt werden.
      1. Eingerichtet , um die Laserleistung und Belichtungszeit basierend auf dem Transgen Intensität für die ~ 20 transgener Embryonen mit beschleunigten Entwicklung ( das heißt , auf 32 ° C erhöht, Schritt 6.2.8).
        HINWEIS: Bei Studien von Beginn der Transgen-Expression, die experimentellen Embryonen zeigen keine Fluoreszenz zum Zeitpunkt der Zeitraffer eingerichtet ist und somit diese beschleunigte Embryonen sind von entscheidender Bedeutung für die Parameter der Bildgebung zu bestimmen.
      2. Für die experimentelle Gericht, jeder Embryo zu visualisieren und die Position speichern und konzentrieren Ebenen der Embryonen.
        1. Wählen Sie Embryonen , die die richtige Montagewinkel (dh mit der seitlichen s habenide des Auges möglichst horizontal) und einem starken Herzschlag (ein Indikator für die Gesundheit). Wählen Sie Embryonen mit einigen transplantierten Spenderzellen (identifiziert durch H2A-GFP oder H2B-RFP - Markierung) in erster Linie in der vorderen ventralen Quadranten der Entwicklung von Netzhaut (wo die Welle der Genexpression beginnt) (3C).
          HINWEIS: In Genaktivität ist die durchschnittliche Herzfrequenz 120 bis 180 Schläge / Minute 25. 120 Schläge / Minute - In den narkotisierten Embryonen, eine gesunde Herzschlag im Bereich von 60 sein kann. Langsamer Herzschlag kann ein Hinweis auf eine verminderte Lebensfähigkeit sein und diese Embryonen sind von der Untersuchung ausgeschlossen werden.
      3. Gesetzt z-Stapel von optischen Schnitten bei 2 & mgr; m Intervallen über die Netzhaut von bis zu 15 Embryonen.
        HINWEIS: Die Gesamtzahl der Embryonen, die in einem bestimmten Experiment abgebildet werden kann auf einzelnen Parametern abhängen (Belichtungszeit und z-Stapelgröße). Die benötigte Zeit, um Bild 1 Zeitpunkt für alle der ausgewählten Embryonen müssen sh seinOrter als das Intervall zwischen den Zeitpunkten. Durch Verzicht auf eine gewisse Tiefe Auflösung können mehr Embryonen innerhalb der Zeitintervalle abgebildet werden. Die Grenzen der z-Stapel als laterale und mediale Extremen des montierten Embryonen Auge ausgewählt und 30 & mgr; m ist auf der lateralen Seite in die aufrechte Mikroskopie Aufbau wie die Augen der sich entwickelnden Embryonen in dieser Konfiguration Verschiebung in der z-Richtung hinzugefügt, wie die Embryonen wachsen über Nacht. Dies führt zu Stapeln von 100 bis 170 & mgr; m Dicke (50 bis 85 Bilder / Auge).
      4. Nehmen Sie Bilder alle 24 min bei 32 ° C (entspricht 0,5 HPF-Intervalle) mit dem Laser / Kanal entsprechend dem Transgen.
        HINWEIS: Die Embryonen bleiben auf der Bühne während der gesamten Zeitraffer innerhalb einer beheizten Kammer das gesamte Mikroskop umfasst. Während das Experiment kann bei 28 ° C, wärmere Temperaturen durchgeführt werden, werden verwendet, die Entwicklung zu beschleunigen und sicherzustellen, dass die entsprechenden Zeitpunkten in dem Experiment in der 16 abgebildet werden - 24 h Zeitraffer-Zeitraum.
      5. BildKanäle die Donormarkierung (H2A-GFP oder H2B-RFP - optional) darstellt und Transgen (Atoh7: RFP oder Vsx1: GFP) unter Verwendung von sequentiellen Abtastung. Zur Analyse nutzen nur die Donor-Markierung geeignete Embryonen zu wählen, wie beschrieben (nehmen einen z-Stapel zu Beginn des Abbildungs) und dann Zeitraffer nur auf dem Kanal führen die Transgen-Expression zu erfassen.
        HINWEIS: Alternativ können Sie die Donormarkierung nur geeignete Embryonen auszuwählen (dh diejenigen mit bestätigten transplantierten Zellen in vorderen ventralen Quadranten) und Bild nur das Transgen Kanal, etwa Belichtungszeit zu halbieren und fast die Anzahl der Embryonen zu verdoppeln , die abgebildet und analysiert werden können pro Experiment (Abbildung 4).

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    Representative Results

    Diese Arbeit stellt eine experimentelle Protokoll Veränderungen in der Genexpression Timing zu beurteilen, wenn Wildtyp-Retina-Vorläufern in einem morphant Wirtsembryo entwickeln. Die experimentellen Host Embryonen sind PTF1A morphants, die die Zwischen geboren horizontal und amacrine lnterneurone der Retina 7, 26 fehlen. Diese wurden verglichen Wirtsembryos zu steuern, die mit einer Standard-Steuer morpholino injiziert.

    Da die Neurogenese von verschiedenen Arten von Neuronen in dem Zentralnervensystem (einschließlich der Retina) tritt in eine hoch konservierte histogenic 27 um, 28, 29, 30, 31 das Fortschreiten der nachfolgenden Schicksal Zelle nicht autonomen Feedbacks abhängenvon Arten früher geboren Neuron zu akkumulieren. Diese Hypothese wurde durch die Ermittlung des Zeitpunkts der Erzeugung von neuronalen Typen später geboren in transplantierten Vorläuferzellen die Entwicklung in der Abwesenheit von Zwischen geboren Neuronentypen getestet. Als Kontrolle wurde der Zeitpunkt der frühen geboren Zellen quantifiziert, die unabhängig unbeeinflußt sein sollte, ob die Zwischenzellen erzeugt werden oder nicht. Zu diesem Zweck wird die Tg (atoh7: RFP) oder Tg (atoh7: gapGFP) Linien wurden verwendet , um den Beginn des ersten geboren Ganglionzellen Neurogenese zu visualisieren , während die Tg (vsx1: GFP) Linie verwendet wurde , um den Beginn des späten analysieren geboren bipolaren Bevölkerung. Andere als zusätzlich die Reporter-Transgene exprimieren, sind die Donorzellen aus diesen Embryos genetisch WT.

    Mikroinjektion von 1 nL mRNA (zu Etikett Spenderzellen) in den Dotter von Single-Zell-Stadium Embryonen Ergebnisse in fluoreszierenden Reporterproteinexpression von 3 HPF, bei deneninszenieren die hellsten Spender ausgewählt (Abbildung 1). Bereiten Transplantation Setup , wenn Embryonen sind etwa 2 HPF (Abbildung 2). Bei 24 hpf, Embryonen mit transplantierten Spenderzellen in den entsprechenden Netzhautstellen ausgewählt und montiert in 1% Agarose mit niedriger Schmelz in Gruppen von fünf (Abbildung 3). 24 h - Nach dem Embryo Position zu speichern, die z-Stack und die Zeitparameter einstellen, Zeitraffer-Bildgebung wird 16 durchgeführt. Zeitpunkt der ersten Ganglionzellen geboren wird durch das Einsetzen der Atoh7 angegeben: RFP oder Atoh7: gapGFP Transgen und den Zeitpunkt der letzten geboren bipolaren Generation wird durch die starke upregulation des Vsx1 angegeben: GFP-Transgen, das auch bei deutlich niedrigeren Helligkeit ausgedrückt wird Ebenen in den Entwicklungs Vorläufern. Der Zeitpunkt der ersten Transgen - Expression, wie Atoh7: gapGFP wird in einzelnen Zellen zu jedem Zeitpunkt des Abbildungs (white Pfeilspitzen, 4) identifiziert. Atoh7: gapGFP und Ganglion Zelldifferenzierung occurs gleich mal unabhängig davon , ob der Host - Embryo ist WT oder ein PTF1A morphant fehlt Zwischen (dh nach Ganglionzellen Geburt) horizontal und Amakrinzellen.

    Die präsentierten Daten zeigen, dass diese experimentelle Ansatz ein leistungsfähiges Werkzeug stellt die Rolle von bestimmten Netzhaut Umgebungen auf die Genexpression Timing, mit den entsprechenden Folgen, nicht nur für das Verständnis der normalen Entwicklungsprozesse zu bewerten, sondern auch für zukünftige Anwendungen der Reprogrammierung Strategien in normalen und krankhaften Zuständen .

    Abbildung 1
    Abbildung 1: Die Mikroinjektion in den Dotter von Einzelzell - Stadium Embryos verwendet Donor Zellen zu markieren und anderen Host - Umgebungen zu erzeugen. A) Die Embryonen werden ausgerichtet gegen die Kante eines Glasobjektträger mit den meisten der umgebenden Flüssigkeit Wiederbewegt. B) Die Nadel in die Mitte des Eigelbs eingeführt wird und entweder H2A-GFP oder H2B-RFP - mRNA (für Spender) oder Morpholin (Standard MO oder PTF1A MO für Host) injiziert. C) Die Injektionsnadel erzeugt eine Nadel Abzieher , die aus jeder Kapillare zwei symmetrische Nadeln erzeugt. Jede gezogen Nadel muss anschließend die Spitze mit einer Pinzette gebrochen zu haben, um die Nadel zu öffnen, während eine scharfe gebogener Spitze bietet (nicht stumpf), die leicht eingesetzt in Embryonen werden kann. D) Spenderembryonen injiziert mit H2B-RFP - mRNA in der Single-Zell - Stadium beginnen die fluoreszierenden Reporter - Proteine von 2,5 HPF ausdrückt, in welchem Stadium sich die hellsten und gleichmäßig markierten Embryonen ausgewählt werden können. E) Etwa 2,5 bis 3 HPF, Spender und Wirt Embryonen werden enzymatisch unter Verwendung von Proteasen dechorionated. Verwirbelung des Erlenmeyerkolben liefert die mechanische Kraft, die notwendig offen geschwächt Chorion zu brechen und bringt dechorionated Embryos in die Mitte. Sobald der erste (Sternchen) oder ein paar dechorionated Embryonen beobachtet werden, schnelle und sanfte Spülung sorgt dafür, dass die Protease-Lösung entfernt wird. F) Für die Übertragung von dechorionated Embryonen, Glas Transferpipetten verwendet werden. Diese können zunächst verkürzt (optional) auf jede beliebige Länge, die bequem von dem Benutzer manövriert wird, durch Zerkratzen des Glases an der geeigneten Position mit einem Diamantmesser, bis er einschnappt ab. Dies führt zu einem scharfen Schnitt Spitze, die feuerpolierte sein muss keine Ecken und Kanten zu glätten, die Zellen schädigen können in die Pipette während der Übertragung angesaugt wird. Maßstabsbalken A, B, D, E = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2: Transplantation - Setup. B) Der Schlauch Transplantation zeigt an , wie potenzielle Lecks an den Verbindungen sind einfach formbaren Kitt und Paraffinfilm verhindert werden. C) eine höhere Vergrößerung Ansicht der Verbindung zwischen dem Einspritzrohr und jedem geeigneten Schlauch an der Spritze zu verbinden. Während jede Schlauch verwendet werden kann, verwendet das Rohr hier hat einen Durchmesser, der eng eine Pipettenspitze 10 uL passt. Verwenden Sie Paraffinfilm eine gute Abdichtung zu gewährleisten. D) Die Form hat 150 (6 x 25) Keile die dreieckigen Einschläge in der Agarose Injektion Platte zu erzeugen. E) Ungefähre Abmessungen jeder Keilform gezeigt. Die Firma Messungen sind urheberrechtlich geschützt. F)6 mit Host-Embryonen gefüllt - zubereitete Agarose Injektion Platten mit keilförmigen Vertiefungen sind mit Spenderembryonen zu der ersten Spalte und Spalten 2 verwendet. Transplantationen sind in der Zeile durchgeführt, wobei von einem Spender in jeder Reihe gesammelten Zellen lassen sich in fünf Host Embryonen transplantiert werden. Innerhalb jeder Form, Zellen von bis zu 25 Spender kann in bis zu 125 Host-Embryonen transplantiert werden. Hinweis wird die Form asymmetrisch mit dem tieferen Ende des Keils näher an der Petrischale Rand platziert. Dies ermöglicht die Transplantation Nadel von der rechten Seite, ohne den Rand Petrischale schlägt. G) Die Transplantation Nadel wird mit den gleichen Parametern wie die Injektionsnadel gezogen in eine lange verjüngte Spitze hier gezeigt zur Folge haben . Die Nadel muss durchbrochen werden, um einen größeren Innendurchmesser zu erzeugen, die Zellen, die sie ohne sich zu verformen aufnehmen kann. Die höhere Leistung Einschub zeigt, dass die Spitze der Transplantation Nadel abgewinkelt sein sollte, und idealerweise eine "Flöte" Form haben, wie gezeigtin diesem Beispiel. H) Höhere Leistungsansicht zeigt Orientierung von Host - Embryonen mit Zellen an der Spitze. Die Transplantation Nadel wird in der Zellmasse des Blastulastadium Wirtsembryo eingefügt seitlich (weiße Sternchen) und schob in die Zukunft Auge, wie hier gezeigt. Spenderzellen können in der Transplantationsnadel (Pfeil) und damit die grobe Anzahl der Zellen gesehen werden kann gesteuert werden transplantiert. I) Zwei Beispiele (links und rechts) , die unmittelbar nach der Transplantation zeigt, Embryonen mit erfolgreich an der richtigen Stelle transplantierten Zellen können sofort aussortiert werden , um die Donormarkierung (zB, H2B-RFP). Ein fluoreszierendes Kanal wurde dem Hell- hinzugefügt "linear ausweichen (add)" Option unter dem Layer-Menü in der Rastergrafik-Editor. Maßstabsbalken (für H, I) = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


    Abbildung 3: Embryo Montage für Zeitraffer-Imaging. A) Petrischale (90 mm) , um mehrere niedrigschmelzende Agarose Tropfen enthält fünf Embryonen jeweils verbunden durch Agarose zeigt ein festes Netzwerk zu bilden einzelne Tropfen zu verhindern , lösen. B) Höhere Leistungs Ansicht von 24 HPF Embryonen ausgerichtet seitlich und im erstarrten Agarose eingebettet. Für den idealen Winkel, die beiden Augen sollten auf der jeweils anderen (in der z-Dimension) positioniert werden. In Abhängigkeit von dem interessierenden Gen, Montage bis unmittelbar vor dem entsprechenden Timing verzögert werden soll (beispielsweise 26 hpf für Ganglion - Zelldifferenzierung oder 35 hpf für den Beginn der bipolaren Zelldifferenzierung). C) Die konfokale Bild eines einzigen optischen z-Schnitt zeigt Überlagerung von Hell- und roten Kanäle (mit "linear ausweichen (add)" Option unter dem Layer - Menü in dereditor Rastergrafik) der Entwicklungs Auges mit wenigen markierten Spenderzellen (rot) in einer sonst unmarkierten Host-Umgebung. Maßstabsbalken B = 1 mm, Skalen bar C = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Timing von Neurogenese kann in transgenen Donorzellen Transplantierte in anderen Host - Umgebungen visualisiert werden. Mikroskopische Aufnahmen von Zeitraffer-Bild der Entwicklung WT Spenderzellen von Tg (atoh7: gapGFP) transgenen transplantierten Embryos in unmarkierten Wirts WT. Transgen-Expression Beginn wird für einige Zellen durch weiße Pfeile angedeutet ist. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version o anzuzeigenf dieser Figur.

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    Discussion

    das Ausmaß, in dem Verständnis benachbarten Zellen Timing der Expression von entscheidender Zellschicksal bestimmenden Faktoren beeinflussen ist wichtig, wenn embryonale oder induziert multipotenter Stammzellen in eine bestimmte post-mitotischen Zelltyp oder sogar gemusterten Gewebe zu unterscheiden, um effizient anweisen Ziel. Darüber hinaus in den Entwicklungs Zellen des lebenden Tieres , diese molekularen Vorgänge der Prüfung stellt zusätzlich relevante dynamische (zeitliche und räumliche) Informationen über die bestimmten zellulären Kontexten im Zusammenhang mit diesen Ereignissen in vivo. Solche Studien in allen Wirbelmodelle erreicht nicht leicht werden.

    Im vorliegenden Protokoll, das zugänglich Zebrafischembryo wird als wirbel Modell genutzt , diese Fragen in vivo zu adressieren, in der relativ einfachen, aber hochorganisierten dreidimensionalen gemusterten Gewebe der Retina von Wirbeltieren. Dies wird durch Testen der Hypothese exemplifiziert, die eine bestimmte Netzhautzelle abbauTyp beeinflusst Genexpression Timing und Entwicklungsschicksal der retinalen Vorläuferzellen. Wir können zusätzlich die Spenderzellmarker verwenden , bestimmte Zellen in der Zeit zurück zu verfolgen , um beurteilen zu können , zum Beispiel, wie lange vor der Expression eines Transgens eine postmitotischer Zelle unterzog seine letzte Abteilung, oder beurteilen das allgemeine Verhalten dieser Zelle (zB Migration) in verschiedenen Stadien vor der Transgen-Expression in verschiedenen Umgebungen. Für diese Studien auf eine Kombination aus relativ einfach durchführen Techniken vorgestellt, die umfassen Morpholino-vermittelte Gen knock down, Transplantation und die Bildgebung. Zur Transplantation Methode führt das Protokoll ein neuartiges, relativ einfach und kostengünstig Transplantation Anlage und zeigt die Leichtigkeit dieses Betriebs Setup.

    Dieses Protokoll ist nicht auf die Netzhaut begrenzt. Es kann auch eine Anzahl von unterschiedlichen dynamischen zellulären Prozesse zu untersuchen angewendet werden, die Entwirrung der zell autonomen Entw erfordernental Programme aus der Zelle nicht autonomen Umwelteinflüssen. Während jedoch wenig Problembehandlung erforderlich ist, muss eine Reihe von kritischen Schritte in Betracht gezogen werden, bevor ein Experiment zu starten. Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung der Technik ist, dass das Organ oder Gewebe der Wahl muss sich leicht in den frühen Embryo gezielt mit dem Schicksal Karte. Wenn die Effizienz Targeting von Gewebe wurde bisher nicht untersucht worden ist, muss diese erste optimierte und standardisiert werden. Die Zahl der mikroinjiziert und transplantierten Embryonen erhöht und ist vor dem Bildgebung leben genügend Embryonen zu erhalten, mit Spenderzellen richtig integriert und innerhalb des jeweiligen Gewebes positioniert. Zusätzlich kann während dieses Protokoll leicht zu frühen embryonalen Zebrabärbling Stufen angewendet werden, Anwendung auf späteren Stufen wie die wachsende Larven schwieriger geworden aus zwei Gründen. Zum einen die Effizienz der Knock-Down erhältlich mit Morpholinos verringert sich im Laufe der Zeit (deauf jeder morpholino anhängig ist es im Allgemeinen am effizientesten, bevor 3 dpf). Um dieses Problem zu überschreiben, ist die Verwendung von genetischer Mutanten als Donator Embryonen für die Transplantation bevorzugt. Zweitens, wie der Zebrabärbling wächst, tieferen Teilen der Larven werden weniger zugänglich mit einem konfokalen Mikroskop Bildgebung, insbesondere bei höheren Vergrößerungen (hohe Leistungsziele), wo der Arbeitsabstand des Mikroskopobjektivs mehr begrenzt ist. So wird jedes Gewebe von Interesse an relevanten Alters zunächst für seine Ansprechbarkeit der Bildgebung zu beurteilen.

    Die Zeitraffer-Bildgebung kann entweder auf einem invertierten oder aufrechten konfokalen Mikroskop durchgeführt werden.

    Es gibt eine Anzahl von Vorteilen des aufrechten Mikroskops, falls vorhanden. Bei der erforderlichen Temperatur, Verdampfung des Eintauchens Substanz verwendet (beispielsweise Wasser oder Eintauchen Öl mit Wasser Brechungsindex) auf einem inversen Mikroskop kann eine vollständige Trocknung herauszuführen. Dies erfordert eine ständige Überwachung undschließlich Befüllens mit dem Risiko, die Probe aus dem Fokus setzt. Dies kann teilweise durch Verwendung von Automatisierung zu senken, das Ziel einen definierten Abstand, Hinzufügen des Eintauchens Substanz und Anheben des Ziel wieder, wenn auch in unserer Erfahrung vermieden werden, Refokussierung häufig noch erforderlich ist, die vor dem Beginn des nächsten Zeitpunkt von Abbildungs ​​passieren soll . Zweitens sind die größte Deckboden Gerichte, die wir bezogen noch viel kleiner (50 mm Durchmesser) als die Standard-Durchmesser von 90 mm Petrischalen für aufrechte Mikroskopie verwendet. Dies bedeutet, dass die Anzahl der Embryonen, die montiert werden kann, und das Medium embryo Volumen hinzugefügt sind begrenzt, wenn inverse Mikroskope verwenden. Dennoch bilden die Zeitraffer-Parameter in der Regel der wichtigste limitierende Faktor für die Anzahl der Embryonen, die abgebildet werden kann und damit die Größe der Schale ist noch geeignet. Wenn sehr hohe Vergrößerung Ziele unter Verwendung der inversen Mikroskopie eine größere Tiefe in der z-Dimension wie das Auge ermöglichen kann, undZiel sind nur durch eine dünne Deck getrennt. Bei sehr hoher Vergrößerung mit aufrechtem Mikroskopie kombinieren, die Agarose Tropfen den Embryo bedecken, ist so dünn wie möglich gehalten werden. Insgesamt sind die Daten unter Verwendung von aufrechten oder inversen Mikroskopie erhalten von gleicher Qualität.

    Zur Erzeugung von Hochqualitätsdaten gibt es weitere wichtige Schritte, die berücksichtigt werden müssen. Erstens ist die Auswahl der hell markiert Donatoren entscheidend für mit einer entsprechenden Anzahl von transplantierten Zellen in das Auge zu Beginn der Zeitraffer-Filme transplantierten Embryonen erhalten (einige, aber nicht zu viele). Die Protease enzymatisch dechorionation ist ein wichtiger Schritt und Inkubation in Protease sollte schnell gefolgt auf einem Minimum gehalten werden, aber schonende Spülungen nicht auf die nachfolgenden Gesundheit der Embryonen beeinflussen. Age Anpassung von Spender und Wirt Embryonen ermöglicht eine genaue Gewebe Targeting nach dem Schicksal Karte und für eine effiziente Integration der Zellen. Eine wohlgeformte Transplantations needle ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Spitze klein und scharf genug, um in Wirts Embryonen einzufügen, ohne viel Schaden zu verursachen, aber groß genug, um einen Innendurchmesser keine mechanischen Schäden an den Zellen zu verursachen transplantiert. Während der Transplantation, wenn die Ausrüstung nicht vollständig verschlossen ist (insbesondere an den Verbindungspunkten), ist es sehr schwierig, von Hand die Bewegung von E3 Medium steuern, und die Zellen in den und aus dem Transplantationsnadel. Dies ist am offensichtlichsten, wenn die Strömung dort entweder in die oder aus der Nadel Transplantation ohne manuell die Spritzenvolumen zu verändern. In diesem Fall müssen alle Verbindungen erneut zu überprüfen und wieder verschlossen werden. Dies sollte vor dem Experiment getestet werden.

    Schließlich während der verstrichenen Zeit zwischen Transplantation und Zeitraffer-Setup, ist es entscheidend, dass die transplantierten Embryonen erlaubt werden bei geringer Dichte zu entwickeln, während akribisch alle ungesunden Embryonen Reinigung aus. Dies ist besonders wichtig, wenn der Zeitpunkt der Entwicklung oder Gen.e Expression untersucht. Wenn das Timing eines jeden Prozesses der Bewertung (zB Genexpression), Kontrollen müssen Effekte der Morpholino - Technologie , um auszuschließen , nicht-spezifische Seite verwendet werden. In unserer Arbeit verwenden wir den Zeitpunkt der Expression des Transgens in einem nicht verwandten Gewebe (zB der Muskel) unbeeinflußt von der spezifischen Gens durch die morpholino abgezielt.

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    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde von einem ARC DECRA zu PRJ (DE120101311) und einer Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Forschungsstipendium LP (PO 1440 / 1-1) unterstützt. Die australische Regenerative Medicine Institute wird gefördert aus Mitteln der Landesregierung von Victoria und der australischen Bundesregierung unterstützt. Wir erkennen an Dr. Jeremy Ng Chi Kei, der hier beschriebenen Experimente durchgeführt , wie in Kei et al. 2016. Wir sind für Bestimmungen transgener Fische von Prof. Higashijima und danken Profs dankbar. Turner und Rupp für die Bereitstellung des pCS2 + Plasmid und Dr. Wilkinson zur Erzeugung von H2B-RFP und H2A-GFP-Konstrukte. Wir danken FishCore den zuständigen Personen (Monash University) für unsere Tiere zu kümmern.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

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    Entwicklungsbiologie Heft 121 Zebrabärblinge Transplantation Chimäre Live-Bildgebung Zelle nicht autonomen Retina Genexpression Timing Neurogenese
    <em>In</em> - <em>vivo</em> - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse
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    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

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