Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג'ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

Abstract

החוזק הגנטי וטכני הפכו את חוליות דג הזברה אורגניזם מודל מפתח אשר ההשלכות של מניפולציות הגן ניתן לייחס in vivo לאורך כל תקופת ההתפתחות המהירה. ניתן ללמוד מספר רב של תהליכים כולל התפשטות תאים, ביטוי גנים, נדידת תאים ומורפוגנזה. חשוב לציין, הדור של מפלצות באמצעות השתלות יכול להתבצע בקלות, ומאפשר תיוג פסיפס ומעקב של תאים בודדים תחת שפעת הסביבה המארחת. לדוגמא, על ידי שילוב של מניפולציות גן פונקציונליות של עובר המארח (למשל, באמצעות microinjection morpholino) ו הדמיה לחיות, את ההשפעות של חיצוני, אותות nonautonomous תא (המסופקים על ידי הסביבה המהונדסת הגנטי) על תאי תורם מושתלים בודדים ניתן להעריך. כאן אנו מדגימים כיצד גישה זו משמשת כדי להשוות את התחלתה של ביטוי transgene ניאון כמדד עיתוי determin גורל התאation בסביבות מארח גנטי שונה.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור microinjecting עוברי דג זברה כדי לסמן תאים תורמים לגרום מציאת גן בעוברים מארחים, תיאור של טכניקת ההשתלה השתמשה כדי ליצור עבר chimeric, ואת הפרוטוקול להכנה והפעלה בתוך confocal הזמן לשגות vivo הדמיה של עוברים מרובים. בפרט, ביצוע הדמיה multiposition הוא קריטי כאשר משווים עיתוי אירועים כגון התפרצות של ביטוי גנים. זה דורש איסוף נתונים מתוך שליטה מרובה ועובר ניסיוני מעובד בו זמנית. גישה כזו ניתן להרחיב בקלות ללימודים של השפעות חיצוניות בכל איבר או רקמה של בחירה נגישה לחיות הדמיה, ובלבד השתלות ניתן לכוון בקלות על פי מפות גורל עובריות הוקמו.

Introduction

היכולת לחזות תהליכים התפתחותיים חשובים בתוך חוליות vivo ב תרמה להפיכת דג הזברה כמודל מפתח ללימוד תנאים נורמלים ומחלות (הנסקרת ב 1, 2). בפרט, הרשתית העצבית היא חלק בלתי נגיש של מערכת העצבים המרכזית. הרשתית משאיל את עצמו לבצע מחקרים בקלות הנוירוגנזה בשל מבנהו מאורגן, אך פשוט יחסית, וסוגים נוירון שלה שמור ביותר על פני מינים בעלי חוליות 3. דינמיקה של התנהגויות הסלולר כגון התפשטות, יציאת מחזור התא, חלוקת תא סימטרית, מפרט גורל, בידול, והיווצרות מעגלים עצבית ניתן בעקבות לאורך כל התהליך של retinogenesis, אשר הושלם ברשתית המרכזית של דג הזברה על ידי 3 ד postfertilization ( 4 DPF), 5,נ"צ "> 6, 7.

יתר על כן, הדרישות הפונקציונליות של גנים שונים בכל השלבים שהוזכרו לעיל ניתן להעריך בו זמנית ברשתית דג הזברה, מתן יתרון על פני דגמים חוליות אחרים בהם פנוטיפים וכתוצאה מיישום של טכניקות נוקאאוט גנטי ניתן להעריך רק בבדיקה שלאחר המוות של קבוע רקמות. בפרט, השימוש בקווים מהונדסים שבו אנו יכולים לחזות את ולנטר את הביטוי של חלבוני ניאון כמו transgenes כתב ברשתית, מאפשר לנו להשיג החלטה זמנית של ביטוי גנים העומדים בבסיס ראשיתו של סוג תאים עצבי בפרט. בשל ההתפתחות המהירה של דג זברה, אירועים אלה ניתן דמיינו בתקופה התפתחותית כולו, ובכך לספק תובנה עמוקות יותר את החשיבות הזמנית של ביטוי גנים ביחס לרכישת זהות תאים עצבית ועל התנהגות תא.

לבסוף, גישות אלה ניתן לשלב ביעילות של דג הזברה עם הדור של הכימרה באמצעות השתלות, וכתוצאה מכך תובנות שני היבטים מרכזיים של תפקוד הגן. ראשית, בחינת תאים המושתלים מעובר תורם, שבו גן מסוים ופל תוך שהם מפתחים בסביבת סוג ברה ללא תווית, מאפשר לנו להשיג מידע רלוונטי על תפקוד גן באופן תא אוטונומי. זה מוביל לתובנות חשובות לגבי הפונקציה של גורמים הקובע גורל רשתית בתוך ובתאים הם באים לידי ביטוי בדרך כלל. זה בא לידי ביטוי על ידי בחינה של התוצאה גורל התפתחותי של אבות כי כבר לא יכול ליצור חלבון פונקציונלי מן הגנים האלה 4, 6, 8, 9. ניצול גישה זו, הראינו כי גורמים הקובעים גורל רב (למשל, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) לפעול תא-autonomously לנהוג גורלות עצביים ברשתית ספציפית; חוסר ביטוי גנים מוביל בעיקר למתג גורל, כך התאים עם גן המציאה להישאר קיימא על ידי אימוץ גורל 4 תאים חלופי, 6, 7, 10. שנית, ניסויי כימרי כזה יכול לשמש כדי להעריך כמה פרא סוג אבות להתנהג כאשר הם מפתחים בתוך סביבות גנטיות שונות. לדוגמא, על ידי השוואת התפתחות תאי WT שבדרך כלל לבטא את גן של עניין (ו transgene כתב) בתוך WT לעומת סביבת מארח מניפולציות (למשל, נוקאאוט גנטי / מציאה), את ההשפעות הנובעות על ביטוי גני גורל תא ניתן להעריך . חוסר סוגי נוירונים מסוימים בסביבת המארחת, למשל, מוכיח להשפיע על התנהגות אב סוג בר באופן תאים שאינם אוטונומי, להטות אותם לכיוון הבחנה לתוך o מיוצגת כראויr חסר סוגי נוירונים 4, 7, 11, 12. בהתחשב בכך נוירונים ברשתית נולדים צו histogenic נשמר על ידי ביטוי מתוזמן ברצף של גנים הקובעים גורל ספציפיים עצביים (ביטוי גני גורל) (הנסקרת ב 13), השתמשנו בשיטות אלה כדי להדגים כיצד התזמון של ביטוי גני גורל אבות סוג ברים מושפע כאשר אבות כאלה לפתח בסביבות מארח רשתית עם קומפוזיציות הסלולר סוטות מושרות. כאן, אנו מתארים גישות אלה כעדות איך השילוב לסטנדרטים יחסית בשימוש נרחב בטכניקות מאפשר בחינת המועדים של ביטוי גני גורל בפיתוח אבות רשתית 8, 9.

פרוטוקול זה מתאר גישה ניסויית שילוב הדמיה זמן לשגות עם הקלות של לכללהרכיב השתלת בעובר דג הזברה פיתוח vivo לשעבר כדי לעקוב אחר תאים בודדים mosaically שכותרתו לאורך כל תקופת retinogenesis התפתחותית. על ידי ביצוע מניפולציות גן פונקציונלי או בעובר המארח, העובר התורם, שניהם או אף אחד, אפשר להעריך את האוטונומיה תאים של תפקוד הגן. גישה זו ניתן להתאים נרחבת לשאלות מחקר דומות בכל מערכת אחרת עבורו הרכיבים הבודדים המפורטים כאן מתאימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים בוצעו על פי הוראות הקוד המועצה למחקר רפואי ובריאות הלאומית של אוסטרליה עיסוק לטיפול ולשימוש בחיות ואת אושרו על ידי ועדות האתיקה של המוסד הרפואי.

1. הכנת דג הזברה

  1. זיווג דגים למבוגר
    1. הגדרת דגים בוגרים כזוגות (או שני זוגות) במיכלים רבייה בגודל מתאים בערב לפני השימוש.
    2. כדי לשמור על האישה הפרודה מן הזכר, להשתמש מחלק כדי לאפשר את הדגים כדי לראות, אבל לא נוגע זה בזה.
    3. בבוקר, לאחר מדליק את האור, להסיר את המחיצות ולאפשר הדגים להזדווג באין מפריע.
    4. לאחר הזדווגות מוצלחת לשים דגים בוגרים בחזרה לתוך הטנקים המקוריים שלהם.
      הערה: Host וללחצים תורמים עשויים להיות זהים, למשל, כל סוג בר (WT) זנים. במחקר זה את העוברים התורם נגזר קווי מהונדס Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) אוTg (vsx1: GFP) שבו הביטוי של גורמים הקובעים גורל הנהיגה מוקדם או ניתן דמיינו גורל עצבי מאוחר, בהתאמה 14, 15, 16. על מנת להשוות את ההשפעות של שוני סביבות גנטיות, עוברת מארח יכול להיות מוטציות ספציפיות או morphants כמתואר להלן.
  2. אוסף העובר
    1. השתמש מסננת תה לאסוף את הביצים מן התיבה הרבייה. בדוק ביצים כל 15 דקות כדי לקבוע את מועד הלידה ולהבטיח בעוברים תא בודד נאספים על הצעדים הבאים.
    2. לשטוף עוברים עם המדיום E3 (5 mM NaCl, 0.2 KCl מ"מ, 0.4 מ"מ 2 CaCl, 0.9 מ"מ MgCl 2 ו -2% מתילן כחול במים מזוקקים) ומניחים אותם צלחות פטרי המכילות ~ 40 מ"ל E3 17 בצפיפות מקסימלית של 50 ביצים לכל 90 מ"מ קוטר צלחת פטרי.
    3. לייבל צלחות פטרי עם המתח שם, תאריך ושעתהוּלֶדֶת. השתמש פיפטה העברת פסטר כדי להסיר כל פסולת תוך הצגה עוברת תחת מיקרוסקופ לנתח.
    4. שמור את העוברים על 28.5 ° C עד ~ 3 שעות postfertilization (hpf) להשתלה, או להמשיך עם microinjections.
      הערה: לקבלת השתלות, לשאוף עובר תורם מארח בגילים דומים. לכן, לנצל טמפרטורות גידול שונות בין 25 - 32 מעלות צלזיוס על פי קימל et al. 18 להאט או להאיץ מצמד אחד של עוברים כדי להתאים את השני.
    5. שמור ~ 20 של עוברי תורם המהונדסים uninjected על 32 מעלות צלזיוס מרגע איסוף עד הזמן לשגות הדמיה (24 - 28 h מאוחר יותר).
      הערה: אלה יפתחו מהר יותר מאשר הדור ניסיוניים יביע סמנים ניאון קודם לכן. הם יוכלו לשמש כדי להגדיר את הפרמטרים (לייזר כוח, רווח) עבור הדמיה. בדוגמא זו בפרט, הדמיה של הדור הניסיון מתחילה לפני ביטוי transgene (כדי להעריךהתזמון המדויק של האירוע הזה).

2. הכנה עבור Microinjection

  1. הכנה מחט Microinjection
    1. השתמש חולץ מחט למשוך מחטים מצינור כל נימי בורוסיליקט זכוכית (1.0 מ"מ OD / 0.78 מזהים מ"מ / 100 מ"מ זכוכית נימים ארוכות) במרכז להשיג שתי מחטים שווים באורכם. כוון מחטים כי להתחדד עם פירים ארוכים.
      הערה: הגדרות דוגמה עבור חולץ מחט משמש כאן מצוינות ב רשימת חומרים.
    2. אחסן את מחטי משך בצלחת הפטר ומאובטחים על ידי לחיצה אותם למפצל של מרק moldable או סרט דביק.
    3. לפני הזריקה להביא את קצה המחט בפוקוס תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש מלקחיים לפרוץ את המחט בקצה. כוון טיפ מחודד חד עם פתח קטן (איור 1 ג).
    2. <li> הכנה Morpholino עבור לארח עוברי
    1. oligonucleotides morpholino להזמין שתוכנן במיוחד עבור הגן של עניין, כמו גם morpholino שליטה רגילה או חוסר סימטריה מתאים 5 בסיס-זוג לשלוט על השפעות פרוצדורליים וטיפול.
      הערה: כאן, תרגום חוסם Ptf1a morpholino עם הרצף 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'אשר מעכב את התפתחות התאים האופקיים amacrine נולדו הביניים, וכן morpholino דג זברה מלאת תקן מיקוד מוטצית אינטרון בטא-גלובין אנושי (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 היו בשימוש.
    2. כן פתרון מניות morpholino 1 מ"מ (~ 8 - 8.5 ng / nL) ולאחסן בטמפרטורת חדר.
    3. ביום ההזרקה, אל תחממו aliquot (10 μL) של morpholino ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ספין בקצרה ומניחים על קרח כדי להתקרר מ- 65 ° C (שלאחריהן הוא יכול להישמר בטמפרטורת החדר במהלך השימוש). thהוא יתהפך כל צבירה פוטנציאלית בתוך פתרון morpholino, אשר יכול להפחית האפקטיביות של המציאה.
      1. לקבלת Ptf1a morpholino ו morpholino שליטה תקן מקביל, להכין פתרון עבודה של 6 ng / nL על ידי דילול פתרון המניות morpholino עם מים מזוקקים. שמור ב RT.
        הערה: השתמש 2 nL של morpholino לכל עובר כמו morpholino Ptf1a דורש ריכוז עבודה גבוה יחסית של 12 ng לכל עובר כפי שנקבע בעבר 7. עבור רוב morpholinos, 2 - 5 ng לכל עובר הוא יעיל, כך לדלל את המניות - 2 5 ng / nL ולהזריק 1 NL לתוך כל עובר.
  2. הכנת כתב היתוך היסטון פלורסנט בונה עבור עוברי תורם תיוג
    הערה: כדי להבדיל / לדמיין תאים התורם בתוך לארח העוברי, ישנן גישות שונות לתייג את העובר התורם, כולל microinjection של H2A-GFP (אם באמצעות תורמים מהונדסים עםכתבי ניאון אדומים) או H2B-RFP (אם באמצעות תורמים מהונדסים עם כתבי ניאון ירוקים) mRNA בחלמון של עובר תורם שלב התא הבודד.
    1. Linearize לפחות 1 מיקרוגרם פלסמיד המכיל את ה- DNA הכתב.
      הערה: כאן pCS2 + פלסמיד (שנוצר בתנאי בחביבות על ידי פרופ 'דוד טרנר מאוניברסיטת מישיגן ופרופ ראלף רופ מן מינכן מרכז ביו-רפואית) המכיל H2A-GFP או-RFP H2B (שנוצר על ידי ד"ר כריסטופר וילקינסון, Royal Holloway, University of London) היה לינארית עם עיכול אנזים הגבלה NotI.
    2. לטהר DNA באמצעות ערכות זמינות מסחרי לפי הוראות יצרן.
    3. לתמלל mRNA באמצעות ערכות זמינות מסחרי עם פולימראז המתאים לפי הוראות יצרן. עבור פלסמיד + pCS2, השתמש בערכת פולימראז SP6.
    4. לטהר mRNA באמצעות ערכות מסחריות או מיצוי פנול, כלורופורם ואחריו משקעים isopropanol לפי הוראה של היצרןים. לדלל את ה- mRNA במי ultrapure (20 - 30 μL), למדוד את הריכוז עם ספקטרופוטומטר ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
    5. ביום ההזרקה, להכין פתרון עובד של mRNA במים סטריליים עם ריכוז סופי של 100 ng / μL ולשמור על הקרח. החזר למניה mRNA בשימוש בחזרה ל -80 מעלות צלזיוס.

3. Microinjection של Morpholinos ו / או mRNA לעוברי שלב-תא יחיד

הערה: microinjections משמשת כדי לסמן את כל התאים תורמים להכין את סביבות מארחת השונות (מלא מציאת גן) ולערב זריקות של mRNA או מולקולות אנטיסנס morpholino 20, 21.

  1. העמסת כיול מחט הזריקה
    1. Backload מחט הזריקה עם 3 μL של morpholino ו / או פתרון mRNA היתוך פלורסנט היסטון באמצעות טיפים פיפטה microloader.
    2. לנער את solutיון לעבר קצה הזרקת המחט עד שאין בועות הנותרות. השתמש במחטי זריקה עם זכוכית פנימית להכניס כזה שהפתרון יצויר בעיקר אל הקצה על ידי פעולת נימים.
    3. צרף את מחט הזריקה לבעל רכוב micromanipulator (micromanipulator ידנית 3D) ולהבטיח חותם חזק בתוך דיור צינור.
    4. הפעל את אספקת החשמל והגז microinjector מוסדר הלחץ.
    5. לטבול את קצה המחט בתוך טיפה של שמן מינרלים בצלחת (אם באמצעות עינית graticule) או העבר את קצה המחט ישירות על שקופית מיקרומטר לכייל את נפח הירידה. מדוד את עוצמת הזריקה על ידי לחיצה על דוושת הרגל ולהתאים את לחץ הגז ו / או משך זמן עד נפח ההזרקה שווה 1 NL (125 מיקרומטר קוטר).
      הערה: היתרון של שקופית מיקרומטר היא שמדידות שאינן תלויות מן ההגדלה על המיקרוסקופ, אולם באמצעות התוספות העיניות graticuletead, הטיפה בקנה מידת ההזרקה יכולות להיות בפוקוס בעת ובעונה אחת.
  2. microinjection העובר
    1. מקום שקופית מיקרוסקופ בצלחת הפטר ולהשתמש פיפטה העבירה להפקיד בעוברי תא בודד בשולי השקופית. יישר לתוך עמודה אחת באמצעות קצה פיפטה microloader עם מחצית הקצה הדק המנותק. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר עם טפטפת העברה בסדר למנוע תנועות במהלך זריקות (איור 1 א).
    2. מנמיך את המחט לכיוון כל עובר, ולחדור הסיסי והחלמון במכה אחת חלקה (איור 1B).
    3. ברגע שקצה המחט מרוכז החלמון, microinject ידי לחיצה על דוושת הרגל. להזריק 1 NL של H2A-GFP או H2B-RFP mRNA בחלמון של עובר תורם שלב תא בודד (מהונדס). להזריק 2 nL לסטנדרטי MO או Ptf1a MO בחלמון של עובר מארח סוג בר בשלב תא בודד על ידי לחיצה על דוושת רגל פעמים. ניתן דמיינו זריקות מוצלחות של smal l עיוות מרחבי החלמון.
    4. הסר את מחט הזריקה, להזיז את הצלחת המכילה את העוברים להביא את העובר הבא להמקום ולהמשיך הזרקה עד העמודה השלמה של עוברים מוזרקות (50 - 60 עוברת).
    5. לאחר הזרקת כל העוברים, להרים את המנה למעלה ב 30 - זווית ° 45 ולהשתמש זרם עדין של מדיום E3 (מבקבוק לחיץ) להעביר את העוברים מוזרק לתוך צלחת חדשה נקייה פטרי.
    6. מניח את צלחת העובר באינקובטור (או על 28.5 מעלות צלזיוס או טמפרטורה אחרת על מנת להבטיח כי עובר תורם המארח הם בגילים דומים להם).
    7. חזור על שלבי 3.2.1 - 3.2.6 ככל שיידרש כדי להשיג ~ 100 עוברים תורמים או ~ 200 - 250 לארח עוברי.
    8. בשעת 1 - 2 hpf, לבדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתח ולהסיר את כל ביצים מופרות שלא העפילו לשלבים 2 או 4 תאים עם טפטפת העברת פסטר.

4. הכנה עבור השתלות

הערת ontent ">: השתלות משמשות ליצירת עבר chimeric המאפשרים את ההשפעות של סביבות מארח גנטי שונות יוערך בתוך אבות תורם מקבילים WT 9, 22, 23.

  1. מבחר עובר תורם
    1. בשעה 3 hpf, לבדוק את העוברים התורמים ל 2 - גדלת 5X לאות תיוג תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בחר מפותח (מסת תאים סימטרית עם תאים בגודל אחיד) עובר עם אות ניאון חזקה באמצעות GFP בתוספת המסנן (עירור ננומטר 460-500, 510 פליטת מסירה ארוכה ננומטר) או מסנן אדום טקסס (540 - 580 עירור ננומטר, 610 ננומטר פליטת מסירה ארוכה) (איור 1D). הכתבים המהונדסים אינם באים לידי ביטוי עד כה.
  2. צלחת הזרקת Agarose והכנת צלחת פטרי
    1. יוצקי agarose 2% מותכים מדולל E3 בינוני לתוך צלחת 90 ​​מ"מ קוטר הפטר ולתת לו להתקרר עד המנה היא בטוחהלגעת. agarose חם יכול אחרת לעוות את התבנית.
    2. Float תבנית פלסטיק עם בליטות בצורת טריז (6 x 25 / עובש) על agarose (איור 2 ד, ה). הימנע בועות אוויר על ידי נחת צד אחד של העובש על agarose ותחתון לאט במורד הצד השני. ודא העובש מרוכז בצלחת או כלפי צד של הנקודה העמוקה ביותר של בליטות בצורת טריז כדי לאפשר מרחב אישור מספיק המחט ההשתלה.
    3. אפשר agarose כדי לחזק לחלוטין ב RT.
    4. מניח את צלחת agarose ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולהסיר את התבניות ידי הרמה בעדינות מפינה אחת (למשל, עם מלקחיים). כן צלחות הזרקת agarose היום לפני הניסוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עם נפח קטן של חותם סרט בינוני פרפין E3 כדי למנוע מהם להתייבש.
    5. לפני ההשתלה, למלא את צלחת הזרקת agarose עם מדיום E3 ומקום לתוך חממת 28.5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
      6. <li> מאז עוברים dechorionated מקל פלסטיק, או כלים מזכוכית לשימוש או המעיל הפנימי של צלחות פטרי (90 מ"מ קוטר) עם שכבה דקה של agarose 2% ב E3. כן צלחת אחת עבור לארח עוברי dechorionated, צלחת אחת עבור עוברי תורם dechorionated ואת צלחת אחת על כל 40 עוברי מושתלים. אחסן כמתואר עבור צלחת ההזרקה (4.2.4).
  3. הכנת פיפטה העברה
    1. חותך את קצה צורה ארוכה אסופה דק פיפטה פסטר הקצה של כוס (2 נפחי מיליליטר, 230 מ"מ אורך, 100 מ"מ קצה ארוך) באורך המאפשר תמרון נוח (אופציונאלי) על ידי גירוד עם סכין יהלום תוך סיבוב עד מפלי טיפ הנחה (איור 1F).
    2. ודא כי הוא חתך ישר. אש פולנית פיפטה העברה זכוכית על ידי החלפה של המשטח לחתוך עם מבער בונזן כדי ליצור קצוות חלקים כדי לא לפגוע עוברי dechorionated (איור 1F).
      הערה: שמירה על קצה פיפטה בתוך הלהבה במשך זמן רב מדי wתוצאה חולה בפתיחה להיות חתומה או להיות קטן מדי עבור העוברים.
  4. Dechorionating blastula עובר תורם מארח בשלב
    1. עובר dechorionate באופן ידני עם שני מלקחיים בסדר ידי קריעה פתוחה כל סיסי בלי לגעת העובר, או enzymatically באמצעות פרוטאז לאפשר dechorionation המהיר סימולטני של מספר גדול של עוברים 9.
      1. כן פתרון מניות 100x של 50 מ"ג / תערובת פרוטאז מיליליטר, לעשות 100 aliquots μL ולאחסן אותם ב -20 ° C.
      2. הוספת 100 μL של פרוטאז המניה עד 10 בינוני מ"ל E3 (הריכוז הסופי של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​פרוטאז).
      3. מניח היטב עובר מארח תורם מפותח בשני כוסות זכוכית Erlenmeyer הקטן נפרדות (10 מיליליטר) ולהסיר נוזל ככל האפשר.
      4. הוסף 5 מ"ל של הפתרון פרוטאז 0.5 מ"ג / מ"ל ​​לכל כוס בעדינות מערבולת את העוברים תוך הסתכלות אותם תחת מיקרוסקופ לנתח. Watch עבור כל סימני עיוות של סיסית.
      5. שמור מתערבל. ברגע העובר הראשון הוא מתוך הסיסי (איור 1D, כוכביות), לבצע שלוש שטיפות מהירות עם מדיום E3 כדי להסיר את פתרון פרוטאז ידי שפיכה את רוב הנוזל מילוי הבקבוק על ידי השפיכה בעדינות E3 בצד. אל תאפשר עובר dechorionated לבוא במגע עם האוויר כל אחד מהשלבים הבאים, עד סוף שנת ההשתלה (סעיף 5), כפי שהם יפרצו. השאר פתרון הולם בבקבוק בין שטיפות.
      6. עם טפטפת העברת זכוכית מלוטשת אש, להעביר את העוברים מן הקנקן Erlenmeyer לתוך צלחות זכוכית פטרי או agarose (2% בטווח הבינוני E3) מצופה צלחות פלסטיק. בעדינות פיפטה במהלך ההעברה כדי להסיר כל סיסית נחלש הנותרים.
  5. הכנה מחט השתלה
    1. השתמש חולץ מחט למשוך שתי מחטים מכל שפופרת זכוכית קיר דק בורוסיליקט (1.0 מ"מ OD/ 0.78 מזהה מ"מ / 100 מ"מ אורך) עם אותן הגדרות כמו טפטפות microinjection.
      הערה: הגדרות דוגמא עבור חולץ מחט משמש כאן מסופקות ברשימת החומרים. מחטי השתלות אין להכניס זכוכית, כפיצויים זה התא נשאב לתוך המחט.
    2. משוך מחטים מראש, חנות בצלחת פטרי ומאובטח על ידי לחיצה למפצל של מרק moldable או סרט דביק.
    3. לפני ההשתלה להביא את קצה המחט בפוקוס תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש מלקחיים לפרוץ את המחט בקצה. שימוש במלקחיים בסדר כדי להתאים את הצורה של המחט לשאוף שיטות חליל-צורה (האיור 2G), או להשתמש חלופיות המתואר על מנת ליצור את צורת קצה 23.

5. דור כימרה באמצעות blastula השתלה

  1. התקנה להשתלות
    הערה: כאן, מנגנון השתלה עצמית התאספו שימש (איור 2 א
  2. הר מחט ההשתלה באותו בעל מחט המשמש microinjection לעיל (רכוב על micromanipulator, צעד 3.1.3) (איור 2 א).
  3. ניתק את צינורות ההזרקה מקשרות סוף בעל micropipette אל microinjector וסת הלחץ המשמש microinjections. צרף צינורות ההזרקה מקושר מזרק 1 מיליליטר (איור 2 א ', ב'), המייצג את אסדת ההשתלה.
    1. ודא שכל החיבורים אטומים בחוזקה באמצעות סרט פרפין או מרק moldable. למנוע עובר מלבוא במגע עם אוויר על ידי ההבטחה כי תמיד יש איזה מדיום E3 את מחט ההשתלה עוצמה. הפעל את המזרק באופן ידני למצוץ תאים / נוזל לתוך והחוצה של מחט ההשתלה.
  • יישור עובר
    1. מעביר את העוברים התורמים עם פיפטה הזכוכית לתוך הטור הראשון של עובש agarose. מעביר את עוברי מארח לטורים 2עד 6 מתוך עובש agarose (איור 2F). מקם את העוברים עם פיפטה כך שהצד blastomere פונה כלפי מעלה.
  • הַשׁתָלָה
    1. בעדינות לנוח המחט השתלה אל תא blastomere של עובר תורם לאט להתחנף כ -20 - 50 תאים לתוך מחט ההשתלה (האיור 2H). הימנע מתחנף החלמון.
    2. הרם את המחט השתלת מעובר התורם באמצעות micromanipulator. הזז את צלחת עובש agarose שמאלה והכנס את קצה מחט השתלת דרך הצד של מסת התאים לתוך מוט החיה של עובר המארח הראשון. הפקדה 5 - 10 תאים קרוב לפני השטח על פי מיפוי גורל מראה כי בתחום זה מוליד בתחום המוח הקדמי / עין 24 (איור 2I). שמרו על קצה המחט שקוע בינוני E3 לאורך ההליך כולו.
  • טיפול של עוברים מושתלים
    1. הסר א עובר התורםnd לעזוב את עוברי מארח עובש agarose עבור 1 - 2 שעות ב 28.5 ° C. מלאו זכוכית או פלסטיק (מצופה 2% agarose) צלחות פטרי עם המדיום E3 המכיל 0.003% N-phenylthiourea (PTU) כדי למנוע היווצרות פיגמנט כמו זה יפריע הדמיה. מעבירים את העוברים המארח לתוך הכלים האלה עם פיפטה זכוכית מלוטשת אש לדגור על 28.5 ° CO / N.
      זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת טיפול PTU.

    • 6. הגדרת הדמיה חיה

    הערה: הגודל הקטן שקיפות אופטית של דג הזברה בשילוב עם ההתפתחות המהירה אפשרו לה להיות מודל חוליות מפתח בתחום ההדמיה vivo של תאים ואיברים שונים. הדמיה יכולה להתבצע על מגוון רחב של מיקרוסקופים, אשר יהיה שונה התקנה ופרמטרים. הסעיפים הבאים מתאר את התקנת הדמית confocal מתאימה הדמיה של התפתחות רשתית 5, 8.

    1. עובר chimericבְּחִירָה
      1. בשעה 24 - 26 hpf, להקרין את העוברים המושתלים מתחת היקף הניתוחים ניאון כדי לבחור עוברים בריאים מפותח המראים את התאים התורם מושתלים (H2A-GFP או H2B-RFP שכותרתו) ב primordium העין מתפתחות.
      2. מניחים בצד עד 40 עוברים הרכבה על ידי pipetting לתוך צלחת חדשה ולהוסיף 0.4 מ"ג / מ"ל ​​tricaine methanesulfate (MS222) להרדים את העוברים.
        זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת טיפול MS222.
    2. עוברים הרכבה
      הערה: משתמשת צלחת ההרכבה המתאימה, תלוי אם הדמיה תבוצע על מיקרוסקופ הפוכה 8 או זקוף (מתואר כאן).
      1. הכן כמה 1.5 צינורות פלסטיק מ"ל המכילה 1 מ"ל של agarose נמוכה להמיס 1% ב 0.4 מ"ג / מ"ל ​​MS222 במדיום E3 ולשמור מותכת באמבט מים 40 מעלות צלזיוס.
      2. להתחנף 5 העוברים לתוך טפטף פלסטיק העברה ולתת את העוברים להצטבר הקצה על ידי כוח הכביד. גע פיפטה ההעברהעל פני השטח של אחד הצינורות פלסטיק מוכן המכיל agarose 1% נמוך להמיס ו -0.4 מ"ג / מ"ל ​​MS222 המאפשר את העוברים לשקוע לתוך הצינור תוך הגבלת סכום ההעברה E3.
      3. עוברים הר בצלחת בקוטר 90 מ"מ פטרי בתחום ההדמיה מיקרוסקופ זקוף צלחת זכוכית התחתונה פטרי (בכל גודל) בתחום ההדמיה מיקרוסקופ הפוכה. השתמש בטוש בלתי מחיק לחלק חזותי או צלחת לשני חצאים לתורמי תמונת מארחי WT (בצד אחד) או מארחי morphant (צד שני) באותו הניסוי.
      4. העבר חמשת העוברים מצינור פלסטיק agarose מאכל או פטרי עם 0.5 - 1 agarose המ"ל. הסר agarose עודף עם טפטפת העברת כך טיפה קטנה בלבד (~ 200 - 300 μL) נשאר. אם הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, למנוע הצבת עוברים בתוך 1 ס"מ מהיקף צלחת פטרי. עדשת טבילת הטבילה במים המשמשת הדמיה ייתכן שלא תוכל להיות מרוכזים באזור זה בשל קיר צלחת פטרי (איור 3 א </ Strong>).
      5. השתמש פיפטה microloading (עם הקצה הנשבר) כדי ליישר את העוברים רוחביים עד agarose מתמצק. עבור שני סוגי מאכלים, העוברים הם בזווית רוחבית תקינה אם שתי העיניים משני צדי הראש הם חופפים לחלוטין (מיושרים בממד XY) (איור 3 ב). לשימוש במיקרוסקופ הפוך, העין ליד coverslip חייבת להיות דחף קרוב ככל כדי coverslip ככל האפשר, כדי לאפשר הדמיה באמצעות z-הממד במסגרת המגבלות של רמות ההתמקדות האפשריות.
      6. המשך הרכבת חמש עוברים בכל פעם בטיפות agarose פרט. השתמש יותר 1% agarose נמוכה להמיס להצטרף agarose טיפות זה לזה בצד של המנה, כדי למנוע כל פירוק ותנועה לרוחב במהלך ההדמיה (איור 3 א).
      7. לאחר מלא הקרושה, לכסות את המנה עם מדיום E3 (המכיל 0.003% PTU, 0.4 מ"ג / מ"ל ​​MS222) prewarmed ל -28.5 מעלות צלזיוס.
      8. תוך שימוש באותה גישה כמתואר בשלבים 6.2.2- 6.2.8, הר ~ 20 עוברים מהונדס העלה על 32 מעלות צלזיוס (שלב 1.2.5) בצלחת נפרדת.
    3. פרמטרי הדמיה
      הערה: הדמיה להעריך ההתפתחות של transgenes פלורסנט אינו מחייבת רזולוציה מרחבית גבוהה תאית. זה יכול להתבצע עם מטרה W Plan-Apochromat 20X / 1.0 דסק"ש M27 70 מ"מ 1.5 זום.
      1. הגדרת זמן כוח וחשיפת ליזר המבוסס על עוצמת transgene עבור ~ 20 עובר מהונדס עם התפתחות מואצת (העלה כלומר על 32 מעלות צלזיוס; צעד 6.2.8).
        הערה: עבור מחקרים מהופעת ביטוי transgene, עוברי ניסיוני מראות קרינה בזמן הזמן לשגות מוגדר וכך, עובר אלה מואצות הם קריטיים לקביעת הפרמטרים של ההדמיה.
      2. לקבלת המנה הניסיונית, לדמיין כל עובר ולשמור את המיקום ואת להתמקד רמות של העוברים.
        1. בחר עובר כי יש זווית ההרכבה הנכונה (כלומר עם הים לרוחבIDE של העין כמו אופקי ככל האפשר) ואת לב חזק (אינדיקטור של בריאות). בחר עובר עם כמה תאי תורם מושתל (מזוהים על ידי ה- GFP-H2A או תיוג H2B-RFP) בעיקר ברבע הגחון הקדמי של הרשתית מתפתחת (שם הגל של ביטוי גנים מתחיל) (איור 3 ג).
          הערה: עוברי דג הזברה, את דופק הממוצע הוא 120 - 180 פעימות / 25 דקות. בשינה עוברת בהרדמה, פעימות לב בריאות עשויות להיות בטווח 60 - 120 פעימות / דקה. איטי דופק היכול להוות מדד הכדאיות מופחת ואלה עוברים צריך להיות מהמחקר.
      3. גדר Z- ערימות של חלקים אופטיים ב 2 מיקרומטר במרווחים דרך הרשתית של עד 15 עובר.
        הערה: המספר הכולל של עוברים ניתן הדמיה בכל ניסוי נתון יהיה תלויים פרמטרים בודדים (זמן חשיפה וגדל Z- מחסנית). הזמן שלוקח לתמונת פעם 1 נקודות עבור כל העוברים נבחרו חייב להיות shorter מאשר המרווח בין נקודות הזמן. על ידי הקרבה כמה רזולוצית עומק, יותר עוברים ניתן הדמיה בתוך מרווחי הזמן. המגבלות של Z- המחסנית נבחרות כמו קצוות לרוחב המדיאלי של העין העוברית רכוב ו -30 מיקרומטר מתווספים הצד לרוחב בהגדרת מיקרוסקופיה הזקופה, כמו בעיני העוברים המתפתחים משמרת התקנה זו בכיוון z כמו העוברים לגדול בין לילה. תוצאת ערימות 100 - 170 עובי מיקרומטר (50 - 85 תמונות / עין).
      4. צלמו תמונות בכל 24 דקות ב 32 מעלות צלזיוס (שווה ערך ל 0.5 hpf במרווחים) באמצעות המתאים לייזר / ערוץ אל transgene.
        הערה: עובר להישאר על הבמה לאורך כל הזמן לשגות כולו בתוך מחומם חדר המקיף את המיקרוסקופ כולו. בעוד ניתן לבצע את הניסוי על 28 מעלות צלזיוס, בטמפרטורות חמות משמשות כדי להאיץ פיתוח ולהבטיח כי נקודות הזמן הרלוונטיות בניסוי הם צלמו בתוך 16 - 24 שעות הזמן לשגות התקופה.
      5. תמונהערוצים המייצגים את תווית התורם (H2A-GFP או-RFP H2B - אופציונאלי) transgene (Atoh7: RFP או Vsx1: GFP) באמצעות סריקה סדרתית. לניתוח, לנצל את תווית התורם רק לבחור עובריים מתאים כמתואר (לקחת אחד Z- מחסנית בתחילת ההדמיה) ולאחר מכן לבצע זמן לשגות רק בערוץ ללכוד את ביטוי transgene.
        הערה: לחילופין, להשתמש בתווית התורם רק כדי לבחור עוברי המתאים (שאוכלוסייתן מונה התאים המושתלים אישר ברבע הגחון הקדמי) ותמונה רק בערוץ transgene, ומורידים בחצי זמן הדמיה וכמעט הכפלה של מספר העוברים ניתן הדמיה וניתח לכל הניסוי (איור 4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    עבודה זו מציגה פרוטוקול ניסוי להעריך שינויים בעיתוי ביטוי גנים כאשר אבות רשתית סוג בר להתפתח בתוך עובר מארח morphant. עובר מארח ניסיוני הם morphants Ptf1a, אשר חסרים את interneurons האופקי amacrine ביניים הנולד של הרשתית 7, 26. אלה היו לעומת שליטה לארח עוברי, אשר הוזרקו עם morpholino שליטה סטנדרטי.

    מאז נוירוגנזה של סוגים שונים של נוירונים ברחבי מערכת העצבים המרכזית (כולל הרשתית) מתרחשת שמור ביותר histogenic כדי 27, 28, 29, 30, 31 ההתקדמות של גורלו יכולה להיות תלויה פידבקים תאים שאינם אוטונומייםמצבירת סוגי נוירונים נולד קודם לכן. השערה זו נבדקה על ידי הערכת העיתוי של דור שלם של עצבית נולד בהמשך ובתאים המושתלים בפיתוח בהעדר סוגי נוירונים נולד ביניים. כביקורת, התזמון של תאים נולדו מוקדם היה לכמת גם, שאמור להיות מושפע באופן בלתי תלוי אם תאי ביניים נוצרים או לא. לשם כך, את Tg (atoh7: RFP) או Tg (atoh7: gapGFP) קווי שימשו כדי להמחיש את התחלתה של neurogenesis תא גנגליון הבכור בעוד Tg (vsx1: GFP) קו שימש להעריך התפתחות של המנוח אוכלוסייה דו קוטבית נולדה. מלבד בנוסף המבטא את transgenes הכתב, תאי התורם מעובר אלה הם גנטיים WT.

    Microinjection של 1 NL mRNA (לתאי התורם התווית) בחלמון של תוצאות בעוברים תא בודד בביטוי חלבון כתב ניאון ב -3 hpf, שבהלביים התורמים המבריקים נבחרים (איור 1). כן התקנה השתלה כאשר הם עוברים כ -2 hpf (איור 2). בגיל 24 hpf, עובר עם תאי תורם מושתלים במקומות הרשתית הרלוונטיים נבחרים ועליתי נמוך להמס agarose 1% בחמישיות (איור 3). לאחר שמירת המיקום העובר, קביעת Z- מחסנית והפרמטרים זמן, זמן לשגות הדמיה מתבצע במשך 16 - 24 שעות. עיתוי תאי גנגליון נולד הראשון מציין את התחלתה של Atoh7: RFP או Atoh7: gapGFP transgene והעיתוי של הדור דו קוטבית נולד האחרון הוא הצביע על ידי הגברת הביטוי החזק של Vsx1: transgene GFP, אשר באה לידי ביטוי גם בהירות מובהק נמוך רמות האבות המתפתחים. העיתוי של ביטוי transgene הראשון, כגון Atoh7: gapGFP מזוהה בתאים בודדים בכל timepoint של הדמיה (ראשי חץ לבן, איור 4). Atoh7: gapGFP ו occu התמיינות תאי גנגליוןrs בזמנים שווים בין אם לעובר המארח הוא WT או Ptf1a morphant חסר ביניים (כלומר לאחר לידת תא גנגליון) תאים אופקיים amacrine.

    הנתונים המוצגים להוכיח כי גישה ניסויית זה מספק כלי רב עצמה כדי להעריך את התפקיד של סביבות רשתית מיוחדות על עיתוי ביטוי גנים, עם השלכות רלוונטיות, לא רק להבנת תהליכים התפתחותיים נורמלים אלא גם עבור יישומים עתידיים של אסטרטגיות תכנות מחדש תאים בתנאים בריאים וחולה .

    איור 1
    איור 1: Microinjection בחלמון של תא בודד שלב עובר להשתמש בתווית תאים תורמים וליצור סביבות מארח שונות. א) עובר מיושרים כנגד הקצה של זכוכית שקופית עם רוב מחדש הנוזל הסובבנִרגָשׁ. ב) המחט מוחדרת לתוך במרכז חלמון ואו H2A-GFP או H2B-RFP mRNA (עבור התורם) או morpholino (תקן MO או Ptf1a MO עבור המארחת) מוזרקים. ג) מחט הזריקה מופקת באמצעות חולץ מחט שיוצר שתי מחטים סימטריות מכל נימים. כל מחט משך מכן צריך להיות הקצה שבור עם מלקחיים כדי לפתוח את המחט תוך מתן טיפ בזווית חד (לא להקהות) שניתן להוסיף בקלות לעוברים. עוברי D) תורם מוזרק עם H2B-RFP mRNA בשלב התא הבודד להתחיל להביע את החלבונים כתבו ניאון ב -2.5 hpf, באיזה שלב את העוברים המבריקים ביותר השווה שכותרתו ניתן לבחור. E) בסביבות 2.5 - 3 hpf, עובר תורם מארח dechorionated enzymatically באמצעות פרוטאזות. מתערבל של בקבוק Erlenmeyer מספק את הכח המכאני הצורך לקטוע את chorions הפתוח נחלש ומביא עובר dechorionatedים למרכז. ברגע הראשון (כוכבית) או כמה עוברים dechorionated הם נצפו, שטיפה מהירה אבל עדין מבטיח שהפתרון פרוטאז מוסר. F) עבור העברה עוברת dechorionated, טפטפות העברת זכוכית מנוצלת. יכול להתקצר אלה בתחילה (אופציונלי) לכל אורך כי הוא תימרן בנוחות על ידי המשתמש, על ידי גירוד הזכוכית במיקום המתאים עם סכין יהלום עד שייתפס מחוץ. התוצאה היא קץ קיצוץ חד, אשר צריך להיות האש המלוטשת כדי להחליק כל קצוות גסים שעשויים להזיק לתאים נשאבה לתוך פיפטה במהלך העברה. ברי סולם A, B, D, E = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    איור 2: הגדרת השתלה. ב) צינורות ההשתלה לראות מעיד עד כמה הדלפות פוטנציאליות מפרקי מנועים פשוט באמצעות מרק moldable וקולנוע פרפין. C) מראה בהגדלה גבוהה יותר של הקשר בין צינורות ההזרקה וכל צינורות מתאימים להתחבר המזרק. בעוד כל צינורות יכולים לשמש, הצינור מנוצל כאן בעל קוטר כי בחוזקה המתאימה קצה פיפטה 10 μL. השתמש בסרט פרפין כדי להבטיח חותם חזק. יש ד) העובש 150 (6 x 25) טריזים על מנת ליצור את divots המשולש בצלחת הזרקת agarose. E) ממדים המשוער בכל צורת טריז מוצגת. מדידות החברה הן קניינים. F)צלחות הזרקת agarose מוכנות עם חריצים בצורת טריז משמשות עם עוברי תורם הוסיפו לעמודה הראשונה ועמודות 2 - 6 מלאים לארח עוברי. השתלות מתבצעות על פני השורה, לפיה התאים שנאספו מתורם אחד בכל שורה ניתן להשתיל לתוך 5 לארח עוברי. בתוך כל עובש, תאים עד 25 תורמים ניתן להשתיל לתוך עד 125 עוברים המארח. שים לב העובש מושם סימטרי עם הסוף העמוק יותר של הטריז קרוב יותר לקץ צלחת פטרי. זה מאפשר את מחט ההשתלה מהצד הימני מבלי להכות את קץ צלחת פטרי. G) מחט ההשתלה נמשכת עם באותם פרמטרים כמו מחט הזריקה כדי לגרום טיפ מחודד ארוך המוצג כאן. המחט חייבת להיות שבורה כדי ליצור קוטר פנימי גדול יותר זה יכול לקחת עד תאים בלי לעוות אותם. הבלעת כוח עליון מראה כי קצה מחט ההשתלה צריך להיות בזווית באופן אידיאלי יש צורה "חליל" כמוצג בדוגמה זו. H) גבוה נוף כוח תערוכות כיוון של עוברי מארח עם תאים בחלק העליון. מחט ההשתלה מוכנסת לתוך מסת התאים של העובר מארח בשלב blastula הרוחבית (כוכביות לבנות) ודחפה לתוך העין בעתיד כפי שמוצגת כאן. תאי תורם ניתן לראות את מחט ההשתלה (חץ) ובכך הגיעו המספר הגס של תאים המושתלים ניתן לשלוט. שתי דוגמאות I) (שמאל וימין) מראה כי מיד לאחר ההשתלה, העוברים עם התאים המושתלים בהצלחה במיקום הנכון יכול מיד להיות מיינו באמצעות תווית התורם (למשל, H2B-RFP). ערוץ ניאון נוסף brightfield באמצעות "להתחמק ליניארי (להוסיף)" תחת תפריט השכבה ב העורך הגרפי סריקה. סרגל קנה מידה (עבור H, I) = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    ss = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 3
    איור 3: עובר הרכבת הדמית זמן לשגות. א) צלחת פטרי (90 מ"מ) מראה טיפות נמוכה להמיס agarose מרובות המכיל חמישה עוברים כל המחוברים על ידי agarose ליצירת רשת בנחישות על מנת למנוע טיפות בודדות מתוך ניתוק. B) כוח צפייה גבוהה של 24 hpf עוברים מיושרים רוחבי מוטבע בתוך agarose הקרושה. עבור הזווית האידיאלית, שתי העיניים צריכות להיות ממוקמות על גב אחד את השני (ב-ממד z). בהתאם הגן של עניין לתלייה צריך להתעכב עד זמן קצר לפני העיתוי הרלוונטי (למשל, 26 hpf לבידול תא גנגליון או 35 hpf עבור תחילת התמיינות תאים דו קוטבית). C) תמונת Confocal של שכבה מראה z-סעיף אופטי בודד של brightfield וערוצי אדום (באמצעות "להתחמק ליניארי (להוסיף)" תחת תפריט השכבה בעורך תמונת מפה סיבית) של העין מתפתחת עם תאים תורם כמה שכותרתו (אדום) בתוך סביבת מארח ללא תווית אחרת. סרגל קנה מידה B = 1 מ"מ, סרגל קנה מידה C = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    איור 4: עיתוי הנוירוגנזה ניתן דמיין בתאים תורמים טרנסגניים הושתלו סביבות מארח שונות. Micrographs מתמונה זמן לשגות של תאי התורם WT בפיתוח מ Tg (atoh7: gapGFP) עוברים מהונדס הושתלו מארח WT ללא תווית. הופעת ביטוי transgene מותווה מספר תאים על ידי ראשי חץ לבן. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר of דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    הבנתי את המידה שבה תאי שכנים להשפיע עיתוי של הביטוי של גורמים בקביעת גורל תא חיוני חיוני כאשר מכוונים להורות עוברי או מושרה ביעילות תאי גזע מולטיפוטנטיים להתמיין לסוג תא ספציפי שלאחר mitotic או אפילו רקמה בדוגמת. יתר על כן, בחינת האירועים המולקולריים האלה בתאים המתפתחים של החי בנוסף מספק דינמית רלוונטי (זמן ומרחב) מידע על הקשרים הסלולר המסוימים בקשר עם אירועים אלה in vivo. מחקרים כאלה לא ניתן להשיג בקלות בכל דגמי החוליות.

    בפרוטוקול שהוצג, עובר דג הזברה המקובל מנוצל כמודל החולייתנים במטרה לענות על שאלות אלה in vivo, בתוך הרקמה בדוגמת תלת ממדים פשוט יחסית, עדיין מאוד מאורגן של הרשתית החולייתנים. זה בא לידי ביטוי על ידי בחינת ההשערה כי ומכלת תא ברשתית בפרטסוג השפיע עיתוי ביטוי גנים וגורל ההתפתחותי של ובתאים רשתית. אנחנו יכולים גם לנצל את סמן התא התורם לעקוב אחר תאים ספציפיים אחורה בזמן כדי להעריך, למשל, לפני כמה זמן את הביטוי של transgene תא postmitotic עבר החלוקה האחרונה שלה, או להעריך את ההתנהגות הכללית של התא הזה (למשל, הגירה) בשלבים שונים לפני ביטוי transgene בסביבות שונות. עבור מחקרים אלה, שילוב של קל יחסית לביצוע טכניקות מוצגות, הכולל גני morpholino בתיווך להפיל, השתלת הדמיה לחיות. לקבלת שיטת ההשתלה, הפרוטוקול מציג רומן, אסדת השתלה קלה וזולה יחסית ממחיש את הקלות של המערך התפעולי הזה.

    פרוטוקול זה אינו מוגבל הרשתית. זה יכול להיות מיושם גם ללמוד מספר תהליכים תאיים שונים דינמי, הדורשים מתירה של developm תאים אוטונומייםתוכניות ental והשפעות סביבתיות שאינם אוטונומיות תא. עם זאת, בזמן פתרון בעיות מעט נדרש, מספר צעדים קריטיים צריכים להילקח בחשבון לפני תחילת ניסוי. תנאי חשוב אחת עבור היישום המוצלח של הטכניקה הוא כי האיבר או הרקמה של בחירה צריך להיות ממוקד בקלות בעובר מוקדם באמצעות מפת הגורל. אם את היעילות של מיקוד רקמות לא נבדקה בעבר, זה צריך להיות מותאם ראשון וסטנדרטי. מספר עוברי microinjected והושתלו ניתן להגדיל הוקרן לפני לחיות הדמיה להשיג עוברים מספיק עם תאי התורם משולב כראוי ואת מיקומו בתוך הרקמה הרלוונטית. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות לשלבים דג הזברה עובריים מוקדם, בקשה בשלבים מאוחרים יותר כגון הזחלים גדל להיות יותר קשה משתי סיבות. ראשית, את היעילות של הגן מציאה השגה עם morpholinos פוחת עם הזמן (דהממתין על כל morpholino, זה הכי יעיל בדרך כלל לפני 3 DPF). כדי לעקוף בעיה זו, השימוש של מוטציות גנטיות כמו עוברי תורם להשתלה עדיף. שנית, כמו דג הזברה גדל, בחלקים עמוקים יותר של הזחלים להיות פחות נגיש הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal, במיוחד בהגדלות גדולות (מטרות מתח גבוה) שבו מרחק עבודה של המטרה מיקרוסקופ הוא יותר מוגבל. לפיכך, כל רקמה של עניין בגיל רלוונטי צריכה להיבחן ראשון עבור amenability שלה הדמיה.

    הדמית הזמן לשגות יכולה להתבצע גם על מיקרוסקופ confocal הפוך או זקוף.

    ישנם מספר היתרונות של המיקרוסקופ הזקוף, אם זמין. בטמפרטורה הנדרשת, אידוי של חומר הטבילה המשמש (למשל, מים או שמן טבילה עם מקדם שבירת מים) על מיקרוסקופ הפוכה יכולים להוביל ייבוש מלא החוצה. זה דורש ניטור מתמידבסופו של דבר מילוי, עם הסיכון של צבת המדגם מחוץ לפוקוס. זה יכול להימנע חלקית באמצעות אוטומציה כדי להקטין את מטרת מרחק מוגדר, הוספת חומר הטבילה וההעלאה האובייקטיבית שוב, למרות שעל פי ניסיוננו, refocusing הוא לעתים קרובות עדיין נדרש, שאמור לקרות לפני תחילת הנקודות בפעם הבאה של הדמיה . שנית, המנות התחתיות coverslip הגדולות אנו שמקורו עדיין קטנות בהרבה (50 מ"מ קוטר) מאשר צלחות פטרי בקוטר הסטנדרטיות 90 מ"מ מנוצלות עבור במיקרוסקופ הזקוף. משמעות הדבר היא כי המספר עוברי שיכול להיות מותקן ואת הנפח הבינוני העובר הוסיף מוגבלים יותר בעת שימוש מיקרוסקופי הפוך. אף על פי כן, הפרמטרים זמן לשגות מהווים בדרך כלל את הגורם המגביל העיקרי עבור מספר העוברים כי ניתן הדמיה ולכן הגודל של המנה הוא עדיין מתאים. בעת שימוש מטרות בהגדלה גבוהה מאוד, מיקרוסקופיה ההפוכה עשויה לאפשר לעומק רב יותר z-הממד כמו העיןהמטרה מופרדים רק על ידי coverslip דק. כאשר שילוב בהגדלה גבוהה מאוד עם מיקרוסקופ הזקוף, ירידת agarose מכסה את העובר חייבת להישמר דקה ככל האפשר. בסך הכל, הנתונים שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ זקוף או הפוך הם באיכות שווה.

    עבור דור של נתונים באיכות גבוהה, ישנם צעדים קריטיים נוספים שצריכים להילקח בחשבון. ראשית, בחירה של תורמים במאור שכותרתו היא קריטית להשגת עוברים מושתלים עם מספר מתאים של תאים מושתלים בעיניים בתחילה של הזמן לשגות סרטים (כמה, אבל לא יותר מדי). Dechorionation האנזימטית פרוטאז הוא שלב קריטי ו דגירת פרוטאז צריך להישמר עד למינימום ואחריו מהיר, אבל עדין מי שטיפה לא להשפיע על הבריאות העוקבת של העוברים. התאמת גיל של עוברי תורם מארחים מאפשרת רקמות מדויקות מיקוד לפי מפת הגורל עבור אינטגרציה יעילה של התאים. התחלה חדשה השתלה חטובהedle חשוב, להבטיח כי הטיפ הוא קטן וחד מספיק כדי להכניס לעוברי המארח ללא גרימת נזק רב, אבל גדול מספיק קוטר פנימי שלא לגרום נזק מכני התאים להעברה. במהלך השתלה, אם הציוד אינו אטום לחלוטין (במיוחד בנקודות חיבור), זה מאוד קשה לשלוט על התנועה ידנית של מדיום ותאי E3 לתוך והחוצה של מחט ההשתלה. הדבר בולט במיוחד כאשר יש זרימה או פנימה או החוצה את מחט ההשתלה מבלי לשנות את עוצמת המזרק ידני. במקרה זה כל המפרקים חייבים להיות מחדש בדקו resealed. זה אמור להיבדק מראש של הניסוי.

    לבסוף, במהלך הזמן שחלף בין ההשתלה והתקנת הזמן לשגות, זה קריטי, כי את העוברים המושתלים מותר לפתח בצפיפות נמוכה תוך ניקוי בקפידה מתוך כל עוברים בריאים. הדבר חשוב במיוחד, כאשר העיתוי של פיתוח או genביטוי דואר נחקר. בהערכות התזמון של כל תהליך (למשל, ביטוי גנים), שולטת חייב לשמש כדי לשלול תופעות לוואי הלא ספציפית של הטכנולוגיה morpholino. בעבודתנו, אנו משתמשים עיתוי ביטוי transgene בתוך רקמות שאינן קשורות (למשל, השריר) מושפעות הגן הספציפי על הכוונת של morpholino.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    עבודה זו נתמכה על ידי ARC DECRA כדי PRJ (DE120101311) ועל ידי (DFG) מענק מחקר כדי LP (PO 1440 / 1-1). המכון לרפואה רגנרטיבית האוסטרלי נתמכת על ידי קרנות מממשלת מדינת ויקטוריה הממשלה הפדרלית האוסטרלית. אנו מכירים ד"ר ג'רמי נג צ'י Kei, שניהל הניסויים שתוארו כאן כפי שפורסם Kei et al. 2016. אנו מודים על הוראות דג מהונדס מפרופ Higashijima ותודה פרופ. טרנר רופ למתן של pCS2 + פלסמיד וד"ר וילקינסון להפקת בונה H2B-RFP ו H2A-GFP. אנו מודים צוות המתקן FishCore (אוניברסיטת מונאש) עבור מטפלת החיות שלנו.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

    Tags

    ביולוגיה התפתחותית גיליון 121 דג זברה השתלה הכימרה הדמיה חיה תאים הלא-אוטונומית רשתית עיתוי ביטוי גנים נוירוגנזה
    <em>In vivo</em> הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter