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Developmental Biology

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Abstract

I punti di forza genetici e tecnici hanno fatto la vertebrati zebrafish organismo modello chiave in cui le conseguenze di manipolazioni genetiche possono essere rintracciate in vivo per tutto il periodo di sviluppo rapido. Più processi possono essere studiati tra cui la proliferazione cellulare, l'espressione genica, la migrazione delle cellule e la morfogenesi. È importante sottolineare che la generazione di chimere attraverso trapianti possa essere effettuata facilmente, permettendo etichettatura mosaico e monitoraggio delle singole celle sotto l'influenza dell'ambiente host. Ad esempio, mediante la combinazione di manipolazioni funzionali di geni dell'embrione host (ad esempio, attraverso morfolino microiniezione) e l'imaging dal vivo, gli effetti di estrinseco, segnali non autonomi cellulari (forniti dall'ambiente geneticamente modificati) su singole cellule del donatore trapiantate possono essere valutate. Qui mostriamo come questo approccio viene utilizzato per confrontare l'insorgenza di espressione del transgene fluorescente come proxy per i tempi del destino delle cellule determinzione in diversi ambienti host genetica.

In questo articolo, forniamo il protocollo per microinjecting embrioni di zebrafish per marcare cellule del donatore e di causare silenziamento genico in embrioni di accoglienza, una descrizione della tecnica di trapianto usato per generare embrioni chimerici, e il protocollo per la preparazione e l'esecuzione in vivo confocale time-lapse imaging più embrioni. In particolare, l'esecuzione di imaging multiposizione è cruciale quando si confrontano tempistica di eventi come l'insorgenza di espressione genica. Ciò richiede la raccolta di dati dal controllo multiplo e embrioni sperimentali elaborati contemporaneamente. Tale approccio può essere facilmente esteso per gli studi di influenze estrinseche in qualsiasi organo o tessuto di scelta accessibili a vivere l'imaging, a condizione che i trapianti possono essere mirati facilmente in base alle mappe destino embrionali stabiliti.

Introduction

La possibilità di visualizzare importanti processi di sviluppo in un vertebrato in vivo ha contribuito a rendere il pesce zebra un modello chiave per lo studio condizioni normali e di malattia (recensione in 1, 2). In particolare, la retina neurale è una parte accessibile del sistema nervoso centrale. La retina si presta per effettuare facilmente studi di neurogenesi per la sua altamente organizzata, ma struttura relativamente semplice, ed i suoi tipi di neuroni altamente conservati tra le specie di vertebrati 3. Dinamica dei comportamenti cellulari come la proliferazione, l'uscita del ciclo cellulare, la divisione cellulare asimmetrica, specifica il destino, la differenziazione, e la formazione di circuiti neurali possono essere seguiti durante tutto il processo di retinogenesi, che si completa nella retina centrale del pesce zebra da 3 d postfertilization ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.

Inoltre, i requisiti funzionali dei diversi geni in ciascuna delle fasi di cui sopra possono essere contemporaneamente valutati nella retina zebrafish, fornendo un vantaggio rispetto ad altri modelli di vertebrati in cui fenotipi derivanti dall'applicazione di tecniche di gene knockout può essere valutata solo dopo l'esame post-mortem di fisso tessuti. In particolare, l'uso di linee transgeniche in cui possiamo visualizzare e monitorare l'espressione di proteine ​​fluorescenti come transgeni giornalista nella retina, ci permette di ottenere risoluzione temporale di espressione genica che sottende la genesi di un particolare tipo di cellule neuronali. A causa del rapido sviluppo di zebrafish, questi eventi possono essere visualizzati durante l'intero periodo di sviluppo, fornendo in tal modo una più profonda comprensione sull'importanza temporale di espressione genica in relazione all'acquisizione identità delle cellule neuronali e il comportamento delle cellule.

Infine, questi approcci possono essere combinati in modo efficiente nel pesce zebra con la generazione di chimere via trapianti, con conseguente intuizioni in due aspetti fondamentali della funzione del gene. In primo luogo, esaminando le cellule trapiantate da un embrione donatore, in cui un particolare gene è stato abbattuto mentre si sviluppano in un ambiente senza etichetta wild type, ci permette di ottenere le informazioni pertinenti circa la funzione del gene in modo cellula-autonomo. Questo porta a importanti intuizioni circa la funzione di fattori destino determinanti della retina all'interno delle cellule progenitrici sono normalmente espressi in. Questo è esemplificato dal l'esame dei risultati destino di sviluppo dei progenitori che non può più generare proteina funzionale di questi geni 4, 6, 8, 9. Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che i fattori determinanti molti Fate (ad esempio, Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) agiscono cellule-autonomously guidare specifici sorti neuronali della retina; la mancanza di espressione genica comporta principalmente un interruttore destino, tale che le cellule con silenziamento genico rimangono vitali adottando un destino alternativo cella 4, 6, 7, 10. In secondo luogo, tali esperimenti chimerici possono essere utilizzati per valutare come selvaggio di tipo progenitori si comportano quando si sviluppano all'interno di diversi ambienti genetici. Ad esempio, confrontando lo sviluppo di cellule WT che normalmente esprimono un gene di interesse (e giornalista transgene) in un WT rispetto ambiente host manipolato (ad esempio, gene knockout / knockdown), gli effetti derivanti sull'espressione genica e destino cellulare possono essere valutati . La mancanza di alcuni tipi di neuroni in ambiente host, ad esempio, è stato dimostrato di influenzare wild type comportamento progenitore in maniera cellule non autonomo, per sollecitare loro verso differenziazione nel o sottorappresentatir mancante tipi di neuroni 4, 7, 11, 12. Dato che i neuroni della retina sono nati in un ordine histogenic conservata dalla fasatura sequenziale espressione di specifici geni destino determinanti neuronali (destino espressione genica) (rivisto in 13), abbiamo utilizzato questi metodi per dimostrare come la tempistica di espressione genica destino in progenitori di tipo selvatico è influenzato quando tali progenitori si sviluppano in ambienti host della retina con composizioni cellulari aberranti indotte. Qui, descriviamo questi approcci come prova di come la combinazione di tecniche relativamente standard e ampiamente utilizzati consente l'esame della tempistica di espressione genica destino nello sviluppo di progenitori retinici 8, 9.

Questo protocollo descrive un approccio sperimentale che combina l'imaging time-lapse con la facilità di ogniformando il trapianto nella ex vivo in via di sviluppo dell'embrione zebrafish per seguire mosaically individuale cellule marcate durante l'intero periodo di retinogenesi sviluppo. Eseguendo manipolazioni genetiche funzionali sia nell'embrione di accoglienza, embrione donatore, entrambi o nessuno, si può valutare l'autonomia delle cellule della funzione del gene. Questo approccio può essere adattato ampiamente domande di ricerca simili a qualsiasi altro sistema per cui i singoli componenti descritti qui sono adatti.

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Protocol

Tutte le procedure sono state effettuate secondo le disposizioni del codice australiana National Health and Medical Research Council di pratica per la cura e l'uso di animali e sono stati approvati dai comitati etici istituzionali.

1. Preparazione di Zebrafish

  1. Adulti abbinamento pesce
    1. Impostare pesci adulti come coppie (o due coppie) in vasche di allevamento di dimensioni in modo appropriato la sera prima dell'uso.
    2. Per mantenere la femmina separata dal maschio, utilizzare un divisore per consentire il pesce di vedere, ma non si toccano.
    3. Al mattino, dopo l'accensione la luce, togliere i divisori e permettere ai pesci di accoppiano indisturbati.
    4. Dopo l'accoppiamento con successo messo pesci adulti nelle loro vasche originali.
      NOTA: ceppi di host e donatore può essere lo stesso, ad esempio, eventuali wild type (WT) ceppi. Per questo studio gli embrioni donatori derivano dalle linee transgeniche Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) oTg (vsx1: GFP) in cui l'espressione di fattori determinanti destino di guida in anticipo o in ritardo destino neurale possono essere visualizzati, rispettivamente di 14, 15, 16. Al fine di confrontare gli effetti di diversi ambienti genetici, gli embrioni host può essere mutanti o morphants specifici come descritto di seguito.
  2. raccolta degli embrioni
    1. Utilizzare un colino da tè per raccogliere le uova dalla casella di allevamento. Verificare la presenza di uova ogni 15 minuti per determinare il momento della nascita e garantire embrioni stadio unicellulari sono raccolti per le fasi successive.
    2. Risciacquare embrioni con mezzo E3 (5 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,4 mM CaCl 2, 0.9 mM MgCl 2 e 2% di blu di metilene in acqua distillata) e metterli in piastre di Petri contenenti ~ 40 mL E3 17 ad una densità massima di 50 uova per 90 millimetri di diametro Petri.
    3. Etichettare le piastre di Petri con il nome ceppo, data e ora dinascita. Utilizzare una pipetta Pasteur di trasferimento per rimuovere eventuali detriti, mentre la visualizzazione degli embrioni sotto il microscopio da dissezione.
    4. Mantenere gli embrioni a 28,5 ° C fino a ~ 3 ore postfertilization (HPF) per il trapianto, o continuare con microiniezioni.
      NOTA: Per i trapianti, obiettivo per gli embrioni di donatori e di accoglienza in età simili. Pertanto, utilizzare diverse temperature di allevamento tra 25 - 32 ° C secondo Kimmel et al. 18 di rallentare o accelerare una frizione di embrioni per abbinare l'altro.
    5. Mantenere ~ 20 degli embrioni donatori transgenici uninjected a 32 ° C dal momento della raccolta fino time-lapse imaging (24 - 28 ore più tardi).
      NOTA: Queste svilupperanno più velocemente di quanto la coorte sperimentale e potranno esprimere marcatori fluorescenti in precedenza. Essi possono quindi essere utilizzati per impostare i parametri (laser di potenza, guadagno) per l'imaging. In questo particolare esempio, l'imaging della coorte sperimentale comincia prima espressione del transgene (per valutarel'esatta tempistica di questo evento).

2. Preparazione per la microiniezione

  1. preparazione microiniezione ago
    1. Utilizzare un estrattore ago per tirare gli aghi da ciascun tubo capillare di vetro borosilicato (1,0 mm di diametro / 0,78 mm ID / 100 mm di lunghezza capillari di vetro) al centro per ottenere due aghi di uguale lunghezza. Obiettivo per gli aghi che si assottigliano con alberi lunghi.
      NOTA: Le impostazioni di esempio per l'estrattore ago usato qui sono forniti nel Lista dei materiali.
    2. Conservare gli aghi tirati in una capsula di Petri e fissare premendoli in una striscia di stucco modellabile o nastro adesivo.
    3. Prima dell'iniezione portare la punta dell'ago a fuoco in un microscopio da dissezione e utilizzare pinze per rompere l'ago sulla punta. Obiettivo per una punta conica tagliente con una piccola apertura (Figura 1C).
    2. <li> preparazione Morpholino per gli embrioni di accoglienza
    1. oligonucleotidi ordine morpholino specificamente progettati per il gene di interesse, nonché un morfolino controllo standard o un adeguato mancata corrispondenza 5 paia di basi per controllare gli effetti procedurali e di movimentazione.
      NOTA: Qui, una traduzione bloccando Ptf1a morfolino con la sequenza 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'che inibisce lo sviluppo delle cellule orizzontali e amacrine nati intermedi, e morfolino controllo zebrafish serie di targeting beta-globina umana introne mutazione (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 sono stati utilizzati.
    2. Preparare una soluzione 1 mM morfolino magazzino (~ 8-8,5 ng / NL) e conservare a temperatura ambiente.
    3. Il giorno dell'iniezione, riscaldare una aliquota (10 mL) di morfolino a 65 ° C per 10 minuti, centrifugare brevemente e posto sul ghiaccio per raffreddare da 65 ° C (dopo di che può essere conservato a temperatura ambiente durante l'uso). thè invertirà qualsiasi potenziale aggregazione all'interno della soluzione morfolino, che può diminuire l'efficacia della atterramento.
      1. Per Ptf1a morfolino ed equivalente morfolino controllo standard, preparare una soluzione di lavoro di 6 ng / NL diluendo la soluzione madre morfolino con acqua distillata. Mantenere a temperatura ambiente.
        NOTA: L'uso 2 NL del morfolino per embrione come il Ptf1a morfolino richiede una concentrazione relativamente alta di lavoro di 12 ng per embrione come stabilito in precedenza 7. Per la maggior parte morpholinos, 2-5 ng per embrione è efficace, in modo da diluire il brodo di 2-5 ng / NL e iniettare 1 NL in ogni embrione.
  2. Preparazione fluorescente giornalista fusione istone costrutti per gli embrioni di etichettatura dei donatori
    NOTA: Per distinguere / visualizzare le cellule del donatore all'interno embrioni di accoglienza, ci sono diversi approcci per etichettare l'embrione donatore, tra cui la microiniezione di H2A-GFP (se si utilizza donatori transgeniche congiornalisti fluorescenti rossi) o H2B-RFP (se si utilizza donatori transgenici con i giornalisti fluorescenti verdi) mRNA nel tuorlo della singola cellula embrionale fase del donatore.
    1. Linearizzare almeno 1 ug plasmide contenente il DNA giornalista.
      NOTA: Qui pCS2 + plasmide (generata e gentilmente fornito dal Prof. David Turner presso l'Università del Michigan e il Prof. Ralph Rupp dal Biomedical centro di Monaco di Baviera) contenente H2A-GFP o H2B-RFP (generato dal Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, Università di Londra) è stato linearizzato con NotI enzima di restrizione digestione.
    2. Purificare DNA utilizzando kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
    3. Trascrivere mRNA utilizzando kit disponibili in commercio con polimerasi appropriato secondo le istruzioni del produttore. Per il plasmide pCS2 +, utilizzare un kit SP6 polimerasi.
    4. Purificare mRNA utilizzando kit commerciali o estrazione con fenolo-cloroformio seguita da isopropanolo precipitazioni come da istruzioni del produttoreS. Diluire il mRNA in acqua ultrapura (20 - 30 mL), misurare la concentrazione con uno spettrofotometro e conservare a -80 ° C.
    5. Il giorno dell'iniezione, preparare una soluzione di lavoro di mRNA in acqua sterile con una concentrazione finale di 100 ng / ml e tenere in ghiaccio. Rientro mRNA inutilizzato magazzino torna a -80 ° C.

3. la microiniezione di Morpholinos e / o di mRNA in Single-cell fase embrioni

NOTA: microiniezioni sono usati per contrassegnare tutte le cellule del donatore e per preparare i diversi ambienti host (controllo e silenziamento genico) e coinvolgono iniezioni di mRNA o morfolino oligonucleotidi antisenso 20, 21.

  1. Caricamento e calibrare l'ago per l'iniezione
    1. Ritardare l'ago per l'iniezione con 3 ml di morfolino e / o soluzione fusione mRNA istone-fluorescente con punte microloader pipette.
    2. Agitare il solutione verso la punta dell'ago iniezione fino a quando non vi siano bolle rimanenti. Utilizzare aghi per iniezione con un vetro interno inserire tale che questa soluzione sarà tratto principalmente alla punta per capillarità.
    3. Attaccare l'ago per l'iniezione di un supporto montato in un micromanipolatore (micromanipolatore manuale 3D) e di garantire una perfetta tenuta all'interno dell'alloggiamento del tubo.
    4. Accendere l'elettricità e gas alla pressione regolata microinjector.
    5. Immergere la punta dell'ago in una goccia di olio minerale in un piatto (se si utilizza un oculare reticolo) o librarsi la punta dell'ago direttamente su una slitta micrometrica per calibrare il volume goccia. Misurare il volume di iniezione premendo il pedale e regolare la pressione del gas e / o di durata fino a quando il volume di iniezione è equivalente a 1 nL (125 micron di diametro).
      NOTA: Il vantaggio della slitta micrometrica è che le misurazioni sono indipendenti dal ingrandimento utilizzato al microscopio, ma in base alle ins oculare reticolotead, la caduta di iniezione e la scala può essere a fuoco contemporaneamente.
  2. embrione microiniezione
    1. Collocare un vetrino da microscopio in una piastra di Petri e utilizzare una pipetta di trasferimento per depositare embrioni fase unicellulari lungo il bordo diapositiva. Allineare in una singola colonna utilizzando una punta microloader pipetta con la metà della punta sottile tagliare. Rimuovere quanto più liquido possibile con una multa pipetta di trasferimento per impedire movimenti durante le iniezioni (Figura 1A).
    2. Abbassare l'ago verso l'embrione, e penetrare il corion e tuorlo in un colpo regolare (Figura 1B).
    3. Una volta che la punta dell'ago è centrato nel tuorlo, microinject premendo il pedale. Iniettare 1 NL di H2A-GFP o H2B-RFP mRNA nel tuorlo di un embrione donatore fase unicellulare (transgenici). Iniettare 2 NL standard MO o Ptf1a MO nel tuorlo di uno stadio unicellulare wild type embrione ospite premendo due volte il pedale. iniezioni di successo possono essere visualizzati dal Smal l deformazione spaziale nel tuorlo.
    4. Rimuovere l'ago per l'iniezione, spostare il piatto contenente gli embrioni per portare la prossima dell'embrione in posizione e continuare a iniettare fino a quando l'intera colonna di embrioni vengono iniettati (50 - 60 embrioni).
    5. Dopo l'iniezione tutti gli embrioni, sollevare il piatto fino a 30 - angolo di 45 ° e utilizzare una leggera corrente di E3 media (bottiglia squeeze) per trasferire gli embrioni iniettati in un nuovo piatto pulito Petri.
    6. Posizionare il piatto embrione in un incubatore (sia a 28,5 ° C o altra temperatura per garantire che gli embrioni donatori e ospitanti sono in età equivalenti).
    7. Ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.6, se necessario, per ottenere ~ 100 embrioni donatori o ~ 200 - 250 embrioni di accoglienza.
    8. A 1 - 2 HPF, controllare gli embrioni sotto un microscopio da dissezione e rimuovere eventuali uova non fecondate che non hanno avanzato al 2 o 4 celle stadi con un trasferimento pipetta Pasteur.

4. Preparazione per Trapianti

ONTENUTO "> NOTA: Trapianti vengono utilizzati per generare embrioni chimerici tenendo conto degli effetti di differenti ambienti host genetica da valutare entro equivalenti WT progenitori donatori 9, 22, 23.

  1. la selezione degli embrioni donatori
    1. A 3 HPF, controllare gli embrioni donatori a 2 - ingrandimento 5X per il segnale di etichettatura sotto un microscopio a fluorescenza. Selezionare ben sviluppato (massa cellulare simmetrica con le cellule in modo uniforme imprese) embrioni con un forte segnale fluorescente utilizzando la GFP e filtro (460-500 nm di eccitazione, 510 nm emissione di passaggio lungo) o un filtro Texas Red (540-580 nm di eccitazione, 610 nm emissione di passaggio lungo) (Figura 1D). I giornalisti transgenici non sono ancora espressi.
  2. piastra di iniezione agarosio e preparazione piastra di Petri
    1. Versare fuso 2% agarosio diluito in media E3 in un diametro di Petri 90 mm e lasciate raffreddare fino a quando il piatto è sicurotoccare. agarosio calda può altrimenti deformare lo stampo.
    2. Float uno stampo di plastica con sporgenze a forma di cuneo (6 x 25 / stampo) sul agarosio (Figura 2D, E). Evitare bolle d'aria collocando un lato dello stampo sul agarosio e lentamente più in basso l'altro lato. Assicurarsi che lo stampo è centrato nel piatto o verso il lato del punto più profondo delle sporgenze a forma di cuneo per consentire spazio libero sufficiente per l'ago trapianto.
    3. Lasciare che il agarosio solidificare completamente a temperatura ambiente.
    4. Porre la capsula agarosio a 4 ° C per 30 minuti e rimuovere gli stampi sollevando delicatamente da un angolo (ad esempio, con una pinza). Preparare piatti iniezione agarosio il giorno prima dell'esperimento e conservare a 4 ° C con un piccolo volume di E3 tenuta media e paraffina pellicola per evitare che si secchi.
    5. Prima del trapianto, riempire il piatto di iniezione agarosio a media E3 e posto in un incubatore a 28.5 ° per almeno 30 minuti.
      6. <li> Dal momento che gli embrioni dechorionated aderisce alla plastica, sia piatti di vetro di uso o rivestire l'interno delle piastre Petri (90 mm di diametro) con un sottile strato di 2% agarosio in E3. Preparare un piatto per gli embrioni di accoglienza dechorionated, un piatto per gli embrioni donatori dechorionated e un piatto per ogni 40 embrioni trapiantati. Conservare come descritto per la piastra di iniezione (4.2.4).
  3. preparazione di trasferimento pipetta
    1. Tagliare la punta di una lunga forma finemente tirato vetro punta pipetta Pasteur (2 volumi mL, 230 mm di lunghezza, 100 mm di lunghezza punta) ad una lunghezza che permette di manovra confortevole (opzionale) graffiando con una lama di diamante mentre ruotando fino cascate punta off (Figura 1F).
    2. Assicurarsi che il taglio è dritto. Fuoco polacco il trasferimento pipetta di vetro ruotando la superficie di taglio in un becco Bunsen per generare estremità lisce in modo da non danneggiare gli embrioni dechorionated (Figura 1F).
      NOTA: Mantenere la punta della pipetta nella fiamma per troppo tempo will risultato nella apertura essendo sigillato o diventare troppo piccolo per gli embrioni.
  4. Dechorionating blastula donatori e di accoglienza embrioni stadio
    1. Embrioni Dechorionate sia manualmente con due pinza sottile per strappare aperto ogni chorion senza toccare l'embrione, o enzimaticamente utilizzando proteasi per consentire una rapida simultanea dechorionation di un gran numero di embrioni 9.
      1. Preparare una soluzione madre 100X di 50 mg miscela proteasi / mL, fare aliquote di 100 microlitri e conservarli a -20 ° C.
      2. Aggiungere 100 ml di brodo proteasi a 10 ml di mezzo E3 (concentrazione finale di 0,5 mg / ml proteasi).
      3. Luogo ben sviluppati ospitanti e donatori di embrioni in due bicchieri di vetro piccolo Erlenmeyer separati (10 ml) e rimuovere quanto più liquido possibile.
      4. Aggiungere 5 ml di 0,5 mg / ml soluzione proteasi per ciascun bicchiere e miscelare delicatamente gli embrioni mentre guardando loro sotto un microscopio da dissezione. Guarda per eventuali segni di deformazione del corion.
      5. Mantenere vorticoso. Non appena il primo embrione è fuori corion (Figura 1D, asterischi), eseguire tre risciacqui veloci con medie E3 per rimuovere la soluzione di proteasi versando la maggior parte del liquido e riempire il matraccio versando delicatamente E3 lungo il lato. Non permettere embrioni dechorionated vengano a contatto con l'aria in uno dei passaggi successivi fino alla fine del trapianto (punto 5), saranno scoppiare. Lasciare adeguata soluzione nel pallone tra i risciacqui.
      6. Con il fuoco lucido pipetta di vetro, trasferire gli embrioni dal bicchiere Erlenmeyer in piastre di Petri di vetro o agarosio (2% in media E3) rivestite piatti di plastica. pipettare delicatamente durante il trasferimento di cancellare qualunque corion indebolita rimanente.
  5. preparazione trapianto ago
    1. Utilizzare un estrattore ago per tirare due aghi da ogni tubo di vetro borosilicato a parete sottile (1,0 mm di diametro esterno/ 0,78 millimetri ID / 100 mm di lunghezza) con le stesse impostazioni dei pipette microiniezione.
      NOTA: Le impostazioni di esempio per l'estrattore ago usato qui sono forniti nella Lista dei materiali. aghi trapianti non hanno un inserto in vetro, in quanto questo danneggia le cellule risucchiati l'ago.
    2. Tirare aghi in anticipo, conservare in una capsula di Petri e fissare premendo in una striscia di stucco modellabile o nastro adesivo.
    3. Prima del trapianto portare la punta dell'ago a fuoco in un microscopio da dissezione e utilizzare pinze per rompere l'ago sulla punta. Utilizzare una pinza sottile per regolare la forma dell'ago di puntare ad un flauto-forma (Figura 2G), o utilizzare metodi alternativi descritti per generare la forma della punta 23.

5. Chimera Generation via Blastula Trapianti

  1. installazione di trapianto
    NOTA: Qui, un apparato trapianto autoassemblato stato utilizzato (Figura 2A
  2. Montare l'ago trapianto stesso supporto dell'ago utilizzato per microiniezione sopra (montato su micromanipolatore passo 3.1.3) (Figura 2A).
  3. Scollegare il tubo iniezione che collega l'estremità del supporto micropipetta alla pressione regolata microinjector utilizzato per microiniezioni. Collegare il tubo di iniezione che è collegato ad una siringa da 1 ml (Figura 2A, B), che rappresenta l'impianto di perforazione trapianto.
    1. Assicurarsi che tutti i collegamenti siano ben sigillati con pellicola paraffina o stucco modellabile. Evitare che gli embrioni di venire a contatto con l'aria, garantendo che vi sia sempre un po 'di media E3 l'ago trapianto stesso. Azionare la siringa per aspirare manualmente cellule / liquido dentro e fuori l'ago trapianto.
  • allineamento degli embrioni
    1. Trasferire gli embrioni donatori con la pipetta di vetro nella prima colonna dello stampo agarosio. Trasferire gli embrioni di accoglienza in colonne 26 dello stampo agarosio (Figura 2F). Posizionare gli embrioni con la pipetta in modo che il lato blastomere rivolto verso l'alto.
  • Trapianto
    1. Appoggiare delicatamente l'ago trapianto su una cella blastomero di un embrione donatore e lentamente aspirare circa 20-50 cellule nell'ago trapianto (Figura 2H). Evitare di succhiare il tuorlo.
    2. Sollevare l'ago trapianto da donatore l'embrione utilizzando il micromanipolatore. Spostare il piatto stampo agarosio a sinistra e inserire la punta trapianto ago attraverso il lato della massa cellulare nel polo animale del primo embrione host. Deposito 5 - 10 celle vicine alla superficie secondo mappatura destino mostrando che questo settore genera il campo proencefalo / occhio 24 (figura 2I). Tenere la punta dell'ago immerso nel medio E3 durante l'intera procedura.
  • Cura degli embrioni trapiantati
    1. Rimuovere il donatore embrioni unaND lasciare gli embrioni di accoglienza nello stampo agarosio per 1 - 2 ore a 28,5 ° C. Riempire di vetro o plastica (rivestito con il 2% di agarosio) capsule di Petri con terreno E3 contenente 0,003% N-feniltiourea (PTU) per prevenire la formazione di pigmento come questo possa interferire con l'imaging. Trasferire gli embrioni host in questi piatti con il fuoco lucido pipetta di vetro e incubare a 28,5 ° CO / N.
      ATTENZIONE: Indossare guanti durante la manipolazione PTU.

    • 6. Setup dal vivo Imaging

    NOTA: Le piccole dimensioni e la trasparenza ottica del pesce zebra in combinazione con un rapido sviluppo hanno permesso di diventare un modello vertebrato chiave per l'imaging in vivo di diverse cellule e organi. Imaging può essere eseguita su una varietà di microscopi, che differiscono per la configurazione e parametri. Quanto segue descrive un adeguato configurazione confocale per l'imaging dello sviluppo della retina 5, 8.

    1. embrione chimericoselezione
      1. A 24 - 26 HPF, schermo gli embrioni trapiantate sotto un ambito dissezione fluorescente per selezionare gli embrioni sani ben sviluppate che mostrano le cellule trapiantate donatore (H2A-GFP o H2B-RFP etichettati) in via di sviluppo primordio occhio.
      2. Mettere da parte fino a 40 embrioni per il montaggio pipettando in un nuovo piatto e aggiungere 0,4 mg / ml tricaine methanesulfate (MS222) per anestetizzare gli embrioni.
        ATTENZIONE: Indossare guanti durante la manipolazione MS222.
    2. embrioni di montaggio
      NOTA: Utilizzare il piatto di montaggio appropriata, a seconda se l'imaging sarà eseguita su un invertito 8 o verticale microscopio (descritto qui).
      1. Preparare una qualche 1,5 tubi di plastica ml contenente 1 ml di 1% agarosio a bassa fusione in 0,4 mg / ml in terreno MS222 E3 e mantenere fuso in un bagno di acqua a 40 ° C.
      2. Aspirare 5 embrioni in un trasferimento pipetta di plastica e lasciare che gli embrioni si accumulano nella punta per gravità. Toccare la pipetta di trasferimentosulla superficie di uno dei tubi di plastica preparati contenenti 1% agarosio a bassa fusione e 0,4 mg / mL MS222 permettendo gli embrioni di affondare nel tubo limitando la quantità di trasferimento E3.
      3. embrioni Montare in un diametro di Petri 90 mm per l'imaging in microscopio in posizione verticale e con fondo di vetro Petri (di qualsiasi dimensione) per l'imaging in microscopio invertito. Utilizzare un pennarello indelebile per dividere visivamente sia piatto in due metà ai donatori immagine agli host WT (su un lato) o host morphant (altro lato) nello stesso esperimento.
      4. Trasferire i cinque embrioni dal tubo di plastica agarosio a uno Petri piatto con 0,5-1 ml di agarosio. Rimuovere l'eccesso di agarosio con una pipetta di trasferimento in modo che solo una piccola goccia (~ 200 - 300 pl) rimane. Se l'imaging con la microscopia in posizione verticale, evitare di mettere gli embrioni a 1 cm della circonferenza piastra di Petri. La lente immersione immersione in acqua utilizzata per l'imaging potrebbe non essere in grado di essere centrato in quella zona a causa della parete piatto Petri (Figura 3A </ Strong>).
      5. Utilizzare una pipetta microloading (con la punta spezzata) per allineare gli embrioni lateralmente fino a quando il solidifica agarosio. Per entrambi i tipi di piatti, gli embrioni vengono correttamente inclinate lateralmente se i due occhi ai lati della testa sono completamente sovrapposti (allineato nelle dimensioni XY) (Figura 3B). Per l'uso microscopio invertito, l'occhio vicino al vetrino deve essere spinto più vicino possibile al vetrino il più possibile, per consentire immagini attraverso lo z-dimensione entro i limiti dei possibili livelli di messa a fuoco.
      6. Continuare montaggio cinque embrioni alla volta in singole gocce agarosio. Utilizzare più 1% agarosio a bassa fusione aderire al agarosio scende tra loro e il lato del piatto per evitare sloggiare e movimento laterale durante l'imaging (Figura 3A).
      7. Una volta completamente solidificato, coprire il piatto con mezzo di E3 (contenente 0,003% PTU, 0,4 mg / ml MS222) preriscaldata a 28,5 ° C.
      8. Utilizzando lo stesso approccio descritto ai punti 6.2.2- 6.2.8, montaggio ~ 20 embrioni transgenici allevati a 32 ° C (punto 1.2.5) in un piatto a parte.
    3. parametri di imaging
      NOTA: Imaging per analizzare l'insorgenza di transgeni fluorescenti non richiede alta risoluzione intracellulare spaziale. Può essere effettuata con un obiettivo W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 da 70 mm a 1.5 zoom.
      1. Impostare il tempo di potenza del laser e l'esposizione in base all'intensità del transgene per le ~ 20 embrioni transgenici con sviluppo accelerato (cioè sollevate a 32 ° C; passo 6.2.8).
        NOTA: Per studi di insorgenza di espressione del transgene, gli embrioni sperimentali mostrano fluorescenza al momento del time-lapse è configurato e quindi, questi embrioni accelerati sono cruciali per la determinazione dei parametri di imaging.
      2. Per il piatto sperimentale, visualizzare ogni embrione e salvare la posizione e mettere a fuoco i livelli degli embrioni.
        1. Scegli gli embrioni che hanno l'angolo di montaggio corretto (cioè con la s lateraliide dell'occhio il più orizzontale possibile) e un battito cardiaco forte (un indicatore della salute). Scegli embrioni con un paio di cellule del donatore trapiantato (identificate da H2A-GFP o l'etichettatura H2B-RFP) principalmente nel quadrante anteriore ventrale della retina di sviluppo (dove l'onda di espressione genica inizia) (Figura 3C).
          NOTA: in embrioni di zebrafish, la frequenza cardiaca media è di 120 - 180 battiti / minuto 25. Negli embrioni anestetizzati, un battito cardiaco sano può essere nell'intervallo di 60 - 120 battiti / minuto. Più lento battito cardiaco può essere indicativo di una ridotta vitalità e quegli embrioni devono essere esclusi dallo studio.
      3. Impostare z-pile di sezioni ottiche a 2 micron intervalli attraverso la retina di un massimo di 15 embrioni.
        NOTA: Il numero totale di embrioni che possono essere esposte in un dato esperimento dipenderà singoli parametri (tempo di esposizione e dimensioni z-stack). Il tempo necessario per l'immagine 1 time-point per tutti gli embrioni scelti deve essere shOrter che l'intervallo tra punti di tempo. Sacrificando un po 'di risoluzione di profondità, più embrioni possono essere esposte entro gli intervalli di tempo. I limiti del z-stack sono scelti come estremi laterale e mediale dell'occhio embrioni montato e 30 micron viene aggiunta al laterale nella configurazione microscopio in posizione verticale, come gli occhi di embrioni in via di sviluppo in questo spostamento configurazione nella direzione z come gli embrioni si sviluppano durante la notte. Ciò si traduce in pile 100-170 micron di spessore (50 - 85 immagini / occhio).
      4. Prendere immagini ogni 24 min a 32 ° C (equivalente a 0,5 HPF intervalli) utilizzando l'apposito laser / canale per il transgene.
        NOTA: Gli embrioni rimangono sul palco per tutto il time-lapse all'interno di una camera riscaldata comprende l'intero microscopio. L'esperimento può essere condotta a 28 ° C, temperature più calde sono utilizzati per accelerare lo sviluppo e garantire che i relativi punti temporali nell'esperimento vengono esposte nel 16 - periodo di time-lapse 24 h.
      5. Immaginecanali che rappresenta l'etichetta del donatore (H2A-GFP o H2B-RFP - opzionale) e transgene (Atoh7: RFP o Vsx1: GFP) utilizzando la scansione sequenziale. Per l'analisi, utilizzare l'etichetta donatore solo scegliere embrioni appropriate descritte (prendere uno z-stack all'inizio della formazione immagine) e quindi eseguire time-lapse solo sul canale per catturare l'espressione del transgene.
        NOTA: In alternativa, utilizzare l'etichetta donatore solo per selezionare gli embrioni appropriati (cioè quelli con le cellule confermati trapiantate in anteriore quadranti ventrale) e l'immagine solo il canale transgene, all'incirca dimezzando il tempo di imaging e quasi raddoppiando il numero di embrioni che possono essere esposte e analizzate per esperimento (Figura 4).

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    Representative Results

    Questo lavoro presenta un protocollo sperimentale per valutare i cambiamenti nel gene tempistica espressione quando wild type progenitori della retina si sviluppano all'interno di un embrione di accoglienza morphant. Gli embrioni di accoglienza sperimentali sono morphants PTF1A, cui mancano le interneuroni orizzontali e amacrine nati intermedi della retina 7, 26. Questi sono stati confrontati per controllare embrioni host, che sono stati iniettati con un morfolino controllo standard.

    Poiché neurogenesis di diversi tipi di neuroni in tutto il sistema nervoso centrale (compresa la retina) si verifica in un altamente conservata histogenic ordine 27, 28, 29, 30, 31 la progressione del successivo destino può dipendere cellulari feedback non autonomil'accumulo di tipi di neuroni in precedenza nati. Questa ipotesi è stata testata valutando i tempi di generazione di tipi neurali successivamente nati in cellule progenitrici trapiantate sviluppo in assenza di tipi di neuroni nati intermedi. Come controllo, i tempi di cellule primi nati stato anche quantificato, che dovrebbe essere influenzata indipendentemente dal fatto che le cellule intermedie sono generati o no. A tal fine, la Tg (atoh7: RFP) o Tg (atoh7: gapGFP) linee sono stati usati per visualizzare l'insorgenza della neurogenesi cellule gangliari primo nato mentre la Tg (vsx1: GFP) linea è stata utilizzata per analizzare l'inizio della fine nato popolazione bipolare. Altro che esprime inoltre i transgeni giornalista, le cellule del donatore da questi embrioni sono geneticamente WT.

    Microiniezione di 1 NL mRNA (per le cellule etichetta donatore) nel tuorlo di embrioni monocellulari Risultati della tappa di espressione della proteina reporter fluorescente da 3 HPF, in cuifase i donatori più brillanti sono selezionati (Figura 1). Preparare l'installazione il trapianto quando gli embrioni sono circa 2 HPF (Figura 2). Al 24 HPF, embrioni con cellule del donatore trapiantate nei luoghi della retina rilevanti sono scelti e montati in 1% agarosio basso punto di fusione in gruppi di cinque (Figura 3). Dopo aver salvato la posizione dell'embrione, l'impostazione della z-stack ed i parametri di tempo, time-lapse imaging viene eseguita per 16 - 24 ore. Tempistica delle cellule gangliari primo nato è indicato dalla comparsa del Atoh7: RFP o Atoh7: gapGFP transgene e la tempistica di ultima generazione bipolare nato è indicato dalla forte up-regolazione del Vsx1: transgene GFP, che si esprime anche con luminosità nettamente inferiore i livelli dei progenitori in via di sviluppo. I tempi di prima espressione del transgene, come Atoh7: gapGFP è identificato nelle singole celle in ogni timepoint dell'imaging (frecce bianche, Figura 4). Atoh7: gapGFP e differenziazione delle cellule gangliari occurs a volte equivalenti indipendentemente dal fatto che l'embrione host è WT o un Ptf1a morphant privi di cellule intermedie (cioè dopo la nascita cellule gangliari) orizzontali e amacrine.

    I dati presentati dimostrano che questo approccio sperimentale fornisce un potente strumento per valutare il ruolo di particolari ambienti della retina sui tempi l'espressione genica, con implicazioni importanti, non solo per comprendere le normali processi di sviluppo, ma anche per le future applicazioni delle strategie di riprogrammazione delle cellule in condizioni normali e malati .

    Figura 1
    Figura 1: microiniezione nel tuorlo di Single-cell fase embrioni utilizzato per etichettare le cellule del donatore e per generare differenti ambienti host. A) Gli embrioni sono allineati contro il bordo di un vetrino con la maggior parte del liquido circostante remosso. B) L'ago viene inserito nel centro del tuorlo e sia H2A-GFP o H2B-RFP mRNA (per donatore) o morfolino (standard MO o Ptf1a MO per host) vengono iniettati. C) L'ago di iniezione viene generata utilizzando un estrattore ago che genera due aghi simmetrico da ogni capillare. Ogni ago tirato successivamente ha bisogno di avere la punta rotta con una pinza per aprire l'ago fornendo allo stesso tempo una punta angolata acuta (non smussare) che può essere facilmente inserito in embrioni. Embrioni D) donatori iniettati con H2B-RFP mRNA allo stadio unicellulare iniziare esprimendo le proteine reporter fluorescenti del 2,5 HPF, in quale fase gli embrioni più brillanti e più uniformemente etichettati possono essere selezionati. E) Circa 2,5-3 HPF, donatori e di accoglienza embrioni vengono enzimaticamente dechorionated utilizzando proteasi. Turbine della beuta fornisce la forza meccanica necessaria per rompere chorions indeboliti aperti e porta embrione dechorionateds verso il centro. Non appena il primo (asterisco) o pochi embrioni dechorionated osservati, rapida ma gentile risciacquo assicura che la soluzione proteasi viene rimosso. F) per il trasferimento di embrioni dechorionated, pipette di vetro sono utilizzati. Questi possono essere inizialmente accorciati (opzionale) per qualsiasi lunghezza che è comodamente manovrato dall'utente, grattando il vetro nella posizione appropriata con un coltello di diamante finché non si stacca. Ciò si traduce in una punta di taglio affilata, che deve essere ribruciate per lisciare eventuali asperità che possono danneggiare le cellule risucchiata nella pipetta durante il trasferimento. Barre di scala A, B, D, E = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2: Installazione trapianto. B) Il tubo trapianto mostrato indica come potenziali perdite in articolazioni sono semplicemente evitati utilizzando stucco modellabile e il film di paraffina. C) Una vista ingrandimento maggiore del collegamento tra il tubo di iniezione e qualsiasi tubi adatti da collegare alla siringa. Mentre ogni tubo può essere usato, il tubo utilizzato qui ha un diametro che ben si adatta una punta di pipetta 10 microlitri. Utilizzare pellicola di paraffina per garantire una perfetta tenuta. D) Lo stampo ha 150 (6 x 25) cunei per generare i divots triangolari nella piastra di iniezione agarosio. E) dimensioni approssimative di ogni forma a cuneo sono mostrati. Le misure di società sono proprietarie. F)piastre preparate iniezione agarosio con rientranze a forma di cuneo sono usati con embrioni donatori aggiunti alla prima colonna e le colonne 2 - 6 pieni di embrioni ospitante. Trapianti vengono eseguiti lungo la riga, per cui le cellule raccolte da un donatore in ogni riga possono essere trapiantate in 5 embrioni di accoglienza. All'interno di ogni stampo, le cellule provenienti da un massimo di 25 donatori possono essere trapiantate in embrioni fino a 125 ospiti. Nota lo stampo viene posizionato asimmetricamente con l'estremità più profonda del cuneo più vicino al bordo piastra di Petri. Questo permette l'ago trapianto da destra senza colpire il bordo piatto Petri. G) L'ago trapianto è tirato con gli stessi parametri come l'ago di iniezione di provocare una lunga punta affusolata mostrato qui. L'ago deve essere rotto per generare un diametro interno più grande che può assumere cellule senza deformarli. L'inserto di potenza superiore mostra che la punta dell'ago trapianto dovrebbe essere angolato e idealmente hanno una forma "flute" come mostratoin questo esempio. H) superiore vista potere mostra orientamento di embrioni di accoglienza con le cellule in alto. L'ago trapianto è inserito nella massa cellulare della blastula dell'embrione ospite fase laterale (asterischi bianco) e spinto nell'occhio futuro come mostrato qui. Cellule del donatore può essere visto in l'ago trapianto (freccia) e quindi il numero grezzo delle cellule trapiantate può essere controllato. I) Due esempi (sinistro e destro) che mostra che, subito dopo il trapianto, gli embrioni con cellule trapiantate con successo nella posizione corretta può essere immediatamente risolto con l'etichetta del donatore (ad esempio, H2B-RFP). Un canale fluorescente è stato inserito il campo chiaro con "Dodge lineare (aggiungere)" opzione nel menu del livello nel editor di grafica raster. barra di scala (per H, I) = 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


    Figura 3: Embrione di montaggio per Time-lapse imaging. A) Petri (90 mm) che mostra più cadute agarosio basso di fusione contenenti cinque embrioni ciascuno collegati da agarosio per formare una rete di società per evitare che singole gocce da staccare. B) superiore vista di potenza di 24 HPF embrioni allineati lateralmente ed embedded all'interno di agarosio solidificato. Per l'angolo ideale, i due occhi devono essere posizionati uno sopra l'altro (nel z-dimensione). A seconda del gene di interesse, montaggio dovrebbe essere ritardata fino a poco prima temporizzazione pertinenti (es, 26 HPF per la differenziazione delle cellule gangliari o 35 HPF per l'inizio della differenziazione cellulare bipolare). C) l'immagine confocale di una singola ottica Z-sezione che mostra sovrapposizione di campo chiaro e canali rosso (usando "Scherma lineare (aggiungere)" opzione nel menu del livello nellaeditor di grafica raster) dell'occhio di sviluppo con poche cellule del donatore marcate (rosso) all'interno di un ambiente host altrimenti senza etichetta. Scala bar B = 1 mm, barra della scala C = 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: Timing della neurogenesi possono essere visualizzati in cellule del donatore transgenici trapiantate in diversi ambienti host. Micrografie immagine time-lapse in via di sviluppo delle cellule del donatore WT da Tg (atoh7: gapGFP) da embrioni transgenici trapiantati in serie senza etichetta WT. espressione del transgene insorgenza è indicato per un paio di cellule di frecce bianche. Barra di scala = 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande of questa figura.

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    Discussion

    Capire la misura in cui le cellule vicine influenzano tempistica di espressione di fattori determinanti cruciali destino delle cellule è fondamentale quando si mira ad istruire efficacemente le cellule staminali multipotenti embrionali o indotte a differenziarsi in un tipo di cellula post-mitotico specifiche o addirittura tessuti a motivi geometrici. Inoltre, l'esame di questi eventi molecolari nelle cellule in via di sviluppo animale vivente fornisce inoltre dinamiche relative informazioni (temporale e spaziale) sulle particolari contesti cellulari associati con questi eventi in vivo. Tali studi non possono essere raggiunti facilmente in tutti i modelli vertebrati.

    Nel protocollo presentato, l'embrione zebrafish suscettibili viene sfruttato come un modello vertebrato per affrontare tali questioni in vivo, in tempi relativamente semplice, ma altamente organizzato tessuti a motivi geometrici tridimensionale della retina dei vertebrati. Questo è esemplificato testando l'ipotesi che riducono una particolare cellula retinicaTipo di influenza tempistica di espressione genica e il destino dello sviluppo di cellule progenitrici della retina. Possiamo inoltre utilizzare il marker delle cellule del donatore per monitorare le cellule specifiche indietro nel tempo per valutare, per esempio, quanto tempo prima l'espressione di un transgene una cella postmitotici ha subito la sua ultima divisione, o valutare il comportamento generale di questa cella (ad esempio, la migrazione) in varie fasi prima della espressione del transgene in ambienti differenti. Per questi studi, una combinazione di relativamente facile da eseguire tecniche vengono presentate, che comprendono gene morfolino-mediata abbattere, il trapianto e l'imaging dal vivo. Per il metodo di trapianto, il protocollo introduce un romanzo, relativamente facile e poco costoso trapianto di perforazione e dimostra la facilità di questa configurazione operativa.

    Questo protocollo non è limitato alla retina. Esso può essere applicato anche per studiare diversi processi cellulari dinamici, che richiedono districare di svi cellula-autonomaprogrammi ental dalla cella influenze ambientali non autonomi. Tuttavia, mentre è previsto poco risoluzione di una serie di passi critici devono essere presi in considerazione prima di iniziare un esperimento. Un presupposto importante per l'applicazione di successo della tecnica è che l'organo o tessuto di scelta deve essere facilmente presi di mira in embrione utilizzando la mappa destino. Se l'efficienza di targeting per tessuti non è stato testato in precedenza, questo deve prima essere ottimizzato e standardizzato. Il numero di embrioni microiniettati e trapiantati può essere aumentato e sottoposto a controllo prima di vivere di imaging per ottenere embrioni sufficienti con cellule del donatore correttamente integrati e posizionati all'interno del tessuto in questione. Inoltre, mentre questo protocollo può essere facilmente applicato a fasi zebrafish embrionali, un'applicazione di fasi successive come la crescente larve diventato più difficile per due motivi. In primo luogo, l'efficienza del silenziamento genico ottenibile con morpholinos diminuisce nel tempo (deattesa su ogni morfolino, è generalmente più efficiente prima 3 dpf). Per ignorare questo problema, l'uso di mutanti genetici come embrioni di donatori per il trapianto è preferibile. In secondo luogo, come il pesce zebra cresce, parti più profonde delle larve diventano meno accessibili per l'imaging con un microscopio confocale, specialmente con ingrandimenti maggiori (obiettivi alta potenza) in cui la distanza di lavoro del obiettivo microscopio è più limitato. Così, ogni tessuto di interesse all'età rilevante deve essere prima valutato per la sua riconducibilità di imaging.

    Il time-lapse imaging può essere effettuata sia su un microscopio confocale invertito o verticale.

    Ci sono una serie di vantaggi del microscopio in posizione verticale, se disponibile. Alla temperatura desiderata, l'evaporazione della sostanza immersione utilizzato (ad esempio, acqua o olio per immersione con indice di rifrazione dell'acqua) su un microscopio invertito può portare alla completa essiccazione. Questo richiede un monitoraggio costante eeventualmente riempimento, con il rischio di commercializzare campione fuori fuoco. Ciò può essere parzialmente evitato utilizzando l'automazione per abbassare l'obiettivo di una distanza definita, aggiungendo la sostanza immersione e sollevando l'obiettivo nuovo, anche se nella nostra esperienza, rifocalizzazione spesso è ancora necessaria, che dovrebbe avvenire prima dell'inizio del successivo punto di tempo di immagini . In secondo luogo, i più grandi piatti vetrino fondo siamo di origine sono ancora molto più piccolo (50 mm di diametro) del diametro piatti standard da 90 mm di Petri utilizzati per la microscopia in posizione verticale. Ciò significa che il numero di embrioni che può essere montato e l'embrione medio volume aggiunto sono più limitate usando microscopi invertiti. Tuttavia, i parametri di tempo-lapse costituiscono generalmente il principale fattore limitante per il numero di embrioni che possono essere ripreso e quindi la dimensione del piatto è ancora adatto. Quando si utilizzano obiettivi molto alto ingrandimento, microscopio invertito può consentire una maggiore profondità nel z-dimensione, come l'occhio eobiettivo sono separati solo da un vetrino sottile. Quando si combinano molto elevato ingrandimento con la microscopia eretta, la caduta di agarosio copre l'embrione deve essere il più sottile possibile. Nel complesso, i dati ottenuti mediante microscopia in posizione verticale o invertita è di qualità equivalente.

    Per la generazione di dati di alta qualità, ci sono altri passaggi critici che devono essere considerati. In primo luogo, la selezione dei donatori brillantemente etichettati è fondamentale per l'ottenimento di embrioni trapiantati con un numero adeguato di cellule trapiantate negli occhi all'inizio del film time-lapse (pochi, ma non troppi). Il dechorionation proteasi enzimatica è un passo fondamentale e l'incubazione in proteasi dovrebbero essere ridotti al minimo seguita da rapida, ma gentile risciacqui per non influenzare la successiva salute degli embrioni. Età corrispondenza di embrioni donatori e di accoglienza permette di tessuto accurato il targeting in base alla mappa destino e per l'integrazione efficace delle cellule. A ne trapianto a forma di pozzoedle è importante, assicurandosi che la punta è piccola e abbastanza affilato da inserire in embrioni di accoglienza senza causare molti danni, ma abbastanza grande in diametro interno di non causare danni meccanici alle cellule di essere trapiantate. Durante il trapianto, se l'apparecchiatura non è completamente sigillato (soprattutto nei punti di collegamento), è molto difficile controllare manualmente il movimento del mezzo e le cellule E3 dentro e fuori l'ago trapianto. Questo è più evidente in presenza di flusso partenza o dell'ago trapianti senza modificare manualmente il volume della siringa. In questo caso tutti i giunti devono essere ricontrollati e richiuse. Questo dovrebbe essere testato in anticipo dell'esperimento.

    Infine, durante il tempo trascorso tra il trapianto e l'impostazione time-lapse, è fondamentale che gli embrioni trapiantati sono autorizzati a svilupparsi a bassa densità, mentre meticolosamente pulizia di tutti gli embrioni non sani. Questo è particolarmente importante quando i tempi di sviluppo o gene l'espressione è oggetto di indagine. Nel valutare la tempistica di qualsiasi processo (ad esempio, l'espressione genica), i controlli devono essere utilizzati per escludere gli effetti collaterali non specifici della tecnologia morfolino. Nel nostro lavoro, utilizziamo la tempistica di espressione del transgene in un tessuto non correlate (per esempio, il muscolo) influenzato dal gene specifico di destinazione del morfolino.

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    Acknowledgments

    Questo lavoro è stato sostenuto da un arco DECRA a PRJ (DE120101311) e da un assegno di ricerca della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) LP (PO 1440 / 1-1). L'australiano Medicina Rigenerativa dell'Istituto è sostenuto da fondi del Governo dello Stato del Victoria e il governo federale australiano. Riconosciamo Dr Jeremy Ng Chi Kei, che ha condotto esperimenti descritti qui come pubblicato in Kei et al. 2016. Siamo grati per le disposizioni di pesci transgenici dal Prof. Higashijima e ringraziare i Proff. Turner e Rupp per la fornitura del pCS2 + plasmide e il dottor Wilkinson per la generazione di H2B-RFP e H2A-GFP costrutti. Ringraziamo personale della struttura FishCore (Monash University) per prendersi cura dei nostri animali.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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    Biologia dello Sviluppo Numero 121 Zebrafish i trapianti chimera l'imaging dal vivo cellule non autonoma retina tempi l'espressione genica la neurogenesi
    Imaging <em>in vivo</em> del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo
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    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

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