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Developmental Biology

Chimeric zebrafish भ्रूण में अलग-अलग रेटिना प्रोजेनिटर्स में ट्रांसजेनिक जीन एक्सप्रेशन के vivo इमेजिंग में सेल Nonautonomous प्रभावों का अध्ययन करने के लिए

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में अलग-अलग गुम्मट रेटिना progenitors के लाइव ट्रैकिंग न्यूरोजेनेसिस के दौरान सेल गैर स्वायत्त सिगनल के योगदान के आकलन के लिए अनुमति देता है। इधर, भ्रूण प्रत्यारोपण के माध्यम से और इन विवो समय चूक confocal इमेजिंग में जीन पछाड़ना, कल्पना पीढ़ी का एक संयोजन इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया गया था।

Abstract

आनुवंशिक और तकनीकी ताकत zebrafish कशेरुकी एक प्रमुख मॉडल जीव जिसमें जीन जोड़तोड़ के परिणामों के तेजी से विकास की अवधि के दौरान इन विवो में पता लगाया जा सकता बना दिया है। कई प्रक्रियाओं सेल प्रसार, जीन अभिव्यक्ति, सेल प्रवास और morphogenesis सहित अध्ययन किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, प्रत्यारोपण के माध्यम से काइमेरा की पीढ़ी आसानी से किया जा सकता है, मेजबान वातावरण के प्रभाव में मूसा की लेबलिंग और व्यक्ति की कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति है। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक जीन मेजबान भ्रूण के (जैसे morpholino microinjection के माध्यम से,) व्यक्तिगत प्रत्यारोपित दाता कोशिकाओं पर जोड़तोड़ और लाइव इमेजिंग, बाह्य का प्रभाव, सेल nonautonomous संकेतों (आनुवंशिक रूप से संशोधित वातावरण द्वारा प्रदान की) के संयोजन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। यहाँ हम कैसे इस दृष्टिकोण सेल भाग्य determin के समय के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में फ्लोरोसेंट transgene अभिव्यक्ति की शुरुआत तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है का प्रदर्शनविभिन्न आनुवंशिक मेजबान वातावरण में व्यावहारिक।

इस अनुच्छेद में, हम दाता कोशिकाओं को चिह्नित करने और मेजबान भ्रूण में जीन पछाड़ना, chimeric भ्रूण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया प्रत्यारोपण तकनीक का विवरण, और तैयारी और इन विवो समय चूक confocal में चलाने के लिए प्रोटोकॉल पैदा करने के लिए zebrafish भ्रूण microinjecting के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं कई भ्रूण की इमेजिंग। विशेष रूप से, multiposition इमेजिंग प्रदर्शन महत्वपूर्ण है जब इस तरह के जीन अभिव्यक्ति की शुरुआत के रूप में की घटनाओं के समय की तुलना है। यह कई नियंत्रण और प्रयोगात्मक भ्रूण एक साथ संसाधित से डेटा संग्रह की आवश्यकता है। इस तरह के एक दृष्टिकोण आसानी से किसी भी अंग या पसंद इमेजिंग रहने के लिए सुलभ के ऊतकों में बाह्य प्रभावों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है, बशर्ते कि प्रत्यारोपण आसानी से स्थापित भ्रूण भाग्य नक्शे के अनुसार लक्षित किया जा सकता है।

Introduction

एक विवो कशेरुकी में महत्वपूर्ण विकास की प्रक्रिया कल्पना करने की क्षमता सामान्य और बीमारी की स्थिति के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण zebrafish मॉडल बनाने में योगदान दिया है (1 में समीक्षा, 2)। विशेष रूप से, तंत्रिका रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक सुलभ हिस्सा है। रेटिना ही अपने उच्च का आयोजन किया है, फिर भी अपेक्षाकृत सरल संरचना, और हड्डीवाला प्रजातियों 3 भर में इसकी अत्यधिक संरक्षित न्यूरॉन प्रकार के कारण बख्शी आसानी से न्यूरोजेनेसिस की पढ़ाई करने के लिए। इस तरह के प्रसार, सेल चक्र से बाहर निकलें, असममित कोशिका विभाजन, भाग्य विनिर्देश, भेदभाव, और तंत्रिका circuitry गठन के रूप में सेलुलर व्यवहार की गतिशीलता जो zebrafish की केंद्रीय रेटिना में 3 डी postfertilization के साथ पूरा हुआ retinogenesis की पूरी प्रक्रिया, भर पीछा किया जा सकता है ( DPF) 4, 5,रेफरी "> 6, 7।

इसके अलावा, उपर्युक्त चरणों में से प्रत्येक में विभिन्न जीनों की कार्यात्मक जरूरतों समन्वित रूप से zebrafish रेटिना में मूल्यांकन किया जा सकता है, अन्य कशेरुकी मॉडल है जिसमें जीन पीटा तकनीक के इस्तेमाल से उत्पन्न phenotypes एक से अधिक लाभ प्रदान करने ही पोस्टमार्टम पर मूल्यांकन किया जा सकता के ऊतकों तय की। विशेष रूप से, ट्रांसजेनिक लाइनों में जो हम कल्पना और रेटिना में संवाददाता transgenes के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी कर सकते का उपयोग करते हैं, हमें जीन अभिव्यक्ति है कि एक विशेष न्यूरोनल सेल प्रकार की उत्पत्ति underlies का अस्थायी समाधान प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। zebrafish के तेजी से विकास के कारण, इन घटनाओं के पूरे विकास की अवधि के दौरान देखे जा सकते हैं, जिससे न्यूरोनल सेल पहचान अधिग्रहण और सेल व्यवहार के संबंध में जीन की अभिव्यक्ति के अस्थायी महत्व में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

अंत में, इन तरीकों कुशलता प्रत्यारोपण के माध्यम से कल्पना की पीढ़ी के साथ zebrafish में, जीन समारोह के दो महत्वपूर्ण पहलुओं में अंतर्दृष्टि, जिसके परिणामस्वरूप में जोड़ा जा सकता है। सबसे पहले, एक दाता भ्रूण, जिसमें एक विशेष जीन नीचे गिरा दिया गया था, जबकि वे एक लेबल हटाया गया जंगली प्रकार के माहौल में विकसित से प्रतिरोपित कोशिकाओं की जांच, हमें एक सेल स्वायत्त ढंग से जीन समारोह के बारे में प्रासंगिक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। इस पूर्वज कोशिकाओं वे सामान्य रूप में। यह व्यक्त कर रहे हैं पूर्वज है कि अब इन जीनों 4, 6 से कार्यात्मक प्रोटीन उत्पन्न कर सकते हैं के विकास के भाग्य परिणाम की परीक्षा द्वारा उदाहरण है भीतर रेटिना भाग्य निर्धारक कारकों के समारोह के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की ओर जाता है, 8, 9। इस दृष्टिकोण का उपयोग, हम पता चला है कि कई भाग्य निर्धारक कारक हैं (जैसे, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) सेल में कार्य-autonomously विशिष्ट रेटिना न्यूरोनल भाग्य ड्राइव करने के लिए; जीन अभिव्यक्ति की कमी मुख्य रूप से एक भाग्य स्विच, कि इस तरह के जीन पछाड़ना के साथ कोशिकाओं को एक वैकल्पिक सेल भाग्य 4, 6, 7, 10 अपनाकर व्यवहार्य रहने के लिए ले जाता है। दूसरे, इस तरह के प्रयोगों कैमेरिक का आकलन करने के लिए कैसे जंगली प्रकार पूर्वज व्यवहार करते हैं, जब वे अलग आनुवंशिक वातावरण के भीतर विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, गुम्मट कोशिकाओं के विकास को आम तौर पर एक गुम्मट में ब्याज (संवाददाता transgene) बनाम छेड़छाड़ मेजबान वातावरण (जैसे, जीन पीटा / पछाड़ना) के एक जीन व्यक्त की तुलना द्वारा, जीन अभिव्यक्ति और सेल भाग्य पर जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । मेजबान वातावरण में कुछ न्यूरॉन प्रकार की कमी है, उदाहरण के लिए, एक सेल गैर स्वायत्त ढंग से जंगली प्रकार पूर्वज व्यवहार को प्रभावित करने के लिए, उन्हें पूर्वाग्रह से underrepresented ओ में फर्क करने की दिशा में दिखाया गया हैन्यूरॉन प्रकार 4, 7, 11, 12 लापता आर। यह देखते हुए कि रेटिना न्यूरॉन्स क्रमिक रूप से समय पर विशिष्ट neuronal भाग्य निर्धारक जीनों की अभिव्यक्ति (भाग्य जीन अभिव्यक्ति) (13 में समीक्षा) द्वारा एक संरक्षित histogenic क्रम में पैदा होते हैं, हम प्रदर्शित करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल कैसे जंगली प्रकार progenitors में भाग्य जीन अभिव्यक्ति के समय प्रभावित होता है जब इस तरह के पूर्वज प्रेरित न्यायपालिका सेलुलर रचनाओं के साथ रेटिना मेजबान वातावरण में विकसित करना। यहाँ, हम के लिए साक्ष्य के रूप में इन तरीकों रूपरेखा कैसे अपेक्षाकृत मानक और व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक के संयोजन रेटिना progenitors के विकास के 8, 9 में भाग्य जीन अभिव्यक्ति के समय की परीक्षा में सक्षम बनाता है।

इस प्रोटोकॉल के अनुसार की आसानी के साथ संयोजन के समय चूक इमेजिंग एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णनपूर्व vivo विकासशील zebrafish भ्रूण में प्रत्यारोपण के गठन व्यक्ति mosaically विकासात्मक retinogenesis की पूरी अवधि के दौरान लेबल की कोशिकाओं का पालन करें। कार्यात्मक जीन जोड़तोड़ प्रदर्शन करके या तो मेजबान भ्रूण, भ्रूण दाता, दोनों या न में, एक जीन समारोह की सेल स्वायत्तता का आकलन कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण किसी अन्य प्रणाली है जिसके लिए अलग-अलग यहाँ उल्लिखित घटकों उपयुक्त हैं में इसी तरह के अनुसंधान के सवालों के व्यापक रूप से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और जानवरों के उपयोग के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद संहिता के प्रावधानों के अनुसार बाहर किया गया और संस्थागत नैतिकता समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. Zebrafish की तैयारी

  1. वयस्क मछली बाँधना
    1. उपयोग करने से पहले उचित आकार प्रजनन टैंक में जोड़े (या दो जोड़े) के रूप में वयस्क मछली सेट अप शाम।
    2. महिला नर से अलग रखने के लिए देखने के लिए मछली सक्षम करने के लिए, लेकिन एक दूसरे को स्पर्श नहीं एक विभक्त का उपयोग करें।
    3. सुबह में, प्रकाश पर स्विचन के बाद, डिवाइडर हटाने और मछली अबाधित दोस्त के लिए अनुमति देते हैं।
    4. बाद सफल संभोग उनके मूल टैंक में वापस वयस्क मछली डाल दिया।
      नोट: मेजबान और दाता उपभेदों ही है, जैसे, किसी भी जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) उपभेदों हो सकता है। (: GapRFP atoh7), टीजी (atoh7: gapGFP) या इस अध्ययन के लिए दाता भ्रूण ट्रांसजेनिक लाइनों टीजी से निकाली गईटीजी (vsx1: GFP) जिसमें भाग्य निर्धारक कारकों की अभिव्यक्ति जल्दी या देर से ड्राइविंग तंत्रिका भाग्य, कल्पना की जा सकती क्रमश: 14, 15, 16। आदेश आनुवंशिक वातावरण भिन्न के प्रभाव की तुलना करने के लिए, मेजबान भ्रूण विशिष्ट म्यूटेंट या morphants नीचे के रूप में वर्णित किया जा सकता है।
  2. भ्रूण संग्रह
    1. प्रजनन बॉक्स से अंडे इकट्ठा करने के लिए एक चाय का झरनी का प्रयोग करें। अंडे के लिए जाँच जन्म के समय को निर्धारित करने और यह सुनिश्चित एकल कोशिका चरण भ्रूण बाद के चरणों के लिए एकत्र कर रहे हैं करने के लिए हर 15 मिनट।
    2. E3 के माध्यम (5 मिमी NaCl, 0.2 मिमी KCl, 0.4 मिमी 2 CaCl, 0.9 मिमी MgCl आसुत जल में 2 और 2% methylene नीले) के साथ भ्रूण कुल्ला और 50 की एक अधिकतम घनत्व पर युक्त ~ 40 एमएल E3 17 पेट्री डिश में उन्हें जगह प्रति 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में अंडे।
    3. तनाव का नाम, तारीख और समय के साथ पेट्री डिश लेबलजन्म। विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण को देखने whilst किसी भी मलबे को हटाने के लिए एक पाश्चर हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें।
    4. जब तक प्रत्यारोपण के लिए ~ 3 घंटे postfertilization (HPF) 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रखें, या microinjections के साथ जारी है।
      ध्यान दें: प्रत्यारोपण के लिए, समान उम्र में दाता और मेजबान भ्रूण के लिए लक्ष्य। किमेल एट अल के अनुसार 32 डिग्री सेल्सियस - इसलिए, 25 के बीच अलग-अलग पालन के तापमान का उपयोग। 18 धीमा या अन्य मैच के लिए भ्रूण की एक क्लच तेजी लाने के लिए।
    5. (- 28 घंटे बाद 24) को जब तक समय चूक इमेजिंग संग्रह के समय से 32 डिग्री सेल्सियस पर uninjected ट्रांसजेनिक दाता भ्रूण की ~ 20 रखें।
      नोट: ये प्रयोगात्मक पलटन से अधिक तेजी से विकास होगा और पहले फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त करेंगे। वे इस प्रकार इमेजिंग के लिए मानकों (लेजर शक्ति, लाभ) स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (आकलन करने के लिए इस विशेष उदाहरण में, प्रयोगात्मक पलटन की इमेजिंग transgene अभिव्यक्ति से पहले शुरू होता हैइस घटना के सही समय)।

2. microinjection के लिए तैयारी

  1. Microinjection सुई तैयारी
    1. केंद्र में प्रत्येक borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (1.0 मिमी आयुध डिपो / 0.78 मिमी आईडी / 100 मिमी लंबे गिलास केशिका) से सुई खींचने के लिए समान लंबाई के दो सुइयों प्राप्त करने के लिए एक सुई खींचने का प्रयोग करें। सुइयों है कि लंबे समय शाफ्ट के साथ घटना के लिए निशाना लगाओ।
      नोट: सुई यहां इस्तेमाल खींचने के लिए उदाहरण सेटिंग्स में सप्लाई कर रहे हैं माल की सूची।
    2. एक पेट्री डिश में खींच लिया सुइयों की दुकान और उन्हें moldable जोड़ने का मसाला या चिपकने वाला टेप की एक पट्टी में दबाकर सुरक्षित।
    3. इंजेक्शन के लिए पहले एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे ध्यान में सुई की नोक लाने और नोक पर खुला सुई तोड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। एक छोटे से खोलने (चित्रा 1 सी) के साथ एक तेज पतला टिप के लिए निशाना लगाओ।
    2. <li> मेजबान भ्रूण के लिए morpholino तैयारी
    1. आदेश morpholino oligonucleotides विशेष रूप से ब्याज की जीन के साथ ही एक मानक नियंत्रण morpholino या प्रक्रियात्मक और हैंडलिंग प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए एक उचित आधार 5-जोड़ी बेमेल के लिए बनाया गया है।
      नोट: यहाँ, एक अनुवाद Ptf1a अनुक्रम 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC -3 'है कि मध्यवर्ती पैदा हुए क्षैतिज और amacrine कोशिकाओं के विकास को रोकता के साथ morpholino अवरुद्ध, और एक मानक नियंत्रण zebrafish morpholino मानव बीटा ग्लोबिन Intron उत्परिवर्तन लक्ष्य (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 इस्तेमाल किया गया।
    2. कमरे के तापमान पर और दुकान - एक 1 मिमी morpholino शेयर समाधान (8.5 एनजी / नाथन ~ 8) तैयार करें।
    3. इंजेक्शन के दिन, 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर morpholino की एक विभाज्य (10 μL) गर्मी संक्षिप्त और जगह बर्फ पर 65 डिग्री सेल्सियस (जिसके बाद यह प्रयोग के दौरान कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है) से नीचे शांत करने के लिए स्पिन। गुकिसी भी संभावित morpholino समाधान है, जो पछाड़ना के प्रभाव को कम कर सकते हैं के भीतर एकत्रीकरण रिवर्स जाएगा।
      1. Ptf1a morpholino और समान मानक नियंत्रण morpholino के लिए, आसुत जल के साथ morpholino शेयर समाधान गिराए द्वारा 6 एनजी / नाथन का काम कर समाधान तैयार है। आरटी पर रखें।
        नोट: उपयोग Ptf1a morpholino के रूप में भ्रूण प्रति morpholino के 2 नाथन भ्रूण प्रति 12 एनजी की एक अपेक्षाकृत उच्च काम एकाग्रता के रूप में पहले 7 चुना गया की आवश्यकता है। सबसे morpholinos के लिए, 2 - भ्रूण प्रति 5 एनजी प्रभावी है, तो 2 के लिए शेयर पतला - 5 एनजी / नाथन और प्रत्येक भ्रूण में 1 नाथन इंजेक्षन।
  2. तैयारी फ्लोरोसेंट हिस्टोन संलयन रिपोर्टर लेबलिंग दाता भ्रूण के लिए constructs
    (साथ ट्रांसजेनिक दाताओं का उपयोग कर यदि आदेश मेजबान भ्रूण के भीतर भेद करने के लिए / दाता कोशिकाओं कल्पना में, वहाँ दाता भ्रूण लेबल करने के लिए अलग अलग दृष्टिकोण, H2A-GFP के microinjection जिनमें शामिल हैं: नोटलाल फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से) या H2B आरएफपी (यदि हरी फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ ट्रांसजेनिक दाताओं का उपयोग) mRNA एकल कोशिका चरण दाता भ्रूण की जर्दी में।
    1. संवाददाता डीएनए युक्त कम से कम 1 माइक्रोग्राम प्लाज्मिड Linearize।
      नोट: यहाँ pCS2 + प्लाज्मिड (उत्पन्न होता है और कृपया मिशिगन और प्रो राल्फ Rupp विश्वविद्यालय से बायोमेडिकल केंद्र म्यूनिख से प्रोफेसर डेविड टर्नर द्वारा प्रदान की) युक्त H2A-GFP या H2B आरएफपी (डॉ क्रिस्टोफर विल्किनसन, रॉयल द्वारा उत्पन्न, यूनिवर्सिटी ऑफ लंदन) चना प्रतिबंध एंजाइम पाचन के साथ linearized किया गया था।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग डीएनए शुद्ध।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार उचित पोलीमर्स के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग mRNA टाइप करना। pCS2 + प्लाज्मिड के लिए, एक SP6 पोलीमर्स किट का उपयोग करें।
    4. शुद्ध mRNA निर्माता के निर्देशों के अनुसार के रूप में वाणिज्यिक किट या फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण isopropanol तेज़ी से बाद का उपयोगएस। ultrapure पानी में mRNA पतला (20 - 30 μL), -80 डिग्री सेल्सियस पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और दुकान के साथ एकाग्रता को मापने।
    5. इंजेक्शन के दिन, 100 एनजी / μL के अंतिम एकाग्रता के साथ बाँझ पानी में mRNA के एक काम समाधान तैयार है और बर्फ पर रख। अप्रयुक्त mRNA शेयर वापस -80 डिग्री सेल्सियस पर लौटें।

एकल कोशिका चरण भ्रूण में Morpholinos और / या mRNA की 3. Microinjection

नोट: Microinjections सभी दाता कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए और अलग अलग मेजबान वातावरण (नियंत्रण और जीन पछाड़ना) तैयार करने और mRNA या morpholino antisense oligonucleotides 20, 21 के इंजेक्शन को शामिल करने के लिए उपयोग किया जाता है।

  1. लोड हो रहा है और इंजेक्शन सुई औजार
    1. morpholino के 3 μL और / या हिस्टोन फ्लोरोसेंट संलयन mRNA समाधान microloader पिपेट युक्तियों का उपयोग के साथ इंजेक्शन सुई Backload।
    2. solut हिलाइंजेक्शन सुई की नोक की ओर आयन जब तक वहाँ कोई शेष बुलबुले हैं। एक आंतरिक गिलास के साथ इंजेक्शन सुई का उपयोग इस तरह डालें कि समाधान मुख्य रूप से केशिका क्रिया द्वारा टिप करने के लिए तैयार हो जाएगा।
    3. एक धारक एक micromanipulator (3 डी मैनुअल micromanipulator) में रखा करने के लिए इंजेक्शन की सुई देते हैं और ट्यूब आवास के भीतर एक तंग सील किया जाता है।
    4. दबाव विनियमित microinjector करने के लिए बिजली और गैस की आपूर्ति चालू करें।
    5. एक थाली में खनिज तेल की एक बूंद में सुई की नोक विसर्जित (अगर एक रेखाजाल आईपीस का उपयोग) या एक माइक्रोमीटर स्लाइड पर सीधे सुई की नोक मंडराना बूंद मात्रा जांच करने के लिए। पैर पेडल दबाकर इंजेक्शन की मात्रा को मापने और जब तक इंजेक्शन की मात्रा 1 नाथन (125 माइक्रोन व्यास) के बराबर है गैस के दबाव और / या अवधि समय समायोजित करें।
      नोट: माइक्रोमीटर स्लाइड का लाभ यह है कि माप आईपीस रेखाजाल आईएनएस का उपयोग करके माइक्रोस्कोप पर इस्तेमाल किया बढ़ाई से स्वतंत्र हैं, तथापि,tead, इंजेक्शन ड्रॉप और बड़े पैमाने फोकस में एक साथ हो सकता है।
  2. भ्रूण microinjection
    1. एक पेट्री डिश में एक खुर्दबीन स्लाइड प्लेस और स्लाइड बढ़त के साथ एकल कोशिका चरण भ्रूण जमा करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। एकल स्तंभ पतली टिप काट के आधे के साथ एक microloader विंदुक टिप का उपयोग करने में संरेखित करें। जितना संभव हो उतना तरल ठीक एक हस्तांतरण विंदुक के साथ हटाये इंजेक्शन (चित्रा 1 ए) के दौरान आंदोलनों को रोकने के लिए।
    2. प्रत्येक भ्रूण की ओर सुई कम, और जरायु घुसना और एक चिकनी स्ट्रोक (चित्रा 1 बी) में जर्दी।
    3. एक बार सुई टिप पैर पेडल दबाकर की जर्दी, microinject में केंद्रित है। H2A-GFP के 1 नाथन इंजेक्षन या एक ही सेल चरण दाता भ्रूण (ट्रांसजेनिक) की जर्दी में H2B आरएफपी mRNA। पैर पेडल दो बार दबाकर एक एकल कोशिका चरण जंगली प्रकार मेजबान भ्रूण की जर्दी में मानक एमओ या Ptf1a एमओ के 2 नाथन इंजेक्षन। सफल इंजेक्शन smal द्वारा देखे जा सकते हैं जर्दी में एल स्थानिक विरूपण।
    4. इंजेक्शन सुई निकालें, भ्रूण युक्त पकवान को स्थानांतरित करने की स्थिति में अगले भ्रूण लाने और भ्रूण के संपूर्ण स्तंभ इंजेक्ट कर रहे हैं जब तक इंजेक्शन लगाने के जारी रखने के लिए (50 - 60 भ्रूण)।
    5. सभी भ्रूण इंजेक्शन लगाने के बाद, एक 30 पर पकवान ऊपर उठा - 45 डिग्री के कोण और E3 मध्यम (निचोड़ बोतल) की एक सौम्य धारा का प्रयोग कर एक नई स्वच्छ पेट्री डिश में इंजेक्शन भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए।
    6. एक मशीन में भ्रूण पकवान प्लेस (या तो 28.5 डिग्री सेल्सियस या अन्य तापमान पर यह सुनिश्चित करने के लिए कि दाता और मेजबान भ्रूण बराबर उम्र में कर रहे हैं)।
    7. दोहराएँ कदम 3.2.1 - 3.2.6 के रूप में आवश्यक प्राप्त करने के लिए ~ 100 दाता भ्रूण या ~ 200 - 250 मेजबान भ्रूण।
    8. 1 - 2 HPF, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जाँच करें और किसी भी unfertilized अंडे कि एक पाश्चर हस्तांतरण विंदुक के साथ 2 या 4 सेल चरणों के लिए उन्नत नहीं किया है हटा दें।

4. प्रत्यारोपण के लिए तैयारी

बराबर गुम्मट दाता पूर्वज 9, 22, 23 के भीतर मूल्यांकन किया जाना प्रत्यारोपण अलग आनुवंशिक मेजबान वातावरण के प्रभाव के लिए अनुमति देता है chimeric भ्रूण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: ontent "> नोट।

  1. दाता भ्रूण चयन
    1. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे लेबलिंग संकेत के लिए 5x बढ़ाई - 3 HPF पर, 2 पर दाता भ्रूण की जाँच करें। अच्छी तरह से विकसित (बराबर आकार वाले कोशिकाओं के साथ सममित सेल मास) का चयन करें GFP प्लस फिल्टर (460-500 एनएम उत्तेजना, 510 एनएम लंबे पास उत्सर्जन) या टेक्सास लाल फिल्टर (540 का उपयोग कर एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत के साथ भ्रूण - 580 एनएम उत्तेजना, 610 एनएम लंबे समय से गुजारें उत्सर्जन) (चित्रा -1)। ट्रांसजेनिक संवाददाताओं से अभी तक व्यक्त नहीं कर रहे हैं।
  2. Agarose इंजेक्शन थाली और पेट्री डिश तैयारी
    1. एक 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में पिघला हुआ 2% agarose E3 के माध्यम में पतला डालो और यह ठंडा होने दें जब तक पकवान सुरक्षित हैछूना। गर्म agarose अन्यथा ढालना ख़राब कर सकते हैं।
    2. Agarose (चित्रा 2 डी, ई) पर पच्चर के आकार का उभार (6 x 25 / मोल्ड) के साथ एक प्लास्टिक मोल्ड फ्लोट। agarose पर मोल्ड के एक तरफ रखने और धीरे-धीरे दूसरे पक्ष के नीचे कम से हवा के बुलबुले से बचें। यकीन ढालना प्रत्यारोपण सुई के लिए पर्याप्त निकासी अंतरिक्ष अनुमति देने के लिए पकवान में या पच्चर के आकार का उभार के गहरे बिंदु के पक्ष की ओर केंद्रित है बनाओ।
    3. agarose पूरी तरह आरटी पर जमना करने की अनुमति दें।
    4. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर agarose पकवान प्लेस और धीरे से (संदंश के साथ जैसे,) एक कोने से उठाने से नए नए साँचे को हटा दें। बाहर सुखाने से उन्हें रोकने के लिए E3 के माध्यम और आयल फिल्म मुहर की एक छोटी मात्रा के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर दिन प्रयोग और स्टोर करने के लिए पहले agarose इंजेक्शन प्लेटों की तैयारी।
    5. प्रत्यारोपण के लिए पहले, E3 के माध्यम साथ agarose इंजेक्शन थाली को भरने और कम से कम 30 मिनट के लिए एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह है।
      6. <li> चूंकि Dechorionated भ्रूण, या तो उपयोग कांच के बर्तन या कोट E3 में 2% agarose की एक पतली परत के साथ पेट्री डिश (90 मिमी व्यास) के अंदर प्लास्टिक से चिपके रहते हैं। dechorionated मेजबान भ्रूण के लिए एक डिश, dechorionated दाता भ्रूण के लिए एक डिश और हर 40 प्रत्यारोपित भ्रूण के लिए एक पकवान तैयार करें। के रूप में इंजेक्शन प्लेट (4.2.4) के लिए वर्णित स्टोर।
  3. हस्तांतरण पिपेट तैयारी
    1. एक लंबे समय फार्म पतले खींच लिया गिलास टिप पाश्चर विंदुक टिप कट (2 एमएल मात्रा, 230 मिमी लंबाई 100 मिमी लंबे टिप) लंबाई है कि आराम से चालों (वैकल्पिक) के लिए अनुमति देता है के लिए टिप गिर जाता है जब तक घूर्णन whilst एक हीरे की चाकू के साथ scratching द्वारा बंद (चित्रा 1F)।
    2. सुनिश्चित करें कि कटौती सीधे है। आग पॉलिश एक लेम्प बर्नर में कटौती की सतह चिकनी घूर्णन समाप्त होता है उत्पन्न करने के लिए इतनी के रूप में dechorionated भ्रूण (चित्रा 1F) को नुकसान नहीं करने से गिलास हस्तांतरण पिपेट।
      नोट: बहुत लंबा w के लिए लौ में पिपेट टिप रखते हुएउद्घाटन में बीमार परिणाम को सील या भ्रूण के लिए बहुत छोटा बनने जा रहा है।
  4. ब्लासटुला चरण दाता और मेजबान भ्रूण dechorionating
    1. Dechorionate भ्रूण या तो भ्रूण स्पर्श, या enzymatically प्रोटीज का उपयोग भ्रूण 9 की एक बड़ी संख्या के साथ-साथ तेजी से dechorionation अनुमति देने के लिए बिना प्रत्येक जरायु खुला फाड़ दो ठीक संदंश के साथ मैन्युअल।
      1. 50 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीज मिश्रण का एक 100x शेयर समाधान तैयार 100 μL aliquots बनाने और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      2. शेयर प्रोटीज के 100 μL 10 एमएल E3 के माध्यम (0.5 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीज की अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
      3. दो अलग-अलग छोटे Erlenmeyer कांच बीकर (10 एमएल) में अच्छी तरह से विकसित मेजबान और दाता भ्रूण रखें और जितना संभव हो उतना तरल हटा दें।
      4. प्रत्येक बीकर 0.5 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीज समाधान के 5 एमएल जोड़ें और धीरे whilst एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें देख भ्रूण ज़ुल्फ़। जरायु के विरूपण के किसी भी लक्षण के लिए देखो।
      5. घूमता रखें। जैसे ही पहला भ्रूण जरायु (चित्रा -1, तारक) से बाहर है, तरल के सबसे बाहर डालने का कार्य और धीरे पक्ष के साथ E3 में गिरने से कुप्पी refilling द्वारा प्रोटीज समाधान निकालने के लिए E3 के माध्यम से तीन त्वरित rinses प्रदर्शन करते हैं। Dechorionated भ्रूण प्रत्यारोपण (धारा 5) के अंत तक बाद के चरणों में से किसी में हवा के संपर्क में आने के रूप में वे फट जाएगा अनुमति न दें। rinses के बीच कुप्पी में पर्याप्त समाधान छोड़ दें।
      6. आग पॉलिश कांच हस्तांतरण विंदुक के साथ, कांच पेट्री डिश या agarose (E3 के माध्यम में 2%) लेपित प्लास्टिक के बर्तन में Erlenmeyer बीकर से भ्रूण हस्तांतरण। धीरे स्थानांतरण के दौरान पिपेट किसी भी शेष कमजोर जरायु हटा दें।
  5. ट्रांसप्लांटेशन सुई तैयारी
    1. प्रत्येक borosilicate पतली दीवार ग्लास ट्यूब (1.0 मिमी आयुध डिपो से दो सुइयों खींचने के लिए एक सुई खींचने का प्रयोग करें/ 0.78 मिमी microinjection pipettes के रूप में ही सेटिंग के साथ आईडी / 100 मिमी लंबाई)।
      नोट: सुई यहां इस्तेमाल खींचने के लिए उदाहरण सेटिंग्स सामग्री सूची में आपूर्ति की जाती है। के रूप में इस नुकसान की कोशिकाओं सुई में चूसा प्रत्यारोपण सुई, एक गिलास डालने की जरूरत नहीं है।
    2. एक पेट्री डिश में अग्रिम में सुइयों खींचो, दुकान और moldable जोड़ने का मसाला या चिपकने वाला टेप की एक पट्टी में दबाकर सुरक्षित।
    3. प्रत्यारोपण से पहले एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे ध्यान में सुई की नोक लाने और नोक पर खुला सुई तोड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। एक बांसुरी आकार (चित्रा 2 जी) के लिए लक्ष्य, या टिप आकार 23 उत्पन्न करने के लिए वर्णित वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करने के लिए सुई के आकार को समायोजित करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें।

5. कल्पना ब्लासटुला प्रत्यारोपण के माध्यम से पीढ़ी

  1. ट्रांसप्लांटेशन सेटअप
    नोट: यहाँ, एक आत्म इकट्ठे प्रत्यारोपण तंत्र का इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 2A
  2. ऊपर microinjection के लिए इस्तेमाल एक ही सुई धारक में प्रत्यारोपण सुई माउंट (2A चित्रा) (micromanipulator, कदम 3.1.3 पर घुड़सवार)।
  3. इंजेक्शन लगाने ट्यूबिंग कि microinjections के लिए इस्तेमाल किया दबाव विनियमित करने के लिए microinjector micropipette धारक के अंत लिंक डिस्कनेक्ट। इंजेक्शन ट्यूबिंग कि 1 एमएल सिरिंज (चित्रा 2A, बी), जो प्रत्यारोपण रिग का प्रतिनिधित्व करने के लिए जुड़ा हुआ है संलग्न।
    1. सुनिश्चित करें कि सभी कनेक्शनों कसकर आयल फिल्म या moldable पोटीन का उपयोग कर सील कर रहे हैं। हमेशा यह है कि वहाँ प्रत्यारोपण सुई अपने आप में कुछ E3 के माध्यम सुनिश्चित करने के द्वारा हवा के संपर्क में आने से भ्रूण को रोकें। सिरिंज मैन्युअल रूप से संचालित में और प्रत्यारोपण सुई से बाहर चूसना करने के लिए कोशिकाओं / तरल।
  • भ्रूण संरेखण
    1. agarose मोल्ड के पहले कॉलम में कांच विंदुक के साथ दाता भ्रूण स्थानांतरण। स्तंभों में मेजबान भ्रूण स्थानांतरण 2agarose मोल्ड (चित्रा 2 एफ) के 6। विंदुक के साथ भ्रूण स्थिति इतनी है कि blastomere पक्ष तक चेहरे।
  • ट्रांसप्लांटेशन
    1. धीरे से एक दाता भ्रूण की एक blastomere सेल पर प्रत्यारोपण सुई आराम और धीरे-धीरे लगभग 20 चूसना - प्रत्यारोपण सुई (चित्रा 2H) में 50 कोशिकाओं। जर्दी को चूसने से बचें।
    2. micromanipulator का उपयोग दाता भ्रूण से प्रत्यारोपण सुई लिफ्ट। बाईं ओर agarose ढालना पकवान ले जाएँ और पहले मेजबान भ्रूण के पशु पोल में सेल द्रव्यमान का पक्ष के माध्यम से प्रत्यारोपण सुई की नोक डालें। जमा 5 - 10 दिखा रहा है कि इस क्षेत्र अग्रमस्तिष्क / आँख क्षेत्र 24 (चित्रा 2I) को जन्म देता है भाग्य मानचित्रण के अनुसार सतह के पास कोशिकाओं। सुई की नोक पूरी प्रक्रिया के दौरान E3 के माध्यम में डूबे रखें।
  • प्रत्यारोपित भ्रूण की देखभाल
    1. दाता भ्रूण एक हटाये28.5 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच - एन डी 1 के लिए agarose मोल्ड में मेजबान भ्रूण छोड़ दें। युक्त 0.003% एन phenylthiourea (पीटीयू) के रूप में इस इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा वर्णक गठन को रोकने के E3 के माध्यम से कांच या प्लास्टिक (2% agarose के साथ लेपित) पेट्री डिश भरें। आग पॉलिश कांच विंदुक के साथ इन व्यंजनों में मेजबान भ्रूण स्थानांतरण और 28.5 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
      चेतावनी: दस्ताने पहन जब पीटीयू से निपटने।

    • 6. लाइव इमेजिंग सेटअप

    नोट: छोटे आकार और तेजी से विकास के साथ संयुक्त zebrafish की ऑप्टिकल पारदर्शिता यह अलग कोशिकाओं और अंगों के vivo इमेजिंग के लिए एक प्रमुख कशेरुकी मॉडल बनने के लिए अनुमति दी है। इमेजिंग माइक्रोस्कोप की एक किस्म है, जो सेटअप और मानकों में अलग होगा पर प्रदर्शन किया जा सकता है। निम्नलिखित रेटिना विकास 5, 8 की इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त confocal इमेजिंग सेटअप का वर्णन है।

    1. chimeric भ्रूणचयन
      1. 24 पर - 26 HPF, एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश के तहत प्रत्यारोपित भ्रूण स्वस्थ अच्छी तरह से विकसित भ्रूण के विकास आंख उत्स में प्रत्यारोपित दाता कोशिकाओं (H2A-GFP या H2B आरएफपी लेबल) बताते हैं कि चयन करने के लिए स्क्रीन।
      2. एक नई डिश में pipetting द्वारा बढ़ते के लिए 40 भ्रूण अप करने के लिए अलग सेट और भ्रूण anesthetize 0.4 मिलीग्राम / एमएल tricaine methanesulfate (MS222) जोड़ें।
        चेतावनी: दस्ताने पहन जब MS222 संभाल रहे हैं।
    2. बढ़ते भ्रूण
      नोट:, उचित बढ़ते पकवान उपयोग पर इमेजिंग एक औंधा 8 या ईमानदार माइक्रोस्कोप (यहाँ वर्णित) पर प्रदर्शन किया जाएगा कि क्या निर्भर करता है।
      1. 0.4 मिलीग्राम / एमएल E3 के माध्यम में MS222 में कुछ 1.5 एमएल प्लास्टिक 1% कम पिघल agarose के 1 एमएल युक्त ट्यूबों तैयार है और एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघला हुआ रहते हैं।
      2. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट में 5 भ्रूण चूसना और भ्रूण गंभीरता से टिप में जमा करते हैं। हस्तांतरण पिपेट को स्पर्श1% कम पिघल agarose और 0.4 मिलीग्राम से युक्त तैयार प्लास्टिक ट्यूब में से एक की सतह पर / एमएल MS222 भ्रूण E3 हस्तांतरण की मात्रा सीमित whilst ट्यूब में सिंक करने के लिए अनुमति देता है।
      3. ईमानदार माइक्रोस्कोप और उल्टे माइक्रोस्कोप में इमेजिंग के लिए गिलास नीचे पेट्री डिश (किसी भी आकार) में इमेजिंग के लिए एक 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में माउंट भ्रूण। एक स्थायी मार्कर का उपयोग नेत्रहीन गुम्मट मेजबान टीम में छवि दाताओं (एक तरफ) या एक ही प्रयोग में morphant होस्ट (दूसरे पक्ष) को दो हिस्सों में विभाजित करने के लिए या तो पकवान।
      4. 1 एमएल agarose - 0.5 के साथ पेट्री डिश या तो agarose प्लास्टिक ट्यूब से पांच भ्रूण स्थानांतरण। एक हस्तांतरण विंदुक के साथ अतिरिक्त agarose निकालें इतना है कि केवल एक छोटी सी बूंद (~ 200 - 300 से μL) बनी हुई है। ईमानदार माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग, तो पेट्री डिश परिधि के भीतर 1 सेमी भ्रूण रखने से बचें। (चित्रा 3 ए पानी विसर्जन सूई इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया लेंस पेट्री डिश दीवार के कारण उस क्षेत्र में केंद्रित किया जा करने में सक्षम नहीं हो सकता है </ Strong>)।
      5. जब तक agarose solidifies laterally भ्रूण के लिए पंक्ति में एक microloading पिपेट (सिरे से टूट के साथ) का प्रयोग करें। व्यंजन के दोनों प्रकार के लिए, भ्रूण को सही ढंग से laterally angled यदि सिर के दोनों ओर से दो आँखें पूरी तरह से ओवरलैपिंग (XY आयाम में गठबंधन) (चित्रा 3 बी) कर रहे हैं। उल्टे माइक्रोस्कोपी उपयोग के लिए, coverslip के पास आंख संभव फोकस के स्तर की कमी के भीतर जेड आयाम के माध्यम से इमेजिंग सक्षम करने के लिए, संभव के रूप में coverslip करने के लिए करीब के रूप में धक्का दे दिया जाना चाहिए।
      6. व्यक्तिगत agarose बूंदों में एक समय में पांच भ्रूण बढ़ते जारी रखें। Agarose एक दूसरे को और इमेजिंग (चित्रा 3) के दौरान किसी भी dislodging और पार्श्व आंदोलन को रोकने के लिए पकवान के पक्ष के लिए चला जाता में शामिल होने के लिए और अधिक 1% कम पिघल agarose का प्रयोग करें।
      7. एक बार पूरी तरह जम, E3 के माध्यम से पकवान कवर (युक्त 0.003% पीटीयू, 0.4 मिलीग्राम / एमएल MS222) 28.5 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed।
      8. एक ही दृष्टिकोण कदम 6.2.2 में वर्णित का उपयोग- 6.2.8, माउंट ~ 20 ट्रांसजेनिक एक अलग पकवान में 32 डिग्री सेल्सियस (कदम 1.2.5) पर उठाया भ्रूण।
    3. इमेजिंग पैरामीटर
      नोट: इमेजिंग फ्लोरोसेंट transgenes की शुरुआत विश्लेषण करने के लिए उच्च स्थानिक intracellular संकल्प की आवश्यकता नहीं है। यह 1.5 ज़ूम पर एक डब्ल्यू योजना Apochromat 20X / 1.0 डीआईसी M27 70 मिमी उद्देश्य के साथ किया जा सकता है।
      1. (; कदम 6.2.8 यानी 32 डिग्री सेल्सियस पर उठाया) त्वरित विकास के साथ ~ 20 ट्रांसजेनिक भ्रूण के लिए ट्रांस्जीन तीव्रता के आधार पर लेजर शक्ति और जोखिम समय निर्धारित करें।
        नोट: transgene अभिव्यक्ति की शुरुआत की पढ़ाई के लिए, प्रयोगात्मक भ्रूण समय समय चूक की स्थापना की और इस प्रकार है पर कोई रोशनी दिखाने के लिए, इन त्वरित भ्रूण इमेजिंग के मापदंडों का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
      2. प्रयोगात्मक पकवान के लिए, प्रत्येक भ्रूण कल्पना और स्थिति को बचाने और ध्यान केंद्रित भ्रूण के स्तर।
        1. भ्रूण (यानी पार्श्व एस के साथ सही बढ़ते कोण है कि चुनेंसंभव के रूप में क्षैतिज रूप में आंख) और एक मजबूत दिल की धड़कन (स्वास्थ्य का सूचक) के आईडीई। कुछ प्रत्यारोपित दाता कोशिकाओं (H2A-GFP या H2B आरएफपी लेबलिंग द्वारा की पहचान) मुख्य रूप से विकासशील रेटिना (जहां जीन अभिव्यक्ति की लहर शुरू होता है) (चित्रा 3 सी) के पूर्वकाल उदर चक्र में साथ भ्रूण का चयन करें।
          नोट: - 180 धड़क रहा है / मिनट 25 zebrafish भ्रूण में औसत heartrate 120 है। 120 धड़क रहा है / मिनट - anesthetized भ्रूण में, एक स्वस्थ दिल की धड़कन 60 की रेंज में हो सकता है। धीमी दिल की धड़कन कम हो व्यवहार्यता का संकेत हो सकता है और उन भ्रूण अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए।
      3. ऊपर से 15 भ्रूण की रेटिना के माध्यम से 2 माइक्रोन अंतराल पर ऑप्टिकल वर्गों के Z ढेर सेट करें।
        नोट: भ्रूण है कि किसी भी प्रयोग में imaged किया जा सकता अलग-अलग मानकों (जोखिम समय और जेड ढेर आकार) पर निर्भर करेगा की कुल संख्या। समय चुना भ्रूण के सभी के लिए छवि 1 समय बिंदु करने के लिए लिया श होना चाहिएसमय बिंदुओं के बीच के अंतराल से orter। कुछ गहराई संकल्प त्याग करके, अधिक भ्रूण समय अंतराल के भीतर imaged किया जा सकता है। जेड ढेर की सीमा घुड़सवार भ्रूण आंख के पार्श्व और औसत दर्जे का चरम सीमाओं के रूप में चुना जाता है और 30 माइक्रोन के रूप में जेड दिशा में इस सेटअप पारी में विकासशील भ्रूण की आंखों के रूप में ईमानदार माइक्रोस्कोपी सेटअप में पार्श्व पक्ष में जोड़ा जाता है, भ्रूण रात भर बढ़ता है। इस ढेर में परिणाम 100 - 170 माइक्रोन मोटाई (50 - 85 छवियों / आंख)।
      4. 32 डिग्री सेल्सियस (0.5 HPF अंतराल के बराबर) पर छवियों को हर 24 मिनट ले ट्रांस्जीन करने के लिए लेजर / चैनल उचित इस्तेमाल करते हैं।
        ध्यान दें: भ्रूण एक गर्म चैम्बर पूरे माइक्रोस्कोप शामिल भीतर पूरे समय चूक के दौरान मंच पर रहते हैं। 24 घंटे के समय चूक अवधि - प्रयोग के 28 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जा सकता है, गर्म तापमान के विकास में तेजी लाने के लिए और सुनिश्चित करें कि प्रयोग में प्रासंगिक समय अंक 16 के भीतर imaged हैं करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
      5. छविचैनलों दाता लेबल (H2A-GFP या H2B आरएफपी - वैकल्पिक) का प्रतिनिधित्व करने और transgene (Atoh7: आरएफपी या Vsx1: GFP) अनुक्रमिक स्कैनिंग का उपयोग कर। विश्लेषण के लिए, केवल दाता लेबल का उपयोग के रूप में वर्णित उचित भ्रूण का चयन करने के लिए (इमेजिंग की शुरुआत में एक जेड ढेर लेने के लिए) और फिर transgene अभिव्यक्ति पर कब्जा करने के लिए ही चैनल पर समय व्यतीत करते हैं।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, उचित भ्रूण का चयन करने के लिए केवल दाता लेबल का उपयोग (यानी पूर्वकाल उदर चक्र में इस बात की पुष्टि प्रतिरोपित कोशिकाओं के साथ उन) और छवि केवल ट्रांस्जीन चैनल, मोटे तौर पर इमेजिंग समय संयोग और लगभग भ्रूण कि imaged और प्रति विश्लेषण किया जा सकता की संख्या दोगुनी प्रयोग (चित्रा 4)।

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    Representative Results

    यह काम जब जंगली प्रकार रेटिना पूर्वज एक morphant मेजबान भ्रूण के भीतर विकसित जीन अभिव्यक्ति समय में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रयोगात्मक मेजबान भ्रूण Ptf1a morphants, जो रेटिना 7, 26 के मध्यवर्ती पैदा हुए क्षैतिज और amacrine इन्तेर्नयूरोंस की कमी कर रहे हैं। ये मेजबान भ्रूण है, जो एक मानक नियंत्रण morpholino के साथ इंजेक्शन थे नियंत्रित करने के लिए तुलना की गई है।

    चूंकि अलग (रेटिना सहित) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र भर में न्यूरॉन्स के प्रकार के न्यूरोजेनेसिस में होता है एक अत्यधिक संरक्षित histogenic आदेश 27, 28, 29, 30, 31 के बाद के भाग्य की प्रगति सेल गैर स्वायत्त फीडबैक पर निर्भर हो सकता हैपहले पैदा हुए न्यूरॉन प्रकार जमते से। इस परिकल्पना प्रत्यारोपित पूर्वज मध्यवर्ती का जन्म न्यूरॉन प्रकार के अभाव में विकासशील कोशिकाओं में बाद में पैदा हुए तंत्रिका प्रकार की पीढ़ी के समय का आकलन करने से परीक्षण किया गया था। एक नियंत्रण के रूप में, जल्दी पैदा कोशिकाओं के समय भी मात्रा निर्धारित किया गया था, जो कि क्या मध्यवर्ती कोशिकाओं उत्पन्न कर रहे हैं की स्वतंत्र रूप से या नहीं अप्रभावित होना चाहिए। यह अंत करने के लिए, टीजी (atoh7: आरएफपी) या टीजी (atoh7: gapGFP) लाइनों पहले पैदा हुए नाड़ीग्रन्थि सेल न्यूरोजेनेसिस की शुरुआत कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि टीजी (vsx1: GFP) लाइन की शुरुआत देर से विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था पैदा हुए द्विध्रुवी आबादी। इसके अतिरिक्त संवाददाता transgenes व्यक्त अलावा, इन भ्रूण से दाता कोशिकाओं के आनुवंशिक रूप से गुम्मट हैं।

    3 HPF, जिस पर, द्वारा फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति में एकल कोशिका चरण भ्रूण परिणामों की जर्दी में (लेबल दाता कोशिकाओं के लिए) 1 नाथन mRNA की Microinjectionमंच प्रतिभाशाली दाताओं (चित्रा 1) चुने गए हैं। जब भ्रूण 2 HPF (चित्रा 2) के आसपास रहे हैं प्रत्यारोपण सेटअप तैयार करें। 24 HPF पर, प्रासंगिक रेटिना स्थानों में प्रत्यारोपित दाता कोशिकाओं के साथ भ्रूण को चुना है और पांच (चित्रा 3) के समूह में 1% कम पिघल agarose में बढ़ रहे हैं। 24 एच - भ्रूण स्थिति बचत, जेड ढेर और समय मानकों की स्थापना के बाद, समय चूक इमेजिंग के लिए 16 किया जाता है। पहले पैदा हुए नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के समय Atoh7 की शुरुआत ने संकेत दिया है: आरएफपी या Atoh7: GFP transgene है, जो भी साफ़ तौर पर कम चमक में व्यक्त किया जाता है: gapGFP ट्रांस्जीन और पिछले जन्म हुआ द्विध्रुवी पीढ़ी के समय Vsx1 की मजबूत अपरेगुलेशन ने संकेत दिया है विकासशील progenitors में स्तरों। ऐसे Atoh7 के रूप में पहली transgene अभिव्यक्ति, के समय: gapGFP इमेजिंग के प्रत्येक timepoint (सफेद तीर, चित्रा 4) में व्यक्ति की कोशिकाओं में पहचान की है। Atoh7: gapGFP और नाड़ीग्रन्थि सेल भेदभाव occuकि क्या मेजबान भ्रूण गुम्मट या एक Ptf1a मध्यवर्ती (यानी नाड़ीग्रन्थि सेल जन्म के बाद) क्षैतिज और amacrine कोशिकाओं की कमी morphant है की परवाह किए बिना बराबर समय पर रु।

    प्रस्तुत डाटा कि इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रासंगिक निहितार्थ, न केवल सामान्य विकास की प्रक्रिया को समझने के लिए, लेकिन यह भी सामान्य और रोगग्रस्त की स्थिति में सेल reprogramming रणनीतियों के भविष्य के लिए आवेदन पत्र के साथ, जीन अभिव्यक्ति समय पर विशेष रूप से रेटिना के वातावरण की भूमिका का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान प्रदर्शित ।

    आकृति 1
    चित्रा 1: एकल कोशिका चरण भ्रूण की जर्दी में Microinjection दाता कोशिकाओं लेबल और अलग मेजबान वातावरण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया। ए) भ्रूण के आसपास के तरल फिर से ज्यादातर के साथ एक गिलास स्लाइड के किनारे के खिलाफ गठबंधन कर रहे हैंले जाया गया। बी) सुई की जर्दी और या तो H2A-GFP या H2B आरएफपी mRNA (दाता के लिए) या morpholino (मानक एमओ या Ptf1a एमओ की मेजबानी के लिए) के केंद्र में डाला जाता है इंजेक्ट किया जाता है। सी) इंजेक्शन की सुई एक सुई खींचने कि प्रत्येक केशिका से दो सममित सुइयों का उपयोग कर उत्पन्न उत्पन्न होता है। प्रत्येक खींच लिया सुई बाद में (कुंद नहीं) टिप टिप एक तेज कोणीय प्रदान whilst सुई खोलने के लिए संदंश के साथ टूट गया है करने के लिए आसानी से भ्रूण में डाला जा सकता है कि जरूरत है। डी) दाता भ्रूण एकल कोशिका स्तर पर H2B आरएफपी mRNA इंजेक्शन के साथ 2.5 HPF, जिस पर मंच प्रतिभाशाली और सबसे समान रूप से लेबल भ्रूण का चयन किया जा सकता है के द्वारा फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त शुरू करते हैं। ई) लगभग 2.5 - 3 HPF, दाता और मेजबान भ्रूण enzymatically proteases का उपयोग कर dechorionated रहे हैं। Erlenmeyer फ्लास्क का घूमता यांत्रिक बल आवश्यक खुला कमजोर chorions तोड़ने के लिए प्रदान करता है और dechorionated भ्रूण लाता हैकेंद्र में है। जैसे ही पहले एक (तारांकन) या कुछ Dechorionated भ्रूण के रूप में मनाया जाता है लेकिन कोमल तेजी से rinsing सुनिश्चित करता है कि प्रोटीज समाधान निकाल दिया जाता है। एफ) dechorionated भ्रूण के हस्तांतरण के लिए, कांच हस्तांतरण pipettes उपयोग किया जाता है। ये शुरू में किसी भी हद है कि आराम से, उपयोगकर्ता द्वारा चतुराई एक हीरे की चाकू के साथ उचित स्थान पर कांच scratching जब तक यह बंद तस्वीरें द्वारा करने के लिए छोटा किया जा सकता (वैकल्पिक)। यह एक तेज कटौती टिप, जो आग पॉलिश किसी भी किसी न किसी किनारों कि कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है सुगम बनाने के स्थानांतरण के दौरान पिपेट में चूसा जा रहा होने की जरूरत का परिणाम है। स्केल सलाखों ए, बी, डी, ई = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: ट्रांसप्लांटेशन सेटअप। बी) प्रत्यारोपण दिखाए ट्यूबिंग इंगित करता है कि जोड़ों में संभावित लीक बस moldable जोड़ने का मसाला और आयल फिल्म का उपयोग कर रोका जाता है। सी) इंजेक्शन ट्यूबिंग और किसी भी उपयुक्त ट्यूबिंग के बीच संबंध का एक उच्च बढ़ाई दृश्य सिरिंज से कनेक्ट करने के लिए। किसी भी ट्यूबिंग इस्तेमाल किया जा सकता है, ट्यूब यहाँ उपयोग एक व्यास कि कसकर एक 10 μL विंदुक टिप फिट बैठता है। आयल फिल्म का उपयोग एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए। डी) ढालना 150 (6 x 25) wedges agarose इंजेक्शन थाली में त्रिकोणीय divots उत्पन्न करने के लिए है। ई) प्रत्येक पच्चर आकार की लगभग आयाम दिखाए जाते हैं। कंपनी माप मालिकाना हैं। एफ)6 मेजबान भ्रूण के साथ भरा - पच्चर के आकार का indentations के साथ तैयार agarose इंजेक्शन प्लेटों दाता भ्रूण पहले कॉलम को जोड़ा गया और कॉलम 2 के साथ किया जाता है। प्रत्यारोपण पंक्ति, जिससे प्रत्येक पंक्ति में एक दाता से एकत्र कोशिकाओं 5 मेजबान भ्रूण में प्रत्यारोपित किया जा सकता भर में प्रदर्शन कर रहे हैं। प्रत्येक मोल्ड के भीतर, अप करने के लिए 25 दानदाताओं से कोशिकाओं को 125 मेजबान भ्रूण के लिए ऊपर में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। नोट ढालना कील पेट्री डिश किनारे के करीब की गहरी अंत के साथ asymmetrically रखा गया है। इस पेट्री डिश किनारे से टकराने के बिना दाहिने हाथ की ओर से प्रत्यारोपण सुई की अनुमति देता है। जी) प्रत्यारोपण सुई यहाँ दिखाया गया है एक लंबी पतला टिप में परिणाम के लिए इंजेक्शन सुई के रूप में एक ही मापदंड के साथ खींच लिया है। सुई एक बड़ा आंतरिक व्यास है कि उन्हें deforming बिना कोशिकाओं को ले जा सकते हैं उत्पन्न करने के लिए तोड़ दिया जाना चाहिए। उच्च शक्ति इनसेट पता चलता है कि प्रत्यारोपण सुई की नोक कोणीय हो सकता है और आदर्श एक "बांसुरी" आकार का होना चाहिए के रूप में दिखायाइस उदाहरण में। एच) उच्च शक्ति देखें शीर्ष पर कोशिकाओं के साथ मेजबान भ्रूण के उन्मुखीकरण से पता चलता है। प्रत्यारोपण सुई laterally ब्लासटुला चरण मेजबान भ्रूण की कोशिका द्रव्यमान (सफेद तारों) में डाला जाता है और जैसा कि यहाँ दिखाया भविष्य आंख में धकेल दिया है। दाता कोशिकाओं के प्रत्यारोपण सुई (तीर) और इस तरह प्रत्यारोपित नियंत्रित किया जा सकता कोशिकाओं के किसी न किसी संख्या में देखा जा सकता है। मैं) दो उदाहरण (बाएं और दाएं) दिखा रहा है कि तुरंत प्रत्यारोपण के बाद, सही स्थान में सफलतापूर्वक प्रतिरोपित कोशिकाओं के साथ भ्रूण तुरंत बाहर दाता लेबल (जैसे, H2B आरएफपी) का उपयोग कर हल किया जा सकता है। एक फ्लोरोसेंट चैनल "रैखिक चकमा (जोड़)" रेखापुंज ग्राफिक्स संपादक में परत मेनू के तहत विकल्प का उपयोग brightfield को जोड़ा गया है। स्केल बार = 500 माइक्रोन (एच, मैं के लिए)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


    चित्रा 3: भ्रूण समय चूक इमेजिंग के लिए बढ़ते। ए) पेट्री डिश (90 मिमी) एकाधिक कम पिघल agarose पांच भ्रूण युक्त बूंदों दिखा agarose से जुड़े हर एक फर्म को हटाए से अलग-अलग बूंदों को रोकने के लिए नेटवर्क के रूप में। बी) 24 HPF भ्रूण laterally गठबंधन और जम agarose के भीतर एम्बेडेड के उच्च शक्ति देखें। आदर्श कोण के लिए, दो आंखें एक दूसरे के शीर्ष पर तैनात किया जाना चाहिए (जेड आयाम में)। , ब्याज की जीन पर निर्भर करता बढ़ते सिर्फ प्रासंगिक समय से पहले तक विलंबित किया जाना चाहिए (जैसे, नाड़ीग्रन्थि सेल भेदभाव के लिए 26 HPF या द्विध्रुवी सेल भेदभाव की शुरुआत के लिए 35 HPF)। सी) एक ऑप्टिकल Z-धारा brightfield और लाल चैनलों की ओवरले दिखाने का confocal छवि (का उपयोग "रैखिक चकमा (जोड़)" में परत मेनू के तहत विकल्परेखापुंज ग्राफिक्स में कुछ लेबल दाता कोशिकाओं (लाल) एक अन्यथा लेबल हटाया गया मेजबान वातावरण के भीतर के साथ विकासशील आंख के संपादक)। स्केल पट्टी बी = 1 मिमी, पैमाने बार सी = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: न्यूरोजेनेसिस के समय अलग मेजबान वातावरण में प्रत्यारोपित ट्रांसजेनिक दाता कोशिकाओं में देखे जा सकते हैं। ट्रांसजेनिक भ्रूण लेबल हटाया गया गुम्मट मेजबान में प्रत्यारोपित: टीजी (gapGFP atoh7) से विकासशील गुम्मट दाता कोशिकाओं के समय चूक छवि से micrographs। ट्रांसजीन अभिव्यक्ति शुरुआत सफेद तीर से कुछ कोशिकाओं के लिए संकेत दिया है। स्केल बार 10 माइक्रोन =। एक बड़ा संस्करण ओ देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा च।

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    Discussion

    समझना किस हद तक पड़ोसी कोशिकाओं महत्वपूर्ण सेल भाग्य का निर्धारण करने वाले कारकों की अभिव्यक्ति के समय को प्रभावित आवश्यक है जब कुशलता से भ्रूण या प्रेरित multipotent स्टेम कोशिकाओं को एक विशिष्ट बाद mitotic सेल प्रकार या यहां तक ​​कि नमूनों के ऊतकों में अंतर करने की हिदायत करने का लक्ष्य है। इसके अलावा, जीवित जानवरों के विकास की कोशिकाओं में इन आणविक घटनाओं की जांच के अतिरिक्त प्रासंगिक गतिशील (अस्थायी और स्थानिक) vivo में इन घटनाओं के साथ जुड़े विशेष सेलुलर संदर्भों के बारे में जानकारी प्रदान करता है। इस तरह के अध्ययन आसानी से सभी कशेरुकी मॉडल में हासिल नहीं किया जा सकता है।

    प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, उत्तरदायी zebrafish भ्रूण कशेरुकी रेटिना के अपेक्षाकृत सरल, अभी तक अत्यधिक आयोजित तीन आयामी नमूनों के ऊतकों में, विवो में इन सवालों को संबोधित करने के लिए एक मॉडल के रूप में कशेरुकी शोषण किया जाता है। इस परिकल्पना है कि एक विशेष रेटिना सेल घट परीक्षण के द्वारा उदाहरण हैप्रकार के जीन अभिव्यक्ति समय और रेटिना पूर्वज कोशिकाओं के विकास के भाग्य को प्रभावित करती है। हम इसके अतिरिक्त उदाहरण के लिए, का आकलन करने के लिए समय में वापस विशिष्ट कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए दाता सेल मार्कर का उपयोग कर सकते हैं, कितनी देर तक एक transgene की अभिव्यक्ति से पहले एक postmitotic सेल अपने पिछले विभाजन कराना पड़ा, या इस सेल के सामान्य व्यवहार का आकलन (जैसे, पलायन) अलग वातावरण में transgene अभिव्यक्ति करने से पहले विभिन्न चरणों में। इन अध्ययनों के लिए अपेक्षाकृत आसान का एक संयोजन प्रदर्शन करने की तकनीक प्रस्तुत कर रहे हैं, जो morpholino की मध्यस्थता जीन, नीचे दस्तक प्रत्यारोपण और लाइव इमेजिंग शामिल हैं। प्रत्यारोपण विधि के लिए, प्रोटोकॉल एक उपन्यास, अपेक्षाकृत आसान है और सस्ती प्रत्यारोपण रिग का परिचय और इस ऑपरेटिंग सेटअप की आसानी दर्शाता है।

    इस प्रोटोकॉल रेटिना तक ही सीमित नहीं है। यह भी विभिन्न गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की एक संख्या है, कि सेल स्वायत्त developm के अलग करने की आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता हैसेल गैर स्वायत्त पर्यावरणीय प्रभावों से ental कार्यक्रम। हालांकि, जबकि छोटी सी समस्या निवारण आवश्यक है, महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर एक प्रयोग शुरू करने से पहले ध्यान में रखा जाना करने की जरूरत है। तकनीक के सफल आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है कि अंग या ऊतक पसंद का आसानी से जल्दी भ्रूण भाग्य नक्शे का उपयोग करने में लक्षित किया जाना चाहिए है। ऊतक लक्ष्य-निर्धारण की दक्षता पहले परीक्षण नहीं किया गया है, यह पहली अनुकूलित और मानकीकृत किया जाना चाहिए। microinjected और प्रत्यारोपित भ्रूण की संख्या में वृद्धि हुई है और इमेजिंग रहने के लिए दाता कोशिकाओं के साथ पर्याप्त भ्रूण को सही ढंग से एकीकृत और प्रासंगिक ऊतक के भीतर तैनात प्राप्त करने से पहले जांच की जा सकती है। साथ ही, इस प्रोटोकॉल आसानी से इस तरह बढ़ रही लार्वा दो कारणों के लिए और अधिक मुश्किल हो गया है के रूप में जल्दी भ्रूण zebrafish चरणों में, बाद के चरणों के लिए आवेदन करने के लिए लागू किया जा सकता है। सबसे पहले, जीन की दक्षता morpholinos साथ प्राप्य पछाड़ना समय के साथ कम हो जाती है (डीप्रत्येक morpholino पर लंबित है, यह आम तौर पर 3 DPF से पहले सबसे कारगर है)। इस समस्या को ओवरराइड करने के लिए, प्रत्यारोपण के लिए दाता भ्रूण के रूप में आनुवंशिक म्यूटेंट के उपयोग के लिए बेहतर है। दूसरे, के रूप में zebrafish बढ़ता है, लार्वा के गहरे भागों कम विशेष रूप से उच्च आवर्धन (उच्च शक्ति उद्देश्यों) जहां खुर्दबीन उद्देश्य के काम दूरी अधिक सीमित है, एक confocal खुर्दबीन के साथ इमेजिंग के लिए सुलभ हो जाते हैं। इस प्रकार, प्रासंगिक उम्र में ब्याज की प्रत्येक ऊतक पहली इमेजिंग के लिए अपनी ज़िम्मा के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

    समय चूक इमेजिंग एक औंधा या ईमानदार confocal खुर्दबीन पर या तो किया जा सकता है।

    वहाँ, यदि उपलब्ध हो तो ईमानदार माइक्रोस्कोप के लाभ का एक नंबर रहे हैं। आवश्यक तापमान में विसर्जन के लिए इस्तेमाल किया पदार्थ का वाष्पीकरण (जैसे, पानी या पानी अपवर्तनांक के साथ विसर्जन के तेल) एक औंधा माइक्रोस्कोप पर पूरा बाहर सुखाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यह लगातार निगरानी की आवश्यकता है औरअंत में ध्यान से बाहर नमूना रखने के जोखिम के साथ, refilling। यह आंशिक रूप से उद्देश्य के लिए एक परिभाषित दूरी कम करने के लिए स्वचालन का उपयोग कर, विसर्जन पदार्थ जोड़ने और हमारे अनुभव में, फिर से उद्देश्य की परवरिश यद्यपि से बचा जा सकता है, refocusing अक्सर अभी भी आवश्यक है, जो इमेजिंग के अगले समय बिंदु की शुरुआत से पहले नहीं होना चाहिए । दूसरे, सबसे बड़ा coverslip नीचे व्यंजन हम स्रोत अभी भी बहुत कुछ (व्यास में 50 मिमी) छोटे ईमानदार माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग मानक 90 मिमी व्यास पेट्री डिश से कर रहे हैं। इसका मतलब यह है कि मुहिम शुरू की जा सकती है कि भ्रूण की संख्या और भ्रूण मध्यम मात्रा जोड़ा अधिक सीमित जब औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं। फिर भी, समय चूक मानकों को आम तौर पर भ्रूण की संख्या कि imaged किया जा सकता है और इसलिए पकवान का आकार अभी भी उपयुक्त है के लिए मुख्य कारक सीमित गठन। बहुत उच्च बढ़ाई उद्देश्यों का उपयोग करते हैं, उल्टे माइक्रोस्कोपी आंख के रूप में जेड आयाम में अधिक से अधिक गहराई अनुमति हो सकती है औरउद्देश्य केवल एक पतली coverslip से अलग होती है। जब ईमानदार माइक्रोस्कोपी के साथ बहुत ही उच्च वृद्धि के संयोजन, agarose भ्रूण को कवर बूंद के रूप में संभव के रूप में पतली रखा जाना चाहिए। कुल मिलाकर, डेटा ईमानदार या उल्टे माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त बराबर गुणवत्ता की है।

    उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की पीढ़ी के लिए, वहाँ अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम माना जा करने की जरूरत है। सबसे पहले, चमकते लेबल दाताओं के चयन के लिए एक उपयुक्त समय चूक फिल्मों के शुरू में आंख में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या के साथ प्रत्यारोपित भ्रूण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है (कुछ है, लेकिन नहीं भी कई) है। प्रोटीज एंजाइमी dechorionation एक महत्वपूर्ण कदम है और प्रोटीज में ऊष्मायन एक न्यूनतम जल्दी से पीछा करने के लिए रखा जाना चाहिए, लेकिन कोमल भ्रूण के बाद के स्वास्थ्य को प्रभावित नहीं करने के लिए rinses। दाता और मेजबान भ्रूण की उम्र मिलान सटीक ऊतक भाग्य नक्शा करने के लिए और कोशिकाओं के कुशल एकीकरण के लिए अनुसार लक्षित करने के लिए अनुमति देता है। एक अच्छी तरह से आकार का प्रत्यारोपण neEDLE सुनिश्चित करना है कि टिप छोटे और काफी तेज ज्यादा नुकसान के कारण के बिना मेजबान भ्रूण में डालने के लिए है, लेकिन आंतरिक व्यास में काफी बड़ी है कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जा रहा करने के लिए यांत्रिक क्षति का कारण नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रत्यारोपण के दौरान, अगर उपकरण पूरी तरह से सील नहीं किया गया है (विशेष रूप से कनेक्शन अंक पर), यह बहुत मुश्किल मैन्युअल में और प्रत्यारोपण सुई से बाहर E3 मध्यम और कोशिकाओं के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए है। इस सबसे स्पष्ट है जब वहाँ मैन्युअल सिरिंज मात्रा को बदलने के बिना या तो में या प्रत्यारोपण सुई से बाहर प्रवाह है। इस मामले में सभी जोड़ों को फिर से जाँच की और resealed किया जाना चाहिए। इस प्रयोग के लिए अग्रिम में परीक्षण किया जाना चाहिए।

    अन्त में, प्रत्यारोपण और समय चूक सेटअप के बीच गुजरे समय के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्यारोपित भ्रूण whilst सावधानी से किसी भी अस्वस्थ भ्रूण बाहर की सफाई के कम घनत्व पर विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब विकास या जनरल के समयई अभिव्यक्ति की जांच की जा रही है। जब किसी भी प्रक्रिया (उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति) के समय का आकलन करने, नियंत्रण morpholino प्रौद्योगिकी के गैर विशिष्ट दुष्प्रभाव बाहर शासन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हमारे काम में, हम एक असंबंधित ऊतक (जैसे, मांसपेशी) morpholino द्वारा लक्षित विशिष्ट जीन से अप्रभावित में transgene अभिव्यक्ति के समय का उपयोग करें।

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    Acknowledgments

    यह काम एक एआरसी DECRA PRJ करने के लिए (DE120101311) के द्वारा और एक ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया एल.पी. (पीओ 1440 / 1-1)। ऑस्ट्रेलियाई पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान विक्टोरिया की राज्य सरकार और ऑस्ट्रेलियाई संघीय सरकार से धन के द्वारा समर्थित है। हम डॉ जेरेमी एनजी ची केई, जो यहाँ वर्णित के रूप में केई एट अल में प्रकाशित प्रयोगों का आयोजन स्वीकार करते हैं। 2016 हम प्रो Higashijima से ट्रांसजेनिक मछली के प्रावधानों के लिए आभारी हैं और Profs धन्यवाद। टर्नर और pCS2 + प्लाज्मिड और H2B आरएफपी और H2A-GFP निर्माणों पैदा करने के लिए डॉ विल्किनसन के प्रावधान के लिए Rupp। हम अपने जानवरों की देखभाल करने के लिए FishCore सुविधा स्टाफ (मोनाश विश्वविद्यालय) धन्यवाद।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

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    References

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    विकास जीवविज्ञान अंक 121 zebrafish प्रत्यारोपण कल्पना लाइव इमेजिंग सेल गैर स्वायत्त रेटिना जीन अभिव्यक्ति समय न्यूरोजेनेसिस
    Chimeric zebrafish भ्रूण में अलग-अलग रेटिना प्रोजेनिटर्स में ट्रांसजेनिक जीन एक्सप्रेशन के <em>vivo</em> इमेजिंग <em>में</em> सेल Nonautonomous प्रभावों का अध्ययन करने के लिए
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    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

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