Summary
明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。
Abstract
遺伝的および技術的な強みは、遺伝子操作の結果は急速な発達期間を通じて生体内で追跡することができたゼブラフィッシュ脊椎動物鍵モデル生物を行いました。複数のプロセスは、細胞増殖、遺伝子発現、細胞遊走及び形態形成を含む、研究することができます。重要なことは、移植を介してキメラの生成を容易にホスト環境の影響下で個々の細胞のモザイク標識および追跡を可能にする、実行することができます。例えば、宿主胚の機能的な遺伝子操作組み合わせることによって（ 例えば、モルホリノマイクロインジェクションによって）ライブイメージング、外因性の影響は、個々の移植されたドナー細胞上の（遺伝的に改変された環境が提供された）細胞非自律信号を評価することができます。ここでは、このアプローチは、細胞の運命determinのタイミングのためのプロキシとして蛍光導入遺伝子発現の発症を比較するために使用される方法を示し異なる遺伝子ホスト環境でエーション。
この記事では、我々は、ドナー細胞をマークするために、ホスト胚における遺伝子ノックダウンを引き起こすためにゼブラフィッシュの胚をマイクロインジェクションのためにin vivoタイムラプス共焦点に準備し、実行するためのキメラ胚を生成するために使用される移植技術、およびプロトコルの説明をプロトコルを提供します複数の胚のイメージング。このような遺伝子発現の開始などのイベントのタイミングを比較した場合、特に、多位置イメージングを行うことが重要です。これは、複数の制御と同時に処理実験胚からのデータ収集が必要です。このようなアプローチは、簡単に選択した任意の器官または組織に外因性の影響の研究のためのイメージングを生きるためにアクセス可能な拡張することができ、移植が確立胚の運命マップに従って、容易に標的とすることができることを条件とします。
Introduction
in vivoでの脊椎動物における重要な発達過程を視覚化する能力は、ゼブラフィッシュ（1、2に概説されている）正常および疾患状態を研究するための重要なモデル作りに貢献してきました。特に、神経網膜は、中枢神経系のアクセス部分です。網膜は、その高度に組織化された、まだ比較的単純な構造、および脊椎動物種3渡ってその高度に保存された神経細胞の種類に簡単に神経新生の研究を行うために自分自身を貸します。 3次元postfertilizationによってゼブラフィッシュの網膜中心に完成され、増殖、細胞周期の出口、非対称細胞分裂、運命の仕様、分化、および神経回路の形成などの細胞の挙動のダイナミクスretinogenesisのプロセス全体を通して追跡することができます、（ DPF）4、5、REF "> 6、7。
また、上記の各段階における異なる遺伝子の機能要件は、同時にのみ死後検査時に評価することが可能な遺伝子ノックアウト技術の適用に起因する表現型を他の脊椎動物モデルに勝る利点を提供する、ゼブラフィッシュ網膜に評価することができます固定組織の。特に、我々は、網膜におけるレポーター導入遺伝子として蛍光タンパク質の発現を可視化し、監視することができるトランスジェニック株の使用は、我々は、特定の神経細胞型の発生の根底にある遺伝子発現の時間分解能を得ることができます。ゼブラフィッシュの急速な発展に、これらのイベントは、それによって神経細胞のアイデンティティの獲得と細胞挙動に関連する遺伝子発現の時間的な重要性をより深く洞察を提供し、全体の発達期間中に可視化することができます。
最後に、これらのアプローチは、遺伝子機能の二つの重要な側面への洞察が得られ、移植を介してキメラを生成するとゼブラフィッシュで効率的に組み合わせることができます。まず、彼らは非標識野生型環境で開発しながら、特定の遺伝子をノックダウンされたドナー胚から移植された細胞を、調べる、私たちは細胞自律的な方法で、遺伝子機能に関する関連情報を得ることができます。これは、それらが通常で表現された前駆細胞内の網膜の運命決定因子因子の機能に関する重要な洞察につながる。これはもはやこれらの遺伝子4、6から機能性タンパク質を生成することができる前駆細胞の発生運命の結果を検査することによって例示され、 8,9。このアプローチを利用して、我々は多くの運命決定因子の因子（ 例えば、Vsx1、Atoh7、Ptf1a、Barhl2）は、細胞を作用することが示されています-autonomously特定の網膜神経運命を駆動します。遺伝子発現の欠如は、主に遺伝子ノックダウンを有する細胞は、代替の細胞の運命4、6、7、10を採用することにより、生存し続けるように運命のスイッチをもたらします。第二に、このようなキメラ実験は、異なる遺伝的環境内で開発するときに型前駆細胞がどのように振る舞うか野生評価するために使用することができます。例えば、通常操作さホスト環境（ 例えば、遺伝子ノックアウト/ノックダウン）対WTに目的の遺伝子（レポーター導入遺伝子）を発現するWT細胞の発達を比較することによって、遺伝子発現および細胞運命のその影響を評価することができます。ホスト環境における特定のニューロン型の欠如は、例えば、細胞非自律的な方法で、野生型前駆体の挙動に影響を与えることが示されており、過小評価Oへの分化に向かってバイアスそれらにニューロンタイプ4、7、11、12が欠落して rを。網膜神経細胞は、特定の神経細胞の運命決定因子遺伝子の順次時限式（13に総説）（運命の遺伝子発現）によって保存された組織原のために生まれていることを考えると、我々は、野生型の前駆細胞における運命の遺伝子発現のどのタイミングを示すためにこれらのメソッドを使用しましたそのような前駆細胞が誘導される異常な細胞組成物と網膜のホスト環境で開発する際に影響を受けています。ここで、我々はどのように比較的標準と広く使われている技術の組み合わせは、網膜前駆細胞8、9の開発に運命の遺伝子発現のタイミングの検査を可能にします。ための証拠としてこれらのアプローチを概説します
このプロトコルは、あたりの容易さとタイムラプスイメージングを組み合わせた実験的なアプローチについて説明します発達retinogenesisの全期間を通じて個々のモザイク状の標識細胞を追跡するためにゼブラフィッシュ胚の開発エクスビボでの移植を形成します。いずれかの宿主胚に機能的な遺伝子操作を行うことにより、ドナー胚、両方またはどちらも、一方は遺伝子機能の細胞自律性を評価することができます。このアプローチは、ここで説明し、個々の成分が適しているため、他のシステムにおける同様の研究課題に広く適応することができます。
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Protocol
すべての手順は、動物の管理と使用の実践のためのオーストラリア国立保健医療研究評議会コードの規定に従って行われたと制度倫理委員会によって承認されました。
ゼブラフィッシュの調製
- 大人の魚のペアリング
- 夕方には、使用前に適切なサイズの繁殖タンク内のペア（または2ペア）として成魚を設定します。
- 男性から分離された女性を、維持するために見るために魚を有効にしても、互いに接触しないように分周器を使用しています。
- 午前中は、光に切り替えた後、仕切りを取り外して、魚が邪魔されずに交尾することができます。
- 成功した交配は元のタンクに戻って成魚を入れた後。
注：ホストとドナー株は、任意の野生型（WT）株、 例えば 、同じであってもよいです。この研究のためのトランスジェニック系統のTg（atoh7：gapRFP）由来のドナー胚、Tgは（atoh7：gapGFP）またはTG（vsx1：GFP）の運命決定因子因子の発現が早い運転または後期神経運命を可視化することができる、それぞれ14、15、16。以下に説明するように遺伝的環境の異なる効果を比較するために、宿主胚は、特定の変異体またはモルファントすることができます。
- 胚コレクション
- 飼育箱から卵を収集するために茶こしを使用してください。卵のために出生の時間を決定し、単一細胞期胚がその後の工程のために収集されていることを確認するために15分ごとに確認してください。
- E3培地（5のNaCl、0.2mMのKClを、0.4 mMのCaCl 2を、0.9蒸留水でのMgCl 2および2％メチレンブルー）で胚を洗浄し、50の最大密度で〜40mLのE3 17を含むペトリ皿に置き直径90mmのペトリ皿当たり卵。
- の菌株名、日付と時刻にペトリ皿にラベルを付けます誕生。解剖顕微鏡下で胚を見ながら任意の破片を除去するために、パスツールホールピペットを使用してください。
- 移植のための〜3時間postfertilization（HPF）まで28.5℃で胚を保ち、または微量注入を続行します。
注：移植については、同様の年齢のドナーとホスト胚を目指します。キンメルらによると32°C -したがって、25の間で異なる飼育温度を利用します。他に一致するように遅くなったり胚の一方のクラッチを高速化する18。 - （ - 28時間後に24）タイムラプスイメージングまでコレクションの時から〜32℃で注射していないトランスジェニックドナー胚の20を保管してください。
注：これらは実験コホートよりも速く発展する以前の蛍光マーカーを発現します。彼らは、このように画像化のためのパラメータ（レーザーパワー、利得）を設定するために使用することができます。この特定の例では、実験群の結像を評価するために、（前の導入遺伝子の発現を開始しこのイベントの正確なタイミング）。
マイクロインジェクションのため2.準備
- マイクロインジェクションの針の準備
- 同じ長さの2本の針を得るために、中央に各ホウケイ酸ガラス毛細管（1.0ミリメートルOD / 0.78ミリメートルのID / 100ミリメートル、長ガラスキャピラリー）から針を引っ張って針プラーを使用してください。長いシャフトとテーパー針を目指します。
注：ここで使用される針プラー用の設定例は、中に供給され、 材料一覧。 - ペトリ皿に引っ張ら針を格納し、成形可能なパテや接着テープのストリップにそれらを押して固定します。
- 注射前に解剖顕微鏡下で焦点の針の先端を持参し、先端に針をこじ開けるために鉗子を使用しています。小さな開口部（ 図1C）と鋭い先細の先端を目指します。
<ホスト胚のためのLI>モルホリノ準備 - 同じ長さの2本の針を得るために、中央に各ホウケイ酸ガラス毛細管（1.0ミリメートルOD / 0.78ミリメートルのID / 100ミリメートル、長ガラスキャピラリー）から針を引っ張って針プラーを使用してください。長いシャフトとテーパー針を目指します。
- 注文モルホリノオリゴヌクレオチドは、具体的には、目的の遺伝子と同様に、標準的な制御モルホリノまたは手続き及び取扱いの影響を制御するために、適切な5塩基対ミスマッチのために設計されています。
注：ここでは、ヒトβ-グロビンイントロン変異を標的とする中間生まれ水平とアマクリン細胞の発達を阻害する配列5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'でモルホリノPtf1aを遮断翻訳、および標準コントロールゼブラフィッシュのモルホリノ（5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 '）7、19を使用しました。 - 室温で - （8.5 ngの/ nLの〜8）と店舗の1mMモルフォリノ原液を準備します。
- 注射の日に、（それが使用中に室温で保持することができた後）、65℃から冷却さ氷上簡単かつ場所回転、10分間65℃でモルホリノのアリコート（10μL）を加熱します。目潜在的ノックダウンの有効性を減少させることができるモルホリノ液、内凝集任意の逆になりますです。
- Ptf1aのモルホリノと同等の標準制御モルホリノについては、蒸留水でモルホリノ原液を希釈することにより6 NG / nLののワーキング溶液を調製。室温で保管してください。
注：以前に7決定されるように胚あたりモルホリノの使用2 nLのPtf1aモルホリノは、胚あたり12 ngの比較的高い作業濃度を必要とします。ほとんどのモルフォリノのために、2 - 胚あたり5 ngのが効果的であるので、2に株式を希釈 - 5 ngの/ nLの各胚に1 nLのを注入します。
- Ptf1aのモルホリノと同等の標準制御モルホリノについては、蒸留水でモルホリノ原液を希釈することにより6 NG / nLののワーキング溶液を調製。室温で保管してください。
- ラベリングドナー胚について蛍光ヒストン融合レポーター構築物を準備
注：トランスジェニックドナーを使用してかどうかを区別/ホスト胚内のドナー細胞を可視化するために、H2A-GFP（のマイクロインジェクションを含むドナー胚を標識する様々なアプローチが存在します赤色蛍光レポーター）または単一細胞期のドナー胚の卵黄にH2B-RFP（緑色蛍光記者とトランスジェニックのドナーを使用している場合）のmRNA。- レポーターDNAを含有する少なくとも1μgのプラスミドを線形。
注：ここではPCS2 +プラスミド（生成され、親切にミシガン大学から教授デビッド・ターナーとバイオメディカルセンターミュンヘンから教授ラルフ・ラップによって提供される）H2A-GFPまたは博士クリストファー・ウィルキンソンによって生成されたH2B-RFP（、ロイヤル・ホロウェイを含みます、ロンドン大学）は、NotI制限酵素消化で線状化しました。 - 製造業者の説明書に従って市販のキットを用いてDNAを精製します。
- 製造者の指示に従って、適切なポリメラーゼで市販のキットを使用してmRNAを転写します。 PCS2 +プラスミドの場合は、SP6ポリメラーゼキットを使用します。
- 製造元の指示に従ってイソプロパノール沈殿に続いて市販のキットまたはフェノール - クロロホルム抽出を用いてmRNAを精製秒。超純水でのmRNAを希釈（20から30μL）、-80℃での分光光度計や店舗での濃度を測定。
- 注射の日に、100 ngの/μLの最終濃度で滅菌水にmRNAのワーキング溶液を調製し、氷上に保ちます。バック-80℃に未使用のmRNAの株式を返します。
- レポーターDNAを含有する少なくとも1μgのプラスミドを線形。
単一細胞期胚へのモルフォリノおよび/またはmRNAの3マイクロインジェクション
注：マイクロインジェクションは、すべてのドナー細胞をマークするために、異なるホスト環境（制御および遺伝子ノックダウン）を調製し、mRNAまたはモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド20、21の注射を含むために使用されます。
- 注射針を読み込みとキャリブレーション
- microloaderピペットチップを使用して、モルホリノおよび/またはヒストン蛍光融合mRNAのソリューションの3μLと注射針を積み込みます。
- solutを振ります残りの気泡がなくなるまで注射針の先端に向かってイオン。ソリューションは、主に毛細管現象により先端に描画されるように挿入し、内部ガラスに注射針を使用してください。
- マイクロマニピュレーター（3Dマニュアルマイクロマニピュレーター）に取り付けられたホルダに注射針を取り付け、チューブハウジング内に密封を確保します。
- 圧力調節マイクロインジェクタへの電力・ガス供給をオンにします。
- （目盛接眼レンズを使用している場合）皿の中の鉱物油の滴に針の先端を浸したり、ドロップボリュームを校正するためにマイクロメータスライド上に直接針の先端を合わせます。フットペダルを押して注入量を測定し、注入量は1 nLの（125μmの直径）と同じになるまで、ガス圧及び/又は持続時間を調整します。
注：マイクロメータスライドの利点は、測定がしかし、接眼目盛インを使用することにより、顕微鏡で使用倍率から独立しているということですTEAD、噴射液滴とスケールが同時に焦点であることができます。
- 胚のマイクロインジェクション
- ペトリ皿で顕微鏡スライドを配置し、スライド縁に沿って単一細胞期胚を堆積させるために、転送ピペットを使用しています。カットオフ細い先端の半分でmicroloaderピペットチップを使用して、単一の列に合わせます。注射時の動きを防止するために、微細なトランスファーピペットでできるだけ多くの液体（ 図1A）を取り外します。
- 各胚に向けて針を下げ、そして1滑らかなストローク（ 図1B）で絨毛膜と卵黄を貫通しています。
- 針の先端は、フットペダルを押すことによって卵黄、顕微注入するの中央に配置されたら。単一細胞期のドナー胚（トランスジェニック）の卵黄にH2A-GFPまたはH2B-RFPのmRNAの1 nLのを注入します。二回フットペダルを押すことによって、単一細胞期野生型宿主胚の卵黄に標準MOやPtf1a MOの2 nLのを注入します。成功した注射はSmalのことで可視化することができます卵黄中リットル空間変形。
- （ - 60胚50）の位置に次の胚を持参し、胚の列全体が注入されるまで注入し続けるために胚を含む皿を移動し、注射針を外します。
- すべての胚を注入した後、30で皿を持ち上げ - 45°の角度と新しいきれいなペトリ皿に注入した胚を転送するためにE3培地（スクイーズボトル）の穏やかな流れを使用します。
- インキュベーターで胚皿を置きます（どちらかの28.5°Cまたは他の温度でドナーとホスト胚は同等の年齢であることを保証するため）。
- 250ホスト胚 - 〜100ドナー胚または〜200を得るために、3.2.6に必要な - を繰り返して、3.2.1を繰り返します。
- 1時 - 2 HPF、解剖顕微鏡下で胚を確認し、パスツールホールピペットで2または4セルの段階に進んでいないすべての未受精卵を削除します。
移植のため4.準備
ontent ">注：移植は異なる遺伝子ホスト環境の影響9等価WTドナー前駆細胞内で評価することを可能にするキメラ胚を生成するために使用される、22、23。- ドナー胚の選択
- 3 HPFでは、2のドナー胚をチェック - ラベリング信号用の5倍の倍率を蛍光顕微鏡下で。よく発達した選択（均等サイズのセルとの対称細胞塊）GFPプラスフィルターを使用して、強い蛍光シグナル（460から500 nmの励起、510nmのロングパス発光）またはテキサスレッドフィルター（540と胚 - 580 nm励起、610 nmのロングパス発光）（ 図1D）。トランスジェニック記者はまだ発現されません。
- アガロース注入プレートとペトリ皿の準備
- 直径90mmのペトリ皿にE3培地で希釈し、溶融2％アガロースを注ぎ、皿が安全になるまで、それはクールダウンしましょう触る。ホットアガロースは、そうでなければ、金型を変形させることができます。
- アガロース（ 図2D、E）にくさび状の突起（6×25 /金型）とプラスチック金型をフロート。アガロース上に金型の一方の側に配置し、他の側を下にゆっくりと低いことにより、気泡を避けてください。金型は、移植針のための十分な隙間空間を可能にするために皿にまたはくさび状突起の最深点の側に中央に配置されていることを確認します。
- アガロースが完全に室温で固化することを可能にします。
- 4℃で30分間、アガロース皿を置き、静かに1コーナー（ 例えば、ピンセットで）から持ち上げて金型を削除します。乾燥からそれらを防ぐためにE3培地とパラフィンフィルムシールの小容量で4℃で一日、実験前と店舗へのアガロース注入プレートを準備します。
- 移植前に、E3媒体とアガロース注入プレートを記入し、少なくとも30分間、28.5℃のインキュベーターに配置します。 <LI> dechorionated胚は、いずれかの使用のガラス食器やコートE3で2％アガロースの薄層を有するペトリ皿（直径90mm）の内側のプラスチックに固執するので。 dechorionatedホスト胚のための一皿、dechorionatedドナー胚およびすべての40移植胚のための1つの皿のための1つの皿を準備します。注入プレート（4.2.4）で説明したように保管してください。
- 先端が下がるまで回転しながらダイヤモンドナイフで引っ掻くことにより、快適な操縦（オプション）を可能にする長さに長い形細かく引かガラスチップパスツールピペット（2 mL容量、230ミリメートルの長さ、長さ100mm、先端）の先端をカットオフ（ 図1F）。
- カットがまっすぐであることを確認してください。ファイアーポリッシュdechorionated胚（ 図1F）を損傷しないように滑らかな末端を生成するためにブンゼンバーナーで切断面を回転させることによってガラストランスファーピペット。
注：ワットあまりにも長い間炎にピペットチップを維持開口部における病気の結果は、密閉または胚のために小さくなり過ぎるされています。
- 胚に触れることなく、各絨毛膜を開いて引き裂く、または酵素的に胚9の多数の同時急速dechorionationを可能にするために、プロテアーゼを使用することにより、2つの微細なピンセットでDechorionate胚手動。
- 、50ミリグラム/ mLのプロテアーゼ混合物の100倍原液を調製し、100μLのアリコートを作成し、-20℃で保管してください。
- 10 mLのE3培地（0.5ミリグラム/ mLのプロテアーゼの最終濃度）に株式プロテアーゼの100μLを加えます。
- 二つの別々の小さな三角ガラスビーカー（10 mL）によく発達したホストとドナー胚を置き、できるだけ多くの液体を除去します。
- 各ビーカーに0.5ミリグラム/ mLのプロテアーゼ溶液5mLを加え、穏やかに解剖顕微鏡下でそれらを見ながら胚を旋回。絨毛膜の変形の兆候を監視します。
- 旋回をしてください。すぐに最初の胚は、絨毛膜（ 図1D、アスタリスク）の外であるとして、液体のほとんどを注ぎ、ゆっくりと側面に沿ってE3に注ぐことによって、フラスコを補充することによりプロテアーゼ溶液を除去するために、E3培地で3迅速なリンスを行います。彼らが破裂するように、dechorionated胚を移植の終わり（第5節）まで、後続工程のいずれかで空気に触れないようにしてください。リンスの間にフラスコ中で適切な解決策を残します。
- 火災研磨されたガラス転送ピペットを用いて、ガラスペトリ皿またはアガロース（E3培地で2％）コーティングされたプラスチック皿に三角ビーカーから胚を移します。静かに残りの弱体化絨毛膜を除去するために、転送中にピペット。
- 1.0ミリメートルOD（各ホウケイ酸薄肉ガラス管から2本の針を引っ張って針プラーを使用しますマイクロインジェクションピペットと同じ設定で/ 0.78ミリメートルID / 100ミリメートルの長さ）。
注：ここで使用される針プラー用の設定例は、物質一覧に供給されています。この損害賠償細胞が針に吸い込まとして移植針は、ガラスインサートを持っていません。 - ペトリ皿に、事前に店舗を針を引いて、成形可能なパテや接着テープのストリップに押して固定します。
- 移植前に解剖顕微鏡下で焦点の針の先端を持参し、先端に針をこじ開けるために鉗子を使用しています。フルート形状（ 図2G）を目指し、または先端形状23を生成するために説明されている代替の方法を使用するために、針の形状を調整するために微細な鉗子を使用してください。
胞胚移植を介した5キメラの生成
- 移植のセットアップ
注記：ここでは、自己組織移植装置を使用した（ 図2A - （マイクロマニピュレータに取り付けられて、ステップ3.1.3）の上にマイクロインジェクションのために使用したのと同じ針ホルダ内移植針をマウントし（ 図2A）。
- マイクロインジェクションのために使用される圧力調節マイクロインジェクターにマイクロピペットホルダーの端を結ぶ注入チューブを外します。移植のリグを表す1 mLシリンジ（ 図2A、B）、にリンクされている注入チューブを取り付けます。
- すべての接続がしっかりパラフィンフィルムや成形可能なパテを使用して密封されていることを確認してください。移植針自体にいくつかのE3媒体が常に存在することを確実にすることにより、空気と接触するから胚を防ぎます。移植針のうち、細胞/液体を吸うために手動で注射器を操作してください。
- アガロース金型の最初の列にガラスピペットを用いてドナー胚を移します。列にホスト胚を移し2アガロースモールド（ 図2F）の6へ。割球側が上を向くようにピペットで胚を置きます。
- 静かにドナー胚の割球細胞に移植針を休ませ、ゆっくりと約20吸う-移植針（ 図2H）に50個の細胞を。卵黄を吸い上げないようにしてください。
- マイクロマニピュレーターを用いて、ドナー胚から移植針を持ち上げます。左にアガロースモールド皿を移動し、最初の宿主胚の動物極に細胞塊の側を通って移植針の先端を挿入します。デポジットは5 -この領域は前脳/アイ・フィールド24（ 図2I）を生じさせることを示す運命のマッピングに従って表面付近の10の細胞。手順全体を通じてE3培地に浸漬針の先端を保管してください。
- ドナー胚aを削除します28.5°Cで2時間 - 番目の1のためにアガロース金型内のホスト胚を残します。これは、撮像を妨害するような色素形成を防ぐために、0.003％のN-フェニルチオ尿素（PTU）を含むE3媒体をガラスまたはプラスチック（2％アガロースでコーティングされた）ペトリ皿を埋めます。火災研磨したガラスピペットを用いて、これらの皿に、ホスト胚を移し、28.5°CO / Nでインキュベートします。
注意：PTUを取り扱う際は手袋を着用してください。
6.ライブイメージングのセットアップ
注：小型かつ急速な発展と組み合わせたゼブラフィッシュの光透過性は、それが別の細胞や臓器のin vivoイメージングのための重要な脊椎動物のモデルになることを許可しています。イメージングは、設定やパラメータが異なるであろう顕微鏡の様々なに対して行うことができます。以下は、網膜の開発5、8のイメージングに適した共焦点イメージングセットアップについて説明します。
- キメラ胚選択
- 24時 - 26 HPF、開発目の原基に移植ドナー細胞（H2A-GFPまたは標識H2B-RFP）を示す健康なよく発達した胚を選択するために、蛍光解剖スコープの下に移植した胚を選別します。
- 胚を麻酔する（MS222）新しい皿にピペットで装着するための40の胚まで置いておきますと、0.4 mg / mlでトリカインmethanesulfateを追加します。
注意：MS222を取り扱う際は手袋を着用してください。
- 取付胚
注：イメージングは8倒立または正立顕微鏡（ここで説明）上で実行されるかどうかに応じて、適切な取り付け皿を使用してください。- E3培地中の0.4mg / mLのMS222に1％の低融点アガロースの1 mLを含む1.5数mLのプラスチックチューブを準備し、40℃の水浴中で溶融しておきます。
- プラスチック製のトランスファーピペットに5胚を吸うと胚は重力によって先端に蓄積してみましょう。トランスファーピペットをタッチ低溶融アガロース1％及び0.4 mgの胚は、E3の転送量を制限しながら、チューブ内にシンクすることを可能にする/ mLのMS222を含む準備プラスチックチューブの一方の表面上に。
- 正立顕微鏡と倒立顕微鏡でのイメージング用ガラス底シャーレ（任意のサイズ）の撮像のための直径90mmのペトリ皿でマウント胚。視覚的イメージ（片側）のWT宿主におけるドナーまたは同じ実験でモルファントホスト（反対側）に2等分に皿のいずれかを分割するために永久的なマーカーを使用してください。
- 1 mLのアガロース - 0.5とペトリ皿のいずれかにアガロースプラスチックチューブから5胚を移します。 （ - 300μL〜200）のままで唯一の小滴は、そのように転送ピペットを用いて、過剰なアガロースを削除します。直立顕微鏡で撮影した場合、シャーレの円周の1cm以内に胚を配置しないように。イメージングのために使用される水浸浸漬レンズによりペトリ皿の壁にその領域内にセンタリングすることができないかもしれない（ 図3A </強いです>）。
- アガロースが固化するまで横方向に胚を整列させるために（折れ先端を有する）マイクロローディングピペットを使用してください。頭部の両側にある2つ目は（ 図3B）（XY寸法に整列）完全に重複している場合は料理の両方のタイプのために、胚を正しく横方向に傾斜しています。倒立顕微鏡での使用のためには、カバーガラスに近い目は、可能なフォーカスレベルの制約内でz次元を通してイメージングを可能にするために、可能な限りカバーガラスの近くにプッシュする必要があります。
- 個々のアガロース滴で一度に5胚をマウント続けます。アガロースは互いにイメージング（ 図3A）の間の任意の脱落と横方向の移動を防止するために、皿の側に下がる参加するより1％低融点アガロースを使用してください。
- 一度完全に固化し、E3培地で皿をカバー（PTU 0.003％を含有し、0.4 mg / mlとMS222）28.5℃に予め温めました。
- ステップ6.2.2に記載したのと同じアプローチを使用して- 6.2.8は、〜別々の皿に32°C（ステップ1.2.5）で上昇20トランスジェニック胚をマウントします。
- 撮像パラメータ
注：蛍光導入遺伝子の発現を分析するためのイメージングは、高い空間細胞内の解像度を必要としません。これは、Wプラン - アポクロマート20X / 1.5ズームで1.0 DIC M27 70 mmの目的で行うことができます。- （;ステップ6.2.8 すなわち 32℃で昇）開発加速で〜20トランスジェニック胚のための導入遺伝子の強度に基づいてレーザパワーと露光時間を設定します。
注：導入遺伝子発現の発症の研究のために、実験的な胚はタイムラプスは、このように設定され、現時点では蛍光を示さない、これらの加速の胚は、イメージングのパラメータを決定するために重要です。 - 実験ディッシュについては、各胚を視覚化し、位置を保存し、胚のレベルに焦点を当てます。
- （ すなわち 、横方向sの正しい取り付け角度を持つ胚を選択してくださいできるだけ水平に目のIDE）と強いハートビート（健康の指標）。主に（遺伝子発現の波が始まる）の開発網膜（ 図3C）の前腹側象限に（H2A-GFPまたはH2B-RFP標識により識別される）いくつかの移植ドナー細胞と胚を選択してください。
注： - 25分180拍/ゼブラフィッシュの胚では、平均心拍数は120です。 120拍/分 - 麻酔した胚では、健康的なハートビートは60の範囲内であってもよいです。遅い心拍が低下生存能力の指標である可能性があり、その胚を研究から除外されるべきです。
- （ すなわち 、横方向sの正しい取り付け角度を持つ胚を選択してくださいできるだけ水平に目のIDE）と強いハートビート（健康の指標）。主に（遺伝子発現の波が始まる）の開発網膜（ 図3C）の前腹側象限に（H2A-GFPまたはH2B-RFP標識により識別される）いくつかの移植ドナー細胞と胚を選択してください。
- 最大15胚の網膜を介して2μmの間隔で光学切片のzスタックを設定します。
注：任意の実験で画像化することができる胚の合計数は、個々のパラメータ（露光時間及びzスタック・サイズ）に依存するであろう。選択された胚のすべてのための画像1の時点にかかる時間はSHである必要があります時点間の間隔よりもorter。いくつかの深さ分解能を犠牲にすることによって、より多くの胚の時間間隔内に画像化することができます。 zスタックの限界が搭載された胚の目の横方向と内側の極端として選択され、30ミクロンは、z方向にこのセットアップシフトなどで発生中の胚の目のように、直立顕微鏡のセットアップの横側に追加されます胚は一晩増殖します。 170ミクロンの厚さ（50 - - 85枚/アイ）これはスタック100になります。 - 導入遺伝子に対するレーザ/チャネルの適切なを使用して、32°C（0.5 HPF間隔に相当）で画像ごとに24分を取ります。
注：胚は顕微鏡全体を網羅する加熱されたチャンバ内の全体の時間経過を通してステージ上に残ります。 24時間タイムラプス期間 - 実験は28℃で行うことができますが、気温の上昇は、開発をスピードアップし、実験では、関連する時点が16内に結像されることを保証するために使用されています。 - 画像順次走査を使用し、導入遺伝子（GFP：RFPまたはVsx1 Atoh7） - ドナーラベル（オプションH2A-GFPまたはH2B-RFP）を表すチャンネル。分析のために、説明したように適切な胚を選択します（撮影の開始時に1 zスタックを取る）した後、導入遺伝子の発現をキャプチャするだけのチャンネルにタイムラプスを実行するための唯一のドナー標識を利用します。
注：別の方法として、適切な胚を選択するだけでドナーラベルを使用（ すなわち確認移植前方腹側象限内の細胞を持つもの）と画像のみ導入遺伝子チャンネル、おおよそ撮像時間を半減し、ほぼ結像さごとに分析することができる胚の数を2倍に実験（ 図4）。
- （;ステップ6.2.8 すなわち 32℃で昇）開発加速で〜20トランスジェニック胚のための導入遺伝子の強度に基づいてレーザパワーと露光時間を設定します。
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Representative Results
この作品は、野生型の網膜前駆細胞がモルファント宿主胚内で開発する場合、遺伝子の発現タイミングの変化を評価するための実験プロトコルを提示します。実験宿主胚は、網膜7、26の中間生まれ水平およびアマクリン介在ニューロンを欠いPtf1aのモルファント、です。これらは、標準の制御モルホリノを注射した宿主胚を制御するために比較されました。
（網膜を含む）、中枢神経系発生を横切るニューロンの異なるタイプの神経新生ので高度に保存された組織原のため27、28、29、30、31に続く運命の進行は、細胞非自律的なフィードバックに依存してもよいです以前生まれのニューロンのタイプを蓄積から。この仮説は、中間誕生ニューロンの種類の非存在下で現像移植前駆細胞で後に生まれた神経型の発生のタイミングを評価することによって試験しました。対照として、早期に生まれた細胞のタイミングも独立して中間細胞が生成されるか否かに影響を受けないはずである、定量化しました。ライン最近の発症を分析するために使用した。この目的のために、Tgは（atoh7：RFP）またはTgは（atoh7：gapGFP）は、Tgは（GFP vsx1）は 、一方のラインは、最初に生まれ神経節細胞の神経発生の開始を視覚化するために使用されましたバイポーラ人口生まれ。さらにレポーター導入遺伝子を発現している以外に、これらの胚からのドナー細胞が遺伝的にWTあります。
3 HPFによる蛍光レポータータンパク質発現における単一細胞期胚の結果の卵黄に（ラベルドナー細胞への）1 nLのmRNAのマイクロインジェクション、で明るいドナーステージ（ 図1）が選択されています。胚は2 HPF（ 図2）の周りにあるときに、移植のセットアップを準備します。 24 HPFでは、関連する網膜の場所に移植ドナー細胞と胚が選択され、5（ 図3）の群で1％低融点アガロースに搭載されました。 24時間 - zスタックと時間パラメータを設定し、胚の位置を保存した後、タイムラプス撮影を16行われます。最初に生まれた神経節細胞のタイミングはAtoh7の開始によって示される：RFPまたはAtoh7：GFP導入遺伝子も明らかに低い明るさで表現される：gapGFP導入遺伝子および最後の生まれたバイポーラ発生タイミングはVsx1の強いアップレギュレーションによって示されています発展途上前駆細胞内のレベル。このようなAtoh7としての第1の導入遺伝子発現のタイミングは、：gapGFPは、撮像（白矢じり、 図4）の各時点での個々の細胞において同定されています。 Atoh7：gapGFPと神経節細胞の分化occu同等の時間でのRSは関係なく、宿主胚があるかどうかのWTまたはPtf1aは、水平およびアマクリン細胞（神経節細胞の出生後すなわち ）の中間を欠くモルファント。
提示されたデータは、この実験的なアプローチは、通常の発達過程を理解するためだけでなく、正常および疾患状態における細胞の再プログラミング戦略の将来のアプリケーションのためだけでなく、関連する意味合いで、遺伝子発現のタイミング上の特定の網膜の環境の役割を評価するための強力なツールを提供することを実証します。
図1：単一細胞期胚の卵黄へのマイクロインジェクションはドナー細胞を標識し、別のホスト環境を生成するために使用されます。 A）胚は、周囲の液体の再のほとんどは、スライドガラスの端に整列されています移動しました。 B）針は卵黄の中央に挿入され、H2A-GFPまたはドナーのためのH2B-RFPのmRNA（）またはモルホリノ（ホストするための標準的なMOやPtf1a MO）のいずれかを注入されています。 C）注射針は、各キャピラリーからの2つの対称な針を発生針プラーを使用して生成されます。各プル針はその後容易に胚の中に挿入することができる（平滑末端ではない）鋭角先端を提供しながら、針を開くために鉗子で破壊先端を有する必要があります。単細胞段階でH2B-RFP mRNAを注入D）ドナー胚は明るいステージ、最も均一に標識された胚は、選択可能な、2.5 HPFによって蛍光レポータータンパク質を発現して起動します。 E）アラウンド2.5から3 HPF、ドナーとホスト胚を酵素プロテアーゼを使用してdechorionatedています。三角フラスコの旋回は、オープン弱体化絨毛膜を破壊するために必要な機械的な力を提供し、dechorionated胚をもたらしますセンターにね。すぐに最初の（アスタリスク）または少数dechorionated胚のように、観察急速しかし穏やかなすすぎは、プロテアーゼ溶液が除去されることを保証しています。 dechorionated胚の移送のためにF）は 、ガラス転移ピペットが利用されます。これらは、最初にそれがオフに固定されるまで、ダイヤモンドナイフを用いて適切な位置にガラスに傷をつけにより、快適にユーザによって操作される任意の長さにします（オプション）を短縮することができます。これは、転送中にピペット内に吸引され、細胞に損傷を与える可能性のある粗いエッジを滑らかにするためにファイアーポリッシュにする必要があるシャープカット先端、になります。スケールバーA、B、D、E = 1mmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：移植のセットアップ。
図3：タイムラプスイメージングのためのマウント胚。 A）5胚を含む複数の低融点アガロース液滴を示すペトリ皿（90 mm）のアガロースで接続されそれぞれが取り外しから個々の液滴を防止するためにしっかりとネットワークを形成します。 B）24 HPFの胚横方向に整列させ、固化したアガロース内に埋め込まの高いパワービュー。理想的な角度は、両眼を（z次元で）互いの上に配置されるべきです。目的の遺伝子に応じて、取り付け直前に、関連するタイミング（双極細胞分化の開始のための神経節細胞の分化または35 HPFのために例えば、26 HPF）にまで遅延されるべきです。 C）明視野と赤チャンネルのオーバーレイを示す単一の光のz断面の共焦点画像（使用して「覆い焼きリニア（追加）」のレイヤーメニューのオプションそれ以外の場合はラベルなしホスト環境の中で、いくつかの標識されたドナー細胞（赤）と発展途上目のペイントソフト）。スケールバーB = 1ミリメートル、スケールバーC =50μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：神経発生のタイミングは、別のホスト環境に移植するトランスジェニックドナー細胞で可視化することができます。非標識のWT宿主に移植トランスジェニック胚：Tgは（gapGFP atoh7）から開発WTドナー細胞のタイムラプス画像から顕微鏡写真。導入遺伝子発現の開始は、白い矢印で少数の細胞のために示されています。 =10μmのスケールバー。 拡大版のOを表示するには、こちらをクリックしてください。この図F。
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Discussion
効率的に特定の有糸分裂後の細胞型、あるいはパターン化された組織に分化する胚性または誘導された多能性幹細胞を指示することを目指したときにエクステントがどの隣接セルが重要な細胞の運命決定因子の発現のタイミングに影響を与えるように理解することが不可欠です。また、生きている動物の開発細胞におけるこれらの分子事象を調べることに加えて、関連する動的な生体内でこれらのイベントに関連付けられた特定の細胞の文脈上の（時間的および空間的）情報を提供しています。このような研究を容易にすべての脊椎動物モデルで達成することができません。
提示されたプロトコルでは、影響を受けやすいゼブラフィッシュの胚は、脊椎動物の網膜のさらに高度に組織化され、比較的単純な3次元パターン化された組織において、in vivoでこれらの問題に対処するための脊椎動物のモデルとして利用されています。これは、特定の網膜細胞を枯渇させるという仮説をテストすることによって例示されます型は、遺伝子発現のタイミングおよび網膜前駆細胞の発生運命に影響を与えます。我々はさらに、導入遺伝子の発現は、有糸分裂後の細胞は、その最後の分裂を受けた、またはこの細胞（ 例えば、移動）の一般的な挙動を評価する前にどのくらいの時間、例えば、バック評価する時間内に特定の細胞を追跡するために、ドナー細胞マーカーを利用することができます異なる環境での導入遺伝子発現の前に様々な段階で。これらの研究のために、技術を実行することが比較的容易との組み合わせは、モルホリノ媒介遺伝子ノックダウン、移植およびライブイメージングが含まれ、提示されています。移植方法の場合、プロトコルは、新規な、比較的容易かつ安価な移植のリグを紹介し、この動作設定の容易さを示しています。
このプロトコルは、網膜に限定されるものではありません。細胞自律的なdevelopmのほぐしを必要とする、異なる動的な細胞プロセスの数を研究するためにも適用することができます細胞非自律的な環境の影響から内部のプログラム。ほとんどのトラブルシューティングが必要とされている間しかし、重要なステップの数は、前の実験を開始する考慮する必要があります。技術の成功のアプリケーションのための1つの重要な前提条件は、選択した臓器または組織が簡単に運命マップを使用して、初期胚に標的にされなければならないということです。組織標的化の効率は、以前に試験されていない場合、これは最初に最適化し、標準化する必要があります。マイクロインジェクションおよび移植胚の数は増加し、ドナー細胞との十分な胚正しく統合されており、関連する組織内に配置を得るために、イメージングを生きるために前にスクリーニングすることができます。さらに、このプロトコルは、簡単に、このような二つの理由のために、より困難になる成長幼虫として初期胚ゼブラフィッシュ段階、後期にアプリケーションに適用することができるが。まず、モルフォリノで得られる遺伝子ノックダウンの効率が経時的に減少する（デ各モルホリノで保留中、それは）3 DPFの前に、一般的に最も効率的です。この問題を上書きするには、移植のためのドナー胚として遺伝的変異体の使用が好適です。第二に、ゼブラフィッシュのように、特に顕微鏡対物レンズの作動距離がより制限され、より高い倍率（高電力の目的）で、共焦点顕微鏡を用いて撮影にあまりアクセス可能になる幼虫のより深い部分を成長させます。このように、関連する年齢で対象の各組織は、第1の撮像への従順のために評価する必要があります。
タイムラプスイメージングは、反転または直立共焦点顕微鏡のいずれかを行うことができます。
利用可能な場合正立顕微鏡の多くの利点があります。必要な温度では、使用イマージョン物質の蒸発が（ 例えば、水の屈折率を持つ水や液浸油）倒立顕微鏡には、完全に乾燥アウトにつながることができます。これは、一定の監視を必要とし、最終的に焦点外のサンプルを置くのリスクと、補充。これは、部分的に画像化の次の時点の開始前に起こるべきである、我々の経験では、リフォーカスがしばしば依然として必要とされるが、浸漬物質を添加し、再度目的を上げ、目的に定義された距離を低下させるために自動化を使用することによって回避することができます。第二に、私たちは調達最大のカバーガラスボトムディッシュはまだ直立顕微鏡検査のために利用標準的な直径90mmのペトリ皿よりも（直径50mm）はるかに小さいです。これは、倒立顕微鏡を使用したときに取り付けられ、胚培地体積を添加することができる胚の数はより限られていることを意味します。それにもかかわらず、タイムラプスのパラメータは、通常、画像化され、したがって、皿のサイズは依然として適切であることができる胚の数のための主な制限要因となります。非常に高倍率の対物レンズを使用する場合は、倒立顕微鏡は目としてz次元におけるより大きな深さを可能にすることができると目的は、薄いだけカバースリップで分離されています。直立顕微鏡で非常に高い倍率を組み合わせる場合、胚をカバーするアガロースドロップを可能な限り薄く維持されなければなりません。全体的な、直立または倒立顕微鏡を用いて得られたデータは、同等の品質です。
高品質データを生成するために、考慮される必要がある追加の重要なステップがあります。まず、明るく標識されたドナーの選択は、タイムラプスムービー（あまりにも多くの数ではなく）の開始時に、眼内移植細胞の適切な数と移植胚を得るために重要です。プロテアーゼ酵素dechorionationは、プロテアーゼにおける重要なステップとのインキュベーションは、胚のその後の健康に影響を与えない迅速な、しかし穏やかなリンスが続い最小限に抑える必要がありです。ドナーとホスト胚の年齢マッチングは運命マップに従って標的に正確な組織のために、細胞の効率的な統合を可能にします。ウェル状移植ねedleは、先端部が、移植された細胞への機械的損傷を起こさないために小さく、多くのダメージを与えることなく、ホスト胚に挿入するのに十分な鋭いが、内部の直径は十分な大きさであることを保証すること、が重要です。装置が完全に（特に接続点で）密封されていない場合、移植時に、手動に移植針からE3培地および細胞の動きを制御することは非常に困難です。手動シリンジの容積を変更することなく、中または移植針のうちいずれかの流れがある場合に最も明らかです。この場合、すべての関節を再チェックし、再密封されなければなりません。これは、実験の前にテストする必要があります。
最後に、移植およびタイムラプスセットアップの間の経過時間中に、移植胚は細心の注意を払って任意の不健康な胚を掃除しながら、低密度で開発することが許可されていることが重要です。これは、特に重要であるときに開発や世代のタイミングEの発現が検討されています。任意の工程（ 例えば、遺伝子発現）のタイミングを評価する場合、コントロールはモルホリノ技術の非特異的な副作用を排除するために使用されなければなりません。私たちの研究では、モルホリノによって標的特異的な遺伝子による影響を受けない無関係の組織（ 例えば、筋肉）における導入遺伝子の発現のタイミングを使用します。
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Acknowledgments
この作品は、PRJ（DE120101311）へとLP（PO 1440 / 1-1）にドイツ学術協会（DFG）研究助成金によってARC DECRAによってサポートされていました。オーストラリアの再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア連邦政府からの資金によってサポートされています。私たちは、圭らに公開され、ここで説明した実験を行った博士ジェレミー呉チー圭を、認めます。 、2016年には、我々は教授東島からトランスジェニック魚の規定に感謝していとPROFSに感謝します。 H2B-RFPとH2A-GFP構築物を生成するためのPCS2 +プラスミドと博士ウィルキンソンの提供のためにターナーとラップ。私たちは、動物の世話をするためのFishCore施設のスタッフ（モナッシュ大学）に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C |
| Agarose low melt | Sigma | A9414-100G | Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted). |
| borosillicate glass capillary tube w/o filament | SDR Scientfic | 30-0035 | alternatives with similar diameter can be used |
| borosillicate glass capillary tube with filament | SDR Scientfic | 30-0038 | alternatives with similar diameter can be used |
| glass petri dishes (60 mm diameter) | Science Supply | 1070506 | any glass alternative of any size |
| Injection tube (2 m) | Eppendorf | 524616004 | This connects the needle holder to the syringe during transplantation |
| Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) | Adaptive Science Tools | PT-1 | alternatives with similar shape can be use |
| microneedle holder | Narishige | M-152 | any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used |
| microinjector | Narishige or Eppendorf Femtojet | Pneumatic injector using gas pressure | |
| micromanipulator | Coherent Scientific | M330IR | similar alternatives can be used |
| microloader tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904-500ML | |
| needle puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension |
| Parafilm | Interpath | PM996 | any paraffin film |
| Pasteur pipette plastic | Samco Scientific | 202 | |
| Pasteur pipette glass | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | Protease Type XIV |
| N-phenyl thiourea | Sigma | P7629-25G | PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use. |
| Qiaquick gel extraction | Qiagen | 28704 | any alternatives to purify DNA can be used |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | any alternatives to purify RNA can be used |
| SP6 mMessage kit | Qiagen | AM1340 | any alternatives to transcribe DNA using SP6 |
References
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