In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo's to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Summary

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

Abstract

De genetische en technische troeven hebben de zebravis gewervelde een belangrijk modelorganisme waarin de gevolgen van gen-manipulaties kunnen worden getraceerd in vivo gedurende de snelle ontwikkelingsperiode gemaakt. Meerdere processen kunnen worden onderzocht waaronder celproliferatie, genexpressie, celmigratie en morfogenese. Belangrijk, kan het genereren van chimeren door middel transplantaties gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor mozaïek etikettering en volgen van individuele cellen onder invloed van de nieuwe omgeving. Bijvoorbeeld, door het combineren functioneel gen manipulaties van de ontvangende embryo (bijvoorbeeld door micro-injectie morfolino) en levende beeldvorming, de effecten van extrinsieke signalen nonautonomous cellen (aangeleverd door de genetisch gemodificeerde milieu) individuele getransplanteerde donor cellen kan worden geëvalueerd. Hier laten we zien hoe deze aanpak wordt gebruikt om het begin van fluorescerende transgenexpressie vergelijken als proxy voor de timing die het lot determinatie in verschillende genetische host-omgevingen.

In dit artikel geven we het protocol voor microinjecting zebravis embryo's donorcellen te markeren en te-gen knock-down in gastheer embryo's, een beschrijving van de transplantatie techniek die wordt gebruikt om chimere embryo's te genereren, en het protocol voor de voorbereiding en uitvoering in vivo time-lapse confocale veroorzaken beeldvorming van meerdere embryo. Vooral uitvoeren op meerdere beeldvorming is cruciaal bij het vergelijken van de timing van gebeurtenissen zoals het ontstaan ​​van genexpressie. Dit vereist het verzamelen van gegevens uit meerdere controle en experimentele embryo's tegelijk verwerkt. Een dergelijke benadering kan eenvoudig worden uitgebreid voor onderzoek extrinsieke invloeden in een orgaan of weefsel van keuze toegankelijke imaging leven, mits transplantaties gemakkelijk kunnen worden gericht volgens de gevestigde embryonale lot kaarten.

Introduction

De mogelijkheid om belangrijke ontwikkelingsprocessen in een in vivo vertebrate visualiseren heeft bijgedragen dat de zebravis een belangrijk model voor de studie van normale en zieke omstandigheden (besproken in ^{1, 2).} Vooral de neurale retina is een toegankelijk deel van het centrale zenuwstelsel. Het netvlies leent zich gemakkelijk studies van neurogenese voeren vanwege de goed georganiseerde, maar relatief eenvoudige structuur en zijn sterk geconserveerd neuron types in gewervelde species ^3. Dynamiek van cellulaire gedrag zoals proliferatie, celcyclus exit asymmetrische celdeling, het lot specificatie, differentiatie en neurale vorming circuits kan het gehele proces van retinogenesis, die de centrale retina van de zebravis wordt aangevuld met 3 d postfertilization volgen ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Bovendien kan de functionele eisen van verschillende genen in elk van de bovengenoemde stappen gelijktijdig worden beoordeeld in de zebravis netvlies, waardoor een voordeel boven andere vertebraat modellen waarin fenotypen uit de toepassing van gen knockout technieken kunnen alleen worden beoordeeld na autopsie van gefixeerde weefsels. Met name het gebruik van transgene lijnen waarin we visualiseren en controleren de expressie van fluorescerende eiwitten reporter transgenen in de retina, kunnen we tijdresolutie van genexpressie die het ontstaan ​​van een bepaald celtype neuronale grondslag verkrijgen. Door de snelle ontwikkeling van de zebravis, kunnen deze gebeurtenissen worden gevisualiseerd gedurende de gehele ontwikkelingsperiode, waardoor diepere inzichten in de temporele belang van genexpressie ten opzichte van neuronale cellen identiteitsverwerving en celgedrag.

Tenslotte kunnen deze benaderingen efficiënt gecombineerd in de zebravis met de productie van chimeer via transplantaties, waardoor inzicht in twee belangrijke aspecten van genfunctie. Ten eerste behandeling getransplanteerd van een donor embryo, waarin een bepaald gen werd neergeslagen terwijl zij ontwikkelen een ongelabeld wildtype milieu, kunnen we relevante informaties genfunctie in een cel-autonome wijze te verkrijgen. Dit leidt tot belangrijke inzichten over de functie van retinale lot bepalende factoren binnen de progenitorcellen zij worden doorgaans uitgedrukt in. Een voorbeeld hiervan is het onderzoek van de ontwikkeling lot resultaat van voorlopers die niet meer functioneel eiwit te genereren van deze genen ^{4, 6, 8, 9.} Met behulp van deze aanpak, hebben we laten zien dat veel lot bepalende factoren (bijvoorbeeld Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handelen cel-autonomously specifieke retinale neuronale lot te rijden; het ontbreken van genexpressie voornamelijk leidt tot een lot schakelaar, zodat de cellen met gen knockdown levensvatbare door eerst een alternatieve lot van de cel ^{4, 6, 7, 10} blijven. In de tweede plaats kan een dergelijke chimerische experimenten worden gebruikt om te beoordelen hoe wild type voorouders gedragen wanneer ze binnen de verschillende genetische omgevingen te ontwikkelen. Bijvoorbeeld door vergelijking van de ontwikkeling van WT cellen die gewoonlijk een gen van belang (en reporter transgen) in WT versus gemanipuleerde nieuwe omgeving (bijvoorbeeld gen knockout / knockdown) tot expressie, de daaruit voortvloeiende effecten op genexpressie en lot van de cel kan worden beoordeeld . Het ontbreken van bepaalde neuronen in de nieuwe omgeving, bijvoorbeeld, is aangetoond dat wild type voorlopercellen te beïnvloeden in een cel non-autonome wijze, om vertekening hen naar differentiatie in de ondervertegenwoordigd or ontbrekende neuron typen ^{4, 7, 11, 12.} Gezien het feit dat het netvlies neuronen worden geboren in een geconserveerd histogenic bestelling door de opeenvolgend getimede expressie van specifieke neuronale lot determinant genen (lot genexpressie) (beoordeeld in ^13), gebruikten we deze methoden om aan te tonen hoe de timing van het lot genexpressie in wild type voorlopers wordt beïnvloed wanneer dergelijke voorlopers ontwikkelen retinale hostomgevingen met geïnduceerde afwijkende cellulaire composities. Hier schetsen we deze benaderingen als bewijs voor hoe de combinatie van relatief standaard en meest gebruikte technieken maakt het onderzoek naar de timing van het lot genexpressie in de ontwikkeling van het netvlies voorouders ^{8, 9.}

Dit protocol beschrijft een experimentele benadering combineren time-lapse imaging met het gemak van perhet vormen van transplantatie in de ex vivo ontwikkeling van de zebravis embryo individuele mosaically volgen gelabelde cellen gedurende de gehele periode van ontwikkelings retinogenesis. Door het uitvoeren van functionele gen manipulaties, hetzij in de gastheer embryo, donor embryo, beide of geen van beide, kan men de cel autonomie van gen-functie te beoordelen. Deze benadering kan wijd aangepast soortgelijke vraagstellingen in andere systemen waarvoor de afzonderlijke componenten hier beschreven geschikt.

Protocol

Alle procedures werden overeenkomstig de bepalingen van de Australische National Health en Medical Research Council gedragscode voor de verzorging en het gebruik van dieren uitgevoerd en werden goedgekeurd door de institutionele ethische comités.

1. Voorbereiding van de zebravis

1. Volwassen vissen pairing
   1. Opgezet volwassen vissen als paren (of twee paren) in de juiste maat kweekbakken de avond vóór gebruik.
   2. Het vrouwelijke gescheiden van de mannelijke houden gebruiken een verdeler om de vissen in staat om te zien, maar elkaar niet raken.
   3. In de ochtend, na het inschakelen van het licht, verwijder de verdelers en laat de vis om te paren ongestoord.
   4. Na een geslaagde paring zetten volwassen vissen terug in hun oorspronkelijke tanks.
      OPMERKING: Gastheer en donorstammen kunnen hetzelfde, bijvoorbeeld elk wild type (WT) stammen zijn. Voor deze studie de donor embryo's afkomstig van de transgene lijnen Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) ofTg (vsx1: GFP) waarin de expressie van het lot bepalende factoren vroege of late neurale lot kan worden gevisualiseerd, respectievelijk ^{14, 15, 16.} Om de effecten van verschillende genetische omgevingen te vergelijken, kan ontvangende embryo's specifieke mutanten of morphants zoals hieronder beschreven.
2. embryo collectie
   1. Gebruik een theezeefje om de eieren te verzamelen van de fokkerij in. Controleren eieren elke 15 minuten naar de geboorte bepalen en een eencellige embryo's worden verzameld voor daaropvolgende stappen.
   2. Spoel embryo's met E3 medium (5 mM NaCl, 0,2 mM KCI, 0,4 mM _CaCl2, 0,9 mM _MgCl2 en 2% methyleenblauw in gedestilleerd water) en ze in platen met ~ 40 ml E3 ¹⁷ bij een maximale dichtheid van 50 eieren per 90 mm petrischaal.
   3. Label de Petri gerechten met de stam naam, datum en tijd vangeboorte. Gebruik een Pasteur overdracht pipet om eventueel vuil te verwijderen, terwijl het bekijken van de embryo's onder de microscoop ontleden.
   4. Houd de embryo's bij 28,5 ° C tot ~ 3 uur postfertilization (HPF) voor transplantatie, of doorgaan met micro-injecties.
      NB: Voor transplantaties, streven naar een donor en gastheer embryo's in dezelfde leeftijd. Daarom gebruik maken van verschillende houderijsystemen temperaturen tussen 25 - 32 ° C volgens Kimmel et al. ¹⁸ te vertragen of versnellen van een koppeling van embryo's naar de andere aan te passen.
   5. Houd ~ 20 van de transgene donor embryo uninjected bij 32 ° C vanaf het moment van de collectie tot time-lapse imaging (24-28 uur later).
      LET OP: Deze zullen sneller dan de experimentele cohort ontwikkelen en fluorescerende markers eerder uit te drukken. Ze kunnen dus worden gebruikt om de parameters (laservermogen, winst) voor de beeldvorming. In dit specifieke voorbeeld, weergave van de experimentele cohort begint vóór transgenexpressie (beoordelende exacte timing van dit evenement).

2. Voorbereiding voor Micro-injectie

1. Micro-injectie naald voorbereiding
   1. Gebruik een naald trekker om naalden van elkaar borosilicaatglas capillair (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm lange glazen capillaire) trekken in het centrum om twee naalden van gelijke lengte te verkrijgen. Doel voor naalden die taps toelopen met een lange assen.
      LET OP: Voorbeeld instellingen voor de naald trekker die hier gebruikt worden geleverd in de Materialen List.
   2. Bewaar de trok naalden in een petrischaal en beveiligen door ze te drukken in een strook van vormbaar stopverf of plakband.
   3. Voorafgaand aan de injectie brengen de punt van de naald in focus onder een dissectie microscoop en een tang open de naald breken aan het uiteinde. Streef naar een scherpe conische tip met een kleine opening (figuur 1C).
<li> Morfolino voorbereiding voor host embryo's
1. Bestel morfolino oligonucleotiden specifiek ontworpen voor het gen van belang, evenals een standaard controle morfolino of een geschikte 5 base-pair mismatch te controleren voor procedurele en behandeling effecten.
   OPMERKING: Hier, een vertaling blokkerende Ptf1a morfolino met de sequentie 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'die de ontwikkeling van de tussenliggende geboren horizontale en amacrine remt, en een standaard controle zebravis morfolino gericht op humane beta-globine intron mutatie (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') ^{7, 19} gebruikt.
2. Bereid een 1 mM morfolino voorraad-oplossing (~ 8-8,5 ng / NL) en bewaar bij kamertemperatuur.
3. Op de dag van de injectie Verhit een aliquot (10 pl) van morfolino bij 65 ° C gedurende 10 min, draaien kort en plaats op ijs af te koelen van 65 ° C (waarna bij kamertemperatuur gedurende gebruik kan worden bewaard). this zal worden afgewikkeld alle potentieel aggregatie binnen de morfolino oplossing, die de effectiviteit van de knock-down kan verminderen.
   1. Voor Ptf1a morfolino en gelijkwaardige norm controle morfolino, bereiden een werkende oplossing van 6 ng / nL door verdunning van de morfolino voorraad oplossing met gedestilleerd water. Houd bij RT.
      LET OP: Gebruik 2 nL van de morfolino per embryo als de Ptf1a morfolino vergt een relatief hoge het werk concentratie van 12 ng per embryo zoals eerder ⁷ bepaald. Voor de meeste morpholinos, 2-5 ng per embryo effectief is, dus verdunnen de voorraad 2 - 5 ng / NL en injecteer 1 nL in elk embryo.
2. De voorbereiding van fluorescerend histon fusion reporter constructen voor etikettering donor embryo
   Opmerking: Voor het onderscheid / visualiseren donorcellen in de gastheer embryo, zijn er verschillende benaderingen van de donor embryo label, waaronder micro-injectie van H2A-GFP (als in transgene donorenrood fluorescerende reporters) of H2B-RFP (bij gebruik van transgene donoren met groene fluorescente reporters) mRNA in de dooier van de single-cell fase donor embryo.
   1. Lineariseren tenminste 1 ug plasmide dat het reporter DNA.
      LET OP: Hier pCS2 + plasmide (gegenereerd en ter beschikking gesteld door Prof. David Turner van de Universiteit van Michigan en Prof. Ralph Rupp van het Biomedical Center München) met H2A-GFP of H2B-RFP (gegenereerd door Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, University of London) werd gelineariseerd met Notl restrictie-enzymdigestie.
   2. Zuiver DNA met behulp van commercieel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.
   3. MRNA transcriberen met behulp van commercieel verkrijgbare kits passende polymerase volgens de instructies van de fabrikant. Voor de pCS2 + plasmide, gebruik dan een SP6 polymerase kit.
   4. Zuiver mRNA behulp van commerciële kits en fenol-chloroform extractie gevolgd door isopropanol precipitatie volgens instructies fabrikants. Verdun het mRNA in ultrazuiver water (20-30 ui), meet de concentratie met een spectrofotometer en bewaar bij -80 ° C.
   5. Op de dag van de injectie, bereid een werkoplossing van mRNA in steriel water met een eindconcentratie van 100 ng / ul en op ijs bewaren. Ongebruikte mRNA voorraad terug tot -80 ° C.

3. Micro-injectie van Morpholinos en / of mRNA in enkele-cel embryo's

OPMERKING: Micro-injecties worden gebruikt om alle donorcellen markeren en de verschillende hostomgevingen (controle en gen knock-down) te bereiden en omvatten injecties van mRNA of morfolino antisense oligonucleotiden ^{20, 21.}

1. Laden en het kalibreren van de injectienaald
   1. Backload de injectienaald met 3 pi van de morfolino en / of histon-fluorescerende fusie-mRNA oplossing met behulp van microloader pipetpunten.
   2. Schud de solution in de richting van de injectienaald tip totdat er geen luchtbellen overgebleven. Gebruik injectienaalden met een interne glas plaatst zodanig dat de oplossing in de eerste plaats zal worden gevestigd op de tip door capillaire werking.
   3. Bevestig de injectienaald aan een houder gemonteerd in een micromanipulator (3D handleiding micromanipulator) en zorgen voor een goede afdichting in de buis behuizing.
   4. Schakel de stroom en de gastoevoer naar de druk geregeld microinjector.
   5. Dompel de naald in een druppel minerale olie in een schotel (bij gebruik van een raster oculair) of direct zweven de naald over een micrometer aan de daling volume te kalibreren. Meet het injectievolume door op het pedaal en pas de gasdruk en / of de wachttijd tot het injectievolume is gelijk aan 1 nL (125 um diameter).
      Opmerking: Het voordeel van de micrometer is dat metingen onafhankelijk van de vergroting gebruikt microscoop, maar met de oculairgraticule instead, de injectie drop en omvang kunnen gelijktijdig worden scherpgesteld.
2. embryo micro-injectie
   1. Plaats een microscoop dia in een petrischaal en het gebruik van een transfer pipet eencellige embryo's langs de glijbaan rand deponeren. Lijn in een enkele kolom met een microloader pipet tip met de helft van de dunne tip afgesneden. Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk met een fijne overdracht pipet om bewegingen te voorkomen tijdens de injecties (figuur 1A).
   2. Laat de naald in de richting van elk embryo, en doordringen in de chorion en de dooier in een vloeiende slag (Figuur 1B).
   3. Zodra de naald in het midden van de dooier, microinject door het indrukken van het voetpedaal. Injecteer 1 nL van H2A-GFP of H2B-RFP mRNA in de dooier van een eencellige stadium donor embryo (transgene). Injecteren 2 nL standaard MO of Ptf1a MO in de dooier van een eencellige stadium wild type gastheer embryo door twee keer op het voetpedaal. Succesvolle injecties kunnen worden gevisualiseerd door het smal l ruimtelijke vervorming in de dooier.
   4. Verwijder de injectienaald, zet de schotel met de embryo's naar de volgende embryo in positie te brengen en verder te injecteren totdat de gehele kolom van embryo's worden geïnjecteerd (50-60 embryo's).
   5. Na het injecteren van alle embryo's, til de schaal omhoog bij een 30 - 45 ° hoek en gebruik een zachte stroom van E3 medium (knijpfles) om de geïnjecteerde embryo's over te dragen naar een nieuwe schone petrischaal.
   6. Plaats het embryo schaal in een incubator (hetzij bij 28,5 ° C of andere temperatuur, dan wordt de donor en gastheer embryo's onder gelijkwaardige leeftijden).
   7. Herhaal stap 3.2.1 - 3.2.6 als nodig is om het verkrijgen van ~ 100 donor embryo's of ~ 200-250 gastheer embryo's.
   8. Bij 1-2 HPF, controleer dan de embryo's onder een dissectie microscoop en verwijder alle onbevruchte eitjes die nog niet gevorderd tot de 2- of 4-cell podia met een Pasteur pipet overdracht.

4. Voorbereiding voor Transplantaties

NHOUD "> OPMERKING: Transplantaties worden gebruikt om chimere embryo waardoor de effecten van verschillende genetische hostomgevingen genereren worden beoordeeld in gelijke WT donor progenitors ^{9, 22, 23.}

1. Donor embryo selectie
   1. Op 3 HPF, controleer dan de donor embryo's in 2 - 5X vergroting voor etikettering signaal onder een fluorescentiemicroscoop. Selecteer goed ontwikkelde (symmetrische celmassa met evenredig verdeelde cellen) embryo's met een sterk fluorescerend signaal met behulp van de GFP plus filter (460-500 nm excitatie, 510 nm lange pass emissie) of Texas Red filter (540-580 nm excitatie, 610 nm lange pass emissie) (figuur 1D). De transgene reporters zijn nog niet uitgedrukt.
2. Agarose injectie plaat en petrischaal voorbereiding
   1. Giet gesmolten 2% agarose verdund in E3 medium tot een diameter van 90 mm petrischaal en laat het afkoelen tot het gerecht is veiligaanraken. Hete agarose anders kan vervormen de mal.
   2. Float een plastic mal met wigvormige uitsteeksels (6 x 25 / schimmel) op agarose (figuur 2D, E). Vermijd luchtbellen door het plaatsen van de ene kant van de mal op de agarose en langzaam lager op de andere kant. Controleer de matrijs wordt gecentreerd in de schotel of naar de zijkant van het diepste punt van de wigvormige uitsteeksels voldoende speelruimte voor de transplantatie naald mogelijk.
   3. Laat de agarose volledig stollen bij kamertemperatuur.
   4. Plaats de agarose schotel bij 4 ° C gedurende 30 minuten en verwijder de mallen door voorzichtig op te tillen van de ene hoek (bijvoorbeeld met een pincet). Bereid agarose injectie platen de dag voor het experiment en bewaar bij 4 ° C met een klein volume medium en E3 paraffine folielaag zodat ze niet uitdrogen.
   5. Voorafgaand aan de transplantatie, vul de agarose injectieplaat met E3 medium en plaats in een 28,5 ° C incubator gedurende ten minste 30 min.
   <li> Aangezien dechorionated embryo zich aan kunststof, hetzij gebruik glazen schalen of coaten van de binnenkant van petrischalen (90 mm diameter) met een dunne laag van 2% agarose in E3. Bereid een schotel voor dechorionated gastheer embryo's, een gerecht voor dechorionated donor embryo's en een gerecht voor elke 40 getransplanteerde embryo's. Opslaan zoals beschreven voor de injectieplaat (4.2.4).
3. Transfer pipet voorbereiding
   1. Snijd het uiteinde van een lange vorm fijn getrokken glas topen Pasteur pipet (2 ml, 230 mm lengte, 100 mm lang tip) tot een lengte die het mogelijk maakt comfortabel manoeuvreren (optioneel) door krassen met een diamanten mes terwijl men tot de punt Falls off (Figuur 1F).
   2. Zorg ervoor dat de snede recht is. Fire polish het glas overdracht pipet door het draaien van het snijvlak in een bunsenbrander om een soepele uiteinden te genereren om zo niet de dechorionated embryo's (Figuur 1F) beschadigen.
      LET OP: Houd de pipet tip in de vlam te lang wslecht resultaat in de opening wordt verzegeld of te klein voor de embryo's.
4. Dechorionating blastula stadium donor en gastheer embryo
   1. Dechorionate embryo handmatig met twee fijne tang door scheuren elke chorion geopend zonder het embryo of enzymatisch met behulp protease gelijktijdige snelle dechorionation van een groot aantal embryo ⁹ mogelijk.
      1. Bereid een 100x voorraadoplossing van 50 mg / ml protease mengsel maken 100 uL aliquots en bewaar ze bij -20 ° C.
      2. Voeg 100 pi van de stock protease 10 ml E3 medium (eindconcentratie van 0,5 mg / ml protease).
      3. Leg goed ontwikkelde gastheer en donor embryo's in twee aparte kleine Erlenmeyer glazen bekers (10 ml) en verwijder zoveel vloeistof als mogelijk te maken.
      4. Voeg 5 ml van de 0,5 mg / ml protease oplossing voor elke beker en voorzichtig wervelen de embryo's terwijl kijken naar ze onder een dissectie microscoop. Let op tekenen van vervorming van het chorion.
      5. Houd wervelende. Zodra de eerste embryo uit het chorion (figuur 1D, sterretjes), het uitvoeren van drie snelle spoelingen met E3 medium voor de protease oplossing te verwijderen door het gieten van het grootste deel van de vloeistof en het bijvullen van de kolf door voorzichtig te gieten in E3 langs de kant. Niet laten dechorionated embryo's in contact komen met de lucht in een van de volgende stappen tot eind transplantatie (punt 5) en mocht explodeert. Laat voldoende oplossing in de kolf tussen spoelingen.
      6. Met het vuur gepolijst glas overdracht pipet de embryo's uit de kolf beker in glas petrischaaltjes of agarose (2% in E3 gemiddeld) gecoate plastic schaaltjes. Voorzichtig pipet tijdens transfer naar eventuele resterende verzwakt chorion te verwijderen.
5. Transplantatie naald voorbereiding
   1. Gebruik een naald trekker twee naalden van elkaar borosilicaat dunwandige glazen buis (1,0 mm OD trekken/ 0,78 mm ID / 100 mm lengte) met dezelfde instellingen als de micro-injectie pipetten.
      LET OP: Voorbeeld instellingen voor de naald trekker die hier gebruikt worden geleverd in de Materials List. Transplantaties naalden beschikken niet over een glazen insert, omdat dit schade aan de cellen meegezogen in de naald.
   2. Trek de naalden van tevoren, op te slaan in een petrischaal en veilig door te drukken in een strook van vormbaar stopverf of plakband.
   3. Voorafgaand aan transplantatie brengen de punt van de naald in focus onder een dissectie microscoop en een tang open de naald breken aan het uiteinde. Gebruik fijne tang om de vorm van de naald te passen om te streven naar een fluit-vorm (figuur 2G) of gebruik alternatieve methoden beschreven voor de puntvorm ²³ genereren.

5. Chimera Generation via Blastula Transplantation

1. transplantatie setup
   LET OP: Hier werd een self-assembled transplantatie apparaat gebruikt (figuur 2A
2. Monteer de transplantatie naald in dezelfde naaldhouder gebruikt voor micro-injectie hierboven (gemonteerd op micromanipulator, stap 3.1.3) (Figuur 2A).
3. Koppel het injecteren slang dat het einde van de micropipet houder de drukgeregelde microinjector voor micro-injecties verbindt. Bevestig de injectie buis die is gekoppeld aan een 1 ml spuit (Figuur 2A, B), waarbij de transplantatie rig vertegenwoordigt.
   1. Zorg ervoor dat alle aansluitingen goed zijn afgedicht met paraffine film of vormbaar stopverf. Voorkom dat embryo's in contact komt met lucht door ervoor te zorgen dat er altijd een aantal E3 medium in de transplantatie naald zelf. Bedien de spuit handmatig cellen / vloeistof te zuigen in en uit de transplantatie naald.

embryo alignment

1. Breng de donor embryo met de glazen pipet in de eerste kolom van de agarose mal. Breng de gastheer embryo's in de kolommen 2tot en met 6 van de agarose mal (figuur 2F). Plaats de embryo's met de pipet, zodat de blastomere kant naar boven gericht.

Transplantatie

1. Voorzichtig rust de transplantatie naald op een blastomere cel van een donor embryo en langzaam zuigen ongeveer 20 - 50 cellen in de transplantatie naald (figuur 2H). Vermijd het opzuigen van de dooier.
2. Til de transplantatie naald van de donor embryo met behulp van de micromanipulator. Verplaats de agarose mal schotel naar links en steek de transplantatie naald door de zijkant van de celmassa in de animale pool van de eerste host embryo. Deposit 5-10 cellen bij het oppervlak volgens het lot mapping blijkt dat dit gebied leidt tot het gebied voorhersenen / oog ²⁴ (figuur 2I). Houd de naald tip ondergedompeld in de E3 medium gedurende de gehele procedure.

Verzorging van getransplanteerde embryo

1. Verwijder de donor embryo eennd laat de gastheer embryo in de agarose mal voor 1-2 uur bij 28,5 ° C. Vul glas of kunststof (bekleed met 2% agarose) Petrischalen met E3 medium dat 0,003% N-fenylthioureum (PTU) om pigmentvorming voorkomen omdat dit zal interfereren met beeldvorming. Breng de gastheer embryo's in deze gerechten met het vuur gepolijst glas pipet en incubeer bij 28,5 ° CO / N.
   LET OP: Draag handschoenen bij het hanteren van PTU.

6. Live-Imaging Setup

LET OP: Het kleine formaat en optische transparantie van de zebravis in combinatie met een snelle ontwikkeling hebben toegestaan dat het een belangrijke gewervelde model voor in vivo beeldvorming van verschillende cellen en organen worden. Beeldvorming kan worden uitgevoerd op een verscheidenheid van microscopen, die verschillen setup en parameters. Het volgende beschrijft een geschikte confocale beeldvorming setup voor beeldvorming van het netvlies ontwikkeling ^{5, 8.}

1. chimeer embryoselectie
   1. Bij 24-26 HPF, het scherm van de getransplanteerde embryo's onder een tl-dissectie ruimte om gezonde goed ontwikkelde embryo's die de getransplanteerde donorcellen (H2A-GFP of H2B-RFP gelabelde) in de ontwikkelingslanden oog primordium tonen selecteren.
   2. Zet opzij tot 40 embryo's voor montage door pipetteren in een nieuw gerecht en voeg 0,4 mg / ml tricaïne methanesulfate (MS222) om de embryo's verdoven.
      LET OP: Draag handschoenen bij het hanteren van MS222.
2. montage van embryo's
   OPMERKING: gebruik de juiste montage schotel, naargelang beeldvorming wordt uitgevoerd op een omgekeerde ⁸ of rechtop microscoop (hier beschreven).
   1. Bereid een enkele 1,5 ml plastic buisjes die 1 ml van 1% laag smeltende agarose in 0,4 mg / ml in MS222 E3 middellange- en gesmolten in een 40 ° C waterbad.
   2. Zuigen 5 embryo's in een plastic overdracht pipet en laat de embryo's zich ophopen in de tip door de zwaartekracht. Raak de overdracht pipetop het oppervlak van een van de bereide kunststof buizen die 1% laag smeltpunt agarose en 0,4 mg / ml MS222 waardoor het embryo te zinken in de buis en beperkt de hoeveelheid E3 overdracht.
   3. Mount embryo's in een diameter van 90 mm petrischaal voor de beeldvorming in rechtopstaande microscoop en glazen bodem petrischaal (elk formaat) voor de beeldvorming in omgekeerde microscoop. Gebruik een permanent marker visueel verdelen hetzij schaal in twee helften beeld donoren in de WT systemen (aan één kant) of morphant systemen (andere kant) in hetzelfde experiment.
   4. Breng de vijf embryo's uit de agarose plastic buis om ofwel petrischaal met 0,5-1 ml agarose. Overtollig agarose met een transferpipet zodat slechts een kleine druppel (~ 200-300 ui) blijft. Als beeldvorming met rechtopstaande microscopie, vermijden dat embryo's binnen 1 cm van de petrischaal omtrek. De onderdompeling in water dompelen lens voor beeldvorming mogelijk niet gecentreerd kunnen worden in dat gebied door de petrischaal wand (Figuur 3A </ Strong>).
   5. Gebruik een microloading pipet (met de punt afgebroken) om de embryo's zijdelings uitlijnen totdat de agarose stolt. Voor beide soorten gerechten, worden de embryo juist lateraal gekanteld indien beide ogen aan weerszijden van de kop volledig overlappen (lijn XY-afmeting) (Figuur 3B). Voor omgekeerde microscopie gebruik moet het oog nabij het dekglaasje zo dicht mogelijk bij het dekglaasje mogelijk worden geduwd, om beeldvorming door de z-dimensie binnen de beperkingen van de mogelijke nadruk niveaus te creëren.
   6. Doorgaan montage vijf embryo's tegelijk in individuele agarose druppels. Met meer 1% laag smeltpunt agarose toetreden tot de agarose daalt tot elkaar en de kant van de schaal aan een loskomen en laterale beweging tijdens beeldvorming (figuur 3A) te voorkomen.
   7. Eenmaal volledig gestolde, dek de schaal met E3 medium (met 0,003% PTU, 0,4 mg / ml MS222) voorverwarmd tot 28,5 ° C.
   8. Met behulp van dezelfde aanpak in stappen 6.2.2 beschreven- 6.2.8, zet ~ 20 transgene embryo verhoogd bij 32 ° C (stap 1.2.5) in een apart schaaltje.
3. Imaging parameters
   LET OP: Imaging te analyseren het begin van de fluorescerende transgenen vereist geen hoge ruimtelijke resolutie intracellulaire. Het kan worden uitgevoerd met een doel W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 70-mm 1,5 zoom.
   1. Het opzetten van het laservermogen en de blootstelling tijd op basis van de transgene intensiteit van de ~ 20 transgene embryo's met versnelde ontwikkeling (dat wil zeggen verhoogd bij 32 ° C; stap 6.2.8).
      Opmerking: Voor studies na aanvang van transgenexpressie, de experimentele embryo's vertonen geen fluorescentie op het moment dat de time-lapse is opgezet en dus deze versnelde embryo cruciaal zijn voor het bepalen van de parameters van de beeldvorming.
   2. Voor de experimentele schaal, visualiseren elk embryo en opslaan van de positie en de focus niveau van de embryo's.
      1. Kies embryo's die de correcte montage hoek (dat wil zeggen met de laterale side van het oog zo horizontaal mogelijk) en een sterke hartslag (een indicator van de gezondheid). Kies embryo's met een paar getransplanteerde donorcellen (geïdentificeerd door H2A-GFP of H2B-RFP etikettering) in de eerste plaats in de voorste ventrale kwadrant van de zich ontwikkelende retina (waar de golf van genexpressie begint) (Figuur 3C).
         LET OP: In de zebravis embryo's, de gemiddelde hartslag is 120-180 slagen / minuut ^25. In de narcose embryo kan een gezonde hartslag in het traject van 60-120 slagen / minuut. Tragere hartslag kan een aanwijzing zijn van een verminderde levensvatbaarheid en die embryo's moeten uit de studie worden uitgesloten.
   3. Set z-stapels optische secties 2 urn intervallen door het netvlies tot 15 embryo's.
      Opmerking: Het totale aantal embryo's dat in elk experiment kan worden afgebeeld zal afhangen van individuele parameters (belichtingstijd en z-stack). De tijd die nodig is om de afbeelding 1 time-point voor alle gekozen embryo's moeten zijn shorter dan het interval tussen tijdstippen. Door te offeren wat diepte resolutie, kan meer embryo's worden afgebeeld binnen de tijdsintervallen. De grenzen van de z-stack worden gekozen als laterale en mediale uitersten van de gemonteerde embryo oog en 30 urn wordt toegevoegd aan de laterale zijde in verticale microscopie setup, als de ogen van de zich ontwikkelende embryo's in deze opstelling verschuiving in de z-richting de embryo's te laten groeien 's nachts. Dit resulteert in stapels 100-170 urn dikte (50-85 images / oog).
   4. Neem beelden elke 24 min bij 32 ° C (overeenkomend met 0,5 hpf intervallen) met de laser / kanaal passend het transgen.
      NB: De embryo's blijven op het podium in het hele time-lapse binnen een verwarmde kamer omvat het gehele microscoop. Terwijl het experiment bij 28 ° C kan worden uitgevoerd, zijn warmere temperaturen gebruikt om vaart te zetten achter de ontwikkeling en ervoor te zorgen dat de relevante tijdstippen in het experiment worden afgebeeld binnen de 16-24 uur time-lapse periode.
   5. Beeldkanalen die de donor label (H2A-GFP of H2B-RFP - optioneel) en transgene (Atoh7: RFP of Vsx1: GFP) met behulp van sequentiële scanning. Voor analyse, gebruik de donormerker enige passende embryo kiezen als beschreven (neem een ​​z-stack aan het begin van de beeldvorming) en voer time-lapse alleen het kanaal naar de transgenexpressie vangen.
      LET OP: U kunt ook gebruik maken van de donor label enige passende embryo's te selecteren (dwz die met bevestigde getransplanteerde cellen in anterior ventrale kwadrant) en het beeld alleen de transgene kanaal, ruwweg een halvering van imaging tijd en bijna een verdubbeling van het aantal embryo's die kunnen worden afgebeeld en per geanalyseerd experiment (Figuur 4).

Representative Results

Dit werk geeft een experimentele protocol om veranderingen in genexpressie timing beoordelen wanneer wild type netvlies voorouders ontwikkelen binnen een morphant gastheer embryo. De experimentele gastheer embryo's Ptf1a morphants, die de tussenliggende geboren horizontale en amacrine interneuronen van het netvlies ^{7, 26} missen. Deze werden vergeleken gastheer embryo's die waren geïnjecteerd met een standaard controle morfolino regelen.

Aangezien neurogenese verschillende soorten neuronen in het centrale zenuwstelsel (inclusief retina) optreedt in een sterk geconserveerd histogenic volgorde ^{27, 28, 29, 30, 31} de progressie van de latere lot afhangen cel non-autonome feedbackzich ophoopt eerder geboren types neuron. Deze hypothese werd getest door het bepalen van de timing van de generatie later geboren neurale soorten van getransplanteerde stamcellen ontwikkelen in afwezigheid van tussenliggende geboren neuron types. Als controle werd de timing van vroegtijdige geboorte cellen ook gekwantificeerd, onafhankelijk van of de tussenliggende cellen worden gegenereerd of niet beïnvloed moeten worden. Daartoe de Tg (atoh7: RFP) of Tg (atoh7: gapGFP) lijnen werden gebruikt om het begin van de eerste geboren ganglioncellen neurogenese visualiseren terwijl de Tg (vsx1: GFP) lijn werd gebruikt om het begin van de late analyseren geboren bipolaire bevolking. Anders dan bovendien de expressie reporter transgenen, de donorcellen uit deze embryo's genetisch WT.

Micro-injectie van 1 nL mRNA (tot label donorcellen) in de dooier van eencellige embryo's resultaten in fluorescerend reporter eiwit expressie door 3 HPF, waarbijstadium de helderste donoren worden geselecteerd (figuur 1). Bereid transplantatie opstart wanneer embryo's ongeveer 2 HPF (figuur 2). Bij 24 HPF, worden embryo's met getransplanteerde donorcellen in de desbetreffende retinale locaties gekozen en geplaatst in 1% laag smeltpunt agarose in groepen van vijf (figuur 3). Na het opslaan van de embryo positie, het instellen van de z-stack en de tijd parameters, is time-lapse imaging uitgevoerd gedurende 16-24 uur. Tijdstip van eerste geboren ganglioncellen wordt aangegeven door het begin van de Atoh7: RFP of Atoh7: gapGFP transgen en timing van de laatste geboren bipolaire generatie wordt aangeduid met de sterke opwaartse regulatie van de Vsx1: GFP transgen, die ook duidelijk lagere helderheid wordt uitgedrukt niveaus in de ontwikkeling van voorlopers. Het tijdstip van eerste transgenexpressie, zoals Atoh7: gapGFP is geïdentificeerd in individuele cellen op elk tijdstip van de imaging (witte pijlen, Figuur 4). Atoh7: gapGFP en ganglion celdifferentiatie inzitrs bij equivalente tijden, ongeacht of de host embryo is WT of een Ptf1a morphant ontbreekt tussenproduct (dwz na ganglion cel geboorte) horizontale en amacrine cellen.

De gepresenteerde gegevens tonen aan dat deze experimentele benadering levert een krachtig hulpmiddel om de rol van specifieke retinale omgevingen op genexpressie timing beoordelen relevante implicaties, niet alleen voor het begrijpen van normale ontwikkelingsprocessen maar ook voor toekomstige toepassingen cel herprogrammering strategieën in normale en zieke omstandigheden .

Figuur 1: Micro-injectie in de dooier van Single-cell embryo's gebruikt om donorcellen Label en andere host-omgevingen genereren. A) Embryo's moeten tegen de rand van het glasplaatje met de meeste van de omringende vloeistof reverhuisd. B) De naald wordt in het midden van de dooier en ofwel H2A-H2B-GFP of RFP mRNA (voor donor) of morfolino (standaard MO of Ptf1a MO van host) ingebracht worden geïnjecteerd. C) De injectienaald wordt gegenereerd met een naald trekker die twee symmetrische naalden van elk capillair genereert. Elke getrokken naald vervolgens moet het topje gebroken met een tang om de naald te openen terwijl een scherpe schuine punt hebben (niet bot) die kan gemakkelijk in embryo's worden geplaatst. D) Donor embryo geïnjecteerd met H2B-RFP mRNA bij de enkele-cellig stadium begint de expressie fluorescerende reporter eiwitten door 2,5 HPF, in welk stadium de helderste en gelijkmatig gelabelde embryo kan worden geselecteerd. E) Ongeveer 2,5-3 HPF, donor en gastheer embryo's worden enzymatisch dechorionated gebruiken proteasen. Wervelende van de erlenmeyer zorgt voor de mechanische kracht die nodig is om een ​​open verzwakte chorions te breken en brengt dechorionated embryos naar het centrum. Zodra de eerste (asterisk) of enkele dechorionated embryo's waargenomen, snelle maar zachte spoeling zorgt dat de protease-oplossing verwijderd. F) voor de overdracht van dechorionated embryo's, zijn glas overdracht pipetten benut. Deze kunnen in eerste instantie worden ingekort (optioneel) om het even welke lengte die comfortabel is gemanoeuvreerd door de gebruiker, door krassen op het glas op de juiste positie met een diamanten mes totdat deze uit. Dit resulteert in een scherpe cut tip, die moet worden-het-vuren gepolijst om eventuele ruwe randen die cellen kunnen beschadigen glad wordt meegezogen in de pipet tijdens de overdracht. Schaalbalken A, B, D, E = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Transplantatie Setup. B) De transplantatie buis getoond geeft aan hoe potentiële lekken in gewrichten eenvoudig worden voorkomen met behulp van vormbaar stopverf en paraffine film. C) Een grotere vergroting weergave van het verband tussen de injectie buis en elke geschikte slang aan te sluiten op de spuit. Terwijl de slang kan worden gebruikt, de buis hier gebruikt heeft een diameter die nauw past een 10 pi pipetpunt. Gebruik paraffine film om een ​​goede afdichting te garanderen. D) De mal heeft 150 (6 x 25) wiggen aan de driehoekige divots in de agarose injecteren plaat te genereren. E) Geschatte afmetingen van elk wigvorm worden weergegeven. Het bedrijf metingen zijn eigendom. F)Bereid agarose injectie platen met wigvormige inkepingen worden gebruikt met donor embryo toegevoegd aan de eerste kolom en kolommen 2-6 vol gastheer embryo. Transplantaties worden uitgevoerd over de toer, waarbij cellen verzameld van één donor in elke rij kan worden getransplanteerd in 5 gastheer embryo's. Binnen elke vorm, kunnen cellen van maximaal 25 donoren getransplanteerd in maximaal 125 ontvangende embryo's. Let op de matrijs asymmetrisch geplaatst met het diepere gedeelte van de wig dichter bij de petrischaal rand. Hierdoor kan de transplantatie naald uit de rechterkant zonder het raken van de petrischaal rand. G) Transplantatie naald wordt getrokken met dezelfde parameters als de injectienaald tot langdurig tapse tip zijn. De naald moet worden doorbroken om een ​​grotere inwendige diameter die kan oplopen cellen zonder te vervormen te genereren. De hogere macht inzet toont dat de punt van de naald transplantatie schuine moeten zijn en idealiter een "fluit" -vorm zoalsin dit voorbeeld. H) Hogere macht weergave toont oriëntatie van gastheer embryo's met cellen aan de top. De transplantatie naald wordt in de cel massa van de blastula stadium gastheer embryo lateraal (witte sterretjes) ingebracht en geduwd in de toekomst oog zoals hier getoond. Donor cellen kunnen worden gezien in de transplantatie naald (pijl) en daarmee het ruwe aantal getransplanteerde cellen kan worden gecontroleerd. I) Twee voorbeelden (links en rechts) aantoont dat direct na transplantatie, embryo's met succes getransplanteerde cellen op de juiste plaats kan onmiddellijk worden opgelost met de donor label (bijvoorbeeld, H2B-RFP). Een TL-kanaal werd aan de helderveld toegevoegd met "linear dodge (toe te voegen)" optie onder het menu laag in het raster graphics editor. Schaal bar (voor H, I) = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Embryo Montage voor Time-lapse Imaging. A) petrischaal (90 mm) waarop meerdere low melt agarose druppels met vijf embryo's elk verbonden door agarose met een stevig netwerk om te voorkomen dat individuele druppels uit los te vormen. B) Hogere macht weergave van 24 HPF embryo zijdelings uitgelijnd en ingebed in gestolde agarose. Voor het ideale hoek dienen beide ogen worden boven op elkaar (in de z-dimensie). Afhankelijk van het gen van belang, montage moet worden uitgesteld tot direct voor de desbetreffende timing (bijvoorbeeld 26 HPF voor ganglion celdifferentiatie of HPF 35 voor het begin van de bipolaire celdifferentiatie). C) confocale beeld van een enkele optische z-doorsnede van overlay van helderveld en rode kanalen (met behulp van "linear dodge (toe te voegen)" optie onder het menu laag in deraster graphics editor) van de zich ontwikkelende oog met een paar gelabelde donorcellen (rood) binnen een anders ongelabelde hostomgeving. Schaal bar B = 1 mm, schaal bar C = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Timing van Neurogenese kunnen worden gevisualiseerd in Transgene donorcellen getransplanteerd in andere host-omgevingen. Microfoto time-lapse beeld van de ontwikkeling van WT donorcellen van Tg (atoh7: gapGFP) uit transgene embryo getransplanteerd in ongelabelde WT gastheer. Transgenexpressie onset is geïndiceerd voor een paar cellen door witte pijlpunten. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie te bekijken of dit cijfer.

Discussion

Inzicht in de mate waarin naburige cellen beïnvloeden timing van de expressie van cruciaal lot van de cel bepalend is essentieel als doel efficiënt instrueren embryonale of geïnduceerde multipotente stamcellen te differentiëren in een bepaalde post-mitotische celtype of weefsel patroon. Het bestuderen deze moleculaire gebeurtenissen in de ontwikkeling van cellen van de levende dieren verschaft bovendien relevante dynamische (temporele en ruimtelijke) gegevens over de specifieke cellulaire contexten gerelateerd aan deze bijwerkingen in vivo. Dergelijke studies kunnen niet gemakkelijk worden bereikt in alle gewervelde modellen.

In de gepresenteerde protocol, is het vatbaar zebravis embryo benut als een gewervelde model op deze vragen in vivo aan te pakken, in de relatief eenvoudige, maar zeer georganiseerde driedimensionale patroon weefsel van de gewervelde netvlies. Een voorbeeld hiervan is het testen van de hypothese dat een bepaalde retinale cellen aantastenType beïnvloedt genexpressie timing en ontwikkelingsstoornissen lot van het netvlies stamcellen. We kunnen bovendien gebruik maken van de donor cel merker specifieke cellen te traceren in de tijd te schatten, bijvoorbeeld hoe lang voor de expressie van een transgen een post-mitotische cellen onderging de laatste afdeling of het algemene gedrag van deze cellen te beoordelen (bijvoorbeeld migratie) in verschillende stadia voorafgaand aan de transgenexpressie in verschillende omgevingen. Voor deze studies werd een combinatie van relatief eenvoudig uit te voeren technieken voorgesteld, die morfolino-gemedieerde gen omvatten knock down, transplantatie en live imaging. Voor de transplantatie methode, het protocol introduceert een nieuwe, relatief eenvoudig en goedkoop transplantatie rig en toont het gemak van deze operationele setup.

Dit protocol is niet beperkt tot het netvlies. Het kan ook worden toegepast op een aantal verschillende dynamische cellulaire processen, dat ontwarren van cel-autonome ont vereisen bestuderenental programma's cel non-autonome omgevingsinvloeden. Hoewel weinig oplossingen vereist zijn, een aantal kritische stappen moeten worden gehouden voor het starten van een experiment worden genomen. Een belangrijke voorwaarde voor de succesvolle toepassing van de techniek is dat het orgaan of weefsel daarmee eenvoudig moeten worden gericht in het vroege embryo met het lot kaart. Indien de efficiëntie van weefsel targeting niet eerder getest moet dit eerst worden geoptimaliseerd en gestandaardiseerd. Het aantal micro-injectie en de getransplanteerde embryo's kunnen worden verhoogd en gescreend voorafgaand aan de beeldvorming te leven om voldoende embryo's met donorcellen correct geïntegreerd en gepositioneerd binnen de relevante weefsel te verkrijgen. Bovendien, terwijl dit protocol kan gemakkelijk worden toegepast op vroege embryonale stadia zebravis, app latere stadia zoals de groeiende larven moeilijker worden om twee redenen. Enerzijds de efficiëntie van gen knockdown verkregen met morpholinos tijd afneemt (dehankelijk van elke morfolino, is het algemeen het meest efficiënt voor 3 dpf). Om dit probleem opheffen, het gebruik van genetische mutanten als donor embryo voor transplantatie voorkeur. Ten tweede, zoals de zebravis groeit, diepere delen van de larven minder toegankelijk voor beeldvorming met een confocale microscoop, vooral bij hogere vergrotingen (high power doelen) wanneer de werkafstand van het microscoopobjectief beperkter. Dus, elk weefsel van belang op relevante leeftijd moet eerst worden beoordeeld op haar ontvankelijkheid voor beeldvorming.

De time-lapse imaging kan ofwel worden uitgevoerd op een omgekeerde of rechtop confocale microscoop.

Er zijn een aantal voordelen van de opstaande microscoop, indien beschikbaar. Op de vereiste temperatuur, verdamping van de onderdompeling gebruikte stof (bijvoorbeeld water of olie met water immersie brekingsindex) op een omgekeerde microscoop kan leiden tot volledige uitdroging. Dit vereist een constante monitoring enuiteindelijk navullen, met het risico van het plaatsen van het monster onscherp. Dit kan gedeeltelijk worden voorkomen door automatisering het doel een bepaalde afstand verlagen, het toevoegen van de onderdompeling stof en het verhogen van het doel weer, maar in onze ervaring wordt heroriëntatie vaak nog nodig is, die moet gebeuren vóór het begin van het volgende tijdstip van beeldvorming . Ten tweede, het grootste dekglaasje bodem gerechten we afkomstig zijn nog veel kleiner (50 mm in diameter) dan de standaard 90 mm petrischalen gebruikt voor staande microscopie. Dit betekent dat het aantal embryo's dat kan worden gemonteerd en de embryo medium volume toegevoegd beperkter bij gebruik omgekeerde microscopen. Desondanks is de time-lapse meestal parameters vormen de belangrijkste beperkende factor voor het aantal embryo's dat kan worden afgebeeld en dus de grootte van de schotel nog geschikt. Bij gebruik van zeer hoge doelstellingen vergroting, omgekeerde microscoop kan een grotere diepte in de z-dimensie als het oog toe endoelstelling zijn slechts gescheiden door een dunne dekglaasje. Bij het combineren hoge vergroting met opstaande microscopie moet de agarose druppel die het embryo zo dun mogelijk worden gehouden. Over het algemeen, de verkregen met behulp van rechtop of omgekeerd microscopie gegevens van gelijkwaardige kwaliteit.

Voor het genereren van gegevens van hoge kwaliteit, zijn er extra kritische stappen die moeten worden overwogen. Ten eerste winkelwagentje helder gelabelde donoren is cruciaal voor het verkrijgen van embryo getransplanteerd met een geschikt aantal getransplanteerde cellen in het oog aan het begin van de intervalfilms (enkele, maar niet te veel). De protease enzymatische dechorionation is een cruciale stap en incubatie in protease moeten tot een minimum, gevolgd door snel worden bewaard, maar zachte spoelt niet van invloed op de latere gezondheid van de embryo's. Leeftijd passende donor en gastheer embryo een accurate weefseltargeting volgens het lot kaart en efficiënte integratie van de cellen. Een goed gevormde transplantatie needle is belangrijk, zodat de punt klein en scherp genoeg te voegen in ontvangende embryo zonder dat er veel schade, maar groot genoeg binnendiameter mechanische schade aan de cellen getransplanteerd veroorzaken. Tijdens transplantatie, wanneer het apparaat niet volledig afgesloten (vooral bij aansluitingen), is het zeer moeilijk om de beweging van E3 medium en cellen handmatig regelen naar en uit de transplantatie naald. Dit is het meest duidelijk wanneer er vloeien ofwel in of uit de transplantatie naald zonder de injectiespuit volume handmatig veranderen. In dat geval worden alle verbindingen moeten opnieuw worden gecontroleerd en opnieuw gesloten. Dit moet worden getest voorafgaand aan het experiment.

Ten slotte, tijdens de verstreken tijd tussen de transplantatie en time-lapse setup, is het cruciaal dat de getransplanteerde embryo's mogen ontwikkelen op een lage dichtheid, terwijl zorgvuldig het schoonmaken van elke ongezonde embryo's. Dit is bijzonder belangrijk, wanneer de timing van de ontwikkeling of gene expressie wordt onderzocht. Bij de beoordeling van de timing van een proces (bijvoorbeeld, genexpressie), moeten de controles worden gebruikt om uit te sluiten niet-specifieke bijwerkingen van de morfolino technologie. In ons werk gebruiken we de timing van transgenexpressie in een niet verwante weefsels (bijvoorbeeld de spier) beïnvloed door de specifieke gen waarop het morfolino.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6