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कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण पर Pannexin1 संदमक में प्रभाव खूब ब्लू FCF: turbidimetry मानव पर प्लेटलेट्स धोया

Published: April 6, 2017 doi: 10.3791/55525
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva, 2Division of Angiology and Haemostasis & Geneva Platelet Group, Geneva University Hospitals

Summary

हम मानव turbidimetry द्वारा एगोनिस्ट प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण माप के बाद खून से धोया प्लेटलेट्स की अलगाव के लिए एक सरल तरीका वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में हम एकत्रीकरण Pannexin1 चैनल अवरोध करनेवाला खूब ब्लू FCF के साथ एक पूर्व ऊष्मायन के बाद कोलेजन के लिए मानव प्लेटलेट्स की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस विधि लागू होते हैं।

Abstract

Turbidimetry एक प्रयोगशाला तकनीक है कि या तो प्लाज्मा (प्लेटलेट रिच प्लाज्मा, पीआरपी) में या (धोया प्लेटलेट्स) बफर में निलंबित कर दिया प्लेटलेट्स की एकत्रीकरण को मापने के लिए लागू किया जाता है, एक के उपयोग या एगोनिस्ट का एक संयोजन कर रहा है। उनके प्लाज्मा वातावरण से और थक्का-रोधी के अभाव में अलग धोया प्लेटलेट्स के उपयोग आंतरिक प्लेटलेट गुणों का अध्ययन के लिए अनुमति देता है। एगोनिस्ट, arachidonic एसिड (एए), एडेनोसाइन di-फॉस्फेट (ADP) की बड़ी पैनल के अलावा, थ्रोम्बिन और कोलेजन सर्वाधिक उपयोग होने वाले हैं। एकत्रीकरण प्रतिक्रिया निरंतर क्रियाशीलता के तहत प्लेटलेट निलंबन के समय के साथ संबधित ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है। सजातीय निलंबन में प्लेटलेट्स एक एगोनिस्ट के अलावा के बाद प्रकाश के पारित होने की सीमा है, प्लेटलेट आकार परिवर्तन आयुध डिपो में एक छोटे से अस्थायी वृद्धि का उत्पादन होता है। इस प्रारंभिक सक्रियण कदम के बाद, प्लेटलेट थक्के धीरे-धीरे फार्म, एक रेस के रूप में निलंबन के माध्यम से प्रकाश के पारित होने के लिए अनुमति देता हैकी ULT आयुध डिपो की कमी हुई। एकत्रीकरण प्रक्रिया अंततः प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा या बफर के आयुध डिपो की तुलना में, एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है। कठोर अंशांकन इस प्रकार प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में आवश्यक है। एक सामान्य नियम के रूप में: अंशांकन के लिए 0% एक गैर प्रेरित प्लेटलेट निलंबन के आयुध डिपो को मापने जबकि निलंबन कोई प्लेटलेट्स युक्त माध्यम के आयुध डिपो को मापने के लिए 100% की एक मूल्य का प्रतिनिधित्व करता द्वारा निर्धारित है। प्लेटलेट एकत्रीकरण आम तौर पर एक वास्तविक समय एकत्रीकरण वक्र के रूप में कल्पना की है। Turbidimetry प्लेटलेट समारोह की जांच के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगशाला तकनीकों में से एक है और ऐतिहासिक सोने के मानक के रूप में माना जाता है और नई दवा प्लेटलेट एकत्रीकरण बाधा के उद्देश्य से एजेंटों के विकास के लिए प्रयोग किया जाता है। यहाँ, हम 1 के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन) मानव की तैयारी प्लेटलेट्स धोया और 2) मानव के कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण के turbidimetric विश्लेषण प्लेटलेट्स भोजन डाई खूब ब्लू FCF कि हाल ही में IDEN था के साथ pretreated धोयाPannexin1 (Panx1) चैनल के एक अवरोध करनेवाला के रूप में tified।

Introduction

प्लेटलेट्स रक्त और जमावट के साथ उनका मुख्य कार्य-साथ के महत्वपूर्ण घटक हैं रक्त वाहिका की चोट के बाद रक्तस्राव को रोकने के कारकों है। प्लेटलेट्स छोटे (2-3 सुक्ष्ममापी) anuclear अस्थि मज्जा 1 की megakaryocytes से ली गई टुकड़े कर रहे हैं। प्लेटलेट्स गैर सक्रिय राज्य में प्रसारित, जिसके दौरान वे लेंस के आकार का संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं। अन्तःचूचुक में रुकावट होने पर, प्लेटलेट्स छेद, एक प्रक्रिया प्राथमिक hemostasis बुलाया प्लग करने के लिए रक्त वाहिका चोट की साइट के लिए इकट्ठा होते हैं। प्रारंभ में, प्लेटलेट्स ऐसे कोलेजन और वॉन Willebrand कारक के रूप में उप endothelial अणु,, चोट-आसंजन चरण 2 के परिणामस्वरूप संपर्क में हैं कि करने के लिए देते हैं। फिर, वे आकार में परिवर्तन और रासायनिक संदेशवाहकों सक्रियण कदम स्राव करते हैं। अंत में, वे रिसेप्टर्स-एकत्रीकरण कदम को पूरा करने से एक दूसरे से कनेक्ट। प्राथमिक hemostasis एक माध्यमिक फाइब्रिन बयान के साथ जमावट झरना की सक्रियता से जुड़े प्रक्रिया है, जो स्थिर द्वारा पीछा किया जाताप्रारंभिक thrombus 2 है।

ऐसे रोधगलन 3 के रूप में तीव्र इस्कीमिक घटनाओं अक्सर थ्रोम्बी कि एक atherosclerotic पट्टिका की शारीरिक व्यवधान (टूटना) की वजह से फार्म से परिणाम। वर्तमान विरोधी प्लेटलेट दवाओं इस व्यापक बीमारी के इलाज की आधारशिला रहे हैं लेकिन उनके चिकित्सीय लाभ खून बह रहा है के लिए एक बढ़ा जोखिम द्वारा सीमित है। हृदय रोगियों, एस्पिरिन और विरोधी P2Y12 यौगिकों में सबसे निर्धारित दवाओं, थ्राम्बाक्सेन A2 और ADP रास्ते 4, क्रमशः, जो प्रमुख प्लेटलेट सक्रियण के लिए अग्रणी रास्ते को लक्ष्य बना। हालांकि, नए लक्ष्य है कि बेहतर antithrombotic प्रभाव और haemorragic जोखिम संतुलन होगा की दिशा में अभिनव अनुसंधान अभी भी आवश्यक है।

1960 के दशक के 5 आज तक, turbidimetric aggregometry अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, प्लेटलेट प्रतिक्रियात्मकता और मैं के हमारे ज्ञान को बढ़ानेमानव में विरोधी thrombotic अभिकर्मकों की शक्ति की निगरानी एन। Turbidimetry शुरू में रक्त के नमूनों से निकाले पीआरपी के लिए लागू किया गया था। दरअसल, रक्त संग्रह युक्त साइट्रेट प्लेटलेट अखंडता और समारोह पर कोई असर बिना पीआरपी के तेजी से और बड़े उत्पादन की अनुमति देता है ट्यूबों में प्रदर्शन किया। हालांकि, पीआरपी की अल्पकालिक स्थिरता (लगभग 3 ज) और इस तरह के रूप में थ्रोम्बिन शेष Plasmatic एंजाइमों, और संभावित artefactual एकत्रीकरण प्रोफाइल के साथ जुड़े कम कैल्शियम एकाग्रता पीआरपी के उपयोग के लिए प्रमुख असुविधा के हैं। एक महत्वपूर्ण कदम आगे अतिरिक्त centrifugation और वाशिंग 6 दोहराएं साथ प्लेटलेट अलगाव के लिए एक विधि के विकास किया गया है। संक्षेप में, पीआरपी एसिड साइट्रेट-डेक्सट्रोज (एसीडी) पर एकत्र अपरिवर्तित रक्त से अलग है और प्लेटलेट्स धारावाहिक centrifugation चरणों के बाद अलग हो जाती हैं एक आईएसओ-आसमाटिक फॉस्फेट बफर (Tyrode के बफर) युक्त ग्लूकोज, मानव सीरम albumin और द्विसंयोजक ग में resuspended किए जाने से पहलेations (सीए 2 + और मिलीग्राम 2 +)। प्लेटलेट प्रतिक्रियात्मकता में परिवर्तन से बचने के लिए Tyrode के बफर के पीएच ध्यान से 7.35-7.4 पर रखा जाता है। इसके अलावा, प्लेटलेट्स की अवांछित सक्रियण कुछ centrifugation चरणों से पहले (PGI 2) prostacyclin जोड़कर रोका जाता है। अंत में, apyrase के अलावा एटीपी / ADP की कार्रवाई के खिलाफ प्रतिरोधी बनने से धोये प्लेटलेट्स से बचाता है। जिसके परिणामस्वरूप प्लेटलेट निलंबन स्कंदक कारकों का अभाव है और पीआरपी समाधान की तुलना में प्लेटलेट्स की स्थिरता कम से कम दो गुना की वृद्धि हुई है। इसके अलावा, तथ्य यह है कि प्लेटलेट्स निष्क्रिय लेकिन बरकरार वारंट turbidimetric माप के reproducibility कर रहे हैं और सबसे अनुकूल तरीके से एगोनिस्ट या प्लेटलेट एकत्रीकरण के विरोधियों में से कार्रवाई का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करता है।

इस विधि का उपयोग करना, हम हाल के एक अध्ययन में पता चला है कि एक आनुवंशिक दृष्टिकोण से Panx1 चैनलों के गठन को रोकते (नॉक-आउट चूहों) या औषधीय द्वारा Panx1 चैनल गतिविधि कम हो रहीकम कोलेजन प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण 7 दृष्टिकोण। Panx1 एटीपी रिलीज़ चैनल है, जो सर्वत्र मानव प्लेटलेट्स 7, 8 सहित कई प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे रूपों। वास्तव में, हम turbidimetry द्वारा प्रदर्शन पर मानव धोया प्लेटलेट्स कि अधिक या कम विशिष्ट रासायनिक ब्लॉकर्स (प्रोबेनेसिड, mefloquine और 10 Panx1 पेप्टाइड्स) विभिन्न एगोनिस्ट के अलावा करने से पहले के एक पैनल के साथ एक 7 मिनट preincubation, हिचकते विशेष रूप से कोलेजन प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण, जबकि ए.ए. और ADP को प्लेटलेट प्रतिक्रियाओं प्रभावित नहीं हुए थे। हम दिखा दिया कि Panx1 चैनलों के माध्यम से एटीपी रिहाई विशेष रूप से GPVI संकेतन मार्ग कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण के लिए अग्रणी में हस्तक्षेप करता है। दिलचस्प बात यह है अन्य बीमारियों (प्रोबेनेसिड, mefloquine) में आवेदन पत्र के साथ कई FDA- स्वीकृत यौगिकों प्लेटलेट्स में Panx1 चैनलों की गतिविधि प्रभावित करते हैं। एक तरफ, यह चयन करने के लिए नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण को खोलता हैively प्लेटलेट प्रतिक्रियात्मकता संशोधित करते हैं। दूसरी ओर, एक इन यौगिकों के संभावित माध्यमिक प्रभाव पर विचार करना चाहिए। इस संदर्भ में, सुरक्षित भोजन डाई खूब ब्लू FCF कई कैंडी और ऊर्जा पेय में प्रयोग किया जाता Panx1 9 के एक चयनात्मक अवरोध करनेवाला के रूप में वर्णित किया गया है। हम यहाँ मानव धोया प्लेटलेट्स और प्लेटलेट एकत्रीकरण की turbidimetric माप के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्लेटलेट एकत्रीकरण के एक विरोधी के रूप में खूब ब्लू FCF डाई के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूलित का वर्णन।

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Protocol

पांच असंबंधित स्वस्थ स्वयंसेवकों प्लेटलेट अलगाव और एकत्रीकरण परीक्षण के लिए रक्त नमूना लेने के लिए भर्ती किया गया। लिखित सूचित सहमति प्राप्त किया गया था और प्रोटोकॉल जिनेवा विश्वविद्यालय अस्पताल के केंद्रीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी स्वयंसेवकों प्रमाणित स्वस्थ होने के लिए और कम से कम 10 दिनों के प्रयोगों पूर्ववर्ती के दौरान किसी भी प्लेटलेट हस्तक्षेप दवाओं नहीं लिया है करने के लिए।

1. मानव रक्त संग्रह के लिए बफर तैयार करना और धोया प्लेटलेट अलगाव

  1. भंग 1.4 ग्राम साइट्रिक एसिड monohydrate (सी 6 एच 8 हे 7 • एच 2 ओ, 66.6 मिमी), 2.5 ग्राम trisodium साइट्रेट dihydrate (Na 3 सी 6 एच 5 से एसिड साइट्रेट-डेक्सट्रोज (एसीडी) की एक 100 एमएल जलीय घोल तैयार करें हे 7 • 2 एच 2 ओ, 85 मिमी) और निर्जल डी (+) के 2 जी - ग्लूकोज। घोल का पीएच 4.5 के बारे में है।
  2. इस प्रकार Tyrode के बफर के लिए शेयर समाधान तैयार करें
    1. भंग 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 2 जी KCl, 10 ग्राम 3 NaHCO और 0.58 ग्राम नः 2 पीओ 4 * एच आसुत एच 2 ओ के 500 एमएल में 2 हे संबंधित अंतिम सांद्रता 2.73 एम, 53.6 मिमी, 238 द्वारा शेयर समाधान 1 तैयार मिमी और 8.4 मिमी। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें।
    2. 500 एमएल में 10.15 छ 2 MgCl * 6 एच 2 ओ (100 मिमी) आसुत एच 2 ओ 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें भंग द्वारा शेयर समाधान 2 तैयार करें।
    3. 10.95 ग्राम (100 मिमी) 2 CaCl * 6 एच 500 एमएल आसुत एच 2 में 2 हे ओ 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें भंग द्वारा शेयर समाधान 3 तैयार करें।
  3. आसुत एच 2 ओ के साथ 50 एमएल की एक अंतिम मात्रा यह 136.5 मिमी NaCl, 2.68 मिमी KCl, के अंतिम सांद्रता से मेल खाती है में शेयर समाधान 1 के 2.5 एमएल कमजोर द्वारा Tyrode के बफर तैयार करें 11.9 मिमी 3 NaHCO और 0.42 मिमी नः 2 पीओ 4 * एच 2 ओ 7.35 पीएच को समायोजित करें और साथ 0.22-सुक्ष्ममापी च छान कर नसबंदीilters।
  4. 5 शेयर समाधान 1 की एमएल कमजोर द्वारा Tyrode के एल्बुमिन 0.35% बफर (टीए बफर 7) तैयार करें, शेयर समाधान 2 में से 1 एमएल, शेयर समाधान 3, 0.5 एमएल 1M HEPES, 200 ग्राम / एल मानव सीरम albumin 1.8 एमएल के 2 एमएल और निर्जल डी (+) के 0.1 ग्राम - 100 एमएल की एक अंतिम मात्रा में ग्लूकोज आसुत एच 2 ओ
    1. 1N एचसीएल के साथ 7.35 पीएच को समायोजित करें और आसुत एच 2 ओ (कुल मात्रा का 10%) जोड़कर करने के लिए 295 mOsm / एल परासारिता निर्धारित किया है। इस समाधान में अंतिम सांद्रता हैं: 124 मिमी NaCl, 2.44 मिमी KCl, 10.82 मिमी 3 NaHCO, 0.38 मिमी नः 2 पीओ 4 * एच 2 ओ, 0.91 मिमी 2 MgCl * 6 एच 2 ओ, 1.82 मिमी 2 CaCl * 6 एच 2 ओ । पूरे प्रयोग के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर टीए बफर रखें।

2. रक्त संग्रह

  1. , कोहनी के सामने नस एक 19 जी सुई और कोई या कम टूनिकेट का उपयोग करने से शिरापरक रक्त के 45-50 एमएल इकट्ठा, 50 एमएल की नलियों में चोरTaining एसीडी थक्कारोधी (रक्त के 6 मात्रा के लिए 1 मात्रा एसीडी)। रक्त के पहले 1-2 एमएल त्यागें थ्रोम्बिन और ऊतक कारक की उपस्थिति से बचने के लिए।
    1. संग्रह के बाद, धीरे inverting ट्यूब द्वारा एसीडी के साथ रक्त मिश्रण। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।

3. मानव की तैयारी प्लेटलेट्स धोया

  1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र पूर्व गर्म करें। नीचे सभी centrifugation चरणों इस तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं।
  2. 250 XG पर 15 एमएल ट्यूब (ट्यूब प्रति 5 एमएल) और अपकेंद्रित्र में एकत्र रक्त प्रेषण 13 मिनट पीआरपी प्राप्त करने के लिए के लिए।
    नोट: नमूने में तीन परतों के उत्पादन में इस centrifugation कदम परिणाम: 1) ऊपरी परत, प्लाज्मा, प्लेटलेट्स से बना है, और श्वेत रक्त कोशिकाओं के एक छोटे से अंश। 2) मध्यवर्ती परत, एक हिस्से को सफेद रक्त कोशिकाओं में अमीर। 3) नीचे की परत है, जो अनिवार्य लाल रक्त कोशिकाओं से बना है।
  3. ऊपरी ला pipetting द्वारा पीआरपी इकट्ठाyer ध्यान से एक नया 15 एमएल ट्यूब अधिकतम लाल और सफेद रक्त कोशिकाओं के साथ संदूषण रोकने के लिए, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं करने के लिए में।
  4. 12 मिनट (5 एमएल पीआरपी के लिए) के लिए 2,200 XG पर पीआरपी अपकेंद्रित्र।
    नोट: यह centrifugation कदम कम ब्रेक के साथ या ब्रेक के बिना किया जाना चाहिए।
  5. सतह पर तैरनेवाला (प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा) निकालें, और ध्यान से एक प्लास्टिक पाश्चर pipet का उपयोग कर 2 μL / हेपरिन के एमएल युक्त टीए बफर के 10 एमएल (5,000 यू / एमएल) और 2.5 μL / 25 माइक्रोन PGI 2 के एमएल के साथ गोली resuspend। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. (कम ब्रेक के साथ या ब्रेक के बिना) 1,900 XG पर 8 मिनट के लिए 2.5 μL / 25 माइक्रोन PGI 2 और अपकेंद्रित्र के एमएल जोड़ें।
  7. तैरनेवाला निकालें और 5 एमएल टीए 2.5 μL / 25 माइक्रोन PGI 2 एमएल युक्त एक प्लास्टिक पाश्चर pipet का उपयोग कर बफर के साथ गोली resuspend। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. ऊष्मायन अवधि के दौरान, में प्लेटलेट निलंबन के 150 μL pipetएक 1.5 एमएल ट्यूब और प्लेटलेट्स गिनती, एक प्रणाली को सेल काउंटर (कि प्रत्यक्ष वर्तमान प्रतिरोध में परिवर्तन को मापने के द्वारा रक्त कोशिकाओं के आकार का पता लगाता है) का उपयोग कर।
  9. 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, प्लेटलेट निलंबन के 2.5 μL / 25 माइक्रोन PGI 2 एमएल जोड़ सकते हैं और तुरंत 8 मिनट के लिए 1,900 XG पर अपकेंद्रित्र।
  10. सतह पर तैरनेवाला निकालें और टीए बफर की पर्याप्त मात्रा के साथ 250,000 प्लेटलेट्स / μL की एकाग्रता को गोली resuspend 0.01 पर 32 μL / apyrase के एमएल युक्त यू (यानी यदि कोशिकाओं की संख्या 500,000 μL प्रति, 10 एमएल टीए बफर में resuspend है) / एमएल (अंतिम एकाग्रता 0.32 यू / एमएल)।
    नोट: apyrase की उच्च सांद्रता एगोनिस्ट के अभाव में एटीपी 10, 11 की सहज स्राव से प्रेरित P2X1 रिसेप्टर्स की विसुग्राहीकरण से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि कोलेजन प्रेरित प्रतिक्रियाओं तेजी पैराक्राइन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं / एटीपी द्वारा P2X1 की ऑटोक्राइन सक्रियण fr जारी कियाओम प्लेटलेट्स सक्रिय। प्लेटलेट संकेतन मार्ग गंभीर रूप से P2X1 समारोह के संरक्षण की आवश्यकता नहीं है, का उपयोग 0.02 यू / एमएल apyrase। कई अध्ययनों से (Mahaut स्मिथ एट अल। 10 में समीक्षा) प्रदर्शन किया है कि 0.02 यू / एमएल apyrase से बचा जाता है नगण्य P2X1 प्रतिक्रियाओं के साथ ADP रिसेप्टर P2Y1 विसुग्राहीकरण।
  11. aggregometric माप प्रदर्शन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए सेल निलंबन सेते हैं। तैयारी 5 से 8 घंटे के लिए स्थिर है।

4. Aggregometry

  1. Tyrode के बफर में फाइब्रिनोजेन (56 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें।
  2. कांच cuvettes में प्लेटलेट निलंबन की Pipet 260 μL (चित्रा 1 ए, बाएं क्युवेट) - ऊष्मायन कुओं वर्तमान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट फाइब्रिनोजेन के 10 μL (56 मिलीग्राम / एमएल) और एक चुंबकीय सरगर्मी रॉड से युक्त है, तो 2 के लिए निलंबन सेते aggregometer (चित्रा 1 बी और 1 C) में।
  3. Panx1 के साथ प्री-सेतेअवरोध करनेवाला खूब ब्लू FCF 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए एक 2.8 मिमी या 28 मिमी स्टॉक समाधान (अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन और 1 मिमी, क्रमशः) के 10 μL जोड़कर।
  4. एक क्युवेट 10 μL फाइब्रिनोजेन (56 मिलीग्राम / एमएल), प्लेटलेट्स के बिना 10 μL खूब ब्लू FCF (2.8 मिमी या 28 मिमी) और प्रादेशिक सेना बफर युक्त आयुध डिपो को मापने के द्वारा एक फ़र्जी 100% एकत्रीकरण मूल्य के लिए aggregometer जांच।
    1. अच्छी तरह के तहत एक एकत्रीकरण स्वचालित सरगर्मी में क्युवेट प्लेस और (यदि एकत्रीकरण अच्छी तरह से 1 प्रयोग किया जाता है यानी प्रेस एफ 1) कंप्यूटर aggregometer से जुड़ा हुआ की कीबोर्ड पर मौजूद संगत बटन दबाएँ।
      नोट: इस प्रयोग के नीचे वर्णित खूब ब्लू FCF भी शामिल है। अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया यौगिक प्रयोगात्मक हालत के लिए समायोजित किया जाना है।
  5. एक ही प्लेटलेट नमूना है कि स्वत: stirrin के तहत प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा का उपयोग करके एक फ़र्जी 0% एकत्रीकरण मूल्य के लिए aggregometer जांचजी।
    1. एकत्रीकरण में क्युवेट अच्छी तरह से रखें और कंप्यूटर aggregometer से जुड़ा हुआ की कीबोर्ड पर मौजूद संगत बटन दबाएँ। आगे बढ़ने से पहले 20-30 के बारे में के लिए प्रतीक्षा करें। इस देरी को आश्वस्त करने के लिए कि कोई एकत्रीकरण एगोनिस्ट जोड़ने से पहले होता है कार्य करता है।
      नोट: प्लेटलेट संख्या में कोई अंतर मापा आयुध डिपो पर एक प्रभाव हो सकता है, 0% अंशांकन कदम प्रत्येक व्यक्ति के माप के लिए दोहराया जाना चाहिए।
  6. , वांछित एगोनिस्ट के 20 μL, इस तरह के रूप में 15 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेजन (1 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) या 1.125 मिमी जोड़े arachidonic एसिड क्युवेट में (75 सुक्ष्ममापी अंतिम)। इसके तत्काल बाद कंप्यूटर aggregometer से जुड़ा हुआ की कीबोर्ड पर मौजूद संगत बटन दबाने से निरंतर स्वत: सरगर्मी के तहत रिकॉर्डिंग शुरू।
    नोट: एगोनिस्ट के अलावा प्लेटलेट सक्रियण प्रेरित करता है। प्लेटलेट समुच्चय स्पष्ट रूप से प्रयोग (चित्रा 1 ए के अंत में कांच क्युवेट में प्रतिष्ठित किया जा सकता; righटी क्युवेट)।
  7. रिकॉर्डिंग स्वचालित रूप से 6 मिनट के बाद बंद हो जाता है। इस बिंदु पर, कंप्यूटर के आइकन को बचाने पर क्लिक करके डेटा को बचाने के।
    नोट: एकत्रीकरण की दर की गणना कंप्यूटर है, जो एक प्रतिशत के रूप में एकत्रीकरण की प्रक्रिया के अंत परिणाम व्यक्त करता द्वारा किया जाता है।
  8. डेटा का विश्लेषण।
    1. धोया प्लेटलेट्स निलंबन और प्लेटलेट एकत्रीकरण की turbidimetric माप की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल पर अतिरिक्त व्यापक जानकारी के लिए, क्षेत्र 12, 13 में विशेषज्ञों द्वारा लिखी अन्य कागजात को देखें।

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Representative Results

aggregometer सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एकत्रीकरण घटता पैदा करता है और प्रतिशत में अधिक से अधिक एकत्रीकरण के लिए मान देता है। मूल्यों आदेश सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं और बार चार्ट के रूप में अधिक से अधिक एकत्रीकरण मूल्यों कल्पना करने के लिए एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर को कॉपी किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एकत्रीकरण घटता के प्रत्येक व्यक्ति बिंदु क्रम घटता कल्पना करने के लिए में एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में और फिर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (GraphPad जैसे) को बारी-बारी से निर्यात किया जा सकता। कुछ जांचकर्ताओं एकत्रीकरण वक्र के अधिक से अधिक ढलान का उपयोग वक्र के तहत वेग और क्षेत्रफल की गणना करने प्लेटलेट गतिविधि का आकलन करने के। अंतराल समय और आकार परिवर्तन भी रेखांकन देखे जा सकते हैं।

नियंत्रण परिस्थितियों में धोया मानव प्लेटलेट्स (एच 2 ओ) के एकीकरण का वक्र का एक विशिष्ट उदाहरण चित्रा 2A में दिखाया गया है। एक का जोड़gonist (कोलेजन), प्रेरित (कुछ विलंब के बाद) एकत्रीकरण प्लेटलेट्स की आकृति परिवर्तन की वजह से वक्र में एक अवसाद। फिर, एकत्रीकरण का प्रतिशत धीरे-धीरे एक अधिकतम मूल्य तक समय के साथ वृद्धि हुई लगभग 3-4 मिनट पर पहुँच गया था। एकत्रीकरण का प्रतिशत में कुछ कमी 6 मिनट रिकॉर्डिंग है, जो कुछ disaggregation को दर्शाता है के अंत में मनाया गया। जैसा कि चित्र 2A-बी में सचित्र, preincubating मानव धोया Panx1 चैनल अवरोध करनेवाला खूब ब्लू FCF साथ प्लेटलेट्स, 1 मिमी की एकाग्रता पर, धीमा या पूरी तरह से प्रारंभिक प्लेटलेट आकार परिवर्तन समाप्त कर दिया और अवरुद्ध 5 से प्राप्त धोया प्लेटलेट्स की कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण अलग असंबंधित स्वस्थ स्वयंसेवकों। जब प्लेटलेट्स जहां खूब ब्लू FCF के एक कम एकाग्रता (100 सुक्ष्ममापी) के साथ preincubated, कोलेजन प्रेरित प्रतिक्रियाओं और आकार परिवर्तन पर डाई के निरोधात्मक प्रभाव अब और नहीं देखा गया (उदाहरण के लिए चित्रा 2A देखें)। Quantifप्लेटलेट एकत्रीकरण 1 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेजन द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं का ication से पता चला कि 1 मिमी खूब ब्लू FCF काफी अधिक से अधिक एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं कम नियंत्रण की स्थिति के साथ ही Panx1 अवरोध करनेवाला के एक कम एकाग्रता (100 सुक्ष्ममापी) (चित्रा 2C) की तुलना में। प्लेटलेट एकत्रीकरण का निषेध कोलेजन प्रेरित प्रतिक्रिया के लिए विशिष्ट नहीं है और अवांछित खूब ब्लू FCF के साइड इफेक्ट की वजह से (सेल व्यवहार्यता पर, उदाहरण के लिए) डाई का एक ही एकाग्रता (1 मिमी) एकत्रीकरण प्रतिक्रिया से प्रेरित को प्रभावित नहीं किया था के रूप में एक और एगोनिस्ट, यानी 75 माइक्रोन ए.ए. के रूप में चित्रा 2 डी में सचित्र। इन परिणामों मानव प्लेटलेट्स की कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण प्रतिक्रिया में Panx1 चैनलों है कि हम और दूसरों को पहले से इस तरह के प्रोबेनेसिड, mefloquine रूप Panx1 के अन्य औषधीय अवरोधकों के साथ पता चला है की विशिष्ट भूमिका की पुष्टि, और विशिष्ट 10 Panx1 पेप्टाइड्स 7, 8।

आकृति 1
चित्र 1: Aggregometry। (ए) गिलास cuvettes के प्रतिनिधि छवि (एक सरगर्मी चुंबक युक्त) aggregometry के लिए इस्तेमाल किया। जबकि सही पर क्युवेट कोलेजन प्रेरित सक्रियण के बाद प्लेटलेट समुच्चय को दिखाता है बाईं तरफ क्युवेट आराम प्लेटलेट्स को दर्शाता है। (बी) turbidimetric मापन के लिए एक 8 अच्छी तरह से aggregometer के प्रतिनिधि छवि। कुओं (तारांकन) का इस्तेमाल किया 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गिलास क्युवेट में मौजूद प्लेटलेट निलंबन सेते हैं, और माप (सफेद तीर) के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सी में दर्शाया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: कोलेजन के जवाब में खूब ब्लू FCF ब्लाकों प्लेटलेट सक्रियण की एक उच्च एकाग्रता। (ए) मानव के कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण के प्रतिनिधि निशान धोया ही स्वस्थ स्वयंसेवक (V1) नियंत्रण परिस्थितियों में से प्राप्त प्लेटलेट्स (एच 2 हे, गहरे नीले रंग) या बाद 1 मिमी पर Panx1 अवरोध करनेवाला खूब ब्लू FCF के साथ 7 मिनट preincubation ( हल्का नीला) या 100 माइक्रोन पर (मध्यवर्ती नीले रंग)। एकत्रीकरण निशान 6 मिनट के लिए दर्ज किए गए। (बी) मानव के कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण के प्रतिनिधि निशान धोया Panx1 अवरोध करनेवाला खूब ब्लू FCF (1 मिमी) के साथ 7 मिनट preincubation के बाद 4 स्वस्थ स्वयंसेवकों (V2-वी 5) से प्राप्त प्लेटलेट्स। (सी) मानव का अधिक से अधिक एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं की मात्रा पर नियंत्रण की स्थिति (सफेद पट्टी) के तहत या के बाद 100 माइक्रोन (ग्रे पट्टी) पर खूब ब्लू FCF के साथ 7 मिनट preincubation या 1 मिमी (काला पट्टी) पर प्लेटलेट्स धोया। एन = 5. **** पी0; 0.0001; एनोवा कई तुलना के लिए Bonferroni के बाद परीक्षण के बाद; परिणाम SEM ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। (डी) मानव के ए.ए. प्रेरित एकत्रीकरण के प्रतिनिधि निशान धोया Panx1 अवरोध करनेवाला खूब ब्लू FCF (1 मिमी) के साथ 7 मिनट preincubation के बाद 5 स्वस्थ स्वयंसेवकों (V1-वी 5) से प्राप्त प्लेटलेट्स। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वहाँ नए आदेश रक्तस्राव का खतरा बढ़ाने के बिना घनास्त्रता को रोकने के लिए प्लेटलेट समारोह modulating में सक्षम दवाओं की खोज में बहुत रुचि है। इस प्रयोजन के लिए इन विट्रो प्रयोगशाला परीक्षणों जो मज़बूती से और reproducibly मानव प्लेटलेट्स में एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं की निगरानी कर सकते बिल्कुल जरूरी है। Turbidimetric aggregometry एक आसान तकनीक प्रदर्शन करने के लिए है। हालांकि, कुछ सावधानियों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। माप के रूप में एकत्रीकरण प्रक्रिया काफी हद तक सरगर्मी पर निर्भर है निरंतर क्रियाशीलता के तहत किया जाना चाहिए। यह भी आदेश समय से पहले सक्रियण के किसी भी प्रकार से बचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के एक शारीरिक तापमान पर प्लेटलेट्स रखने के लिए महत्वपूर्ण है। प्लेटलेट्स की Preactivation भी रक्त संग्रह के दौरान हो और प्लेटलेट्स तैयारी धोया, सहज एकत्रीकरण के लिए अग्रणी कर सकते हैं। इस प्रकार सावधान उपायों प्लेटलेट तैयारी की पूरी प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए।

Turbidimetry ओ आधारित हैn प्लेटलेट निलंबन के आयुध डिपो की माप। यह लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण तकनीक पूरे रक्त में एकत्रीकरण माप के लिए अनुपयुक्त बना देता है। इस प्रकार, turbidimetry केवल पीआरपी या पीआरपी से अलग धोया प्लेटलेट्स पर किया जा सकता। हालांकि साथ सौदा करने के लिए आसान और नहीं बल्कि सस्ती, turbidimetry microaggregates 14, 15 की उपस्थिति के प्रति असंवेदनशील के रूप में पहचाना गया है। Microaggregates महत्व का हो जाने की उम्मीद कर रहे हैं, प्रतिबाधा aggregometry है, जो विद्युत प्रतिरोध में परिवर्तन को मापता है जब प्लेटलेट्स एक इलेक्ट्रोड एक citrated पूरे रक्त के नमूने में डूबे का पालन, बेहतर अनुकूल 16 है। प्लेटलेट एकत्रीकरण की प्रक्रिया भी काफी हद तक प्लेटलेट निलंबन 17 में प्लेटलेट काउंट पर निर्भर है; प्रवाह cytometry, थ्रोम्बोसाइटोपेनिया 18 से पीड़ित रोगियों में प्रयोग किया जाता है जिससे प्लेटलेट्स की अधिकतम संख्याप्राप्त किया जा सकता turbidimetry के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, turbidimetry के सामान्य लाभ यह है कि इस तरह के आकार परिवर्तन और disaggregation, जो पूरी रक्त के नमूनों में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है के रूप में प्लेटलेट प्रतिक्रियात्मकता का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है, है।

यह एहसास है कि मानव प्लेटलेट एकत्रीकरण में प्राकृतिक विभिन्नता उम्र, लिंग और जीवन शैली के साथ ही विषय जिसका प्लेटलेट समारोह चुनौती दी है 19, 20, 21 के स्वास्थ्य की स्थिति में अंतर के कारण मौजूद है महत्वपूर्ण है। इस तरह की प्राकृतिक विभिन्नता turbidimetric परिणामों में 10-20% के आदेश पर हो सकता है, इस प्रकार की देखभाल, लिया जाना चाहिए जब प्रदर्शन और इन प्रयोगों की व्याख्या असंबंधित स्वस्थ स्वयंसेवकों की पर्याप्त संख्या से प्लेटलेट्स प्राप्त करने के विश्वसनीय आंकड़े अनुमति देने के लिए,। यह सीमा हालांकि तथ्य यह है कि turbidimetric माप अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत कर रहे हैं, कम से कम जब एकत्रीकरण द्वारा प्रतिभारित हैप्रक्रियाओं में अच्छी तरह से प्रयोगशालाओं भर में मानकीकृत कर रहे हैं। मानकीकरण के प्रयासों Thrombosis और Haemostasis 22 की इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा किया गया है। इस कारण से, turbidimetry अभी भी दोनों नैदानिक ​​और बुनियादी विज्ञान प्रयोगशालाओं में प्लेटलेट एकत्रीकरण की माप के लिए सबसे अधिक सामना करना पड़ा परीक्षण है और प्लेटलेट प्रतिक्रियाओं पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पसंद की एक तकनीक बनी हुई है।

वर्तमान अध्ययन में हम दिखा दिया है, turbidimetry का उपयोग कर मानव धोया प्लेटलेट्स में प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, कि एक सामान्य रूप से प्रयुक्त भोजन डाई खूब ब्लू FCF प्लेटलेट एकत्रीकरण को प्रभावित करता है। सुरुचिपूर्ण electrophysiological अध्ययन इस डाई 9, 23 से Panx1 चैनलों की एक विशिष्ट नाकाबंदी पता चला है। दरअसल, इस डाई के उच्च सांद्रता (1 मिमी) दोनों कोलेजन प्रेरित आकार परिवर्तन और अधिक से अधिक एकत्रीकरण लेकिन कम सांद्रता 10 गुना पर निरोधात्मक प्रभाव से पता चला है (100 सुक्ष्ममापी)डाई के प्लेटलेट एकत्रीकरण प्रतिक्रिया को प्रभावित नहीं किया। खाद्य योज्य के रूप खूब ब्लू FCF (E133) का पुन: मूल्यांकन पर वैज्ञानिक राय, यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण 24 द्वारा प्रकाशित के अनुसार, खूब ब्लू FCF (आणविक भार = 792.84 जी / मोल) की अधिकतम स्वीकार्य एकाग्रता 500 है भोजन की मिलीग्राम / किग्रा। एच 2 ओ के लिए, यह 0.63 मिमी है, जो एक हमारे प्रयोगों में बाधा कोलेजन प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण की तुलना में एक 1.59 गुना कम एकाग्रता है के अनुरूप होगा। यह मानते हुए कि केवल डाई के एक छोटा सा अंश मौखिक घूस के बाद आंतों में अवशोषित हो जाएगा, और कहा कि डाई अंत में एक वयस्क व्यक्ति के रक्त के 5-एल मात्रा में पतला हो जाएगा, इस नीले भोजन डाई के दैनिक सेवन की संभावना है काफी हद तक सामान्य स्तर को पार करने के प्लेटलेट एकत्रीकरण पर कोई दुष्प्रभाव प्रत्याशित किया जा सकता से पहले। प्लेटलेट व्यवहार्यता पर हमारे प्रयोगों में डाई के सर्वोच्च एकाग्रता के संभावित दुष्प्रभावों, उदाहरण के लिए, थेएक और एगोनिस्ट (एए) के लिए ठोस एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं की मौजूदगी से बाहर रखा गया है। ये अप्रभावित ए.ए. प्रतिक्रियाएं भी पुष्टि की कि खूब ब्लू FCF की निरोधात्मक प्रभाव विशेष रूप से कोलेजन संकेतन मार्ग को शामिल करने लगते हैं। यह इन-लाइन हमारे पहले के अध्ययन 7 कोलेजन प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण जवाब में Panx1 चैनलों के माध्यम से एटीपी रिहाई के लिए विशिष्ट स्थान विवरण के साथ है।

इस अध्ययन के लिए धोया प्लेटलेट अलगाव के प्रोटोकॉल अनुकूल करके, हम मानव रक्त से प्लेटलेट्स अलग करने के लिए एक सरल और सीधा विधि का वर्णन। बाद कई धोने चरणों centrifugation द्वारा अनिवार्य रूप से प्रदर्शन किया, प्लेटलेट्स एक माध्यम है कि पीएच सहित सटीक शारीरिक स्थितियों, काम कर रहे तापमान और द्विसंयोजक आयनों की सांद्रता का सम्मान करता है, लेकिन प्लाज्मा प्रोटीन के अभाव का आश्वासन दिया में resuspended हैं। इस तरह के जेल निस्पंदन के रूप में वैकल्पिक तरीकों से अधिक इस तकनीक का एक फायदा है प्लाज्मा घटकों की जो उन्मूलन मेंपिता 25 नहीं होती है।

सभी धोने की प्रक्रिया के कदम जब धोया प्लेटलेट्स का उपयोग कर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व है। दवाओं का एक बहुतायत प्लेटलेट प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, इस प्रकार यह जरूरी है कि स्वस्थ स्वयंसेवकों में कम से कम 10 दिनों के रक्त संग्रह पूर्ववर्ती के लिए किसी भी दवा नहीं लेने के लिए कहा जाता है। इसके अलावा, रक्त संग्रह जरूरी है कि ध्यान के रूप में इस थ्रोम्बिन और बाद में प्लेटलेट सक्रियण 22 की पीढ़ी का कारण हो सकता नस आघात या बहुत धीमी गति से प्रवाह से बचने के लिए भुगतान किया जाता है। उसी तर्ज पर, centrifugation और वाशिंग चरणों के दौरान संभावित प्लेटलेट सक्रियण PGI 2 की बार-बार इस्तेमाल से बचा जा सकता। इसके बहुत कम स्थिरता के कारण, PGI 2 प्रत्येक चरण धोने प्रत्येक centrifugation से ठीक पहले में जोड़ा जाना चाहिए। प्रादेशिक सेना बफर में प्लेटलेट्स की मेजबान (एक शारीरिक पीएच पर) apyrase युक्त सुनिश्चित करता है कि प्लेटलेट प्रतिक्रियाओं रहनेबरकरार। प्लेटलेट निलंबन में apyrase की उपस्थिति ताकि उनके purinergic रिसेप्टर्स की एक विसुग्राहीकरण से प्लेटलेट्स बचाने के लिए एटीपी और ADP की गिरावट की अनुमति के लिए आवश्यक है। Panx1 मार्ग संकेत कोलेजन रिसेप्टर सक्रियण पर मानव प्लेटलेट्स में P2X1 रिसेप्टर सक्रियण शामिल है के रूप में, हम आदेश P2X1 विसुग्राहीकरण 7 से बचने के लिए प्लेटलेट निलंबन के apyrase का एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता (0.32 यू / एमएल) जोड़ा गया। प्लेटलेट्स में अन्य purinergic रिसेप्टर्स की densensitization बचने के लिए, apyrase की कम सांद्रता पर्याप्त 10 होगा।

हालांकि धारावाहिक centrifugations और धोने के कदम की प्रक्रिया श्रम गहन कर रहे हैं और अधिक समय की आवश्यकता, धोया प्लेटलेट्स इस प्रोटोकॉल का उपयोग (के रूप में पीआरपी से सीधे इस्तेमाल किया प्लेटलेट्स की तुलना में 37 डिग्री सेल्सियस (5-8 ज) पर उच्च स्थिरता का लाभ देने के 1 प्राप्त -3 ज)। हालांकि, पीआरपी का उपयोग करने का विकल्प या धोया प्लेटलेट्स बनाया जाना चाहिए cautiously और इस तरह के प्रयोग के लिए उपलब्ध रक्त की मात्रा के रूप में विचार को शामिल करना चाहिए, एगोनिस्ट सवाल को संबोधित किया जाएगा और साथ ही इस्तेमाल किया जाएगा। उदाहरण के लिए, के रूप में सक्रिय α2β3 इंटेग्रिन को फाइब्रिनोजेन के बंधन मुख्य तंत्र प्लेटलेट एकत्रीकरण, धोया प्लेटलेट्स प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं में फाइब्रिनोजेन के अभाव में मध्यस्थता है; विशेष रूप से, जब (जैसे ADP) के रूप में कमजोर एगोनिस्ट 13 उपयोग किया जाता है। यह समस्या जब एक शक्तिशाली एगोनिस्ट ऐसे थ्रोम्बिन या कोलेजन है, जो स्वयं द्वारा α-कणिकाओं से फाइब्रिनोजेन की रिहाई के लिए प्रेरित करने में सक्षम हैं के रूप में प्रयोग किया जाता है, कम महत्वपूर्ण है। फिर भी, हम नियमित रूप बहिर्जात फाइब्रिनोजेन धोये मानव प्लेटलेट निलंबन के आदेश एकत्रीकरण प्रतिक्रिया कोलेजन द्वारा प्रेरित के आयाम को बढ़ाने के लिए जोड़ सकते हैं।

अंत में, मानव का उपयोग करके प्लेटलेट्स धोया और turbidimetry, हमने पाया कि भोजन डाई खूब ब्लू FCF, Panx1 पर इसके निरोधात्मक प्रभाव के माध्यम से, का प्रतिनिधित्व करता हैप्लेटलेट समारोह का एक संभावित अवरोध करनेवाला।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान (310030_162579 / 1 ब्रेंडा रेनाटा क्वाक के लिए और 320030_144150 पियरे फोंटाना के लिए) के साथ ही द्वारा स्विस हार्ट फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) Roth 5949-29-1 danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) Sigma-Aldrich S1804 -
D(+)-glucose Sigma-Aldrich G8270 -
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 -
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 -
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014 -
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) Sigma-Aldrich S9638 -
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) Sigma-Aldrich M9272 -
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) Sigma-Aldrich 442909 danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) ThermoFisher Scientific  15630 -
human serum albumin CSL Behring 00257/374 -
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331 Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R Fisher Scientific - -
heparin Drosspharm AG/SA 20810
prostacyclin I2 (PGI2) Cayman 18220 -
apyrase from potatoes Sigma-Aldrich A6535 -
fibrinogen (Haemocomplettan) CSL Behring HS 73466011 -
thrombo-aggragometer SD-Medical SD-Innovation TA8V -
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) Sigma-Aldrich 80717 Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen Horm, Nycomed -
arachidonic acid Bio/Data corporation C/N 101297 -
cell counter Sysmex KX-21N Sysmex Digitana  - -
HEPES Gibco 15630-056 -
glass cuvettes SD-Innovation THCV1000 -
magnetic stirrers SD-Innovation THA100 -

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References

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कोलेजन प्रेरित एकत्रीकरण पर Pannexin1 संदमक में प्रभाव खूब ब्लू FCF: turbidimetry मानव पर प्लेटलेट्स धोया
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Molica, F., Nolli, S., Fontana, P., Kwak, B. R. Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation. J. Vis. Exp. (122), e55525, doi:10.3791/55525 (2017).

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