Summary
Descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di piastrine lavate dal sangue umano seguita da agonista indotta misurazioni aggregazione piastrinica turbidimetria. A titolo di esempio applichiamo questo metodo per lo studio della risposta di aggregazione delle piastrine umane al collagene dopo un pre-incubazione con l'inibitore del canale Pannexin1 blu brillante FCF.
Abstract
Turbidimetria è una tecnica di laboratorio che viene applicata per misurare l'aggregazione delle piastrine sospese in entrambi plasma (plasma ricco di piastrine, PRP) o in tampone (piastrine lavate), mediante l'uso di uno o una combinazione di agonisti. L'uso di piastrine lavate separati dal loro ambiente plasma e in assenza di anticoagulanti consente di studiare le proprietà intrinseche delle piastrine. Tra il grande pannello di agonisti, acido arachidonico (AA), adenosina di-fosfato (ADP), trombina e collagene sono i più usati. La risposta di aggregazione viene quantificato misurando la densità ottica relativa (OD) nel tempo di sospensione di piastrine sotto continua agitazione. Piastrine in sospensione omogenea limitano il passaggio della luce dopo l'aggiunta di un agonista, piastrinico cambiamento forma verifica produrre un piccolo aumento transitorio in OD. A seguito di questa fase di attivazione iniziale, trombi piastrinici formano gradualmente, permettendo il passaggio della luce attraverso la sospensione come result di diminuita OD. Il processo di aggregazione è infine espresso in percentuale, rispetto alla densità ottica del plasma povero di piastrine o tampone. calibratura rigorosa è quindi essenziale all'inizio di ogni esperimento. Come regola generale: taratura 0% è impostato misurando la densità ottica di una sospensione non stimolata piastrine mentre si misura la densità ottica del mezzo di sospensione non contenente piastrine rappresenta un valore del 100%. L'aggregazione piastrinica è generalmente visualizzato come una curva di aggregazione in tempo reale. Turbidimetria è una delle tecniche di laboratorio più comunemente usati per lo studio della funzione piastrinica ed è considerato come il gold standard storico e utilizzato per lo sviluppo di nuovi agenti farmaceutici volti a inibire l'aggregazione piastrinica. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per 1) preparazione di umana lavato piastrine e 2) analisi turbidimetrica di aggregazione indotta da collagene di umana lavato piastrine pretrattato con il colorante alimentare blu brillante FCF che è stato recentemente identificata come inibitore di Pannexin1 canali (Panx1).
Introduction
Le piastrine sono componenti cruciali del sangue e la loro funzione, insieme a fattori di coagulazione-è quello di fermare l'emorragia dopo la lesione dei vasi sanguigni. Le piastrine sono piccoli frammenti (2-3 micron) anuclear derivate da megacariociti del midollo osseo 1. Piastrine circolano in stato non attivato, durante i quali appaiono come strutture lenticolari. Su interruzione della endotelio, piastrine si riuniscono per il sito di lesione dei vasi sanguigni per tappare il buco, un processo chiamato emostasi primaria. Inizialmente, piastrine attaccano alle molecole sub-endoteliale, quali il collagene e fattore di von Willebrand, che sono esposti a seguito della fase di lesione aderenza 2. Poi, cambiano forma e secernono passo messaggeri-attivazione chimica. Infine, si collegano tra loro da colmare passo recettori-aggregazione. dell'emostasi primaria è seguita da un processo secondario che coinvolge l'attivazione della cascata coagulativa con deposizione di fibrina, che stabilizzanos trombo iniziale 2.
Eventi ischemici acuti quali infarto miocardico 3 spesso il risultato di trombi che si formano a causa di interruzione fisica (rottura) di una placca aterosclerotica. farmaci anti-piastrinici attuali sono la pietra angolare del trattamento di questa malattia molto diffusa, ma il loro beneficio clinico è limitato da un aumentato rischio di sanguinamento. I farmaci più prescritti in pazienti cardiovascolare, composti aspirina e anti-P2Y12, indirizzare il trombossano A2 e le vie ADP 4, rispettivamente, che sono le principali vie che portano all'attivazione piastrinica. Tuttavia, la ricerca innovativa verso nuovi obiettivi che in modo ottimale bilanciare gli effetti antitrombotici e il rischio emorragico è ancora necessario.
Dal 1960 ad oggi 5, aggregometria turbidimetrico ha svolto un ruolo cruciale nella ricerca, migliorare la nostra conoscenza della reattività piastrinica ed ion per il monitoraggio della potenza di reagenti anti-trombotici nell'uomo. Turbidimetria stata inizialmente applicata a PRP estratto da campioni di sangue. Infatti, la raccolta del sangue eseguita in provette contenenti citrato permette una produzione rapida e grande di PRP senza avere alcun effetto sulla integrità e la funzionalità piastrinica. Tuttavia, la stabilità a breve termine (circa 3 h) PRP e le restanti enzimi plasmatici, quali trombina, e la bassa concentrazione di calcio associato con un profilo di aggregazione potenzialmente artefattuali sono di gravi inconvenienti per l'uso di PRP. Un importante passo avanti è stato lo sviluppo di un metodo per l'isolamento delle piastrine con centrifugazione e lavaggio passi 6 supplementare. In breve, PRP è isolato dal sangue intero raccolto in acido citrato destrosio (ACD) e le piastrine sono isolati dopo le fasi di centrifugazione seriale prima di essere risospese in un tampone iso-osmotica fosfato (tampone di Tyrode) contenente glucosio, albumina di siero umano e bivalente cni (Ca 2+ e Mg 2+). Per evitare variazioni di reattività piastrinica, il pH del tampone di Tyrode è attentamente mantenuta a 7,35-7,4. Inoltre, l'attivazione indesiderata di piastrine è impedito aggiungendo prostaciclina (PGI 2) prima di alcune fasi di centrifugazione. Infine, l'aggiunta di apyrase impedisce piastrine lavate di diventare resistente contro l'azione di ATP / ADP. La sospensione di piastrine risultante manca di fattori coagulanti e la stabilità delle piastrine è aumentata di almeno due volte rispetto alle soluzioni PRP. Inoltre, il fatto che le piastrine sono mandati inattive ma intatti riproducibilità delle misurazioni turbidimetriche e fornisce la possibilità di studiare l'azione di agonisti o antagonisti di aggregazione piastrinica in modo ottimale.
Usando questo metodo, abbiamo dimostrato in un recente studio che inibendo la formazione di canali Panx1 da un approccio genetico (knock-out topi) o diminuendo canale attività Panx1 da farmacologicaapprocci ridotta aggregazione piastrinica indotta da collagene 7. Panx1 forma canali ATP-rilascio, che sono ubiquitariamente espressi in molti tipi di cellule inclusi piastrine umane 7, 8. Infatti, abbiamo dimostrato mediante turbidimetria su umano lavato piastrine che un 7 min preincubazione con un pannello di bloccanti più o meno specifici chimici (probenecid, meflochina e 10 peptidi Panx1) prima della aggiunta di vari agonisti, inibito specificamente collagene-indotta aggregazione piastrinica mentre le risposte alle piastrine AA e ADP non sono stati influenzati. Abbiamo dimostrato che l'ATP rilascio attraverso canali Panx1 interferisce in modo specifico nella via di segnalazione che porta alla GPVI aggregazione indotta da collagene. È interessante notare che, più composti FDA ha approvato con applicazioni in altre malattie (probenecid, meflochina) influenzano l'attività dei canali Panx1 in piastrine. Da un lato, questo apre nuove prospettive terapeutiche per selezionaretivamente modificare reattività piastrinica. D'altra parte, si dovrebbe prendere in considerazione i potenziali effetti secondari di questi composti. In questo contesto, il colorante alimentare sicuro Blu Brillante FCF utilizzato in più caramelle e bevande energetiche è stato descritto come un inibitore selettivo di Panx1 9. Descriviamo qui un protocollo per l'isolamento di piastrine lavate umani e misurazioni turbidimetrici dell'aggregazione piastrinica adattato per investigare l'effetto del colorante blu brillante FCF come antagonista di aggregazione piastrinica.
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Protocol
Cinque volontari sani non imparentati sono stati reclutati per il prelievo di sangue per le prove di isolamento e l'aggregazione piastrinica. consenso informato scritto è stato ottenuto e il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Centrale delle ospedali universitari ginevrini. Tutti i volontari certificati per essere sani e di non hanno preso tutte le droghe piastrine-interferire durante almeno i 10 giorni precedenti esperimenti.
1. Buffer Preparazione per la Raccolta Sangue umano e isolamento piastrinico Lavato
- Preparare una soluzione acquosa di 100 mL di acido-citrato-destrosio (ACD) sciogliendo 1,4 g acido citrico monoidrato (C 6 H 8 O 7 • H 2 O, 66,6 mM), 2,5 g di trisodio citrato diidrato (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H 2 O, 85 mm) e 2 g di D anidro (+) - glucosio. Il pH della soluzione è circa 4,5.
- Preparare soluzioni per il buffer di Tyrode come segue
- Preparare soluzione stock 1 sciogliendo 80 g di NaCl, KCl 2 g, 10 g NaHCO 3 e 0,58 g di NaH 2 PO 4 * H 2 O in 500 ml di H 2 O distillata O. Le rispettive concentrazioni finali sono 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM e 8,4 mM. Mantenere la soluzione a 4 ° C.
- Preparare soluzione stock 2 sciogliendo 10,15 g MgCl 2 * 6 H 2 O (100 mM) in 500 mL di acqua distillata H 2 O. Conservare soluzione a 4 ° C.
- Preparare soluzione madre 3 sciogliendo 10,95 g (100 mM) CaCl 2 * 6 H 2 O in 500 ml H 2 O distillata O. Conservare soluzione a 4 ° C.
- Preparare tampone Tyrode diluendo 2,5 ml di soluzione stock 1 in un volume finale di 50 ml con acqua distillata H 2 O. Ciò corrisponde a concentrazioni finali di 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO 3 e 0,42 mM NaH 2 PO 4 * H 2 O. Regolare il pH a 7,35 e sterilizzare filtrando con 0,22 micron filters.
- Preparare albumina 0,35% tampone Tyrode (TA tampone 7) diluendo 5 ml di soluzione 1, 1 ml di soluzione 2, 2 ml di soluzione madre 3, 0.5 mL 1M HEPES, 1,8 mL di 200 g / l di albumina sierica umana e 0,1 g di D anidro (+) - glucosio in un volume finale di 100 mL di acqua distillata H 2 O.
- Regolare il pH a 7,35 con HC1 e impostare l'osmolarità di 295 mOsm / L aggiungendo H 2 O distillata O (10% del volume totale). Concentrazioni finali di questa soluzione sono: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO 3, 0.38 mM NaH 2 PO 4 * H 2 O, 0,91 mM MgCl 2 * 6 H 2 O, 1,82 mM CaCl 2 * 6 H 2 O . Mantenere tampone TA a 37 ° C durante l'intero esperimento.
Collezione 2. Sangue
- Raccogliere 45-50 ml di sangue venoso, dalla vena antecubitale usando un ago G 19 e non o basso laccio emostatico, in 50 mL provette conTaining ACD anticoagulante (1 volume ACD per 6 volumi di sangue). Eliminare i primi 1-2 mL di sangue per evitare la presenza di trombina e fattore tissutale.
- Dopo la raccolta, miscelare il sangue con ACD capovolgendo delicatamente il tubo. Incubare il campione per 10 min a 37 ° C.
3. Preparazione di Human Washed Piastrine
- Pre-riscaldare la centrifuga a 37 ° C. Tutte le fasi di centrifugazione seguito vengono eseguite a questa temperatura.
- Inviare il sangue raccolto in provette 15 ml (5 ml per provetta) e centrifugare a 250 xg per 13 min per ottenere PRP.
NOTA: Questo centrifugazione risultati passo nella produzione di tre strati del campione: 1) Lo strato superiore, composto da plasma, piastrine, e una piccola frazione di cellule bianche del sangue. 2) Lo strato intermedio, una porzione ricco di cellule bianche del sangue. 3) Lo strato inferiore, che è essenzialmente composto da globuli rossi. - Raccogliere il PRP pipettando la tomaia layer accuratamente in un nuovo tubo 15 ml per evitare al massimo la contaminazione con i globuli rossi e bianchi, e incubare per 10 min a 37 ° C.
- Centrifugare la PRP a 2.200 g per 12 min (per 5 mL PRP).
NOTA: Questa fase di centrifugazione deve essere eseguita con una bassa freno o senza freno. - Rimuovere il surnatante (plasma povero di piastrine), e risospendere accuratamente il pellet con 10 ml di tampone TA contenente 2 microlitri / ml di eparina (5.000 U / ml) e 2,5 ml / ml di 25 pM PGI 2 utilizzando una pipetta di plastica Pasteur. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
- Aggiungere 2,5 microlitri / ml di 25 micron PGI 2 e centrifugare per 8 min a 1.900 g (con basso freno o senza freno).
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 5 mL di tampone TA contenente 2,5 microlitri / ml di 25 pM PGI 2 utilizzando una plastica Pasteur pipetta. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
- Durante il periodo di incubazione, pipettare 150 microlitri della sospensione piastrinicaad una provetta da 1,5 ml e conta piastrine, utilizzando un contatore di cellule automatizzata (che rileva la dimensione dei globuli misurando le variazioni di resistenza in corrente continua).
- Dopo il 10 minuti di incubazione, aggiungere 2,5 microlitri / ml di 25 pM PGI 2 alla sospensione di piastrine e subito centrifugare a 1900 xg per 8 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet ad una concentrazione di 250.000 piastrine / mL con un volume adeguato di tampone TA (ossia se il numero di celle è 500.000 per ml, risospendere in 10 mL di tampone TA) contenente 32 microlitri / ml di apyrase a 0.01 U / ml (concentrazione finale 0,32 U / mL).
NOTA: Alta concentrazione di apyrase viene utilizzato per evitare la desensibilizzazione dei recettori P2X1 indotte da secrezione spontanea di ATP 10, 11 in assenza di agonisti. Questo è importante perché risposta indotta dal collagene sono indotte da paracrino veloce / attivazione autocrina di P2X1 da ATP rilasciato from attivato piastrine. Se il percorso di segnalazione di piastrine non richiede criticamente conservazione della funzione P2X1, utilizzare 0,02 U / mL apyrase. Diversi studi (recensiti Mahaut-Smith et al. 10) hanno dimostrato che 0,02 U / mL apyrase evita ADP desensibilizzazione del recettore P2Y1 con risposte P2X1 trascurabili. - Incubare la sospensione cellulare per almeno 30 minuti a 37 ° C prima di effettuare le misurazioni aggregometric. La preparazione è stabile da 5 a 8 h.
4. Aggregometria
- Preparare fibrinogeno (56 mg / ml) in tampone di Tyrode.
- Pipettare 260 ml di sospensione di piastrine in cuvette di vetro (Figura 1A; cuvetta sinistra) contenente 10 ml di fibrinogeno (56 mg / mL) e un agitatore magnetico poi incubare la sospensione per 2 - 3 minuti a 37 ° C in pozzetti di incubazione presenti nel aggregometro (Figura 1B e 1C).
- Pre-incubazione con il Panx1inibitore blu brillante FCF aggiungendo 10 ml di 2,8 mM o 28 soluzione madre mM (concentrazione finale 100 pM e 1 mM, rispettivamente) per 7 minuti a 37 ° C.
- Calibrare l'aggregometro ad un valore di aggregazione assumptive 100% misurando la densità ottica di una cuvetta contenente 10 microlitri fibrinogeno (56 mg / mL), 10 microlitri blu brillante FCF (2,8 mm o 28 mM) e la soluzione tampone TA senza piastrine.
- Posizionare la cuvetta in un'aggregazione ben sotto agitazione automatica e premere il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro (cioè premere F1 se si usa l'aggregazione ben 1).
NOTA: Questo esperimento descritto di seguito include blu brillante FCF. Il materiale impiegato per la taratura deve essere adattata alla condizione sperimentale.
- Posizionare la cuvetta in un'aggregazione ben sotto agitazione automatica e premere il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro (cioè premere F1 se si usa l'aggregazione ben 1).
- Calibrare l'aggregometro ad un valore di aggregazione assumptive 0% utilizzando lo stesso campione di piastrine che verrà utilizzata per l'esperimento sotto Stirrin automaticag.
- Posizionare la cuvetta nell'aggregazione pozzo e premere il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro. Attendere circa 20-30 s prima di procedere. Questo ritardo serve per assicurare che nessun aggregazione avviene prima di aggiungere gli agonisti.
NOTA: Come qualsiasi differenza nel numero di piastrine può avere un effetto sul diametro esterno misurato, la fase di calibrazione 0% deve essere ripetuta per ogni singola misura.
- Posizionare la cuvetta nell'aggregazione pozzo e premere il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro. Attendere circa 20-30 s prima di procedere. Questo ritardo serve per assicurare che nessun aggregazione avviene prima di aggiungere gli agonisti.
- Aggiungere 20 ml di agonista desiderato, ad esempio 15 ug collageno / mL (1 ug / ml finale) o 1,125 mM acido arachidonico (75 uM finale), nella cuvetta. avviare immediatamente la registrazione sotto continua agitazione automatica premendo il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro.
NOTA: L'aggiunta del agonista induce l'attivazione piastrinica. Aggregati piastrinici possono essere chiaramente distinti nella cuvetta di vetro alla fine dell'esperimento (Figura 1A; right cuvetta). - La registrazione si interrompe automaticamente dopo 6 min. A questo punto, salvare i dati facendo clic sull'icona di salvataggio del computer.
NOTA: Il calcolo del tasso di aggregazione viene eseguita dal computer, che esprime il risultato finale del processo di aggregazione in percentuale. - Analizzare i dati.
- Per ulteriori informazioni esaustive su protocolli per la preparazione di piastrine lavate e sospensioni misurazione turbidimetrica dell'aggregazione piastrinica, fare riferimento ad altri documenti scritti da esperti del settore 12, 13.
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Representative Results
Il software aggregometro produce automaticamente le curve di aggregazione e fornisce i valori per l'aggregazione massima in percentuale. I valori possono essere copiati ad un software di analisi dei dati per effettuare analisi statistiche e visualizza i valori massimi di aggregazione in forma di grafici a barre. Facoltativamente, ogni singolo punto delle curve di aggregazione possono essere esportati successivamente in un foglio elettronico e poi software statistico (es GraphPad) per visualizzare le curve. Alcuni ricercatori utilizzano la pendenza massima della curva di aggregazione per calcolare la velocità e l'area sotto la curva per valutare l'attività delle piastrine. Il tempo di ritardo e il cambiamento di forma può anche essere visualizzate graficamente.
Un esempio tipico di una curva di aggregazione delle piastrine umane lavate sotto condizioni di controllo (H 2 O) è mostrato in Figura 2A. Aggiunta del ungonist (collagene), indotta (dopo un breve ritardo) una depressione della curva di aggregazione causata dal cambiamento di forma delle piastrine. Quindi, la percentuale di aggregazione gradualmente aumentata nel tempo fino ad un valore massimo è stato raggiunto a circa 3-4 min. Una leggera diminuzione nella percentuale di aggregazione è stata osservata verso la fine della registrazione 6 min, che denota una disaggregazione. Come illustrato in Figura 2A-B, preincubando umano lavato piastrine con inibitore canale Panx1 blu brillante FCF, ad una concentrazione di 1 mM, rallentato o completamente abolita il cambiamento iniziale forma piastrinica e bloccato l'aggregazione indotta da collagene di piastrine lavate ottenuto da 5 diversi volontari sani non imparentati. Se le piastrine dove preincubate con una concentrazione inferiore (100 uM) di blu brillante FCF, l'effetto inibitorio del colorante sulle risposte collagene-indotta e variazione di forma non sono stati osservati più (vedere la Figura 2A per un esempio). Quantificazione delle risposte aggregazione piastrinica indotta da collagene 1 ug / mL rivelato che 1 mM blu brillante FCF ridotto significativamente risposte di aggregazione massime rispetto alle condizioni di controllo, nonché ad una concentrazione inferiore (100 uM) di inibitore Panx1 (Figura 2C). Inibizione dell'aggregazione piastrinica era specifico per le risposte collagene-indotta e non a causa di effetti collaterali indesiderati di blu brillante FCF (sulla vitalità cellulare, per esempio) come la stessa concentrazione del colorante (1 mM) non ha modificato la risposta di aggregazione indotta da un altro agonista, cioè 75 uM AA, come illustrato in figura 2D. Questi risultati confermano il ruolo specifico di canali Panx1 in collagene-indotta risposte di aggregazione di piastrine umane che noi ed altri hanno precedentemente indicati con altri inibitori farmacologici di Panx1 come probenecid, meflochina, e le specifiche 10 peptidi Panx1 7, 8.
Figura 1: Aggregometria. (A) immagine rappresentativa di cuvette di vetro (contenente un magnete agitazione) utilizzati per aggregometria. La cuvetta a sinistra mostra piastrine di appoggio, mentre la cuvetta a destra illustra aggregati piastrinici dopo l'attivazione indotta da collagene. (B) immagine Rappresentante di un 8-ben aggregometro per misure turbidimetrici. I pozzetti utilizzati (asterisco) incubare sospensioni di piastrine presenti in una cuvetta di vetro a 37 ° C, e quelli utilizzati per le misurazioni (freccia bianca) sono indicati in C. Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: una elevata concentrazione di blu brillante FCF blocchi piastrine attivazione in risposta al collagene. (A) tracce rappresentativi di aggregazione indotta da collagene di umana lavato piastrine ottenute dal medesimo volontario sano (V1) in condizioni di controllo (H 2 O; blu scuro) o dopo 7 min preincubazione con l'inibitore Panx1 blu brillante FCF a 1 mM ( azzurro) oppure a 100 pM (colore blu intermedio). tracce di aggregazione sono stati registrati per 6 min. (B) tracce rappresentativi di aggregazione indotta da collagene di umana lavato piastrine ottenute da 4 volontari sani (V2-V5) dopo 7 min preincubazione con l'inibitore Panx1 blu brillante FCF (1 mM). (C) Quantificazione delle risposte di aggregazione massimali di umana lavato piastrine in condizioni di controllo (barre bianche) o dopo 7 min preincubazione con blu brillante FCF a 100 pM (barra grigia) o 1 mM (barra nera). N = 5. **** P0; 0,0001; ANOVA seguito dal post-test di Bonferroni per confronti multipli; I risultati sono espressi come media ± SEM. (D) tracce rappresentativi di aggregazione AA indotta umana lavato piastrine ottenute da 5 volontari sani (V1-V5) dopo 7 min preincubazione con l'inibitore Panx1 blu brillante FCF (1 mM). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
C'è un grande interesse nella ricerca di nuovi farmaci in grado di modulare la funzione delle piastrine al fine di prevenire la trombosi senza aumentare il rischio di sanguinamento. A tale scopo, in vitro test di laboratorio che possono monitorare affidabile e riproducibile risposte di aggregazione di piastrine umane sono assolutamente necessarie. aggregometria turbidimetrico è una tecnica facile da eseguire. Tuttavia, alcune precauzioni devono essere tenuti in considerazione. Le misurazioni devono essere eseguite sotto agitazione continua, come il processo di aggregazione è largamente dipendente agitazione. E 'anche importante mantenere le piastrine a temperatura fisiologica di 37 ° C al fine di evitare qualsiasi tipo di attivazione prematura. Preattivazione di piastrine può avvenire anche durante la raccolta del sangue e piastrine lavate preparazione, portando ad aggregazione spontanea. Così dovrebbero essere prese misure di attenzione durante la procedura completa di preparazione delle piastrine.
Turbidimetria si basa on la misurazione del diametro esterno della sospensione di piastrine. Questo rende la tecnica non idoneo per la misura aggregazione in sangue intero per la presenza di globuli rossi. Così, turbidimetria può essere eseguita solo su PRP o piastrine lavate isolate da PRP. Sebbene facile da trattare e piuttosto costoso, turbidimetria è stato riconosciuto come insensibile alla presenza di microaggregati 14, 15. Quando microaggregati dovrebbero essere di importanza critica, impedenza aggregometria, che misura la variazione di resistenza elettrica quando le piastrine aderiscono ad un elettrodo immerso in un campione di sangue intero citrato, è più adatto 16. Il processo di aggregazione piastrinica è anche largamente dipendente conta piastrinica nella sospensione di piastrine 17; citometria a flusso è utilizzato in pazienti affetti da trombocitopenia 18, da cui il numero massimo di piastrine chepuò essere ottenuto è insufficiente per turbidimetria. Tuttavia, il vantaggio generale di turbidimetria è che consente un'analisi dettagliata della reattività piastrinica, quali i cambiamenti di forma e di disaggregazione, che non può essere valutata in campioni di sangue intero.
E 'importante rendersi conto che la variazione naturale nell'aggregazione piastrinica umana esiste a causa delle differenze di età, sesso e stile di vita così come lo stato di salute del soggetto la cui funzione piastrinica è contestata 19, 20, 21. Tale variazione naturale può essere dell'ordine del 10-20% nei risultati turbidimetrici, quindi occorre prestare attenzione, durante l'esecuzione e l'interpretazione di questi esperimenti, ad ottenere piastrine da un numero sufficiente di volontari sani non imparentati per consentire statistiche affidabili. Questa limitazione è tuttavia controbilanciato dal fatto che le misurazioni turbidimetrici sono altamente riproducibili, almeno quando aggregazionele procedure sono ben standardizzati attraverso laboratori. Gli sforzi di standardizzazione sono stati fatti dalla Società Internazionale di Trombosi ed Emostasi 22. Per questo motivo, turbidimetria è ancora il test più comunemente incontrati per la misura dell'aggregazione piastrinica in entrambi i laboratori di scienza di base e clinica e rimane una tecnica di scelta per studiare l'effetto dei farmaci sulle risposte piastrinica.
Nel presente studio abbiamo dimostrato, mediante turbidimetria per misurare le risposte in piastrine umane lavate, che un colorante alimentare usato comunemente blu brillante FCF colpisce l'aggregazione piastrinica. Studi elettrofisiologici eleganti hanno rivelato un blocco specifico di canali Panx1 da questo colorante 9, 23. Infatti, elevate concentrazioni (1 mM) di questo colorante hanno mostrato effetti inibitori sulla sia il cambiamento di forma indotta da collagene e aggregazione massima ma 10 volte concentrazioni più basse (100 uM)del colorante non ha influenzato la risposta aggregazione piastrinica. Secondo il parere scientifico sulla nuova valutazione del Blu Brillante FCF (E133) come additivo alimentare, pubblicato dalla European Food Safety Authority 24, la concentrazione massima consentita di Blu Brillante FCF (peso molecolare = 792,84 g / mol) è 500 mg / kg di alimenti. Per H 2 O, questo corrisponderebbe a 0,63 mM, che è una concentrazione 1,59 volte inferiore a quella inibire l'aggregazione piastrinica indotta da collagene nei nostri esperimenti. Partendo dal presupposto che solo una piccola frazione del colorante sarà assorbito nell'intestino dopo l'ingestione orale, e che il colorante sarà finalmente essere diluito nel volume 5-L di sangue di una persona adulta, l'assunzione giornaliera di questo colorante alimentare blu probabilmente ha di superare ampiamente i livelli normali prima di eventuali effetti collaterali sull'aggregazione piastrinica potrebbe essere anticipato. Possibili effetti collaterali della più alta concentrazione del colorante nei nostri esperimenti sulla vitalità delle piastrine, per esempio, sono statiesclusi dalla presenza di risposte di aggregazione solidi ad un altro agonista (AA). Queste risposte AA inalterati anche confermato che gli effetti inibitori di blu brillante FCF sembrano riguardare specificamente la via di segnalazione collagene. Questo è in linea con il nostro studio precedente 7 specificando il luogo specifico per il rilascio di ATP attraverso canali Panx1 nella risposta piastrinica indotta dal collagene.
Adattando il protocollo di isolamento piastrine lavate a questo studio, si descrive un metodo semplice e diretto per isolare le piastrine da sangue umano. Dopo vari stadi di lavaggio eseguiti essenzialmente mediante centrifugazione, le piastrine sono risospese in un mezzo che rispetti le condizioni precise fisiologici come pH, temperatura di funzionamento e la concentrazione di ioni bivalenti ma assicura l'assenza di proteine plasmatiche. Questo è un vantaggio di questa tecnica rispetto a metodi alternativi come gel filtrazione in cui eliminazione dei compon plasmaEnt non si verifica 25.
Tutte le fasi del procedimento di lavaggio sono di importanza cruciale per ottenere risultati riproducibili quando si usano piastrine lavate. Una pletora di farmaci possono influenzare la reattività piastrinica, quindi è essenziale che i volontari sani sono invitati a non prendere alcun farmaco per almeno 10 giorni precedenti la raccolta del sangue. Inoltre, la raccolta di sangue richiede che si presti attenzione per evitare traumi vena o flusso troppo lento come puo causare la generazione di trombina e successiva attivazione piastrinica 22. Sulla stessa linea, potenziale attivazione piastrinica durante le fasi di centrifugazione e lavaggio può essere evitato l'uso ripetuto di PGI 2. Grazie alla sua bassa stabilità, PGI 2 deve essere aggiunto ad ogni fase di lavaggio immediatamente prima di ogni centrifugazione. Risospensione delle piastrine nel buffer TA (a pH fisiologico) contenente apyrase assicura che le risposte piastriniche rimangonointatto. La presenza di apyrase nella sospensione di piastrine è essenziale per permettere la degradazione di ATP e ADP al fine di preservare le piastrine da una desensibilizzazione dei recettori purinergici. Come Panx1 via di segnalazione comporta P2X1 recettore attivazione in piastrine umane su attivazione del recettore collagene, abbiamo aggiunto una concentrazione relativamente alta di apyrase (0,32 U / mL) alla sospensione di piastrine per evitare P2X1 desensibilizzazione 7. Per evitare densensitization di altri recettori purinergici in piastrine, concentrazioni inferiori di apyrase sarebbero sufficienti 10.
Sebbene il procedimento di centrifugazione e lavaggi seriali passaggi sono laborioso e richiede più tempo, le piastrine lavate ottenuti usando questo protocollo offrire il vantaggio di una maggiore stabilità a 37 ° C (5-8 h) rispetto alle piastrine utilizzati direttamente dal PRP (1 -3 h). cau Tuttavia, la scelta di utilizzare PRP o piastrine lavate dovrebbero esseretiously e dovrebbe includere considerazioni come la quantità di sangue disponibile per l'esperimento, l'agonista da utilizzare, così come la questione che verrà affrontata. Ad esempio, come legame del fibrinogeno al attivati α2β3 integrine è il meccanismo principale mediare l'aggregazione piastrinica, assenza di fibrinogeno in piastrine lavate possono influenzare la reazione; in particolare, quando si utilizzano agonisti deboli (come ADP) 13. Questo problema è meno critica quando un potente agonista viene utilizzato, come trombina o collagene, che sono di per sé in grado di indurre il rilascio di fibrinogeno da a-granuli. Ancora, noi routine aggiunge fibrinogeno esogeno alla sospensione lavata piastrine umane al fine di aumentare l'ampiezza della risposta di aggregazione indotta da collagene.
In conclusione, utilizzando umano lavato piastrine e turbidimetria, abbiamo trovato che il colorante alimentare blu brillante FCF, attraverso i suoi effetti inibitori sulla Panx1, rappresentaun potenziale inibitore della funzionalità piastrinica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Fondo nazionale svizzero (310030_162579 / 1 a Brenda Renata Kwak e 320030_144150 Pierre Fontana), così come da una sovvenzione della Fondazione svizzera Cuore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
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