Summary
Vi beskriver en grei metode for isolering av vaskede blodplater fra humant blod, etterfulgt av agonist-indusert blodplateaggregasjon målinger ved hjelp av turbidimetri. Som et eksempel kan vi anvende denne metode for å studere aggregeringsrespons av humane blodplater til kollagen etter en forinkubering med Pannexin1 kanal inhibitoren Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetri er en laboratorieteknikk som brukes for å måle aggregering av blodplatene suspendert i enten plasma (blodplaterikt plasma, PRP) eller i buffer (vaskede blodplater), ved anvendelse av en eller en kombinasjon av agonister. Bruken av vaskede blodplater separert fra sitt plasma miljø og i fravær av antikoagulanter gir mulighet for å studere indre plateegenskaper. Blant de stort panel av agonister, arakidonsyre (AA), adenosin-di-fosfat (ADP), trombin og kollagen er den mest brukte. Aggregeringen respons kvantifiseres ved å måle den relative optiske tetthet (OD) over tid av blodplatesuspensjonen under kontinuerlig omrøring. Blodplater i homogen suspensjon begrense passasjen av lys etter tilsats av en agonist, oppstår blodplate-formendring som produserer en liten forbigående økning i OD. Efter denne innledende aktiveringstrinn, blodplateklumper danner gradvis, slik at passasje av lys gjennom suspensjonen som en result av redusert OD. Aggregeringen prosessen er til syvende og sist uttrykt som en prosentandel i forhold til OD for blodplatefattig plasma eller buffer. Streng kalibrering er således vesentlig ved begynnelsen av hvert forsøk. Som en generell regel: kalibrering til 0% er angitt ved måling av OD av en ikke-stimulert blodplate-suspensjonen under måling av OD av suspensjonsmedium som ikke inneholder noen blodplater representerer en verdi på 100%. Blodplateaggregering vanligvis visualiseres som en sanntids aggregering kurve. Turbidimetri er en av de mest brukte laboratorieteknikker for undersøkelse av blodplatefunksjon og er ansett som den historiske gullstandarden og som brukes for utvikling av nye farmasøytiske midler som tar sikte på å inhibere blodplate-aggregering. Her beskriver vi detaljerte protokoller for 1) Fremstilling av humane vaskede blodplater og 2) turbidimetrisk analyse av kollagenfremkalt aggregering av humane vaskede blodplater forbehandlet med maten fargestoff Brilliant Blue FCF som var nylig idenserte som en inhibitor av Pannexin1 (Panx1) kanaler.
Introduction
Blodplater er viktige komponenter i blodet, og deres hovedfunksjon-sammen med koagulasjonsfaktorer-er for å stoppe blødning etter blodkarskade. Blodplater er små (2-3 mm) anuclear fragmenter avledet fra megakaryocytter i benmargen 1. Blodplater sirkulere i ikke-aktivert tilstand, i løpet av hvilken de fremstår som linseformede strukturer. Ved avbrytelse av endotelet, blodplater samles til stedet for blod karskade å plugge igjen hullet, en prosess som kalles primær hemostase. Til å begynne med, blodplater fester seg til sub-endotel-molekyler, slik som kollagen og von Willebrand faktor, som er eksponert som et resultat av skaden-adhesjon trinn 2. Deretter ble de endrer form og skiller kjemiske budbringere-aktiveringstrinn. Til slutt, de er koblet til hverandre ved å bygge bro reseptorer-aggregering trinn. Primære hemostase er etterfulgt av en sekundær prosess som involverer aktivering av koagulasjonskaskaden med fibrinavsetning, som stabiliserers den innledende tromben 2.
Akutte iskemiske hendelser slik som myokardialt infarkt tre ofte et resultat av tromber som dannes på grunn av fysisk forstyrrelse (ruptur) av et aterosklerotisk plakk. Nåværende platehemmende legemidler er hjørnesteinen i behandling av denne utbredt sykdom, men deres klinisk nytte er begrenset av en økt risiko for blødning. De mest foreskrevne medikamenter i kardiovaskulære pasienter, aspirin og anti-P2Y12-forbindelser, målrette tromboksan A2 og ADP trasé 4, henholdsvis, som er de viktigste reaksjonsveier som fører til blodplateaktivering. Men er nyskapende forskning mot nye mål som ville optimalt balansere antitrombotiske effekter og haemorragic risiko fortsatt nødvendig.
Fra 1960-tallet 5 til i dag, har turbidimetrisk aggregometribuffer spilt en avgjørende rolle i forskning, styrke vår kunnskap om plate reaktivitet og jegn overvåking av styrken av anti-trombotiske reagenser hos mennesker. Turbidimetri ble først påført på PRP utvunnet fra blodprøver. Faktisk, blodoppsamlings utført i rør inneholdende citrat tillater rask og stor produksjon av PRP uten å ha noen effekt på blodplate integritet og funksjon. Imidlertid er den kortvarige stabilitet (ca. 3 timer) av PRP og de gjenværende plasmatiske enzymer, slik som trombin, og den lave kalsiumkonsentrasjonen forbundet med potensielt arte aggregering profiler er av vesentlig ulempe for bruk av PRP. Et viktig steg fremover har vært utviklingen av en metode for blodplate isolasjon med ytterligere sentrifugering og vasking trinn 6. Kort sagt, blir PRP isolert fra fullblod oppsamlet på syre-citrat-dextrose (ACD), og blodplater blir isolert etter seriesentrifugeringstrinn før de ble resuspendert i et iso-osmotisk fosfatbuffer (Tyrodes buffer) inneholdende glukose, humant serumalbumin og toverdig casjon (Ca2 + og Mg2 +). For å unngå endringer i blodplatene, blir pH i Tyrodes buffer omhyggelig holdt ved 7,35 til 7,4. Videre er uønsket aktivering av blodplater forhindres ved å tilsette prostacyklin (PGI2) før noen sentrifugeringstrinn. Endelig gjør tilsetning av apyrase forhindrer vaskede blodplater fra å bli motstandsdyktig mot virkningen av ATP / ADP. Den resulterende blodplatesuspensjonen mangler koagulerende faktorer, og stabiliteten av blodplater blir øket med minst to-ganger sammenlignet med PRP-løsninger. I tillegg er det faktum at blodplater ikke er virksomme, men intakte garanterer reproduserbarheten av turbidimetriske målinger og gir mulighet til å studere virkningen av agonister eller antagonister for blodplate-aggregering på en optimal måte.
Ved hjelp av denne metode, har vi vist i en nylig undersøkelse at hemming av dannelsen av Panx1 kanaler ved hjelp av en genetisk metode (knock-out mus) eller avtagende Panx1 kanal aktivitet av farmakologisknærmer redusert collagen-indusert blodplate-aggregering 7. Panx1 danner ATP-frigjøringskanaler, som er ubikvitært uttrykt i mange celletyper, inkludert humane blodplater 7, 8. Faktisk viste vi ved turbidimetri på humane vaskede blodplater som en 7 min forhåndsinkubering med et panel av mer eller mindre bestemte kjemiske blokkere (probenecid, meflokin og 10 Panx1 peptider) før tilsetning av forskjellige agonister, hemmet spesielt kollagen-indusert blodplateaggregasjon mens blodplate responser til AA og ADP ikke ble påvirket. Vi demonstrerte at ATP-frigjøring ved Panx1 kanaler griper spesifikt i GPVI signalveien som fører til kollagen-indusert aggregering. Interessant, multiple FDA-godkjente forbindelser med anvendelser innenfor andre sykdommer (probenecid, meflokin) påvirke aktiviteten til Panx1 kanaler i blodplater. På den ene siden åpner dette nye terapeutiske perspektiver å velgeively modifisere blodplatene. På den annen side bør man vurdere potensielle sekundære virkninger av disse forbindelser. I denne sammenheng er sikker mat fargestoff Brilliant Blue FCF brukes i flere godteri og energidrikker har blitt beskrevet som en selektiv inhibitor for Panx1 9. Vi beskriver her en protokoll for isoleringen av humane vaskede blodplater og turbidimetriske målinger av blodplate-aggregering tilpasset for å undersøke effekten av den Brilliant Blue FCF fargestoff som en antagonist for blodplate-aggregering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fem ubeslektede friske frivillige ble rekruttert for blodprøvetaking for blodplate isolerings- og aggregering tester. Skriftlig informert samtykke ble innhentet og protokollen ble godkjent av sentral Ethics Committee av Genève universitetssykehusene. Alle frivillige sertifisert for å være sunn og har ikke tatt noen blodplate-forstyrrende stoffer i løpet av minst de 10 dagene før forsøkene.
1. Buffer Forberedelse for Human Blood Collection og vasket Platelet Isolering
- Fremstill en 100 ml vandig oppløsning av syre-citrat-dextrose (ACD) ved å løse opp 1,4 g sitronsyre-monohydrat (C 6 H 8 O 7 • H 2O, 66,6 mM), 2,5 g trinatriumcitrat-dihydrat (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H2O, 85 mM) og 2 g vannfritt D (+) - glukose. PH-verdien i oppløsningen er 4,5.
- Forbered lagerløsninger for Tyrodes buffer som følger
- Fremstill en stamløsning ved å oppløse 80 g NaCl, 2 g KCl, 10 g NaHCO3, og 0,58 g NaH 2PO 4 * H 2 O i 500 ml destillert H2O De respektive endelige konsentrasjoner er 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM og 8,4 mM. Hold oppløsningen ved 4 ° C.
- Fremstill stamløsning 2 ved å oppløse 10,15 g MgCl2 * 6 H2O (100 mM) i 500 ml destillert H2O Hold oppløsningen ved 4 ° C.
- Fremstill stamløsning 3 ved å oppløse 10,95 g (100 mM), CaCl2 * 6 H2O i 500 ml destillert H2O Hold oppløsningen ved 4 ° C.
- Forbered Tyrodes buffer ved fortynning av 2,5 ml av stamoppløsning 1 i et sluttvolum på 50 ml med destillert H2O Dette svarer til sluttkonsentrasjoner på 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3 og 0,42 mM NaH 2PO 4 * H2O Juster pH til 7,35 og sterilisere ved filtrering med 0,22 um ffiltere.
- Forbered Tyrodes albumin 0,35% buffer (TA-buffer 7) ved å fortynne 5 ml stamløsning 1, 1 ml av stamløsning 2, 2 ml stamløsning 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml av 200 g / l humant serumalbumin og 0,1 g vannfritt D (+) - glukose i et sluttvolum på 100 ml destillert H2O
- Juster pH-verdien til 7,35 med IN HC1 og satt osmolariteten til 295 mOsm / liter ved tilsetning av destillert H2O (10% av totalvolumet). Sluttkonsentrasjoner i denne oppløsning er: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO 3, 0,38 mM NaH 2PO 4 * H2O, 0,91 mM MgCl2 * 6 H2O, 1,82 mM CaCl2 * 6 H 2 O . Hold TA-buffer ved 37 ° C under hele forsøket.
2. Blodprøvetaking
- Samle 45-50 ml venøst blod, fra antecubital vene ved hjelp av en 19 G nål og ingen eller lav tilstrammende, i 50 ml rør conholdende ACD antikoaguleringsmiddel (1 volum ACD til 6 volumer av blod). Kast den første 1-2 ml blod for å unngå tilstedeværelse av trombin og vevsfaktor.
- Etter oppsamling, blandes blodet med ACD ved forsiktig å vende røret. Inkuber prøven i 10 minutter ved 37 ° C.
3. Fremstilling av humane vaskede blodplater
- Forvarm sentrifugen til 37 ° C. Alle sentrifugeringstrinn under blir utført ved denne temperaturen.
- Sende den oppsamlede blod inn i 15 ml rør (5 ml per rør) og sentrifuger ved 250 xg i 13 min for å oppnå PRP.
MERK: Dette sentrifugeringstrinn resulterer i produksjon av tre lag i prøven: 1) Det øvre lag, bestående av plasma, blodplater, og en liten fraksjon av hvite blodceller. 2) Det mellomliggende laget, en del rik på hvite blodlegemer. 3) Det nederste lag, som i det vesentlige består av røde blodceller. - Samle opp PRP ved pipettering den øvre layer forsiktig inn i en ny 15 ml tube maksimalt å forhindre forurensning med røde og hvite blodlegemer, og inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Sentrifuger av PRP ved 2200 x g i 12 min (for 5 ml PRP).
MERK: Dette sentrifugeringstrinn bør utføres med en lav bremse eller uten brems. - Fjern supernatanten (blodplatefattig plasma), og forsiktig resuspender pelleten med 10 ml av TA-buffer inneholdende 2 pl / ml heparin (5000 U / ml) og 2,5 pl / ml 25 uM PGI 2 ved hjelp av en plast Pasteur-pipette. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Legg 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 og sentrifuger i 8 minutter ved 1900 x g (med lav bremse eller uten brems).
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten med 5 ml TA-buffer inneholdende 2,5 ul / ml 25 uM PGI 2 ved hjelp av en plast Pasteur-pipette. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- I løpet av inkubasjonsperioden Pipetter 150 ul av blodplatesuspensjonen itil et 1,5 ml rør og telle blodplater, ved hjelp av en automatisert celleteller (som detekterer størrelsen av blodceller ved å måle endringer i likestrømsmotstand).
- Etter 10 minutters inkubering, tilsett 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 til blodplatesuspensjon og umiddelbart sentrifuger ved 1900 xg i 8 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten til en konsentrasjon på 250.000 blodplater / pl med et tilstrekkelig volum av TA-buffer (dvs. hvis det celletall er 500 000 per mL, resuspendere i 10 ml TA-buffer) inneholdende 32 pl / ml apyrase på 0,01 U / ml (sluttkonsentrasjon 0,32 U / ml).
MERK: Høy konsentrasjon av apyrase benyttes for å unngå den desensibilisering av P2X1-reseptorer fremkalt av spontane sekresjon av ATP 10, 11 i fravær av agonister. Dette er viktig fordi kollagen-induserte responser indusert ved hurtig parakrin / autokrin aktivering av P2X1 av ATP frigitt from aktiverte blodplater. Dersom blodplatesignalveien ikke kritisk krever preservering av P2X1 funksjon, bruke 0,02 U / ml apyrase. Flere studier (oversikt i Mahaut-Smith et al. 10) viste at 0,02 U / ml apyrase unngår ADP-reseptor P2Y1 desensitivisering med neglisjerbare responser P2X1. - Inkuber cellesuspensjonen i minst 30 minutter ved 37 ° C før utføring av aggregometric målingene. Dette produktet er stabilt i 5 til 8 timer.
4. aggregometribuffer
- Forbered fibrinogen (56 mg / ml) i Tyrodes buffer.
- Pipetter 260 pl blodplatesuspensjon i glass kyvetter (figur 1A, venstre kyvette) inneholdende 10 ul av fibrinogen (56 mg / ml) og en magnetisk rørestav, deretter inkuberes suspensjonen i 2 - 3 minutter ved 37 ° C i ruge brønner som er tilstede i aggregometeret (figur 1B og 1C).
- Pre-inkuber med Panx1inhibitor Brilliant Blue FCF ved tilsetning av 10 ul av en 2,8 mM eller 28 mM stamløsning (sluttkonsentrasjon 100 uM og 1, respektivt mM) i 7 minutter ved 37 ° C.
- Kalibrer aggregometer til en ledende, 100% aggregering verdi ved måling av OD av en kyvette inneholdende 10 ul fibrinogen (56 mg / ml), 10 ul Brilliant Blue FCF (2,8 mM eller 28 mM) og TA-buffer uten blodplater.
- Plasser kyvetten i en aggregering godt under automatisk omrøring og trykker den tilsvarende knapp på tastaturet til datamaskinen koblet til aggregometeret (dvs. trykk F1 hvis aggregering brønn 1 er brukt).
MERK: Dette eksperimentet beskrevet nedenfor omfatter Brilliant Blue FCF. Den benyttes til kalibrering forbindelsen har til å bli justert til den eksperimentelle tilstand.
- Plasser kyvetten i en aggregering godt under automatisk omrøring og trykker den tilsvarende knapp på tastaturet til datamaskinen koblet til aggregometeret (dvs. trykk F1 hvis aggregering brønn 1 er brukt).
- Kalibrer aggregometer til en ledende, 0% aggregering verdi ved anvendelse av den samme blodplate-prøven som vil bli brukt for forsøket i henhold til automatisk stirring.
- Plasser kyvetten i samlings brønn og trykker den tilsvarende knapp på tastaturet til datamaskinen koblet til aggregometeret. Vent i ca 20-30 s før du fortsetter. Denne forsinkelse tjener til å sikre at ingen aggregering skjer før tilsetning av agonistene.
MERK: Som et hvilket som helst forskjell i antall blodplater, kan ha en effekt på den målte OD, må kalibreringstrinnet 0% for å bli gjentatt for hver enkelt måling.
- Plasser kyvetten i samlings brønn og trykker den tilsvarende knapp på tastaturet til datamaskinen koblet til aggregometeret. Vent i ca 20-30 s før du fortsetter. Denne forsinkelse tjener til å sikre at ingen aggregering skjer før tilsetning av agonistene.
- Tilsett 20 mL av ønsket agonist, som for eksempel 15 pg / ml kollagen (1 pg / ml sluttkonsentrasjon) eller 1,125 mM arakidonsyre (75 mM endelig) i kyvetten. starter umiddelbart opptaket under kontinuerlig omrøring automatisk ved å trykke på den tilsvarende knapp på tastaturet til datamaskinen koblet til aggregometeret.
MERK: tilsetning av agonisten induserer plateaktivering. Plateaggregater kan tydelig skjelnes i glasskyvette ved slutten av eksperimentet (figur 1A; høt kyvette). - Opptaket stopper automatisk etter 6 min. På dette punktet, lagre dataene ved å klikke på lagre ikonet for datamaskinen.
MERK: beregning av graden av aggregering blir utført av en datamaskin, som uttrykker slutten resultatene av aggregeringen prosessen som en prosentandel. - Analysere dataene.
- For ytterligere omfattende informasjon om protokoller for fremstilling av vaskede blodplater suspensjoner og turbidimetriske målinger av blodplate-aggregering, se andre papirer forfattet av eksperter på området 12, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aggregometeret programvare frembringer automatisk aggregasjonskurver og gir verdiene for maksimal aggregering i prosent. Verdiene kan kopieres til et dataanalyse-programvare for å utføre statistisk analyse og visual maksimale aggregering verdier i form av stolpediagrammer. Eventuelt kan hvert enkelt punkt av de aggregasjonskurver eksporteres suksessivt inn i en regnearkprogram og deretter til statistisk programvare (f.eks GraphPad) for å visual kurvene. Noen forskere bruker den maksimale helling av aggregasjonskurven beregne hastigheten og arealet under kurven for å vurdere blodplateaktivitet. Forsinkelsestiden og formforandring kan også visualiseres grafisk.
Et typisk eksempel på en kurve aggregering av vaskede humane blodplater under kontroll betingelser (H2 O) er vist i figur 2A. Tilsetting av engonist (kollagen), fremkalt (etter en kort forsinkelse) en depresjon i aggregasjonskurven forårsaket av formendring av blodplatene. Deretter ble den prosentvise aggregering av gradvis økt over tid inntil en maksimal verdi nådd ved omtrent 3-4 min. En liten reduksjon i andelen av aggregering ble observert mot slutten av den 6 min opptak, noe som gjenspeiler noe dekomponering. Som vist i figur 2A-B, vasket preinkubering humane blodplater med Panx1 kanal inhibitoren Brilliant Blue FCF, ved en konsentrasjon på 1 mM, bremset ned eller fullstendig opphevet den innledende blodplatenes form og sperret kollagenfremkalt aggregering av vaskede blodplater oppnådd fra 5 forskjellige urelaterte friske frivillige. Når blodplater hvor preinkubert med en lavere konsentrasjon (100 uM) av Brilliant Blue FCF, ble den inhiberende virkning av fargestoffet på kollagen-induserte responser og formforandring ikke lenger ble observert (se figur 2A for et eksempel). Quantification av blodplateaggregasjonen responsene som induseres av 1 ug / ml kollagen viste at 1 mM Brilliant Blue FCF betydelig redusert maksimale aggregering respons, sammenlignet med kontrollbetingelser, så vel som til en lavere konsentrasjon (100 uM) av Panx1 inhibitor (figur 2C). Inhibering av blodplate-aggregering ble bestemt for kollagen-induserte responser og ikke på grunn av uønskede bivirkninger av Brilliant Blue FCF (på cellenes levedyktighet, for eksempel) som den samme konsentrasjon av fargestoff (1 mM) påvirket ikke aggregering indusert av en annen agonist, dvs. 75 M AA, som vist i figur 2D. Disse resultater bekrefter den spesifikke rollen Panx1 kanaler i kollagen-indusert aggregasjon av humane blodplater responser som vi og andre har tidligere vist sammen med andre farmakologiske inhibitorer av Panx1 såsom probene-cid, meflokin, og de spesifikke 10 Panx1 peptider 7, 8.
Figur 1: aggregometribuffer. (A) som er representativt bilde av glass kyvetter (inneholdende en røremagnet) som brukes for aggregometribuffer. Kuvetten til venstre viser hvilende plater mens kuvetten til høyre illustrerer plateaggregater etter kollagen-indusert aktivering. (B) som er representativt bilde av en 8-brønn aggregometer for turbidimetriske målinger. Brønnene brukes (stjerne) for å inkubere blodplatesuspensjoner er tilstede i et glass kyvette ved 37 ° C, og de som brukes for målingene (hvit pil), er angitt i C. Trykk her for å vise en større versjon av denne figur.
Figur 2: En høy konsentrasjon av Brilliant Blue FCF blokker blodplateaktivering som respons til kollagen. (A) Representative spor av kollagenfremkalt aggregering av humane vaskede blodplater ble oppnådd fra den samme friske frivillige (V1) under kontrollbetingelser (H 2 O; mørke blå), eller etter 7 min forhåndsinkubering med den Panx1 inhibitor Brilliant Blue FCF ved 1 mM ( lys blå) eller 100 pM (mellom blå farge). Aggregering spor ble registrert i 6 min. (B) Representative spor av kollagenfremkalt aggregering av humane vaskede blodplater ble oppnådd fra 4 friske frivillige (V2-V5) etter 7 min preinkubering med den Panx1 inhibitor Brilliant Blue FCF (1 mM). (C) Kvantifisering av maksimal aggregering responser hos humane vaskede blodplater i henhold til kontrollbetingelser (hvit bar), eller etter 7 min forhåndsinkubering med Brilliant Blue FCF 100 um (grå bar) eller ved 1 mM (sort bar). N = 5. **** P0; 0,0001; ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-test for multiple sammenlignings; Resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (D) Representative spor av AA-indusert aggregasjon av humane vaskede blodplater ble oppnådd fra 5 friske frivillige (V1-V5) etter 7 min preinkubering med den Panx1 inhibitor Brilliant Blue FCF (1 mM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er stor interesse for å finne nye legemidler som er i stand til å modulere blodplatefunksjonen for å forebygge trombose uten å øke risikoen for blødning. For dette formål in vitro laboratorieforsøk som på en pålitelig og reproduserbart kan overvåke aggregering reaksjoner i humane blodplater er absolutt nødvendig. Turbidimetrisk aggregometribuffer er en enkel teknikk for å utføre. Men noen forholdsregler må tas i betraktning. Målingene må utføres under kontinuerlig omrøring som aggregering prosessen er i stor grad avhengig omrøring. Det er også viktig for å holde platene ved en fysiologisk temperatur på 37 ° C for å unngå enhver form for for tidlig aktivering. Preaktivering av blodplater kan også forekomme under fyllingen og vasket blodplater forberedelse, som fører til spontan aggregering. Dermed bør tas forsiktige tiltak under hele prosedyren av blodplate forberedelse.
Turbidimetri er basert on måling av OD av blodplatesuspensjonen. Dette gjør teknikken uegnet for aggregering måling i helt blod på grunn av tilstedeværelsen av røde blodceller. Således kan turbidimetri utføres bare på PRP eller vaskede blodplater isolert fra PRP. Selv lett å håndtere og ganske billig, har turbidimetri blitt anerkjent som ufølsom for tilstedeværelse av mikroaggregater 14, 15. Når mikroaggregater er forventet å være av kritisk viktighet, impedans aggregometribuffer, som måler variasjonen i elektrisk motstand når blodplater seg til en elektrode neddykket i en citrat-behandlet hel blodprøve, er bedre egnet 16. Plateaggregeringsprosessen er også i stor grad avhengig av blodplatetallet i blodplatesuspensjonen 17; flowcytometri brukes til pasienter som lider av trombocytopeni 18, fra hvem det maksimale antallet blodplater somkan oppnås er utilstrekkelig for turbidimetri. Men den generelle fordel ved turbidimetri er at den tillater en detaljert analyse av blodplatene, slik som formendring og disaggregering, som ikke kan vurderes i fullblodsprøver.
Det er viktig å innse at naturlig variasjon i menneskelig blodplateaggregasjon foreligger grunn av forskjeller i alder, kjønn og livsstil samt helse status for faget som platefunksjonen er utfordret 19, 20, 21. En slik naturlig variasjon kan være i størrelsesorden 10-20% i den turbidimetriske utfall, således forsiktighet bør utvises ved utførelse og tolke disse forsøk på å oppnå blodplater fra et tilstrekkelig antall av ubeslektede friske frivillige for å tillate pålitelig statistikk. Denne begrensningen er imidlertid oppveies av det faktum at turbidimetriske målinger er meget reproduserbar, i det minste når aggregeringprosedyrer er godt standardisert på tvers av laboratorier. Standardiseringsarbeid er gjort av International Society for trombose og Hemostase 22. Av denne grunn er turbidimetri fortsatt den mest vanlig fore test for måling av blodplateaggregasjon i både klinisk og grunnleggende laboratorier vitenskap og forblir en teknikk av valget for å studere effekten av legemidler på blodplaterespons.
I den foreliggende undersøkelse har vi vist, ved hjelp av turbidimetri å måle responser i humane vaskede blodplater, at en vanlig brukt mat fargestoff Brilliant Blue FCF påvirker blodplate-aggregering. Elegante elektrofysiologiske studier har vist en spesifikk blokkade av Panx1 kanaler av dette fargestoffet 9, 23. Faktisk høye konsentrasjoner (1 mM) av dette fargestoffet viser hemmende effekter på både kollagen-induserte formendring og maksimal aggregering men 10 ganger lavere konsentrasjoner (100 pM)av fargestoff påvirket ikke blodplateaggregasjonen respons. I henhold til vitenskapelig uttalelse om den revurdering av Brilliant Blue FCF (E133) som et tilsetningsstoff, utgitt av European Food Safety Authority 24, den maksimale tillatte konsentrasjon av Brilliant Blue FCF (molekylvekt = 792,84 g / mol) er 500 mg / kg mat. For H2O, ville dette tilsvare 0,63 mM, som er en 1,59-ganger lavere konsentrasjon enn den inhiberende collagen-indusert blodplateaggregasjon i våre eksperimenter. Forutsatt at bare en liten del av farvestoffet vil bli absorbert i tarmen etter oralt inntak, og at fargestoffet vil til slutt bli fortynnet i 5-liters volum av blod fra en voksen person, har det daglige inntaket av denne blå mat fargestoff sannsynlig til i stor grad overstiger det normale nivå før noen bivirkninger på blodplateaggregering kan bli forventet. Mulige bivirkninger av den høyeste konsentrasjonen av fargestoff i våre forsøk på blodplate levedyktighet, for eksempel, varekskludert av tilstedeværelsen av fast aggregering responser til en annen agonist (AA). Disse upåvirket AA-responser også bekreftet at inhiberende virkninger av Brilliant Blue FCF synes å spesifikt gjelder kollagen signalveien. Dette er på linje med vårt tidligere studium 7 detaljering bestemt sted for ATP-frigjøring ved Panx1 kanaler i den kollageninduserte trombocyttaggregasjon respons.
Ved å tilpasse protokollen vasket blodplate isolasjon til denne studien, beskriver vi en enkel og grei metode for isolering av blodplater fra humant blod. Etter flere vasketrinn utført hovedsakelig ved sentrifugering, blir blodplater resuspenderes i et medium som respekterer nøyaktige fysiologiske tilstander, inkludert pH, arbeidstemperaturen og konsentrasjonen av toverdige ioner, men sikrer fraværet av plasmaproteiner. Dette er en fordel med denne teknikken fremfor alternative metoder slik som gelfiltrering, hvor eliminering av plasma kompentene oppstår ikke 25.
Alle trinnene i vaskeprosedyren er av kritisk viktighet for å oppnå reproduserbare resultater ved bruk av vaskede blodplater. En mengde medikamenter kan påvirke blodplatene, så er det essensielt at de friske frivillige blir bedt om å ikke ta noen medisiner i minst 10 dager før blodoppsamling. I tillegg nødvendiggjør blodoppsamling at det tas hensyn for å unngå vene traumer eller for langsom strømning, da dette kan føre til generering av trombin og påfølgende blodplateaktivering 22. Langs samme linjer kan potensiell blodplateaktivering i løpet av sentrifugering og vasketrinn unngås ved gjentatt bruk av PGI2. På grunn av sin meget lave stabilitet, bør PGI2 tilsettes til hvert vasketrinn umiddelbart før hver sentrifugering. Den suspendering av blodplater i TA-buffer (ved en fysiologisk pH-verdi) som inneholder apyrase sikrer at plate responser forbliintakt. Tilstedeværelsen av apyrase i blodplatesuspensjonen er vesentlig for å tillate nedbrytning av ATP og ADP for å bevare blodplater fra en desensitivisering av deres purinergiske reseptorer. Som Panx1 signalveien innebærer P2X1-reseptor-aktivering i humane blodplater ved kollagen-reseptor-aktivering, tilsatte vi en relativt høy konsentrasjon av apyrase (0,32 U / ml) til den blodplatesuspensjonen for å unngå P2X1 desensitivisering 7. For å unngå densensitization av andre purinergiske reseptorer i blodplater, vil lavere konsentrasjoner av apyrase være tilstrekkelig 10.
Selv om fremgangsmåten i seriesentrifugeringer og vasker måten er arbeidskrevende og krever mer tid, de vaskede blodplatene oppnådd ved anvendelse av denne protokollen gir fordelen av en større stabilitet ved 37 ° C (5-8 timer) sammenlignet med blodplater brukt direkte fra PRP (1 -3 timer). Imidlertid bør valget mellom å bruke PRP eller vaskede blodplater gjøres Caufullt og bør omfatte betraktninger slik som den mengde blod er tilgjengelig for dette eksperimentet ble agonist for å bli brukt, så vel som det spørsmål som vil bli behandlet. For eksempel, som bindingen av fibrinogen til aktiverte α2β3 griner er hovedmekanismen formidling av blodplateaggregering, fravær av fibrinogen i vaskede blodplater som kan influere på reaksjonen; når spesielt svake agonister (så som ADP) brukes 13. Dette problemet er mindre kritisk når en kraftig agonist anvendes, slik som trombin eller kollagen, som er i seg selv i stand til å indusere frigjøring av fibrinogen fra a-granuler. Likevel, vi rutinemessig tilsette et eksogent fibrinogen til den vaskede humane blodplatesuspensjon for å øke amplituden av aggregasjonen indusert ved kollagen.
Som konklusjon, ved anvendelse av humane vaskede blodplater og turbidimetri, har vi funnet at maten fargestoff Brilliant Blue FCF, gjennom sine inhibitoriske effekter på Panx1, representereren potensiell inhibitor av blodplatefunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den sveitsiske National Science Foundation (310030_162579 / 1 til Brenda Renata Kwak og 320030_144150 til Pierre Fontana) samt av en bevilgning fra den sveitsiske Heart Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E.
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
