Summary
Мы опишем простой способ выделения промытых тромбоцитов из человеческой крови с последующим агонист-индуцированной агрегацией тромбоцитов измерений по турбидиметрии. В качестве примера можно применить этот метод для изучения реакции агрегации тромбоцитов человека к коллагену после предварительной инкубации с ингибитором канала Pannexin1 Brilliant Blue FCF.
Abstract
Турбидиметрия является лабораторная методика, которая применяется для измерения агрегацию тромбоцитов, взвешенных в плазме (либо обогащенной тромбоцитами плазмы, PRP) или в буфере (промытых тромбоцитов), с использованием одного или комбинации агонистов. Использование промытых тромбоцитов, выделенные из плазмы их среды и в отсутствии антикоагулянтов позволяет изучать внутренние свойства тромбоцитов. Среди большой панели агонистов, арахидоновых кислот (АА), аденозин-ди-фосфат (АДФ), тромбин и коллаген является наиболее часто используемым. Реакция агрегации количественно путем измерения относительной оптической плотности (OD) с течением времени суспензии тромбоцитов при непрерывном перемешивании. Тромбоциты в гомогенной суспензии ограничивают прохождение света после добавления агониста, тромбоциты происходит изменение формы производить небольшое преходящее увеличение OD. После этой начальной стадии активации, тромбоциты сгустки образуют постепенно, позволяя прохождение света через суспензию в качестве Резаии уменьшенного OD. Процесс агрегации, в конечном счете, выраженное в процентах, по сравнению с наружным диаметром обедненной тромбоцитами плазмы или буфера. Строгие калибровки Таким образом, важны в начале каждого эксперимента. Как общее правило: калибровка до 0% устанавливается путем измерения ОП не-стимулированных суспензии тромбоцитов при измерении оптической плотности суспензии среде, не содержащей тромбоциты представляет значение 100%. агрегации тромбоцитов, как правило, визуализируются в виде кривой агрегации в режиме реального времени. Турбидиметрия является одним из наиболее часто используемых лабораторных методов для исследования функции тромбоцитов и рассматриваются как исторический золотой стандарт и используются для разработки новых фармацевтических средств, направленных на ингибировании агрегации тромбоцитов. Здесь мы описываем подробные протоколы для 1) подготовки человека промывают тромбоциты и 2) турбидиметрический анализ индуцированного коллагена агрегации тромбоцитов человека промытого предварительно обработанные с пищевым красителем Brilliant Blue FCF, который был недавно IDENtified в качестве ингибитора (Panx1) каналов Pannexin1.
Introduction
Тромбоциты являются важнейшими компонентами крови и их основной функции тусовки с коагуляцией факторами, чтобы остановить кровотечение после травмы кровеносных сосудов. Тромбоциты представляют собой небольшие фрагменты (2-3 мкм) безьядерные , полученные из мегакариоцитов костного мозга 1. Тромбоциты циркулируют в неактивированном состоянии, в течение которого они появляются в виде линзовидных структур. После перерыва в эндотелии, тромбоциты собираются в месте повреждения кровеносного сосуда, чтобы заткнуть дыру, процесс, называемый первичный гемостаз. Первоначально, тромбоциты прикрепляются к югу от эндотелиальной молекул, таких как коллаген и фактор фон Виллебранда, которые подвергаются воздействию в результате стадии травмы адгезии 2. Затем, они изменяют форму и секретируют химический шаг мессенджеры-активации. И, наконец, они соединяются друг с другом, соединяя шаг рецепторы-агрегации. Первичный гемостаз с последующим вторичным способом, включающим активацию каскада свертывания с отложением фибрина, которые стабилизируютев первоначальный тромб 2.
Острые ишемические события , такие как инфаркт миокард-часто является результат тромбов , которые формируют из - за физическое разрушение (разрыв) атеросклеротической бляшки. Современные антитромбоцитарные препараты являются краеугольным камнем лечения этого распространенного заболевания, но их клиническая эффективность ограничена повышенным риском кровотечения. Наиболее предписанные лекарства в сердечно - сосудистых больных, аспирин и анти-P2Y12 соединений, целевой тромбоксана А2 и ADP пути 4, соответственно, которые являются основными пути , ведущие к активации тромбоцитов. Тем не менее, инновационные исследования к новым целям, которые будут оптимально сбалансировать антитромботические эффекты и haemorragic риск по-прежнему необходимо.
С 1960 - х лет 5 до сегодняшнего дня, Турбидиметрическая агрегометрия играет важную роль в исследованиях, повышение наших знаний о реактивности тромбоцитов и яп мониторинг активности антитромботических реагентов в организме человека. Турбидиметрия был первоначально применен к PRP, извлеченной из образцов крови. В самом деле, сбор крови проводили в пробирки, содержащие цитрат позволяет быстро и большое производство PRP без какого-либо влияния на целостность тромбоцитов и функции. Тем не менее, кратковременная стабильность (около 3 ч) ПОТА, а остальные плазматических ферменты, таких как тромбин, и низкая концентрация кальция, связанная с потенциально артефактным профилей агрегации имеют большое неудобство для использования PRP. Важный шаг вперед стал разработкой методы для выделения тромбоцитов с дополнительным центрифугированием и промывкой шаги 6. Короче говоря, ПРП выделяют из цельной крови, собранной на кислотно-цитрат-декстроза (ACD) и тромбоциты выдел ют после стадий последовательного центрифугирования перед тем, как снова суспендируют в изо-осмотического фосфатного буфера (буфера Тирода), содержащей глюкозу, сывороточный альбумин человека и двухвалентной сations (Ca 2+ и Mg 2+). Для того, чтобы избежать изменений в реактивности тромбоцитов, рН буфера Тироды тщательно хранятся в 7.35-7.4. Кроме того, нежелательная активация тромбоцитов предотвращаются путем добавления простациклина (PGI 2) , прежде чем несколько шагов центрифугирования. Наконец, добавление апиразы предотвращает промытые тромбоциты стать устойчивыми к действию АТФ / АДФ. Полученную суспензию тромбоцитов не хватает коагулянта факторов и стабильность тромбоцитов увеличивается, по меньшей мере, в два раза по сравнению с PRP решений. Кроме того, тот факт, что тромбоциты являются неактивными, но интактным гарантирует, что воспроизводимость измерений турбидиметрических и обеспечивает возможность изучить действие агонистов или антагонистов агрегации тромбоцитов оптимальным образа.
С помощью этого метода, мы показали в недавнем исследовании, что ингибирования образования Panx1 каналов с помощью генетического подхода (нокаут-мыши) или уменьшение активности канала Panx1 фармакологическогоподходы уменьшенных индуцированного коллагена агрегации тромбоцитов 7. Panx1 формирует АТФ-релиз каналы, которые экспрессируются во многих типах клеток , в том числе тромбоцитов человека 7, 8. На самом деле, мы продемонстрировали турбидиметрии на человеческом промывают тромбоциты , что 7 мин инкубация с группой более или менее специфических химических блокаторов (пробенецид, мефлокина и 10 Panx1 пептидов) перед добавлением различных агонистов, ингибирует специфический коллаген-индуцированная агрегации тромбоцитов, а тромбоциты ответы на АА и АДФ не были затронуты. Мы показали, что высвобождение АТФ через Panx1 каналы специфически вмешивается в сигнальной GPVI пути, ведущего к индуцированной коллагеном агрегации. Интересно, что несколько FDA утвержденного соединения с приложениями в других заболеваниях (пробенецид, мефлокина) влияет на активности Panx1 каналов в тромбоцитах. С одной стороны, это открывает новые терапевтические перспективы для выбораively изменение реактивности тромбоцитов. С другой стороны, следует учитывать возможные побочные эффекты этих соединений. В этом контексте, безопасный пищевой краситель Brilliant Blue FCF используется в нескольких конфетами и энергетических напитков был описан как селективный ингибитор Panx1 9. Здесь мы опишем протокол для выделения человеческих тромбоцитов и промывают турбидиметрическое измерение агрегации тромбоцитов адаптированы для исследования влияния Brilliant Голубого красителя FCF в качестве антагониста агрегации тромбоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пять неродственных здоровых добровольцев были набраны для забора крови для выделения тромбоцитов и агрегации тестов. Письменное информированное согласие было получено, и протокол был утвержден Центральный комитет по этике из Женевского университета Больницы мимо. Все добровольцы сертифицирован, чтобы быть здоровыми и не принимали никаких пластинчатых мешая препараты в течение по крайней мере 10 дней, предшествующих эксперименты.
1. Буфер Подготовка к коллекции крови человека и Промывают тромбоциты Изоляция
- Приготовьте водный раствор 100 мл кислоты-цитрат-декстроза (ACD) путем растворения моногидрата 1,4 г лимонной кислоты (С 6 Н 8 О 7 • H 2 O, 66,6 мМ), 2,5 г дигидрата тринатрийцитрата (Na 3 С 6 Н 5 O 7 • 2 Н 2 о, 85 мМ) и 2 г безводного D (+) - глюкозы. РН раствора составляет примерно 4,5.
- Готовим растворы для буфера Тироды следующим образом
- Подготовка исходного раствора 1 путем растворения 80 г NaCl, 2 г KCl, 10 г NaHCO 3 и 0,58 г NaH 2 PO 4 * Н в 500 мл дистиллированной H 2 O. 2 O Соответствующие конечные концентрации 2,73 М, 53,6 мМ, 238 мМ и 8,4 мМ. Хранить раствор при температуре 4 ° С.
- Подготовка исходного раствора 2, растворяя 10,15 г MgCl 2 * 6 H 2 O (100 мМ) в 500 мл дистиллированной H 2 O. Keep раствор при температуре 4 ° С.
- Подготовка исходного раствора 3 путем растворения 10,95 г (100 мМ) CaCl 2 * 6 H 2 O в 500 мл дистиллированной H 2 O. Хранить раствор при температуре 4 ° С.
- Готовлю буфер Тироды путем разбавления 2,5 мл исходного раствора 1 в конечном объеме 50 мл дистиллированной H 2 O. Это соответствует конечной концентрации 136,5 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, 11,9 мМ NaHCO 3 и 0,42 мМ NaH 2 PO 4 * H 2 O. Доводят рН до 7,35 и стерилизуют путем фильтрации с 0,22-мкм Filters.
- Приготовьте альбумин 0,35% буфер Тироды (ТОТ буфер 7) путем разбавления 5 мл исходного раствор 1, 1 мл исходного раствора 2, 2 мл исходного раствора 3, 0,5 мл 1 М HEPES, 1,8 мл 200 г / л сывороточного альбумина человека и 0,1 г безводного D (+) - глюкозы в конечном объеме 100 мл дистиллированной Н 2 О.
- Доводят рН до 7,35 с помощью 1N HCl и установить осмолярности до 295 мОсм / л добавлением дистиллированной H 2 O (10% от общего объема). Конечные концентрации в этом растворе: 124 мМ NaCl, 2,44 мМ KCl, 10,82 мМ NaHCO 3, 0,38 мМ NaH 2 PO 4 * H 2 O, 0,91 мМ MgCl 2 * 6 H 2 O, 1,82 мМ CaCl 2 * 6 H 2 O . Хранить TA буфер при 37 ° с в течение всего эксперимента.
Коллекция 2. Кровь
- Сбор 45-50 мл венозной крови из локтевой вены , используя иглу 19 G и отсутствие или низкий турникета, в 50 мл пробирки конTaining ДС антикоагулянта (1 объем ДС 6 объемов крови). Выбросьте первые 1-2 мл крови, чтобы избежать присутствия тромбина и тканевого фактора.
- После сбора, смешать кровь с ДС, осторожно переворачивая пробирку. Инкубируйте образец в течение 10 мин при 37 ° С.
3. Подготовка человеческих промытые тромбоциты
- Предварительно нагреть центрифугу до 37 ° C. Все стадии центрифугирования ниже, выполняются при этой температуре.
- Отправка собранной крови в 15 мл пробирки (5 мл на пробирку) и центрифуге при 250 мкг в течение 13 мин, чтобы получить PRP.
Примечание: Этот шаг центрифугирования приводит к получению трех слоев в образце: 1) верхний слой, состоящий из плазмы, тромбоцитов, и малая доля белых кровяных клеток. 2) промежуточный слой, часть богатой белых кровяных клеток. 3) нижний слой, который по существу состоит из красных кровяных клеток. - Соберите PRP пипетки верхней LAЕр тщательно в новую 15 мл трубки, чтобы максимально предотвратить загрязнение красных и белых кровяных клеток, и инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
- Центрифуга PRP при 2200 х г в течение 12 мин (в течение 5 мл PRP).
Примечание: Этот шаг центрифугирования должен быть выполнен с низким тормозом или без тормоза. - Удалить супернатант (обедненную тромбоцитами плазмы), и тщательно ресуспендируют осадок с 10 мл TA - буфера , содержащего 2 мкл / мл гепарина (5000 ед / мл) и 2,5 мкл / мл 25 мкМ PGI 2 с использованием пластиковых Пастера пипетку. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
- Добавить 2,5 мкл / мл 25 мкМ PGI 2 и центрифуги в течение 8 мин при 1900 х г (с низким тормозом или без тормоза).
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок с 5 мл буфера , содержащего TA 2,5 мкл / мл 25 мкМ PGI 2 с помощью пластиковой пипетки Пастера. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
- В течение инкубационного периода, пипеткой 150 мкл суспензии тромбоцитов вв 1,5 мл трубки и подсчет тромбоцитов, используя автоматизированный счетчик клеток (который определяет размер клеток крови путем измерения изменений в постоянном токе сопротивления).
- После 10 - минутной инкубации, добавьте 2,5 мкл / мл 25 мкМ PGI 2 к суспензии тромбоцитов и немедленно центрифугировать при 1900 х г в течение 8 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок до концентрации 250000 тромбоцитов / мкл с адекватным объемом буфера TA (то есть , если количество клеток составляет 500000 в мкл, ресуспендируют в 10 мл TA буфер) , содержащий 32 мкл / мл апиразы при 0,01 U / мл (конечная концентрация 0,32 Ед / мл).
Примечание: Высокая концентрация апиразы используется , чтобы избежать десенситизации рецепторов P2X1 , вызванных спонтанной секреции АТФ 10, 11 в отсутствие агонистов. Это важно, потому что коллаген-индуцированная реакция индуцируется быстрыми паракринным / аутокринные активации P2X1 АТФ выпущена фромы активированных тромбоцитов. Если сигнальный путь тромбоцитов не критично требует сохранения функции P2X1, использовать 0,02 ед / мл апиразы. Несколько исследований (обзор в Mahaut-Smith и др. 10) было показано , что 0,02 Ед / мл апираза избегает АДФ - рецептора P2Y1 десенсибилизации с незначительными ответами P2X1. - Инкубируйте клеточную суспензию в течение по крайней мере 30 мин при 37 ° С перед выполнением aggregometric измерений. Препарат стабилен в течение от 5 до 8 ч.
4. агрегометрия
- Подготовьте фибриноген (56 мг / мл) в буфере Тироды.
- Пипеткой 260 мкл тромбоцитов суспензии в стеклянных кюветах (Фигура 1А, левый кювету) , содержащий 10 мкл фибриногена (56 мг / мл) и магнитный стержень мешалки, а затем инкубируют в суспензии в течение 2 - 3 мин при 37 ° С в инкубационных скважин , присутствующих в агрегометре (рис 1В и 1С).
- Предварительно инкубировать с Panx1ингибитор бриллиантовый синий FCF путем добавления 10 мкл 2,8 мМ или 28 мМ исходного раствора (конечная концентрация 100 мкМ и 1 мМ, соответственно) в течение 7 мин при 37 ° С.
- Откалибруйте агрегометр к предположительной 100% стоимости агрегации пути измерения ОП в кювете , содержащей 10 мкл фибриногена (56 мг / мл), 10 мкл Brilliant Blue FCF (2,8 мМ или 28 мМ) и буфер без TA тромбоцитов.
- Поместите кювету в агрегации а при автоматическом перемешивании и нажать соответствующую кнопку на клавиатуре компьютера , связанный с агрегометром (т.е. нажмите F1 , если агрегации и 1 используется).
Примечание: Этот эксперимент описан ниже, включает бриллиантовый синий FCF. Соединение, используемое для калибровки должно быть скорректировано на экспериментальные условия.
- Поместите кювету в агрегации а при автоматическом перемешивании и нажать соответствующую кнопку на клавиатуре компьютера , связанный с агрегометром (т.е. нажмите F1 , если агрегации и 1 используется).
- Откалибруйте агрегометр к предположительной 0% стоимости агрегации с использованием того же образца тромбоцитов , который будет использоваться для эксперимента при автоматическом stirrinг.
- Поместите кювету в агрегации хорошо и нажать соответствующую кнопку на клавиатуре компьютера, подключенный к агрегометру. Подождите 20-30 секунд, прежде чем продолжить. Эта задержка служит для обеспечения того, чтобы не агрегации не происходит до добавления агонистов.
Примечание: В любое различие в тромбоцитов числа могут иметь влияние на измеренной оптической плотности, 0% шаг калибровки необходимо повторить для каждого отдельного измерения.
- Поместите кювету в агрегации хорошо и нажать соответствующую кнопку на клавиатуре компьютера, подключенный к агрегометру. Подождите 20-30 секунд, прежде чем продолжить. Эта задержка служит для обеспечения того, чтобы не агрегации не происходит до добавления агонистов.
- Добавьте 20 мкл желаемого агониста, например, 15 мкг / мл коллагена (1 мкг / мл) или конечная 1,125 мМ арахидоновой кислоты (75 мкМ конечная), в кювету. Немедленно начать запись при непрерывном автоматическом перемешивании нажатия соответствующей кнопки на клавиатуре компьютера, связанный с агрегометром.
Примечание: Добавление агониста индуцирует активацию тромбоцитов. Тромбоцитарные агрегаты могут четко различать в стеклянной кювете в конце эксперимента (фиг.1О; RIGHт кювета). - Запись автоматически прекращается через 6 мин. На данный момент, сохраните данные, нажав на значок сохранения на компьютере.
Примечание: Расчет скорости агрегации осуществляется с помощью компьютера, который выражает конечные результаты процесса агрегации в процентах. - Анализ данных.
- За дополнительной информацией по обширным протоколам для получения суспензий промытых тромбоцитов и турбидиметрическим измерения агрегации тромбоцитов, см других работ , авторами которых являются специалистами в области 12, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Программное обеспечение агрегометра автоматически производит кривые агрегации и дает значение для максимальной агрегации в процентах. Значения могут быть скопированы на программное обеспечение для анализа данных для выполнения статистического анализа и визуализации максимальных значений агрегации в виде гистограммы. По желанию, каждая отдельная точка кривых агрегации может быть экспортирована последовательно в программное обеспечение электронной таблицы , а затем статистическое программное обеспечение (например , GraphPad) для того , чтобы визуализировать кривые. Некоторые исследователи используют максимальный наклон кривой агрегации, чтобы вычислить скорость и площадь под кривой для оценки активности тромбоцитов. Время задержки и изменения формы также могут быть визуализированы графически.
Типичный пример кривой агрегации промытых тромбоцитов человека в условиях управления (H 2 O) показана на рисунке 2А. Добавление аgonist (коллаген), индуцированного (после короткой задержки) углубление на кривой агрегации, вызванной изменением формы тромбоцитов. Затем был достигнут процент агрегации постепенно увеличивалось с течением времени до тех пор, максимальное значение при температуре около 3-4 мин. Небольшое снижение доли агрегации наблюдались в конце 6 мин записи, которая отражает некоторые дезагрегации. Как показан на фигуру 2A-B, преинкубации люди промывают тромбоциты с ингибитором Panx1 канала Brilliant Blue FCF, при концентрации 1 мМ, замедляется или полностью отменил первоначальное изменение формы тромбоцитов и блокировал индуцированный коллаген агрегации промытых тромбоцитов , полученную из 5 различные неродственные здоровые добровольцы. Когда тромбоциты , где предварительно инкубировали с более низкой концентрацией (100 мкМ) бриллиантовым голубым FCF, ингибирующее действие красителя на коллаген-индуцированной реакций и изменение формы не наблюдалось больше (рис 2A для примера). Quantification ответов агрегации тромбоцитов , индуцированных 1 мкг / мл коллагена показали , что 1 мМ Brilliant Blue FCF значительно снижены максимальные реакции агрегации по сравнению с контрольными условиями, а также к более низкой концентрации (100 мкМ) ингибитора Panx1 (рис 2C). Ингибирование агрегации тромбоцитов было специфическим для коллагена индуцированных реакций, а не из-за нежелательные побочные эффекты бриллиантового голубого FCF (на жизнеспособности клеток, например) в качестве одной и той же концентрации красителя (1 мМ) не влияет на реакцию агрегации, индуцированную другой агонист, т.е. 75 мкМ АА, как показан на фиг.2D. Эти результаты подтверждают специфическую роль Panx1 каналов в индуцированном коллагене агрегации человеческих реакций тромбоцитов , что мы и другие , как показано ранее с другими фармакологическими ингибиторами Panx1 , такие как пробенецид, мефлокина, и конкретные 10 Panx1 пептидов 7, 8,
Рисунок 1: агрегометрии. (А) представитель образ стеклянных кювет (содержащий перемешивающий магнит) , используемая для агрегометрии. Кювета слева показывает отдыхая тромбоциты в то время как на кювету справа иллюстрирует агрегаты тромбоцитов после того, как коллаген-индуцированной активации. (Б) представитель образ агрегометра 8-луночного для турбидиметрических измерений. Лунки используются (звездочка) для инкубации суспензии тромбоцитов , присутствующую в стеклянной кювете при температуре 37 ° C, и те , которые используются для измерений (белая стрелка) указаны в C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: высокая концентрация Brilliant Blue FCF блоков активации тромбоцитов в ответ на коллаген. (А) Характерные следы коллаген-индуцированной агрегации человеческих промытые тромбоциты , полученные из того же здорового добровольца (V1) в условиях управления (H 2 O; темно - синий) или после 7 мин предварительной инкубации с ингибитором Panx1 Brilliant Blue FCF на 1 мМ ( светло-синий) или при 100 мкМ (промежуточный продукт синего цвета). Агрегация следы были записаны в течение 6 мин. (Б) Характерные следы коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов человека промывают , полученные из 4 здоровых добровольцев (V2-V5) после 7 мин предварительной инкубации с ингибитором Panx1 Brilliant Blue FCF (1 мМ). (С) Количественное максимальной ответной реакции агрегации тромбоцитов человека промывали в контрольных условиях (белый бар) или после 7 мин предварительной инкубации с бриллиантовым голубым FCF при 100 мкМ (серый бар) или на 1 мМ (черный бар). N = 5. **** Р0; 0,0001; ANOVA с последующим пост-тест Бонферрони для множественного сравнения; Результаты выражены в виде среднего значения ± SEM. (D) Характерные следы AA-индуцированной агрегации тромбоцитов человека , полученные промывали от 5 здоровых добровольцев (V1-V5) после 7 мин предварительной инкубации с ингибитором Panx1 Brilliant Blue FCF (1 мМ). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует большой интерес к поиску новых препаратов, способных модулировать функцию тромбоцитов, чтобы предотвратить тромбоз не увеличивая риск кровотечения. Для этой цели в пробирке лабораторные тесты , которые могут надежно и воспроизводимо контролировать реакцию агрегации в тромбоцитах человека абсолютно необходимы. Турбидиметрический агрегометрия является простым методом для выполнения. Тем не менее, некоторые меры предосторожности необходимо иметь в виду. Измерения должны быть выполнены при непрерывном перемешивании, поскольку процесс агрегации в значительной степени зависит от перемешивания. Важно также, чтобы держать тромбоциты при физиологической температуре 37 ° С для того, чтобы избежать любого типа преждевременной активации. Предварительная активация тромбоцитов может также произойти во время сбора крови и промытые тромбоциты препарата, что приводит к спонтанной агрегации. Таким образом, тщательные меры должны быть приняты в течение всей процедуры подготовки тромбоцитов.
Турбидиметрия основана оп измерение оптической плотности суспензии тромбоцитов. Это делает метод непригодным для измерения агрегации в цельной крови из-за присутствия красных кровяных клеток. Таким образом, турбидиметрия может быть выполнена только на PRP или промытых тромбоцитов, выделенных из PRP. Хотя легко иметь дело и относительно недороги, турбидиметрия была признана нечувствительны к наличию микроагрегатов 14, 15. Когда Микроагрегаты , как ожидается, иметь решающее значение, Импеданс агрегометрия, который измеряет изменение электрического сопротивления , когда тромбоциты придерживаться электрода , погруженного в цитратной образце цельной крови, лучше всего подходит 16. Процесс агрегации тромбоцитов также в значительной степени зависит от тромбоцитов в суспензии тромбоцитов 17; проточной цитометрии используется у пациентов , страдающих от тромбоцитопении 18, от которого максимальное количество тромбоцитов , чтоможет быть получено недостаточно для турбидиметрии. Тем не менее, общее преимущество турбидиметрии является то, что она позволяет детальный анализ реактивности тромбоцитов, такие как изменение формы и дезагрегация, которые не могут быть оценены в образцах цельной крови.
Важно понимать , что естественная изменчивость агрегации тромбоцитов человека существует из - за различий по возрасту, полу и образа жизни, а также состояния здоровья субъекта , чьи функции тромбоцитов оспаривается 19, 20, 21. Такое естественное отклонение может быть порядка 10-20% в турбидиметрических результатах, таким образом, следует соблюдать осторожность при выполнении и интерпретации этих экспериментов, в получении тромбоцитов, отобранных из достаточного числа неродственных здоровых добровольцев, чтобы позволить надежные статистическим данные. Это ограничение, однако, уравновешиваются тем, что Турбидиметрические измерения высокой воспроизводимости, по крайней мере, когда агрегациипроцедуры хорошо стандартизированы в лабораториях. Усилия по стандартизации были сделаны Международным обществом тромбозов и гемостаза 22. По этой причине, турбидиметрия по-прежнему наиболее часто встречающийся тест для измерения агрегации тромбоцитов в обеих клинических и фундаментальных научных лабораториях и остается метод выбора для изучения влияния препаратов на ответы тромбоцитов.
В настоящем исследовании мы показали, используя турбидиметрия для измерения реакции в человеческих тромбоцитов промывали, что обычно используемый пищевой краситель Brilliant Blue FCF влияет на агрегацию тромбоцитов. Элегантные электрофизиологические исследования показали специфическую блокаду Panx1 каналов с помощью этого красителя 9, 23. Действительно, высокие концентрации (1 мМ) этого красителя показали ингибирующее действие на обоих коллаген-индуцированного изменения формы и максимальной агрегации, но в 10 раз более низкие концентрации (100 мкМ)красителя не влияет на реакцию агрегации тромбоцитов. По данным научного мнения по переоценке бриллиантового голубого FCF (E133) в качестве пищевой добавки, опубликованного Европейского орган по безопасности пищевых продуктов 24, максимальная допустимая концентрация бриллиантового голубого FCF (молекулярная масса = 792,84 г / моль) составляет 500 мг / кг пищи. Для H 2 O, это будет соответствовать 0,63 мМ, который представляет собой 1,59-кратное более низкой концентрации , чем та , ингибирующим агрегацию тромбоцитов , индуцированную коллагеном в наших опытах. Если предположить, что только небольшая часть красителя будет поглощаться в кишечнике после перорального приема внутрь, и что краситель будет, наконец, разводил в объеме 5 л крови взрослого человека, ежедневное потребление этого синего пищевого красителя, вероятно, имеет в значительной степени превышают нормальные уровни, прежде чем какие-либо побочные эффекты на агрегацию тромбоцитов можно ожидать. Возможные побочные эффекты высокой концентрации красителя в наших опытах на жизнеспособность тромбоцитов, например, былиисключено наличием твердых ответов агрегации к другому агонисту (AA). Эти неповрежденные ответы АА также подтвердили, что ингибирующие эффекты бриллиантовым синим FCF, кажется, в частности, включать в себя коллаген сигнального пути. Это в линию с нашей более ранней работе 7 подробно конкретное место для выпуска АТФ через Panx1 каналов в индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов ответ.
По адаптации протокола промытой изоляции тромбоцитов в это исследование мы опишем простой и простой способ для выделения тромбоцитов из человеческой крови. После нескольких стадий промывки проводили в основном путем центрифугирования, тромбоциты ресуспендировали в среде, которая уважает точные физиологические условия, включая рН, рабочую температуру и концентрацию двухвалентных ионов, но гарантирует отсутствие белков плазмы. Это является преимуществом этого метода по сравнению с альтернативными способами, такими как гель-фильтрации, в котором устранение плазмы COMPONЭнты не происходит 25.
Все этапы процедуры промывки имеют решающее значение для получения воспроизводимых результатов при использовании промытых тромбоцитов. Множество препаратов может влиять на реактивность тромбоцитов, таким образом, очень важно, что здоровые добровольцы просят не принимать какие-либо лекарства в течение по крайней мере 10 дней, предшествующих сбору крови. Кроме того, для сбора крови , что требует внимания уделяется , чтобы избежать травмы вены или слишком медленно поток , так как это может привести к генерации тромбина и последующего активации тромбоцитов 22. В том же направлении, потенциал активации тромбоцитов во время центрифугирования , и стадии промывки можно избежать путем повторного использования PGI 2. Из - за его очень низкую стабильность, PGI 2 должен быть добавлен к каждой стадии промывки непосредственно перед каждым центрифугированием. Ресуспендирования тромбоцитов в буфере TA (при физиологическом рН), содержащая апираз гарантирует, что ответы тромбоцитов остаютсянеповрежденными. Наличие апиразы в суспензии тромбоцитов имеет важное значение, чтобы разрешить деградацию АТФ и АДФ в целях сохранения тромбоциты из десенсибилизации их пуринергическими рецепторов. По мере того как Panx1 сигнального пути включает в себя активацию рецептора P2X1 в тромбоцитах человека после активации рецептора коллагена, мы добавили относительно высокую концентрацию апиразы (0,32 ед / мл) к суспензии тромбоцитов во избежание P2X1 десенсибилизации 7. Чтобы избежать densensitization других пуринергических рецепторов тромбоцитов, более низкие концентрации апиразы были бы достаточно 10.
Хотя процедура последовательных центрифугировани и промывных шагов являются трудоемкой и требует больше времени, промытые тромбоциты, полученных с использованием этого протокола предлагают преимущество более высокой стабильности при температуре 37 ° С (5-8 ч) по сравнению с тромбоцитами, используемых непосредственно из PRP (1 -3 ч). Однако выбор использования PRP или Промытые тромбоциты должны быть сделаны Кауосторожно и должны включать в себя факторы, такие как количество крови, доступной для эксперимента, агонист для использования, а также вопрос, который будет решать. Например, как связывание фибриногена с активированными α2β3 интегрин является основным механизмом опосредования агрегации тромбоцитов, отсутствия фибриногена в промытых тромбоцитах могут повлиять на реакцию; в частности, когда слабые агонисты (например, АДФ) используются 13. Эта проблема менее критична, когда используется мощный агонистом, таким как тромбин или коллаген, которые сами по себе способны вызывать высвобождение фибриногена из альфа-гранул. Тем не менее, мы обычно добавляют экзогенный фибриногена в промытой суспензии тромбоцитов человека, с тем, чтобы увеличить амплитуду реакции агрегации, индуцированной коллагеном.
В заключение, с помощью человека промывают тромбоциты и турбидиметрия, мы обнаружили, что пищевой краситель Brilliant Blue FCF, через его тормозящее действие на Panx1, представляет собойпотенциальный ингибитор функции тромбоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Швейцарского Национального научного фонда (310030_162579 / 1 к Бренда Рената Квак и 320030_144150 Пирр Фонтана), а также за счет гранта Швейцарского фонда сердца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
