Summary
Se describe un método sencillo para el aislamiento de plaquetas lavadas a partir de sangre humana seguido por mediciones de la agregación plaquetaria inducida por agonistas por turbidimetría. Como un ejemplo aplicamos este método para estudiar la respuesta de agregación de plaquetas humanas a colágeno después de un pre-incubación con el inhibidor de canales Pannexin1 Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetría es una técnica de laboratorio que se aplica para medir la agregación de plaquetas en suspensión en cualquiera de plasma (plasma rico en plaquetas, PRP) o en tampón (plaquetas lavadas), por el uso de uno o una combinación de agonistas. El uso de plaquetas lavadas separados de su entorno de plasma y en ausencia de anticoagulantes permite estudiar las propiedades de plaquetas intrínsecas. Entre el gran panel de agonistas, ácido araquidónico (AA), adenosina difosfato (ADP), la trombina y colágeno son los más utilizados. La respuesta de agregación se cuantifica midiendo la densidad óptica relativa (OD) con el tiempo de suspensión de plaquetas bajo agitación continua. Las plaquetas en suspensión homogénea limitan el paso de la luz después de la adición de un agonista, el cambio de forma de plaquetas se produce la producción de un pequeño aumento transitorio de la OD. Después de esta etapa de activación inicial, la formación de coágulos de plaquetas forman gradualmente, lo que permite el paso de luz a través de la suspensión como una resULT de la disminución de OD. El proceso de agregación se expresa en última instancia como un porcentaje, en comparación con la OD de plasma o tampón pobre en plaquetas. calibración rigurosa tanto, es esencial al comienzo de cada experimento. Como regla general: calibración a 0% se establece mediante la medición de la DO de una suspensión no estimulada de plaquetas mientras se mide la DO del medio de suspensión que no contiene plaquetas representa un valor de 100%. La agregación plaquetaria es generalmente visualizado como una curva de agregación en tiempo real. Turbidimetría es una de las técnicas de laboratorio más comúnmente utilizados para la investigación de la función plaquetaria y se considera como el estándar de oro histórico y se utiliza para el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos dirigidos a la inhibición de la agregación plaquetaria. A continuación, describimos protocolos detallados para 1) la preparación de plaquetas humanas lavadas y 2) análisis turbidimétrico de la agregación inducida por colágeno de plaquetas humanas lavadas previamente con el colorante alimenticio azul brillante FCF que fue recientemente idenficados como un inhibidor de Pannexin1 canales (Panx1).
Introduction
Las plaquetas son componentes cruciales de la sangre y su principal función junto con factores de coagulación-es para detener el sangrado después de una lesión de los vasos sanguíneos. Las plaquetas son fragmentos pequeños (2-3 m) anucleares derivadas de megacariocitos de la médula ósea 1. Las plaquetas circulan en estado no activado, durante el que aparecen como estructuras en forma de lente. Tras la interrupción del endotelio, las plaquetas se reúnen para el sitio de la lesión de los vasos sanguíneos para tapar el agujero, un proceso llamado hemostasia primaria. Inicialmente, las plaquetas se adhieren a las moléculas de sub-endotelial, como el colágeno y el factor de von Willebrand, que se exponen como resultado de la etapa de lesión-adhesión 2. Luego, se cambian de forma y secretan paso mensajeros-activación química. Finalmente, se conectan entre sí por puentes paso receptores de agregación. hemostasia primaria es seguida por un proceso secundario que implica la activación de la cascada de coagulación con la deposición de fibrina, que estabilizans trombo inicial 2.
Eventos isquémicos agudos tales como infarto de miocardio 3 menudo el resultado de los trombos que se forman a causa de la interrupción física (ruptura) de una placa aterosclerótica. fármacos antiplaquetarios actuales son la piedra angular del tratamiento de esta enfermedad muy extendida pero su beneficio clínico está limitado por un aumento del riesgo de sangrado. Los fármacos más prescritos en pacientes cardiovasculares, compuestos de aspirina y anti-P2Y12, Target el tromboxano A2 y las vías de ADP 4, respectivamente, que son las principales vías que conducen a la activación plaquetaria. Sin embargo, la investigación innovadora hacia nuevos objetivos que equilibrar de manera óptima los efectos antitrombóticos y el riesgo hemorrágico sigue siendo necesaria.
Desde la década de 1960 hasta la actualidad 5, agregometrıa turbidimétrico ha jugado un papel crucial en la investigación, mejorar nuestro conocimiento de la reactividad plaquetaria y yon el seguimiento de la potencia de los reactivos anti-trombóticos en los seres humanos. Turbidimetría se aplicó inicialmente a PRP extraído de muestras de sangre. De hecho, la recogida de sangre a cabo en tubos que contienen citrato permite una producción rápida y grande de PRP sin tener ningún efecto sobre la integridad de las plaquetas y la función. Sin embargo, la estabilidad a corto plazo (aproximadamente 3 h) de PRP y las enzimas plasmáticas restantes, tales como trombina, y la baja concentración de calcio asociado con perfiles de agregación potencialmente artefactual son de gran inconveniente para la utilización de PRP. Un avance importante ha sido el desarrollo de un método para el aislamiento de plaquetas con centrifugación y etapas de lavado 6 adicional. En resumen, PRP está aislado de la sangre total extraída en ácido-citrato-dextrosa (ACD) y las plaquetas se aisló después de etapas de centrifugación de serie antes de ser resuspendido en un tampón iso-osmótica fosfato (tampón de Tyrode) que contenía glucosa, albúmina de suero humano y divalente cciones (Ca2 + y Mg2 +). Para evitar cambios en la reactividad de las plaquetas, el pH del tampón de Tyrode es cuidadosamente mantenida a 7,35 hasta 7,4. Además, la activación no deseada de las plaquetas se evita mediante la adición de la prostaciclina (PGI 2) antes de que algunos pasos de centrifugación. Finalmente, la adición de apirasa evita que las plaquetas lavadas se vuelvan resistentes contra la acción de ATP / ADP. La suspensión de plaquetas resultante carece de factores coagulantes y la estabilidad de las plaquetas se aumenta en al menos dos veces en comparación con soluciones de PRP. Además, el hecho de que las plaquetas son órdenes inactivos pero intactas la reproducibilidad de las mediciones turbidimétricos y proporciona la capacidad para estudiar la acción de los agonistas o antagonistas de la agregación de plaquetas de una manera óptima.
Usando este método, hemos demostrado en un estudio reciente que la inhibición de la formación de canales Panx1 por un enfoque genético (knock-out ratones) o disminuyendo la actividad del canal Panx1 por farmacológicaenfoques reducida agregación plaquetaria inducida por colágeno 7. Panx1 forma canales de liberación de ATP, que se expresan ubicuamente en muchos tipos celulares, incluyendo plaquetas humanas 7, 8. De hecho, hemos demostrado por turbidimetría en plaquetas humanas lavadas que una preincubación de 7 min con un panel de más o menos específicos bloqueadores químicos (probenecid, mefloquina y 10 péptidos Panx1) antes de la adición de diversos agonistas, inhibido específicamente inducida por colágeno- la agregación de plaquetas mientras que las respuestas de plaquetas a AA y ADP no se vieron afectados. Hemos demostrado que la liberación de ATP a través de canales Panx1 interfiere específicamente en la vía de señalización GPVI conduce a la agregación inducida por colágeno. Curiosamente, varios compuestos aprobados por la FDA con aplicaciones en otras enfermedades (probenecid, mefloquina) afectan a la actividad de los canales Panx1 en plaquetas. Por un lado, esto abre nuevas perspectivas terapéuticas para seleccionarIvely modificar la reactividad plaquetaria. Por otro lado, se debe considerar los posibles efectos secundarios de estos compuestos. En este contexto, el colorante alimentario seguro Brilliant Blue FCF utiliza en múltiples dulces y bebidas energéticas se ha descrito como un inhibidor selectivo de Panx1 9. Se describe aquí un protocolo para el aislamiento de plaquetas lavadas humanas y mediciones turbidimétricas de la agregación plaquetaria adaptado para investigar el efecto del colorante azul de FCF Brilliant como un antagonista de la agregación plaquetaria.
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Protocol
Cinco voluntarios sanos no relacionados se reclutaron para el muestreo de sangre para pruebas de aislamiento y la agregación plaquetaria. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito y el protocolo fue aprobado por el Comité Central de Ética de los Hospitales Universitarios de Ginebra. Todos los voluntarios certificados estén sanos y no han tomado ningún medicamento de plaquetas de interferencia durante al menos los 10 días anteriores los experimentos.
1. Preparación de búfer para extracción de sangre humana y se lavó Aislamiento de plaquetas
- Preparar una solución acuosa de 100 ml de ácido-citrato-dextrosa (ACD) por disolución de 1,4 g de monohidrato de ácido cítrico (C 6 H 8 O 7 • H 2 O, 66,6 mM), 2,5 g de citrato trisódico dihidrato (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H2O, 85 mM) y 2 g de D anhidro (+) - glucosa. El pH de la solución es aproximadamente 4,5.
- Preparar soluciones madre de tampón de Tyrode de la siguiente
- Preparar la solución stock 1 mediante la disolución de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 10 g de NaHCO3 y 0,58 g NaH 2 PO 4 * H 2 O en 500 ml de H2O destilada Las concentraciones finales respectivas son 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM y 8,4 mM. Mantener la solución a 4 ° C.
- Preparar solución madre 2 mediante la disolución de 10,15 g de MgCl 2 * 6 H 2 O (100 mM) en 500 ml de H2O destilada Mantener solución a 4 ° C.
- Preparar solución madre 3 por disolución de 10,95 g (100 mM) CaCl 2 * 6 H 2 O en 500 ml de H2O destilada Mantener solución a 4 ° C.
- Preparar tampón de Tyrode diluyendo 2,5 ml de solución madre de 1 en un volumen final de 50 ml con H2O destilada Esto corresponde a concentraciones finales de NaCl 136,5 mM, KCl 2,68 mM, 11,9 mM de NaHCO3 y 0,42 mM NaH 2 PO 4 * H 2 O. Ajustar el pH a 7,35 y esterilizar por filtración con 0,22-m fILTROS.
- Preparar albúmina 0,35% de tampón de Tyrode (tampón TA 7) diluyendo 5 ml de solución madre de 1, 1 ml de solución madre de 2, 2 ml de solución madre de 3, 0,5 ml de HEPES 1 M, 1,8 ml de 200 g / albúmina de suero humano L y 0,1 g de D anhidro (+) - glucosa en un volumen final de 100 ml destilada H 2 O.
- Ajustar el pH a 7,35 con HCl 1 N y ajustar la osmolaridad a 295 mOsm / L mediante la adición de H2O destilada (10% del volumen total). Las concentraciones finales en esta solución son: NaCl mM 124, KCl 2,44 mM, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH 2 PO 4 * H 2 O, MgCl 0,91 mM 2 * 6 H 2 O, 1,82 mM CaCl 2 * 6 H 2 O . Mantenga tampón TA a 37 ° C durante todo el experimento.
Colección 2. Sangre
- Recoger 45-50 ml de sangre venosa, de la vena antecubital usando una aguja 19 G y ninguna o baja torniquete, en tubos de 50 ml de ConTaining anticoagulante ACD (1 volumen ACD para 6 volúmenes de sangre). Desechar la primera 1-2 ml de sangre para evitar la presencia de trombina y factor tisular.
- Después de la recogida, se mezcla la sangre con la ACD invirtiendo suavemente el tubo. Incubar la muestra durante 10 min a 37 ° C.
3. Preparación de plaquetas humanas lavadas
- Pre-calentar la centrifugadora a 37 ° C. Todos los pasos de centrifugación a continuación se llevan a cabo a esta temperatura.
- Despachar la sangre recogida en tubos de 15 ml (5 ml por tubo) y se centrifuga a 250 xg durante 13 min para obtener PRP.
NOTA: esta centrifugación paso resulta en la producción de tres capas en la muestra: 1) la capa superior, compuesta de plasma, plaquetas, y una pequeña fracción de células blancas de la sangre. 2) La capa intermedia, una parte rica en células blancas de la sangre. 3) La capa inferior, que se compone esencialmente de las células rojas de la sangre. - Recoger el PRP con la pipeta la parte superior layer cuidadosamente en un nuevo tubo de 15 ml para evitar al máximo la contaminación con células rojas y blancas de la sangre, y se incuba durante 10 min a 37 ° C.
- Centrifugar el PRP a 2200 xg durante 12 min (para 5 ml PRP).
NOTA: Este paso de centrifugación se debe realizar con una baja de freno o sin freno. - Eliminar el sobrenadante (plasma pobre en plaquetas), y resuspender cuidadosamente el sedimento con 10 ml de tampón TA que contiene 2 l / ml de heparina (5000 U / ml) y 2,5 l / ml de 25? M PGI 2 usando una pipeta de plástico Pasteur. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Añadir 2,5 l / ml de 25? M PGI 2 y centrifugar durante 8 min a 1.900 xg (con baja freno o sin freno).
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5 ml de tampón TA que contiene 2,5 l / ml de 25? M PGI 2 usando un plástico pipeta Pasteur. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Durante el periodo de incubación, pipetear 150 l de la suspensión de plaquetas ena un tubo de 1,5 ml y el recuento de plaquetas, utilizando un contador de células automatizado (que detecta el tamaño de células de la sangre mediante la medición de los cambios en la resistencia de corriente continua).
- Después de la 10 min de incubación, añadir 2,5! L / ml de 25? M PGI 2 a la suspensión de plaquetas y se centrifuga inmediatamente a 1900 xg durante 8 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet a una concentración de 250.000 plaquetas / mu l con un volumen adecuado de tampón TA (es decir, si el recuento de células es de 500.000 por ml, resuspender en 10 ml de tampón TA) que contiene 32 l / ml de apirasa a 0,01 U / ml (concentración final 0,32 U / ml).
NOTA: La alta concentración de apirasa se utiliza para evitar la desensibilización de los receptores P2X1 inducidas por la secreción espontánea de ATP 10, 11 en ausencia de agonistas. Esto es importante porque las respuestas de colágeno inducida son inducidas por paracrina rápido / activación autocrina de P2X1 por ATP liberado from activa las plaquetas. Si la vía de señalización de plaquetas no requiere críticamente preservación de la función P2X1, utilice 0,02 U / ml de apirasa. Varios estudios (revisado en Mahaut-Smith et al. 10) demostraron que 0,02 U / ml de apirasa evita ADP desensibilización P2Y1 receptor con respuestas P2X1 insignificantes. - Incubar la suspensión de células durante al menos 30 min a 37 ° C antes de realizar las mediciones aggregometric. La preparación es estable durante 5 a 8 h.
4. agregometría
- Preparar fibrinógeno (56 mg / ml) en tampón de Tyrode.
- Pipetear 260 l de suspensión de plaquetas en cubetas de vidrio (Figura 1A; cubeta izquierda) que contiene 10 l de fibrinógeno (56 mg / ml) y una varilla de agitación magnética, a continuación, se incuba la suspensión durante 2 - 3 min a 37 ° C en pocillos de incubación presentes en el agregómetro (Figura 1B y 1C).
- Pre-incubar con el Panx1inhibidor de Brilliant Blue FCF mediante la adición de 10 l de una 2,8 mM o 28 mM solución madre (concentración final 100? M y 1 mM, respectivamente) durante 7 minutos a 37 ° C.
- Calibrar el agregómetro a un valor de agregación assumptive 100% en la medición de la DO de una cubeta que contiene 10 l de fibrinógeno (56 mg / ml), 10! L azul brillante FCF (2,8 mM o 28 mM) y tampón TA sin plaquetas.
- Colocar la cubeta en una agregación bien bajo agitación automática y pulse el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro (es decir prensa F1 si se usa bien la agregación 1).
NOTA: Este experimento se describe a continuación incluye azul brillante FCF. El compuesto utilizado para la calibración tiene que ser ajustado a la condición experimental.
- Colocar la cubeta en una agregación bien bajo agitación automática y pulse el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro (es decir prensa F1 si se usa bien la agregación 1).
- Calibrar el agregómetro a un valor de agregación assumptive 0% mediante el uso de la misma muestra de plaquetas que será utilizado para el experimento bajo stirrin automáticagramo.
- Colocar la cubeta en la agregación bien y pulse el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro. Espere unos 20-30 s antes de continuar. Este retraso sirve para asegurar que ninguna agregación ocurre antes de la adición de los agonistas.
NOTA: Como cualquier diferencia en el número de plaquetas puede tener un efecto sobre el diámetro exterior medido, la etapa de calibración 0% necesita ser repetido para cada medición individual.
- Colocar la cubeta en la agregación bien y pulse el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro. Espere unos 20-30 s antes de continuar. Este retraso sirve para asegurar que ninguna agregación ocurre antes de la adición de los agonistas.
- Añadir 20 l de agonista se desea, colágeno / ml, tal como 15 g (1 g definitiva / ml) o 1,125 mM de ácido araquidónico (75? M final), en la cubeta. Inmediatamente iniciar la grabación con agitación automática continua pulsando el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada a la agregómetro.
NOTA: La adición del agonista induce la activación de plaquetas. Agregados de plaquetas se distinguen claramente en la cubeta de vidrio al final del experimento (Figura 1A; right cubeta). - La grabación se detiene automáticamente después de 6 min. En este punto, guardar los datos haciendo clic en el icono de guardar de la computadora.
NOTA: El cálculo de la velocidad de agregación se lleva a cabo por el ordenador, que expresa los resultados finales del proceso de agregación como porcentaje. - Analizar los datos.
- Para obtener información adicional extensa sobre los protocolos para la preparación de suspensiones de plaquetas lavadas y medición turbidimétrico de la agregación plaquetaria, referirse a otros documentos publicados por expertos en el campo 12, 13.
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Representative Results
El software agregómetro produce automáticamente las curvas de agregación y da los valores para la agregación máxima en porcentaje. Los valores se pueden copiar en un software de análisis de datos con el fin de realizar análisis estadísticos y visualizar valores máximos de agregación en forma de gráficos de barras. Opcionalmente, cada punto de las curvas de agregación individual puede ser exportado sucesivamente en un software de hoja de cálculo y luego a software estadístico (por ejemplo, GraphPad) con el fin de visualizar las curvas. Algunos investigadores utilizan la pendiente máxima de la curva de agregación para calcular la velocidad y el área bajo la curva para evaluar la actividad de las plaquetas. El tiempo de retraso y cambio de forma también se pueden visualizar de forma gráfica.
Un ejemplo típico de una curva de agregación de las plaquetas humanas lavadas en condiciones de control (H 2 O) se muestra en la Figura 2A. Además de la unagonist (colágeno), inducida (después de un breve retardo) una depresión en la curva de agregación causada por el cambio de forma de las plaquetas. Entonces, el porcentaje de agregación aumentó gradualmente con el tiempo hasta un valor máximo se alcanzó a aproximadamente 3-4 min. Una ligera disminución en el porcentaje de agregación se observó hacia el final de la grabación 6 min, lo que refleja algunos desagregación. Como se ilustra en la Figura 2A-B, la preincubación de plaquetas humanas lavadas con el inhibidor de canal Panx1 Brilliant Blue FCF, a una concentración de 1 mM, se ralentizó o abolió totalmente el cambio inicial forma de las plaquetas y bloqueó la agregación inducida por colágeno de plaquetas lavadas obtenido a partir de 5 diferentes voluntarios sanos no relacionados. Cuando las plaquetas donde preincubaron con una concentración más baja (100? M) de azul brillante FCF, el efecto inhibidor del colorante sobre las respuestas de colágeno inducida y cambio de forma no se observaron más (véase la Figura 2A para un ejemplo). Quantificación de las respuestas de agregación plaquetaria inducida por 1 mg de colágeno / ml reveló que 1 mM Brilliant Blue FCF redujo significativamente las respuestas máximas de la agregación en comparación con las condiciones de control, así como a una concentración más baja (100? M) de inhibidor Panx1 (Figura 2C). La inhibición de la agregación plaquetaria fue específica para las respuestas de colágeno inducida y no debido a efectos secundarios no deseados de Brilliant Blue FCF (sobre la viabilidad celular, por ejemplo) como la misma concentración del colorante (1 mM) no afectó a la respuesta de agregación inducida por otro agonista, es decir, 75? M AA, como se ilustra en la Figura 2D. Estos resultados confirman el papel específico de canales Panx1 en las respuestas de agregación inducida por colágeno de plaquetas humanas que nosotros y otros han demostrado previamente con otros inhibidores farmacológicos de Panx1 tales como probenecid, mefloquina, y los 10 péptidos Panx1 específicos 7, 8.
Figura 1: Agregometría. (A) imagen representativa de cubetas de vidrio (que contiene un imán de agitación) utilizado para la agregometría. La cubeta de la izquierda muestra plaquetas en reposo mientras que la cubeta de la derecha ilustra los agregados de plaquetas después de la activación inducida por colágeno. (B) imagen representativa de un agregómetro de 8 pocillos para las mediciones turbidimétricos. Los pozos utilizados (asterisco) incubar suspensiones de plaquetas presentes en una cubeta de vidrio a 37 ° C, y los utilizados para las mediciones (flecha blanca) se indican en C. favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Una alta concentración de Brilliant Blue FCF Bloques activación plaquetaria en respuesta al colágeno. (A) los rastros representativos de la agregación inducida por colágeno de plaquetas lavadas humanas obtenidas del mismo voluntario sano (V1) bajo condiciones de control (H 2 O; azul oscuro) o después de 7 min de preincubación con el inhibidor de Panx1 azul brillante FCF en 1 mM ( azul claro) o en 100? M (color azul intermedio). trazas de agregación se registran durante 6 min. (B) los rastros representativos de la agregación inducida por colágeno de plaquetas lavadas humanas obtenidas a partir de 4 voluntarios sanos (V2-V5) después de 7 min de preincubación con el inhibidor de Panx1 Brilliant Blue FCF (1 mM). (C) Cuantificación de respuestas de agregación máximas de plaquetas humanas lavadas en condiciones de control (barra blanca) o después de 7 min de preincubación con azul brillante FCF en 100? M (barras grises) o en 1 mM (barra de color negro). N = 5. **** P0; 0,0001; ANOVA seguido por el post-test de Bonferroni para comparaciones múltiples; Los resultados se expresan como media ± SEM. (D) los rastros representativos de agregación AA-inducida de plaquetas lavadas humanas obtenidas a partir de 5 voluntarios sanos (V1-V5) después de 7 min de preincubación con el inhibidor de Panx1 Brilliant Blue FCF (1 mM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay un gran interés en la búsqueda de nuevos fármacos capaces de modular la función de las plaquetas con el fin de prevenir la trombosis sin aumentar el riesgo de hemorragia. Para este propósito, in vitro pruebas de laboratorio que fiable y reproducible pueden monitorear las respuestas de agregación en plaquetas humanas son absolutamente necesarias. agregometrıa turbidimétrico es una técnica fácil de realizar. Sin embargo, algunas precauciones deben tenerse en cuenta. Las mediciones deben realizarse con agitación continua como el proceso de agregación depende en gran medida de agitar. También es importante mantener las plaquetas a una temperatura fisiológica de 37 ° C con el fin de evitar cualquier tipo de activación prematura. La preactivación de las plaquetas también puede ocurrir durante la recogida de la sangre y plaquetas lavadas preparación, lo que lleva a la agregación espontánea. Por lo tanto se deben tomar medidas cuidadosas durante el procedimiento completo de preparación de plaquetas.
Turbidimetría se basa On la medida de la OD de la suspensión de plaquetas. Esto hace que la técnica no aptos para la medición de la agregación en sangre entera debido a la presencia de células rojas de la sangre. Por lo tanto, turbidimetría se puede realizar sólo en PRP o plaquetas lavadas aisladas a partir de PRP. Aunque es fácil de tratar y más barato, turbidimetría ha sido reconocido como insensible a la presencia de microagregados 14, 15. Cuando se espera que los microagregados a ser de importancia crítica, agregometría impedancia, que mide la variación de la resistencia eléctrica cuando las plaquetas se adhieren a un electrodo sumergido en una muestra de sangre entera citrada, se adapta mejor 16. El proceso de agregación de plaquetas es también depende en gran medida del recuento de plaquetas en la suspensión de plaquetas 17; la citometría de flujo se utiliza en pacientes que sufren de trombocitopenia 18, de la que el número máximo de plaquetas quese puede obtener es insuficiente para turbidimetría. Sin embargo, la ventaja general de turbidimetría es que permite un análisis detallado de la reactividad plaquetaria, tales como cambio de forma y desagregación, que no puede ser evaluada en muestras de sangre entera.
Es importante darse cuenta de que la variación natural en la agregación plaquetaria humana existe debido a diferencias en la edad, el sexo y el estilo de vida, así como el estado de salud del sujeto cuya función plaquetaria es desafiado 19, 20, 21. Tal variación natural puede ser del orden de 10-20% en los resultados turbidimétricos, por lo tanto se debe tener cuidado, cuando se realiza y la interpretación de estos experimentos, en la obtención de las plaquetas de un número suficiente de voluntarios sanos no relacionados para permitir estadísticas fiables. sin embargo Esta limitación es contrarrestada por el hecho de que las mediciones turbidimétricos son altamente reproducible, al menos cuando la agregaciónprocedimientos son bien estandarizados a través de los laboratorios. Los esfuerzos de normalización han sido realizadas por la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia 22. Por esta razón, turbidimetría sigue siendo la prueba más comúnmente encontrado para la medición de la agregación plaquetaria en los dos laboratorios de ciencias básicas y clínicas y sigue siendo una técnica de elección para el estudio del efecto de los fármacos sobre las respuestas de plaquetas.
En el presente estudio hemos demostrado, usando turbidimetría para medir las respuestas en plaquetas lavadas humanas, que un colorante de alimentos comúnmente utilizada Brilliant Blue FCF afecta a la agregación plaquetaria. Elegantes estudios electrofisiológicos han puesto de manifiesto un bloqueo específico de canales Panx1 por este colorante 9, 23. De hecho, las altas concentraciones (1 mM) de este colorante mostraron efectos inhibitorios sobre ambos inducida por colágeno cambio de forma y agregación máxima pero 10 veces las concentraciones más bajas (100? M)del colorante no afectó a la respuesta de agregación de plaquetas. De acuerdo con el dictamen científico sobre la re-evaluación de Brilliant Blue FCF (E133) como un aditivo alimentario, publicado por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria 24, la concentración máxima permisible de Brilliant Blue FCF (peso molecular = 792,84 g / mol) es de 500 mg / kg de alimento. Para H 2 O, esto correspondería a 0,63 mM, que es una concentración 1,59 veces menor que la inhibición de la agregación plaquetaria inducida por colágeno en nuestros experimentos. Suponiendo que sólo una pequeña fracción del colorante será absorbido en el intestino después de la ingestión oral, y que el colorante finalmente se diluye en el volumen 5-L de la sangre de una persona adulta, la ingesta diaria de este colorante alimenticio azul probable tiene exceder en gran medida de los niveles normales antes de efectos secundarios sobre la agregación plaquetaria pueden ser anticipados. Posibles efectos secundarios de la más alta concentración del colorante en nuestros experimentos sobre la viabilidad de plaquetas, por ejemplo, eranexcluido por la presencia de respuestas de agregación sólido a otro agonista (AA). Estas respuestas AA no afectados también confirmaron que los efectos inhibitorios de Brilliant Blue FCF parecen implicar específicamente la vía de señalización de colágeno. Esto está en línea con nuestro estudio anterior 7 detalla el lugar específico de la liberación de ATP a través de canales Panx1 en la respuesta de agregación plaquetaria inducida por colágeno.
Al adaptar el protocolo de aislamiento de plaquetas se lava para este estudio, se describe un método simple y directo para aislar plaquetas a partir de sangre humana. Después de varias etapas de lavado a cabo esencialmente por centrifugación, las plaquetas se resuspenden en un medio que respeta las condiciones precisas fisiológicos incluyendo el pH, la temperatura de trabajo y la concentración de iones divalentes pero asegura la ausencia de proteínas plasmáticas. Esto es una ventaja de esta técnica sobre los métodos alternativos, tales como filtración en gel en el que la eliminación de COMPON plasmaentos no se produce 25.
Todos los pasos del procedimiento de lavado son de importancia crucial para obtener resultados reproducibles utilizando las plaquetas lavadas. Una plétora de fármacos puede influir en la reactividad plaquetaria, por lo tanto, es esencial que los voluntarios sanos se les pide que no tomar ninguna medicación durante al menos 10 días anteriores de recogida de sangre. Además, la recogida de sangre requiere que se presta atención para evitar el trauma vena o flujo demasiado lento ya que esto puede causar la generación de trombina y la posterior activación de plaquetas 22. A lo largo de las mismas líneas, el potencial de activación de las plaquetas durante las etapas de centrifugación y lavado se puede evitar mediante el uso repetido de PGI 2. Debido a su muy baja estabilidad, PGI 2, debe añadirse a cada etapa de lavado inmediatamente antes de cada centrifugación. La resuspensión de las plaquetas en tampón TA (a un pH fisiológico) que contiene apirasa asegura que las respuestas de plaquetas permanecenintacto. La presencia de apirasa en la suspensión de plaquetas es esencial para permitir la degradación de ATP y ADP con el fin de preservar las plaquetas de una desensibilización de sus receptores purinérgicos. A medida que la vía de señalización de Panx1 implica la activación del receptor P2X1 en plaquetas humanas tras la activación del receptor de colágeno, hemos añadido una concentración relativamente alta de apirasa (0,32 U / ml) a la suspensión de plaquetas con el fin de evitar P2X1 desensibilización 7. Para evitar desensibilización de otros receptores purinérgicos en plaquetas, concentraciones más bajas de apirasa serían suficientes 10.
Aunque el procedimiento de centrifugaciones y lavados de serie pasos son mano de obra intensiva y requiere más tiempo, las plaquetas lavadas obtenidas utilizando este protocolo ofrecen el beneficio de mayor estabilidad a 37 ° C (5-8 h) en comparación con las plaquetas utilizadas directamente de PRP (1 -3 h). Sin embargo, la opción de usar PRP o plaquetas lavadas deben hacerse cautiously y debe incluir consideraciones tales como la cantidad de sangre disponible para el experimento, el agonista a utilizar, así como la cuestión que se abordará. Por ejemplo, como la unión de fibrinógeno a activados α2β3 integrinas es el principal mecanismo mediación de la agregación, la ausencia de fibrinógeno en las plaquetas lavadas pueden influir en la reacción; en particular, cuando se utilizan agonistas débiles (tales como ADP) 13. Este problema es menos crítico cuando se usa un potente agonista, tal como trombina o colágeno, que son por sí mismas capaces de inducir la liberación de fibrinógeno a partir de alfa-gránulos. Aún así, de manera rutinaria añadimos fibrinógeno exógeno a la suspensión de plaquetas humanas lavadas con el fin de aumentar la amplitud de la respuesta de agregación inducida por colágeno.
En conclusión, mediante el uso de plaquetas humanas lavadas y turbidimetría, se encontró que el colorante alimenticio azul brillante FCF, a través de sus efectos inhibidores sobre Panx1, representaun potencial inhibidor de la función plaquetaria.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (310030_162579 / 1 a Brenda Renata Kwak y 320030_144150 a Pierre Fontana), así como por una beca de la Fundación Suiza del corazón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
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