Summary
אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של טסיות נשטף מן הדם האנושי ואחריו מדידות צימות טסיות דם הנגרמת אגוניסט ידי turbidimetry. כדוגמא אנחנו מיישמים שיטה זו לחקר התגובה אגרגציה של טסיות אדם קולגן לאחר דגירה מראש עם מעכב ערוץ Pannexin1 בריליאנט בלו FCF.
Abstract
Turbidimetry היא טכניקת מעבדה מוחלת על מנת למדוד את ההצטברות של טסיות מושעה או פלזמה (פלזמה העשירה בטסיות-, PRP) או במאגר (טסיות נשטפה), על ידי שימוש באחד או שילוב של אגוניסטים. השימוש טסיות נשטף מופרד מסביבתם הפלזמה שלהם בהעדר תרופות נגד קרישת הדם מאפשר לחקר מאפיינים טסיות מהותיים. בין הפנל הגדול של אגוניסטים, חומצה הארכידונית (AA), אדנוזין די-פוספט (ADP), תרומבין קולגן הם נפוץ ביותר בשימוש. תגובת הצבירה מכומת על ידי מדידת הצפיפות האופטית היחסית (OD) לאורך זמן השעיה הטסיות תחת בחישה מתמדת. טסיות השעיה הומוגנית להגביל המעבר של אור לאחר התוספת של אגוניסט, שינוי צורה טסיות מתרחש לייצר גידול חולף קטן OD. בעקבות צעד ההפעלה הראשונית הזו, קרישי טסיות יוצרים בהדרגה, המאפשר מעבר של אור דרך ההשעיה כמו מילult של ירידת OD. תהליך הצבירה בסופו של דבר מבוטא באחוזים, לעומת OD של פלזמה ירודה טסיות או חיץ. כיול מדוקדק כן חיוני בתחילת כל ניסוי. ככלל: כיול ל 0% מוגדרים על ידי מדידת OD של השעית הטסיות הלא מגורה תוך מדידת OD של מדיום ההשעיה המכיל שום טסיות מייצגת שווי של 100%. טסיות צבירה היא דמיינה בדרך כלל עקומת צבירה בזמן אמת. Turbidimetry היא אחת טכניקות המעבדה הנפוצות ביותר לחקירת תפקוד הטסיות ונחשבת כתקן זהב ההסטורי המשמשת לפיתוח סוכני תרופות החדשים שמטרתן עיכוב צימות טסיות דם. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים 1) הכינו אדם שנשטף טסיות 2) ניתוח turbidimetric של צבירת מושרה הקולגן של אדם שנשטף pretreated טסיות עם צבע המזון FCF הכחול המבריק שהיה לאחרונה iDENtified כמעכב של ערוצי Pannexin1 (Panx1).
Introduction
טסיות הן מרכיב חיוני של דם והתפקוד יחד העיקרי שלהם עם קרישת גורמים-הוא כדי לעצור את הדימום לאחר פציעה של כלי דם. טסיות קטנות (2-3 מיקרומטר) שברי anuclear נגזר megakaryocytes של מח עצם 1. טסיות להסתובב המדינה הלא-מופעל, שבמהלכה הם מופיעים כמו מבנים דמוית-עדשה. לאחר הפסקה של האנדותל, טסיות לאסוף לאתר של פגיעה בכלי הדם כדי לסתום את החור, תהליך הנקרא המוסטאסיס העיקרי. בתחילה, טסיות לצרף מולקולות תת-אנדותל, כגון קולגן גורם פון Willebrand, כי נחשפות כתוצאת הצעד הדבק-פציעת 2. ואז, הם משנים צורה להפריש צעד שליחי הפעלה כימי. לבסוף, הם מתחברים זה לזה על ידי גישור צעד קולטני-צבירה. המוסטאסיס ראשי ואחריו תהליך משני מעורבי הפעלה של מפל הקרישה עם בתצהיר הפיברין, אשר לייצבזה פקיק 2 הראשוני.
אירועים חריפים איסכמי כגון אוטם שריר לב 3 לעתים קרובות נובעים בורידים היוצרות בגלל שיבוש פיזי (קרע) של פלאק טרשת עורק. תרופות אנטי-טסיות הנוכחיות הן אבן הפינה של הטיפול במחלה נפוצה זו אך התועלת הקלינית שלהם מוגבלת על ידי סיכון מוגבר לדימומים. תרופות מרשם ביותר בחולים קרדיו, אספירין ותרכובות נגד P2Y12, למקד את thromboxane A2 ואת השבילים ADP 4, בהתאמה, המהווים את המסלולים העיקריים המובילים ההפעלה טסיות. עם זאת, מחקר חדשני לקראת יעדים חדשים שיאזנו בצורה אופטימלית תופעות נוגדות וסיכון haemorragic הוא עדיין נחוץ.
מ 1960 5 עד היום, aggregometry turbidimetric שיחק תפקיד מרכזי במחקר, שיפור הידע שלנו היצמדות טסיות הדם ואניn את הניטור של העוצמה של ריאגנטים אנטי טרומבוטיים בבני אדם. Turbidimetry בתחילה היה מוחל PRP מופק דגימות דם. ואכן, איסוף דם שבוצע צינורות המכילים ציטרט מאפשר ייצור מהיר גדול של PRP מבלי כל השפעה על שלמות טסיות ולתפקד. עם זאת, את היציבות לטווח הקצר (כ 3 שעות) של PRP ואת אנזימי plasmatic הנותרים, כגון תרומבין, ואת ריכוז סידן הנמוך הקשורים פרופילי צבירה artefactual בפוטנציה הם של המטרד הזה לשימוש PRP. צעד חשוב קדימה כבר הפיתוח של שיטה לבידוד טסיות עם צנטריפוגה נוסף כביסת שלבי 6. בקיצור, PRP מבודד דם כולו נאסף על ציטרט חומצת דקסטרוז (ACD) וטסיות מבודדות לאחר צעדי צנטריפוגה סדרה בטרם resuspended ב חיץ פוספט iso-אוסמוטי (החיץ של Tyrode) גלוקוז המכיל, אלבומין אנושי ג divalentהוא שינויים (Ca 2+ ו Mg 2+). כדי להימנע משינויי היצמדות טסיות דם, ה- pH של החיץ של Tyrode נשמר בקפידה על 7.35-7.4. יתר על כן, הפעלה לא רצויה של טסיות נמנעת על ידי הוספת prostacyclin (PGI 2) לפני כמה צעדים צנטריפוגה. לבסוף, תוספת של apyrase מונע טסיות שטף מלהפוך עמיד נגד הפעולה של ה- ATP / ADP. השעית טסיות וכתוצאה חסרת גורמים מקרישים ואת היציבות של טסיות גדלה ב לפחות פי שתיים בהשוואה לפתרונות PRP. בנוסף, העובדה כי טסיות הם כתבים פעילים אך ללא פגע השחזור של מדידות turbidimetric ומספקת את היכולת ללמוד את הפעולה של אגוניסטים או אנטגוניסטים של הצטברות טסיות בצורה אופטימלית.
באמצעות שיטה זו, אנו הראו במחקר שנערך לאחרונה כי מעכב את יצירתו של ערוצי Panx1 ידי גישה גנטית (נוק-אאוט עכברים) או ירידה בפעילות ערוץ Panx1 ידי תרופתיגישות טסיות מופחתת מושרה קולגן צבירה 7. Panx1 יוצר ערוצי שחרור ATP, אשר באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף בסוגי תאים רבים, כולל טסיות אדם 7, 8. למעשה, אנו שהפגנו turbidimetry על אדם שנשטף טסיות כי preincubation 7 הדק 'עם פנל של חוסמים כימיים יותר-או-פחות ספציפיים (probenecid, mefloquine ו 10 פפטידים Panx1) לפני התוספת של אגוניסטים שונים, עכבות במיוחד קולגן מושרה צימות טסיות דם ואילו תגובות טסיות ל- AA ו- ADP לא הושפעו. הראינו כי שחרור ATP בערוצי Panx1 מפריע במיוחד את מסלול איתות GPVI המוביל צבירה מושרת קולגן. מעניין, מספר תרכובות ה- FDA עם יישומים במחלות אחרות (probenecid, mefloquine) משפיעים על הפעילות של ערוצי Panx1 במספר טסיות הדם. מצד אחד, זו פותחת אופקים חדשים טיפוליים כדי לבחורively לשנות היצמדות טסיות הדם. מצד השני, יש לשקול השפעות משניות פוטנציאל של תרכובות אלה. בהקשר זה, לצבוע מזון הבטוח FCF הכחול המבריק בשימוש סוכריות מרובות ומשקאות אנרגיה תואר בתור מעכב סלקטיבי של Panx1 9. אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד של טסיות נשטף האנושית ומדידות turbidimetric של הצטברות טסיות מותאמים לחקור את ההשפעה של צבע FCF הכחול המבריק כאל יריב של הצטברות טסיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
חמש מתנדב בריאים שאינו קשור גויסו דגימת דם לבדיקות בידוד צימות טסיות דם. הסכמה מדעת נכתב הושג ואת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה המרכזית של בתי חולים אוניברסיטת ז'נבה. כל המתנדבים מוסמכים להיות בריאים כדי לא נקטו כל תרופות מפריעה-טסיות במהלך לפחות 10 הימים שקדמו ניסויים.
הכנת חוצץ 1. עבור אוסף דם אדם ובידוד טסיות שטף
- הכן תמיסה מימית 100 מ"ל של חומצה-ציטרט דקסטרוז (ACD) על ידי המסת מונוהידראט 1.4 גרם חומצת לימון (C 6 H 8 O 7 • H 2 O, 66.6 מ"מ), מימית ציטראט Trisodium 2.5 גרם (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H 2 O, 85 מ"מ) ו 2 גרם של D נטול מים (+) - גלוקוז. ה- pH של התמיסה הוא כ 4.5.
- הכן פתרונות מניות עבור החיץ של Tyrode כדלקמן
- כן מניות פתרון 1 על ידי המסת 80 גרם NaCl, KCl 2 גרם, 10 גרם NaHCO 3 ו 0.58 גרם לאא 2 PO 4 * H 2 O ב 500 מיליליטר של H 2 O. מזוקק הריכוזים הסופיים בהתאמה הם 2.73 M, 53.6 מ"מ, 238 מ"מ ו 8.4 מ"מ. שמור את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון המניות 2 על ידי המסת 10.15 גרם MgCl 2 * 6 H 2 O (100 מ"מ) ב- 500 מ"ל מזוקקים H 2 O. שמור פתרון ב- C 4 °.
- הכן פתרון מניות 3 על ידי המסת 10.95 גרם (100 מ"מ) CaCl 2 * 6 H 2 O ב 500 מ"ל מזוקקים H 2 O. שמור פתרון ב- C 4 °.
- הכן חיץ של Tyrode ידי דילול 2.5 מ"ל של פתרון מניות 1 בנפח סופי של 50 מ"ל עם O. H 2 מזוקקים זו תואמת ריכוזים הסופי של 136.5 מ"מ NaCl, 2.68 mM KCl, 11.9 מ"מ NaHCO 3 ו 0.42 מ"מ לאא 2 PO 4 * H 2 O. התאם את ה- pH 7.35 לעקר ידי סינון עם 0.22 מיקרומטר Filters.
- הכן חיץ 0.35% אלבומין של Tyrode (ת"א חיץ 7) על ידי דילול 5 מ"ל של פתרון מניות 1, 1 מ"ל של פתרון המניות 2, 2 מ"ל של פתרון המניות 3, 0.5 מ"ל 1M HEPES, 1.8 מ"ל של 200 גר '/ ל אלבומין אנושי 0.1 גרם של D נטול מים (+) - גלוקוז בנפח סופי של 100 מ"ל מזוקקים H 2 O.
- התאם את ה- pH 7.35 עם 1N HCl ולהגדיר את osmolarity כדי 295 mOsm / L ידי הוספת H מזוקק 2 O (10% של נפח כולל). ריכוזים גמר בתמיסה זו הם: 124 מ"מ NaCl, 2.44 KCl mM, 10.82 מ"מ NaHCO 3, 0.38 מ"מ לאא 2 PO 4 * H 2 O, 0.91 מ"מ MgCl 2 * 6 H 2 O, 1.82 מ"מ CaCl 2 * 6 H 2 O . שמור חיץ ת"א ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסוי כולו.
איסוף דם 2.
- אסוף 45-50 מיליליטר של דם ורידים, מוריד antecubital באמצעות מחט 19 G ואין או חוסם עורקים נמוכים, תוך 50 צינורות מיליליטר conקרישת ACD Taining (1 הנפח ACD עבור 6 כרכים של דם). מחק את הדם 1-2 מ"ל של הראשון כדי למנוע את נוכחותו של תרומבין גורם לרקמות.
- לאחר איסוף, לערבב את הדם עם ACD ידי צינור היפוך בעדינות. דגירה המדגם עבור 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
3. הכנת האדם שנשטפה טסיות
- טרום לחמם את צנטריפוגות כדי 37 מעלות צלזיוס. כל הצעדים צנטריפוגה מתחת מבוצעים בטמפרטורה זו.
- שלחי הדם נאסף לתוך 15 מ"ל צינורות (5 מ"ל לכל צינור) צנטריפוגות ב 250 XG במשך 13 דקות כדי להשיג PRP.
הערה: תוצאות צעד צנטריפוגה זה בייצור משלוש שכבות במדגם: 1) השכבה העליונה, מורכבת הפלזמה, טסיות, ואת חלק קטן של תאי דם לבנים. 2) שכבת ביניים, חלק עשיר בתאי דם לבנים. 3) השכבה התחתונה, אשר מורכבת בעיקר של תאי דם אדומים. - אסוף את PRP ידי pipetting la העליוןyer בזהירות לתוך צינור 15 מ"ל חדש למניעת זיהום מקסימאלי עם תאי דם אדומים ולבנים, דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה PRP ב 2200 XG במשך 12 דקות (עבור 5 מ"ל PRP).
הערה: זה צעד צנטריפוגה צריכה להתבצע עם נמוך בלם או בלי בלמים. - הסר את supernatant (פלזמה ירודה טסיות), ובזהירות resuspend גלולה עם 10 מ"ל של חיץ ת"א המכיל 2 μL / מ"ל של הפרין (5000 U / mL) ו 2.5 μL / מ"ל של 25 מיקרומטר PGI 2 באמצעות pipet פלסטיק פסטר. דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 2.5 μL / מיליליטר של 25 מיקרומטר PGI 2 צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 1900 XG (עם בלם נמוך או ללא בלם).
- הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה עם 5 חיץ מ"ל ת"א המכיל 2.5 μL / מ"ל של 25 מיקרומטר PGI 2 באמצעות pipet פלסטיק פסטר. דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- בתקופת הדגירה, pipet 150 μL של ההשעיה טסיותכדי צינור 1.5 מיליליטר ולספור טסיות, באמצעות דלפק תא automatized (שמזהה את הגודל של תאי דם על ידי מדידת שינויי ההתנגדות ישירה נוכחית).
- לאחר דגירה 10 דקות, להוסיף 2.5 μL / מ"ל של 25 מיקרומטר PGI 2 להשהייה טסיות צנטריפוגות מיד 1900 XG במשך 8 דקות.
- הסר את supernatant מחדש להשעות את הגלולה לריכוז של 250,000 טסיות / μL עם נפח נאות של חיץ ת"א (כלומר אם את ספירת התאים היא 500,000 לכל μL, גלולה ב 10 חיץ המ"ל ת"א) המכיל 32 μL / מיליליטר של apyrase ב 0.01 U / מ"ל (ריכוז סופי 0.32 U / mL).
הערה: ריכוז גבוה של apyrase משמש כדי למנוע את הקהיה של קולטני P2X1 המושרה על ידי הפרשת ספונטנית של 10 ATP, 11 בהיעדרו של אגוניסטים. זה חשוב כי תגובות מושרות קולגן הם המושרה על ידי paracrine המהיר / הפעלת autocrine של P2X1 ידי ATP שפורסמה frאום מופעל טסיות. אם את מסלול איתות טסיות אינו מחייב באופן ביקורתי שימור התפקוד P2X1, להשתמש 0.02 U / mL apyrase. מספר מחקרים (הנסקרת ב Mahaut-סמית ואח '. 10) הדגימו כי 0.02 U / mL apyrase ימנע הקהיה P2Y1 קולטן ADP עם התגובות P2X1 זניח. - לדגור על השעיית התא למשך 30 דקות לפחות 37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע מדידות aggregometric. ההכנה היא יציבה במשך 5 עד 8 שעות.
4. aggregometry
- הכן פיברינוגן (56 מ"ג / מ"ל) במאגר של Tyrode.
- Pipet 260 μL של השעיה טסיות לתוך cuvettes זכוכית (איור 1A; קובט שמאל) המכיל 10 μL של פיברינוגן (56 מ"ג / מ"ל) ו מוט בחישה מגנטית, ואז דגירה ההשעיה עבור 2 - 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בארות הדגירה הנוכחי ב aggregometer (איור 1B ו 1C).
- טרום דגירה עם Panx1מעכב FCF כחול מבריק על ידי הוספת 10 μL של פתרון המניות 2.8 מ"מ או 28 מ"מ (מיקרומטר 100 הריכוז הסופי 1 מ"מ, בהתאמה) עבור 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- כייל את aggregometer לערך צבירה 100% ובשיא ידי מדידת OD של קובט המכיל פיברינוגן 10 μL (56 מ"ג / מ"ל), 10 μL FCF כחול מבריק (2.8 מ"מ או 28 מ"מ) חיץ ת"א ללא טסיות.
- מניח את קובט ב הצטברות היטב תחת בחישה אוטומטית ולחץ על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב הצמוד aggregometer (F1 העיתונות כלומר אם גם צבירת 1 משמש).
הערה: ניסוי זה כמתואר להלן כולל FCF הכחול מבריק. המתחם משמש לכיול צריך להיות מותאם על תנאי הניסוי.
- מניח את קובט ב הצטברות היטב תחת בחישה אוטומטית ולחץ על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב הצמוד aggregometer (F1 העיתונות כלומר אם גם צבירת 1 משמש).
- כייל את aggregometer לערך צבירת 0% ובשיא באמצעות המדגם הזהה טסיות אשר ישמש לצורך הניסוי תחת בערבוב אוטומטיז.
- מניחים את קובט של צבירה היטב ולחץ על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב צמוד aggregometer. מתן כ 20-30 s לפני שתמשיך. עיכוב זה משמש כדי להבטיח ששום צבירה קורית לפני הוספת אגוניסטים.
הערה: כמו כל הבדל מספר הטסיות עלול להיות השפעה על OD נמדד, צעד כיול 0% יש צורך לחזור על כל מדידה בודדת.
- מניחים את קובט של צבירה היטב ולחץ על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב צמוד aggregometer. מתן כ 20-30 s לפני שתמשיך. עיכוב זה משמש כדי להבטיח ששום צבירה קורית לפני הוספת אגוניסטים.
- להוסיף 20 μL של אגוניסט הרצוי, כגון 15 מיקרוגרם / מ"ל קולגן (1 מיקרוגרם / מ"ל הסופי) או 1.125 מ"מ החומצה הארכידונית (75 מיקרומטר הסופי), לתוך קובט. מיד מתחיל להקליט תחת בחישה אוטומטית רציפה על ידי לחיצה על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב צמוד aggregometer.
הערה: התוספת של אגוניסט גורמת הפעלת טסיות. אגרגטים טסיות ניתן להבחין בבירור קובט זכוכית בסוף הניסוי (איור 1A; righקובט t). - ההקלטה נפסקת באופן אוטומטי לאחר 6 דקות. בשלב זה, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על הסמל להציל את המחשב.
הערה: החישוב של שיעור הצבירה מבוצעת על ידי המחשב, אשר מבטא את התוצאות בסופו של תהליך ההצטברות כאחוז. - לנתח את הנתונים.
- לקבלת מידע נרחב נוסף על פרוטוקולים להכנת השעיות טסיות נשטפו ומדידת turbidimetric של הצטברות טסיות, מתייחס עיתונים אחרים שחברו מומחים בתחום 12, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוכנת aggregometer אוטומטית מייצרת את עקומות צבירה ונותנת את הערכים עבור צבירה מירבית באחוזים. הערכים ניתן להעתיק תוכנה לניתוח נתונים על מנת לבצע ניתוח סטטיסטי ולדמיין ערכי צבירה מירבית בצורה של תרשימים ברים. לחלופין, כל נקודה בודדת של עקומות צבירה ניתן לייצא ברציפות לתוך תוכנת גיליון אלקטרוני ולאחר מכן התוכנה הסטטיסטית (למשל GraphPad) כדי להמחיש את עקומות. חוקרים אחדים להשתמש המדרון המקסימאלי של עקומת הצבירה לחשב את המהירות ואת השטח מתחת לעקומה להעריך פעילות טסיות. השעה בפיגור ושינוי צורה יכולים גם להיות דמיינו גרפית.
דוגמה אופיינית עקומת צבירה של טסיות אדם שנשטפו בתנאים מבוקרים (H 2 O) מוצגת באיור 2A. תוספת של אgonist (קולגן), מושרת (לאחר עיכוב קל) שקע עקום הצבירה שנגרם עקב שינוי הצורה של טסיות. ואז, אחוז הצבירה המוגבר בהדרגה לאורך זמן עד ערך מרבי הושג בסביבות 3-4 דקות. ירידה קלה באחוז הצבירה נצפתה לקראת סוף הקלטת 6 דקות, אשר משקפת כמה מפירוק. כמו באיור 2A-B, אדם preincubating נשטף טסיות עם מעכב ערוץ Panx1 FCF הכחול המבריק, בריכוז של 1 מ"מ, האטה או לחלוטין בטלתי את שינוי הצורה טסיות הראשוני וחסם צבירת מושרה הקולגן של טסיות הנשטפת המתקבל 5 מתנדבים בריאים שונות שאינן קשורות. כאשר טסיות שבו preincubated עם ריכוז נמוך יותר (100 מיקרומטר) של FCF הכחול המבריק, ההשפעה המעכבת של הצבע על תגובות מושרות קולגן ושינוי צורה לא נצפה יותר (ראה איור 2A עבור דוגמא). Quantification מהתגובות צימות טסיות דם הנגרמת על ידי 1 מיקרוגרם / מ"ל קולגן גילה כי 1 מ"מ בריליאנט בלו FCF מופחת משמעותית התגובות צבירה מירבית לעומת תנאי השליטה וכן ריכוז נמוך (100 מיקרומטר) של מעכב Panx1 (איור 2C). לעיכוב של הצטברות טסיות היה ספציפי עבור תגובות מושרות קולגן ולא בשל תופעות לוואי בלתי רצויות של FCF הכחול המבריק (על כדאיויות תא, למשל) כמו באותו הריכוז של הצבע (1 מ"מ) לא השפיע על תגובת הצבירה המושרית על ידי אחר אגוניסט, כלומר 75 מיקרומטר AA, כפי שמודגם באיור 2D. תוצאות אלה מאשרות את התפקיד הספציפי של ערוצי Panx1 בתגובות צבירה מושרה-קולגן של טסיות אדם שאנחנו ואחרים הראינו בעבר עם מעכבים תרופתיים אחרים של Panx1 כגון probenecid, mefloquine, ואת פפטידים Panx1 10 ספציפית 7, 8.
איור 1: aggregometry. (א) תמונת נציג cuvettes זכוכית (המכיל מגנט בחישה) המשמש aggregometry. קובט משמאל מראה טסיות המנוחה תוך קובט מימין ממחיש אגרגטים טסיות לאחר ההפעלה המושרה קולגן. (ב) תמונת נציג של aggregometer 8-היטב למדידות turbidimetric. הבארות בשימוש (כוכבית) כדי לדגור השעיות טסיות נוכחים קובט זכוכית ב 37 מעלות צלזיוס, ואלה המשמשים את המדידות (חץ לבן) מסומנים ב ג אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ריכוז גבוה של הפעלת טסיות בלוקים FCF כחול מבריק בתגובה קולגן. (א) עקבות נציג של צבירת מושרה הקולגן של אדם שנשטף טסיות המתקבלת מאותו מתנדב בריא (V1) בתנאים מבוקרים (H 2 O; כחול כהה) או לאחר 7 דקות preincubation עם מעכב Panx1 FCF הכחול המבריק ב 1 מ"מ ( תכלת) או 100 מיקרומטר (צבע כחול ביניים). עקבות צבירה נרשמו עבור 6 דקות. (ב) עקבות נציג של צבירת מושרה הקולגן של אדם שנשטף טסיות המתקבלת 4 מתנדבים בריאים (V2-V5) לאחר preincubation 7 דקות עם מעכב Panx1 FCF הכחול המבריק (1 מ"מ). (C) כימות תגובות צבירה מירבית של אדם שנשטפו טסיות בתנאים מבוקרים (בר לבן) או לאחר 7 דקות preincubation עם FCF הכחול המבריק ב 100 מיקרומטר (בר אפור) או 1 מ"מ (בר שחור). N = 5. **** P0; 0.0001; ANOVA ואחריו שלאחר הבדיקה של Bonferroni להשוואה מרובים; תוצאות מבוטאות ממוצע ± SEM. (ד) עקבות נציג של צבירה מושרת AA של אדם שנשטף טסיות המתקבלת 5 מתנדבים בריאים (V1-V5) לאחר preincubation 7 דקות עם מעכב Panx1 FCF הכחול המבריק (1 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש עניין רב במציאת תרופות חדשות המסוגל ויסות תפקוד הטסיות כדי למנוע פקקת ללא שיפור את הסיכון לדימום. לשם כך, בבדיקות מעבדה במבחנה אשר יכול באמינות reproducibly לפקח תגובות אגרגציה טסיות אדם נחוצות לחלוטין. aggregometry Turbidimetric הוא טכניקה קלה לביצוע. עם זאת, כמה אמצעי זהירות צריכה לזכור. המדידות צריכות להתבצע תחת בחישה מתמדת כמו תהליך ההצטברות הוא תלוי במידה רבה בחישה. כמו כן, חשוב לשמור על טסיות בטמפרטורה פיזיולוגית של 37 מעלות צלזיוס, כדי למנוע כל סוג של הפעלה מוקדמת. Preactivation של טסיות יכול להתרחש גם במהלך איסוף הדם נשטף הכנה טסיות, שמוביל צבירה ספונטנית. לפיכך צעדים זהירים צריכים להילקח במהלך ההליך המלא של הכנת טסיות.
Turbidimetry מבוססת on המדידה של OD של השעיה טסיות. זה הופך את הטכניקה המתאימה למדידת צבירה בדם כולה בשל נוכחותם של תאי דם אדומים. לפיכך, turbidimetry יכול להתבצע רק על PRP או טסיות נשטף מבודד PRP. למרות קל להתמודד עם ודי זול, turbidimetry הוכר כחוסר רגיש לנוכחות של microaggregates 14, 15. כאשר microaggregates צפוי להיות בעלי חשיבות קריטית, aggregometry impedence, אשר מודד את שוני התנגדות חשמלית כאשר טסיות לדבוק ואלקטרודה שקוע דגימת דם citrated כולו, הוא מתאים יותר 16. תהליך הצטברות טסיות הוא גם תלוי במידה רבה ספירת הטסיות בתרחיף טסיות 17; cytometry זרימה משמש בחולים הסובלים תרומבוציטופניה 18, ממי את המספר המרבי של טסיות כיניתן להשיג אינו מספיק עבור turbidimetry. עם זאת, היתרון הכללי של turbidimetry הוא שהיא מאפשרת ניתוח מפורט של טסיות דם, כגון שינוי צורה חלוקה, אשר לא ניתן להעריכם דגימות דם כולו.
חשוב להבין כי וריאציה טבעית צימות טסיות דם אדם קיימת עקב הבדלים בגיל, מין וסגנון חיים, כמו גם מצבם הבריאותי של שנושאת תפקוד טסיות מאותגרת 19, 20, 21. וריאציה טבעית כזו עשויה להיות בסדר הגודל של 10-20% על תוצאות turbidimetric, ובכך יש להקפיד, בעת ביצוע ופירוש ניסויים אלה, בקבלת טסיות בכמות מספקת של מתנדבים בריאים שאינם קשורים לאפשר סטטיסטיקה אמינה. הגבלה זו מתאזנת עם זאת בשל העובדה כי מדידות turbidimetric הן מאוד לשחזור, לפחות כאשר צבירהנהלים הם גם טופלו על פני מעבדות. מאמצי תקינה נעשו על ידי האגודה הבינלאומית של פקקת ו haemostasis 22. מסיבה זו, turbidimetry עדיין במבחן נתקל לרוב לשקיל צימות טסיות דם הן מעבדות המדע קליניות ובסיסיות ונשאר טכניקה של בחירה לחקר השפעת הסמים על תגובות טסיות.
במחקר הנוכחי אנו הוכחנו, באמצעות turbidimetry למדוד תגובות טסיות נשטף אנושי, כי צבע מזון נפוץ בשימוש בריליאנט בלו FCF משפיע צימות טסיות דם. מחקרים אלקטרו אלגנטיים חשפו מצור ספציפי של ערוצי Panx1 ידי צבע 9 זה, 23. ואכן, ריכוזים גבוהים (1 מ"מ) של צבע זה הראו השפעות מעכבות משני שינוי צורה מושרה-קולגן צבירה מירבית אך 10-לקפל ריכוזים נמוכים (100 מיקרומטר)של הצבע לא השפיע על התגובה צימות טסיות דם. לפי חוות הדעת המדעיות על ההערכה מחדש של FCF הכחול המבריק (E133) כתוסף מזון, שפרסמו הרשות האירופית לבטיחות מזון 24, ריכוז המותר המרבי של FCF הכחול המבריק (משקל מולקולרי = 792.84 g / mol) הוא 500 מ"ג / ק"ג של מזון. עבור H 2 O, זה יתאים 0.63 מ"מ, המהווה ריכוז 1.59 פי נמוכה מזו עיכוב צימות טסיות דם הנגרמת קולגן בניסויים שלנו. בהנחה כי רק חלק קטן של הצבע ייקלט במעי לאחר בליעה דרך פה, וכי הצבע יהיה סוף סוף להיות מדולל בהיקף 5-L של דם של אדם מבוגר, הצריכה היומית של צבע מזון כחול זה יש סיכוי יחרוג לרמות נורמליות בעיקר לפני עלול להיות צפוי לתופעות לוואי על אגרגציה של טסיות. תופעות לוואי אפשריות של הריכוז הגבוה ביותר של צבע בניסויים שלנו על כדאיות טסיות, למשל, היונשלל על ידי הנוכחות של תגובות צבירה מוצקות כדי אגוניסט אחר (AA). גם התגובות AA מושפעים אלה אישרו כי השפעתו המעכבת של בריליאנט בלו FCF נראה לערב את מסלול איתות קולגן במיוחד. זה עולה בקנה אחד עם המחקר קודם שלנו 7 המפרט את המקום הספציפי עבור שחרור ATP בערוצים Panx1 בתגובת צימות טסיות דם הנגרמת קולגן.
על ידי התאמת פרוטוקול בידוד טסיות נשטף למחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה וישירה לבידוד טסיות הדם אנושי. לאחר מספר צעדי כביסה בצעו למעשה על ידי צנטריפוגה, טסיות הן resuspended במדיום מכבדת תנאים פיסיולוגיים מדויקים כולל pH, טמפרטורת עבודה וריכוז של יוני divalent אבל מבטיח העדר חלבוני פלזמה. זהו יתרון של טכניקה זו על פני שיטות חלופיות כגון סינון ג'ל שבה חיסול של קומפוננ פלזמההמציג אינו מתרחש 25.
כל השלבים של הליך הכביסה הם בעלי חשיבות מכרעת כדי להשיג תוצאות לשחזור בעת שימוש טסיות נשטף. עודף של תרופות עשוי להשפיע היצמדות טסיות דם, ולכן הוא חיוני כי מתנדב הבריא מתבקשים לא לקחת שום תרופות במשך לפחות 10 ימים שקדמו לאיסוף דם. בנוסף, איסוף דם מחייב כי הוא קדיש תשומת לב כדי למנוע טראומת וריד או זרימה איטית מדי מכיוון שהם עלולים לגרום לדור של טסיות תרומבין עוקבת הפעלת 22. בנוסח זהה, הפעלת טסיות פוטנציאל במהלך השלבים צנטריפוגה שטיפת ניתן להימנע על ידי שימוש חוזר של PGI 2. בשל יציבות נמוכה מאוד שלה, PGI 2 יש להוסיף בכל שלב הכביסה מיד לפני כל צנטריפוגה. Resuspension של טסיות חיץ ת"א (ב- pH פיזיולוגי) המכיל apyrase מבטיח כי התגובות טסיות להישארשָׁלֵם. הנוכחות של apyrase בתרחיף הטסיות היא חיונית כדי לאפשר את ההשפלה של ATP ו ADP כדי לשמר טסיות מתוך הקהיה של קולטני purinergic שלהם. ככל Panx1 במסלול איתות כרוכה הפעלת קולטן P2X1 במספר טסיות הדם האנושי עם הפעלת הקולטן קולגן, הוספנו ריכוז גבוה יחסית של apyrase (0.32 U / mL) על השעיית הטסיות כדי למנוע P2X1 הקהיה 7. כדי להימנע densensitization של קולטנים purinergic אחרים טסיות, ריכוזים נמוכים של apyrase יספיקו 10.
למרות ההליך של צעדי centrifugations ו כביסות סדרתי הם עתירים עבודה ודורש יותר זמן, טסיות הנשטפת שהושגה באמצעות פרוטוקול זה להציע את היתרון של יציבות גבוהה יותר ב 37 ° C (5-8 שעות) לעומת טסיות בשימוש ישירות PRP (1 -3 ח). עם זאת, הבחירה של שימוש PRP או טסיות נשטף צריכה להיעשות קאוברוב חשיבות וצריך לכלול שיקולים כגון כמות הדם זמין עבור הניסוי, אגוניסט לשמש גם את השאלה אשר תטופל. לדוגמה, כמחייבים של פיברינוגן כדי α2β3 integrins מופעל הוא המנגנון העיקרי המתווך צימות טסיות דם, היעדר פיברינוגן במספר טסיות הדם שטף עלול להשפיע על התגובה; בפרט, כאשר אגוניסטים חלשים (כגון ADP) משמשים 13. בעיה זו היא פחות קריטית כאשר אגוניסט חזק משמש, כגון תרומבין או קולגן, אשר הם בעצמם יכולים לגרום לשחרור של פיברינוגן מ-גרגרי α. ובכל זאת, אנו שגרתי להוסיף פיברינוגן אקסוגניים השעית טסיות אדם שנשטפה על מנת להגדיל את משרעת תגובת הצבירה המושרית על ידי קולגן.
לסיכום, באמצעות אדם שנשטפו טסיות turbidimetry, מצאנו כי צבע האוכל בריליאנט בלו FCF, דרך השפעתו המעכבת על Panx1, מייצגמעכב פוטנציאל של תפקוד טסיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע השויצרי (310030_162579 / 1 עד ברנדה הרנטה קוואק ו 320030_144150 כדי פיר Fontana) כמו גם על ידי מענק מטעם קרן הלב השויצרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E.
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
