Summary
Wir beschreiben eine einfache Methode zur Isolierung von gewaschenen Thrombozyten aus menschlichem Blut, gefolgt von Agonisten induzierte Thrombozytenaggregation Messungen durch Turbidimetrie. Als Beispiel verwenden wir diese Methode zur Untersuchung der Aggregationsreaktion von menschlichen Blutplättchen an Kollagen nach einer Vorinkubation mit dem Pannexin1 Kanalinhibitor Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetrie ist eine Labortechnik, die angewandt wird, um die Aggregation von Thrombozyten in entweder Plasma (platelet-rich plasma, PRP) oder in Puffern (gewaschenen Thrombozyten), durch die Verwendung von einer oder einer Kombination von Agonisten ausgesetzt zu messen. Die Verwendung von gewaschenen Plättchen aus ihrer Plasmaumgebung getrennt und in Abwesenheit von Antikoagulantien ermöglicht intrinsische Thrombozyten Eigenschaften zu studieren. Unter den großen Panel von Agonisten, Arachidonsäure (AA), Adenosin-di-phosphat (ADP), Thrombin und Kollagen sind die am häufigsten verwendet. Die Aggregationsreaktion wird durch Messung der relative optische Dichte (OD) über die Zeit der Thrombozytensuspension unter ständigem Rühren quantifiziert. Platelets in homogener Suspension begrenzt den Durchtritt von Licht nach der Zugabe eines Agonisten tritt Plättchenformänderung eine geringe vorübergehende Zunahme des OD erzeugen. Nach diesem anfänglichen Aktivierungsschritt, bildet allmählich Thrombozytenklumpen, die den Durchgang von Licht durch die Suspension als result verminderter OD. Der Aggregationsprozess wird schließlich als ein Prozentsatz ausgedrückt, verglichen mit dem OD-Wert von plättchenarmen Plasma oder Puffer. Rigorose Kalibrierung ist zu Beginn jeden Versuch somit unerlässlich. Als allgemeine Regel gilt: Kalibrierung auf 0% wird durch Messung der OD einer nicht-stimulierten Plättchensuspension eingestellt, während der OD des Suspensionsmediums Messung keine Blutplättchen enthalten, einen Wert von 100% entspricht. Die Thrombozytenaggregation wird als Echtzeit-Aggregationskurve allgemein sichtbar gemacht. Turbidimetrie ist eines der am häufigsten verwendeten Labortechniken zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion und wird als der historische Goldstandard und für die Entwicklung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe bei der Hemmung der Thrombozytenaggregation Ziel verwendet. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für 1) Herstellung von humanen Thrombozyten gewaschen und 2) turbidimetrische Analyse von Kollagen-induzierter Aggregation von menschlichen gewaschenen Blutplättchen mit dem Lebensmittelfarbstoff Brilliant Blue FCF vorbehandelt, das vor kurzem war IdenFertigt als Inhibitor der Pannexin1 (Panx1) -Kanäle.
Introduction
Thrombozyten sind entscheidende Bestandteile des Blutes und ihre Hauptfunktion-zusammen mit Gerinnungsfaktoren-ist Blutungen nach der Blutgefäßverletzung zu stoppen. Thrombozyten sind klein (2-3 um) , kernlose Fragmente von Megakaryozyten des Knochenmarks abgeleitet 1. Platelets zirkuliert im nicht aktivierten Zustand, in dem sie erscheinen, als linsenförmige Strukturen. Bei Unterbrechung des Endothels, sammeln Blutplättchen an der Stelle der Blutgefäßverletzung um das Loch zu stecken, einen Prozess, die primäre Hämostase genannt. Anfänglich legen Plättchen zu subendothelialen Moleküle wie Kollagen und von - Willebrand - Faktor, dass 2 als Ergebnis der verletzungs Adhäsionsschritt ausgesetzt sind. Dann sie ihre Form verändern und chemischen Boten-Aktivierungsschritt absondern. Schließlich verbinden sie miteinander durch Rezeptoren-Aggregationsschritt überbrücken. Primäre Hämostase wird durch einen sekundären Prozess, der die Aktivierung der Gerinnungskaskade mit Fibrinablagerung, gefolgt, die Stabilisierungs die anfängliche Thrombus 2.
Akute ischämischen Ereignisse wie Herzinfarkt 3 führen oft von Thromben , die wegen körperlicher Störung (Bruch) ein atherosklerotischen Plaques bilden. Aktuelle Anti-Thrombozyten-Medikamente sind der Grundstein für die Behandlung dieser weit verbreiteten Krankheit, aber ihr klinischer Nutzen für Blutungen durch ein erhöhtes Risiko begrenzt. Die am meisten verschriebenen Arzneimittel in kardiovaskulären Patienten, Aspirin und anti-P2Y12 Verbindungen, zielen auf den Thromboxan - A2 und die ADP Bahnen 4 verbunden, die die Hauptwege , die zu Plättchenaktivierung sind. Allerdings innovative Forschung auf neue Ziele, die optimal antithrombotische Wirkung und hämorrhagisches Risiko ausgleichen würden, ist nach wie vor notwendig.
Von den 1960er Jahren 5 bis heute hat turbidimetrischen Aggregometrie eine entscheidende Rolle in der Forschung gespielt, unser Wissen über Plättchenreaktivität verbessern und in die Überwachung der Wirksamkeit von anti-thrombotischen Reagenzien beim Menschen. Turbidimetrie wurde zunächst extrahiert aus dem Blut zu PRP angewendet Proben. Tatsächlich Blutentnahme in Röhrchen durchgeführt, die eine schnelle und Citrat große Produktion von PRP erlaubt irgendeine Wirkung auf die Thrombozytenfunktion und Integrität ohne. Allerdings ist die Kurzzeitstabilität (ca. 3 h) von PRP und die verbleibenden plasmatische Enzyme, wie Thrombin, und die niedrige Calciumkonzentration im Zusammenhang mit potentiell artefactual Aggregationsprofilen sind von großem Nachteile für die Verwendung von PRP. Ein wichtiger Schritt ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Thrombozytentrennung mit weiteren Zentrifugieren und Waschen wurden die Schritte 6. Kurz gesagt, ist PRP von Vollblut auf der Säure-Citrat-Dextrose (ACD) gesammelt wird, isoliert und Plättchen werden nach serieller Zentrifugationsschritte isoliert, bevor sie in ein iso-osmotischen Phosphatpuffern (Tyrode-Puffer), enthaltend Glucose, menschliches Serumalbumin und zweiwertigen C resuspendiertationen (Ca 2+ und Mg 2+). Um Änderungen in Plättchenreaktivität zu vermeiden, wird der pH-Wert von Tyrode-Puffer sorgfältig bei 7,35-7,4 gehalten. Darüber hinaus unerwünschte Aktivierung von Plättchen wird durch Zugabe von Prostacyclin (PGI 2) vor einiger Zentrifugationsschritte vermieden. Schließlich Zusatz von Apyrase verhindert gewaschenen Plättchen aus resistent gegen die Wirkung von ATP / ADP. Die resultierende Plättchensuspension fehlt Koagulationsmittel Faktoren und die Stabilität der Plättchen durch mindestens zweifach erhöht ist im Vergleich zu dem PRP-Lösungen. Darüber hinaus ist die Tatsache, dass Blutplättchen inaktiv aber intakt gewährleisten die Reproduzierbarkeit der turbidimetrischen Messungen sind, und bietet die Möglichkeit, die Wirkung von Agonisten oder Antagonisten von Blutplättchen-Aggregation in optimaler Weise zu studieren.
Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir in einer neuen Studie ergeben, dass durch einen genetischen Ansatz, um die Bildung von Kanälen Panx1 Hemmen (knock-out-Mäuse) oder Erniedrigen Panx1 Kanalaktivität durch pharmakologischeAnsätze reduziert Kollagen-induzierte Plättchenaggregation 7. Panx1 bildet ATP-Freisetzung Kanäle, die in vielen Zelltypen , einschließlich humanen Thrombozyten ubiquitär exprimiert werden 7, 8. In der Tat haben wir gezeigt , durch Turbidimetrie auf menschliche Blutplättchen , dass eine 7 min Vorinkubation mit einer Gruppe von mehr oder weniger spezifischen chemischen Blocker (Probenecid, Mefloquin und 10 Panx1 Peptide) vor der Zugabe verschiedenen Agonisten hemmte spezifisch gewaschenen kollageninduzierte Thrombozytenaggregation während Thrombozyten Reaktionen auf AA und ADP waren nicht betroffen. Wir zeigten, dass die ATP-Freisetzung durch Panx1 Kanälen interferiert speziell in der GPVI-Signalweg zu Kollagen-induzierte Aggregation führt. Interessanterweise beeinflussen mehrere FDA-zugelassene Verbindungen mit Anwendungen bei anderen Krankheiten (Probenecid, Mefloquin) die Aktivität von Panx1 Kanälen in Blutplättchen. Einerseits eröffnet diese neue therapeutische Perspektiven wählenively Plättchenreaktivität ändern. Auf der anderen Seite sollte man mögliche Nebenwirkungen dieser Verbindungen in Betracht ziehen. In diesem Zusammenhang verwendet die sichere Lebensmittel - Farbstoff Brilliant Blue FCF in mehreren Bonbons und Energy - Drinks ist als selektiver Inhibitor von Panx1 9 beschrieben. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Isolierung von humanen gewaschenen Plättchen und turbidimetrische Messungen der Plättchenaggregation geeignet ist, die Wirkung des Farbstoffs Brillantblau FCF als Antagonist der Plättchenaggregation zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fünf unabhängige gesunde Probanden wurden zur Blutentnahme für die Thrombozytenaggregation und Isolierung Tests rekrutiert. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde erhalten und das Protokoll wurde von der Zentralen Ethikkommission der Universität Genf Krankenhäuser genehmigt. Alle Freiwilligen zertifiziert, gesund zu sein und keine plättchen störenden Medikamente während mindestens die 10 Tage genommen haben die Experimente vorhergehenden.
1. Puffer Vorbereitung für Menschen Blutentnahme und Washed Platelet Isolation
- Vorbereiten einer 100 ml einer wässrigen Lösung von Säure-Citrat-Dextrose (ACD) , um 1,4 g Citronensäure-Monohydrat Auflösen (C 6 H 8 O 7 • H 2 O, 66,6 mM), 2,5 g Trinatriumcitrat - Dihydrat (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H 2 O, 85 mM) und 2 g wasserfreie D (+) - Glukose. Der pH-Wert der Lösung beträgt etwa 4,5.
- Stocklösungen für Tyrode-Puffer wie folgt
- Bereiten Stammlösung 1 durch 80 g NaCl aufgelöst, 2 g KCl, 10 g NaHCO 3 und 0,58 g NaH 2 PO 4 · H 2 O in 500 ml destilliertem H 2 O. Die jeweiligen Endkonzentrationen 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM und 8,4 mM. Halten Sie die Lösung bei 4 ° C.
- Bereiten Stammlösung 2 durch Auflösen von 10,15 g MgCl 2 * 6 H 2 O (100 mM) in 500 ml destilliertem H 2 O - Lösung bei 4 ° C aufbewahren.
- Bereiten Stammlösung 3 durch Lösen von 10.95 g (100 mM) , CaCl 2 * 6 H 2 O in 500 ml destilliertem H 2 O - Lösung bei 4 ° C aufbewahren.
- Bereiten Tyrode-Puffer durch Verdünnen von 2,5 ml der Stammlösung 1 in einem Endvolumen von 50 ml mit H 2 O destilliert Dies entspricht Endkonzentrationen von 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO 3 und 0,42 mM NaH 2 PO 4 * H 2 O. der pH - Wert auf 7,35 und sterilisieren durch Filtern mit 0,22 & mgr; m-filters.
- Bereiten Tyrode-Albumin 0,35% Puffer (TA - Puffer 7) durch Verdünnen von 5 ml der Stammlösung 1, 1 ml der Stammlösung 2, 2 ml der Stammlösung 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml von 200 g / L humanem Serumalbumin und 0,1 g wasserfreies D (+) - Glucose in einem Endvolumen von 100 ml destilliertem H 2 O.
- Den pH - Wert auf 7,35 mit 1 N HCl eingestellt und die Osmolarität auf 295 mOsm / l durch Zugabe von destilliertem H 2 O (10% des Gesamtvolumens). Endkonzentrationen in dieser Lösung: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO 3, 0,38 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 0,91 mM MgCl 2 * 6 H 2 O, 1,82 mM CaCl 2 * 6 H 2 O Halten. TA-Puffer bei 37 ° C während des gesamten Experiments.
2. Blutentnahme
- Sammeln 45-50 ml venösen Blut aus der Antekubitalvene eine 19 G - Nadel und keine oder nur geringe Tourniquet, in 50 ml - Röhrchen conTaining ACD-Antikoagulans (ACD 1 Volumen für 6 Volumina Blut). Verwerfen Sie den ersten 1-2 ml Blut die Anwesenheit von Thrombin und Gewebefaktor zu vermeiden.
- durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens nach der Entnahme, mit der ACD das Blut vermischt. Inkubieren der Probe für 10 min bei 37 ° C.
3. Herstellung von menschlichen gewaschenen Blutplättchen
- Vorheizen Zentrifuge auf 37 ° C. Alle Zentrifugationsschritte unten werden bei dieser Temperatur durchgeführt.
- Versand der gesammelten Blut in 15 ml-Röhrchen (5 ml pro Röhrchen) und Zentrifuge bei 250 × g für 13 min PRP zu erhalten.
Hinweis: dieser Zentrifugationsschritt führt zur Herstellung von drei Schichten in der Probe: 1) die obere Schicht, zusammengesetzt aus Plasma, Blutplättchen und ein kleiner Anteil der weißen Blutkörperchen. 2) Die Zwischenschicht wird ein Teil reich an weißen Blutkörperchen. 3) Die Bodenschicht, die im wesentlichen aus roten Blutzellen besteht. - Sammeln Sie die PRP durch den oberen la Pipettierenyer vorsichtig in ein neues 15 ml-Röhrchen auf maximal Kontamination mit roten und weißen Blutzellen zu verhindern, und für 10 min bei 37 ° C inkubieren.
- Zentrifugiere die PRP bei 2200 · g für 12 min (bei 5 ml PRP).
HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt sollte mit geringer Bremse oder ohne Bremse durchgeführt werden. - Entfernen Sie den Überstand (plättchenarmes Plasma) und Resuspension sorgfältig das Pellet mit 10 ml TA - Puffer, der 2 & mgr; l / ml Heparin (5000 U / ml) und 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI 2 eine Kunststoff - Pasteurpipette verwenden. bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
- Fügen 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI 2 und zentrifugiert für 8 Minuten bei 1.900 xg (mit niedriger Bremse oder ohne Bremse).
- Entfernen Sie den Überstand und das Pellet mit 5 ml TA - Puffer , enthaltend 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI 2 eine Kunststoff - Pasteurpipette verwenden. bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
- Während der Inkubationsperiode pipettieren 150 ul der Thrombozytensuspension inin ein 1,5 ml-Röhrchen und zählen Blutplättchen, einen automatisierten Zellzähler (das erkennt die Größe der Blutzellen, durch Messen der Änderungen in der Gleichstrom-Widerstand) verwendet wird.
- Nach der 10 min Inkubation, fügen 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI 2 zu der Plättchensuspension und sofort bei 1.900 × g für 8 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und das Pellet auf eine Konzentration von 250.000 Thrombozyten / & mgr; l mit einem ausreichenden Volumen von TA - Puffer (dh wenn die Zellzahl liegt bei 500.000 pro uL, Resuspendieren in 10 ml TA - Puffer) , enthaltend 32 ul / ml Apyrase bei 0,01 U / ml (Endkonzentration 0,32 U / ml).
HINWEIS: Ein hohe Konzentration von Apyrase verwendet , um die Desensibilisierung von P2X1 - Rezeptoren durch spontane Sekretion von ATP 10, 11 in Abwesenheit von Agonisten induziert zu vermeiden. Dies ist wichtig, weil die Kollagen-induzierten Reaktionen, die durch schnelle parakrine / autokrine Aktivierung von P2X1 durch ATP induziert werden freigegeben from aktivierte Blutplättchen. Wenn der plättchen Signalweg nicht kritisch Erhaltung der P2X1-Funktion benötigt, verwendet 0,02 U / ml Apyrase. Mehrere Studien (besprochen in Mahaut-Smith et al. 10) zeigte , dass 0,02 U / ml Apyrase ADP - Rezeptor P2Y1 Desensibilisierung mit vernachlässigbarer P2X1 - Antworten vermeidet. - mindestens 30 min bei 37 ° C inkubieren, die Zellsuspension, bevor die Messungen durchgeführt werden aggregometric. Die Zubereitung ist stabil für 5 bis 8 Stunden.
4. Aggregometrie
- Bereiten Fibrinogen (56 mg / ml) in Tyrode-Puffer.
- Pipettiere 260 ul der Thrombozytensuspension in Glasküvetten (1A; linke Küvette) , die 10 & mgr; l Fibrinogen (56 mg / ml) und einen magnetischen Rührstab inkubieren dann die Suspension für 2 - 3 min bei 37 ° C in Inkubationsvertiefungen vorliegenden in dem Aggregometer (1B und 1C).
- Pre-Inkubation mit dem Panx1Inhibitor Brilliant Blue FCF von 10 & mgr; l einer 2,8 mM oder 28 mM Zugabe Stammlösung (Endkonzentration 100 & mgr; M und 1 mM jeweils) für 7 min bei 37 ° C.
- Kalibrieren den Aggregometers zu einem 100% assumptive Aggregationswert durch die OD einer Küvette gemessen , die 10 & mgr; l Fibrinogen (56 mg / mL), 10 ul Brilliant Blue FCF (2,8 mM oder 28 mM) und TA - Puffer ohne Blutplättchen.
- Platzieren Sie die Küvette in einer Aggregations auch unter automatischen Rühren und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers mit dem Aggregometer verknüpft (dh F1 drücken , wenn die Aggregation und 1 verwendet wird).
Hinweis: Dieses Experiment unten beschrieben enthält Brilliant Blue FCF. Die Verbindung zur Kalibrierung verwendet wird, hat auf die experimentellen Bedingungen eingestellt werden.
- Platzieren Sie die Küvette in einer Aggregations auch unter automatischen Rühren und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers mit dem Aggregometer verknüpft (dh F1 drücken , wenn die Aggregation und 1 verwendet wird).
- Kalibrieren den Aggregometers zu einem assumptive 0% Aggregationswert durch die gleiche Blutplättchenprobe , die unter Verwendung von für das Experiment unter automatischer stirrin verwendet wirdG.
- Platzieren Sie die Küvette in der Aggregations gut und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers mit dem Aggregometer verbunden. Warten Sie etwa 20-30 s, bevor Sie fortfahren. Diese Verzögerung dient dazu, sicherzustellen, dass keine Aggregation geschieht, bevor die Agonisten hinzufügen.
HINWEIS: Wie jeder Unterschied in der Thrombozytenzahl kann eine Auswirkung auf die gemessene OD haben, die 0% Kalibrierschritt muss für jede einzelne Messung wiederholt werden.
- Platzieren Sie die Küvette in der Aggregations gut und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers mit dem Aggregometer verbunden. Warten Sie etwa 20-30 s, bevor Sie fortfahren. Diese Verzögerung dient dazu, sicherzustellen, dass keine Aggregation geschieht, bevor die Agonisten hinzufügen.
- Fügen Sie 20 & mgr; l der gewünschten Agonisten, wie 15 ug / ml Kollagen (1 ug / ml final) oder 1,125 mM Arachidonsäure (75 uM final), in die Küvette. Sofort startet die Aufzeichnung unter kontinuierlichem automatischem Rühren durch die entsprechende Taste auf der Tastatur des den Aggregometer verknüpften Computers drücken.
HINWEIS: Die Zugabe des Agonisten induziert Thrombozytenaktivierung. Platelet Aggregate können deutlich in der Glasküvette am Ende des Experiments (1A unterscheiden; right-Küvette). - Die Aufnahme stoppt automatisch nach 6 min. An diesem Punkt speichern Sie die Daten, indem Sie auf das Symbol des Computers speichern klicken.
HINWEIS: Die Berechnung der Aggregationsrate wird durch den Computer durchgeführt, die die Endergebnisse des Aggregationsprozesses als Prozentsatz zum Ausdruck bringt. - Analysieren Sie die Daten.
- Weitere umfangreiche Informationen über Protokolle zur Herstellung von gewaschenen Thrombozyten - Suspensionen und Trübungsmessung der Thrombozytenaggregation, beziehen sich auf andere Papiere von Experten auf dem Gebiet 12 verfasst, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aggregometer Software erzeugt automatisch die Aggregationskurven und gibt die Werte für maximale Aggregation in Prozent. Die Werte können auf eine Datenanalyse-Software, um kopiert werden, um statistische Analysen durchzuführen und maximale Aggregation Werte in Form von Balkendiagrammen visualisiert werden. Wahlweise kann jeder einzelne Punkt der Aggregationskurven nacheinander in einer Tabellenkalkulations - Software exportiert werden und dann auf statistische Software (zB GraphPad), um die Kurven zu visualisieren. Einige Forscher verwenden, um die maximale Steigung der Aggregationskurve die Geschwindigkeit und die Fläche unter der Kurve zu berechnen Thrombozytenaktivität zu beurteilen. Die Verzögerungszeit und Formänderung kann auch grafisch visualisiert werden.
Ein typisches Beispiel für eine Aggregationskurve von gewaschenen humanen Thrombozyten unter Kontrollbedingungen (H 2 O) wird in 2A gezeigt. Die Zugabe des agonist (Kollagen), induzierte (nach einer kurzen Verzögerung) eine Vertiefung in der Aggregationskurve, die durch die Formänderung der Blutplättchen verursacht. Dann wurde der Prozentsatz der Aggregation allmählich erhöht, bis im Laufe der Zeit einen Maximalwert bei etwa 3-4 min erreicht. Eine leichte Abnahme des Prozentsatzes der Aggregation wurde gegen Ende der Aufnahme 6 min beobachtet, was eine gewisse Disaggregation widerspiegelt. Wie in 2A-B dargestellt ist , Vorinkubieren menschlichen Blutplättchen mit dem Panx1 Kanal - Inhibitor aus 5 Brilliant Blue FCF, bei einer Konzentration von 1 mM, verlangsamt oder völlig beseitigt die anfängliche Blutplättchenformänderung und blockierte kollageninduzierte Aggregation von gewaschenen Thrombozyten erhalten gewaschen verschiedene unabhängige gesunde Probanden. Wenn Blutplättchen in denen mit einer geringeren Konzentration (100 uM) von Brilliant Blue FCF, die hemmende Wirkung des Farbstoffs auf die Kollagen-induzierte Reaktionen und Formänderung vorinkubiert nicht mehr beobachtet wurden (2A für ein Beispiel siehe). Quantification der von 1 ug / ml Kollagen induzierten Blutplättchenaggregation Reaktionen ergab , dass 1 mM Brilliant Blue FCF maximale Aggregationsreaktionen signifikant reduziert , wie auch zu einer geringeren Konzentration (100 uM) von Panx1 Inhibitor (2C) zu Kontrollbedingungen verglichen. Hemmung der Thrombozytenaggregation war spezifisch für Kollagen-induzierte Reaktionen und nicht durch unerwünschte Nebenwirkungen von Brilliant Blue FCF (auf die Lebensfähigkeit der Zellen, zum Beispiel) als die gleiche Konzentration des Farbstoffes (1 mM) nicht die Aggregationsantwort beeinflussen, induziert durch ein anderer Agonisten, dh 75 & mgr; M AA, wie in 2D dargestellt. Diese Ergebnisse bestätigen die besondere Rolle der Panx1 Kanäle in Kollagen-induzierte Aggregation Antworten von menschlichen Blutplättchen , die wir und andere haben vorher mit anderen pharmakologischen Inhibitoren von Panx1 wie Probenecid, Mefloquin, und die spezifischen 10 Panx1 Peptide 7 gezeigt, 8.
Abbildung 1: Aggregometrie. (A) repräsentatives Bild von Glasküvetten (a Rührmagnet enthält) für Aggregometrie verwendet. Die Küvette auf der linken Seite zeigt ruhenden Blutplättchen während die Küvette auf der rechten Thrombozytenaggregate nach der Aktivierung kollageninduzierte zeigt. (B) repräsentatives Bild eines 8-Well - Aggregometer für die turbidimetrische Messungen. Die Vertiefungen verwendet (Stern) an Thrombozyten - Suspensionen in einer Glasküvette bei 37 ° C, und diejenigen , die für die Messungen (weißer Pfeil) sind in C angegeben verwendet brüten Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Eine hohe Konzentration von Brilliant Blue FCF Blocks Platelet Activation in Reaktion auf Kollagen. (A) Repräsentative Spuren von Kollagen-induzierter Aggregation von menschlichen gewaschenen Blutplättchen vom gleichen gesunden Freiwilligen erhalten (V1) unter Kontrollbedingungen (H 2 O; dunkelblau) oder nach 7 min Vorinkubation mit dem Panx1 Inhibitor Brilliant Blue FCF bei 1 mM ( hellblau) oder bei 100 & mgr; M (intermediate blauer Farbe). Aggregation Spuren wurden 6 min aufgezeichnet. (B) Repräsentative Spuren von Kollagen-induzierter Aggregation von menschlichen 4 gesunden Freiwilligen erhalten gewaschenen Thrombozyten (V2-V5) nach 7 min Vorinkubation mit dem Panx1 Inhibitor Brilliant Blue FCF (1 mM). (C) Quantifizierung der maximalen Aggregationsreaktionen des menschlichen gewaschenen Blutplättchen unter Kontrollbedingungen (weiße Balken) oder nach 7 min Vorinkubation mit Brilliant Blue FCF bei 100 uM (graue Balken) oder 1 mM (schwarze Balken). N = 5. **** P0; 0,0001; ANOVA durch Bonferroni-Post-Test folgte für mehrere Vergleich; Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. (D) Repräsentative Spuren von AA-induzierte Aggregation von menschlichen von 5 gesunden Freiwilligen erhalten gewaschenen Thrombozyten (V1-V5) nach 7 min Vorinkubation mit dem Panx1 Inhibitor Brilliant Blue FCF (1 mM). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es besteht eine großes Interesse neue Medikamente bei der Suche nach der Lage der Thrombozytenfunktion in der Reihenfolge der Modulation Thrombose ohne Erhöhung die Gefahr von Blutungen zu verhindern. Zu diesem Zweck werden in vitro Laboruntersuchungen , die zuverlässig und reproduzierbar Aggregationsreaktionen in menschlichen Blutplättchen sind absolut notwendig überwachen. Turbidimetrische Aggregometrie ist eine einfache Technik auszuführen. Allerdings müssen einige Vorsichtsmaßnahmen im Auge behalten werden. Die Messungen müssen unter kontinuierlichem Rühren durchgeführt werden, da der Aggregationsprozess beim Rühren weitgehend abhängig ist. Es ist auch wichtig, dass die Blutplättchen bei einer physiologischen Temperatur von 37 ° C zu halten, um jede Art von vorzeitiger Aktivierung zu vermeiden. Voraktivierung der Thrombozyten können auch bei der Blutentnahme auftreten und gewaschenen Thrombozyten Herstellung, spontane Aggregation führt. So vorsichtig Maßnahmen sollten während des gesamten Verfahrens von Blutplättchenpräparat eingenommen werden.
Turbidimetrie basiert on die Messung der OD der Plättchensuspension. Dies macht die Technik nicht geeignet für die Aggregation Messung im Vollblut aufgrund der Anwesenheit von roten Blutkörperchen. Somit kann Turbidimetrie von PRP isoliert nur auf PRP oder gewaschenen Plättchen durchgeführt werden. Obwohl leicht zu behandeln und ziemlich billig, Turbidimetrie wurde als unempfindlich gegenüber der Anwesenheit von Mikroaggregaten 14, 15 erfaßt. Wenn Mikroaggregate erwartet sind von entscheidender Bedeutung sein, Aggregometrie Impedanz, die die Variation des elektrischen Widerstandes misst , wenn Blutplättchen mit einer Elektrode in einem Citrat versetztem Vollblut - Probe eingetaucht haften, ist besser geeignet , 16. Die Plättchenaggregation Verfahren ist auch stark abhängig von Thrombozytenzahl in der Blutplättchensuspension 17; ist bei Patienten mit Thrombozytopenie 18, von denen die maximale Anzahl von Blutplättchen Durchflusszytometrie verwendet , diekann, ist für Turbidimetrie unzureichend erhalten werden. Allerdings ist der allgemeine Vorteil von Turbidimetrie, dass es eine detaillierte Analyse der Thrombozytenreaktivität, wie Formänderung und Disaggregation erlaubt, die nicht in Vollblut-Proben untersucht werden.
Es ist wichtig , dass die natürliche Variation in der menschlichen Thrombozytenaggregation zu erkennen , aufgrund der Unterschiede besteht in Alter, Geschlecht und Lebensstil sowie der Gesundheitszustand des Patienten , deren Thrombozytenfunktion 19 in Frage gestellt, 20, 21. Solche natürliche Variation in der Größenordnung von 10-20% in den turbidimetrischen Ergebnissen sein kann, so sollte darauf geachtet werden, bei der Durchführung und diese Experimente zu interpretieren, in Blutplättchen aus einem ausreichenden Anzahl von nicht verwandten gesunden Probanden zu erhalten zuverlässige Statistiken zu ermöglichen. Diese Beschränkung wird jedoch durch die Tatsache ausgeglichen, dass turbidimetrische Messungen in hohem Maße reproduzierbar sind, zumindest wenn die AggregationVerfahren sind in Laboratorien gut standardisiert. Standardisierungsbemühungen wurden von der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase 22 gemacht. Aus diesem Grund ist Turbidimetrie immer noch die am häufigsten auftretenden Test zur Messung der Thrombozytenaggregation in klinischen und der Grundlagenforschung Labors und bleibt eine Technik der Wahl für die Untersuchung der Wirkung von Medikamenten auf die Blutplättchen Antworten.
In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, Turbidimetrie unter Verwendung von Reaktionen in menschlichen gewaschenen Blutplättchen zu messen, dass ein häufig verwendete Lebensmittelfarbstoff Brillantblau FCF Plättchenaggregation beeinträchtigt. Elegante elektrophysiologische Untersuchungen haben eine spezifische Blockade von Panx1 Kanälen durch diesen Farbstoff 9, 23 offenbart. Tatsächlich hohe Konzentrationen (1 mM) dieses Farbstoffes zeigten eine hemmende Wirkung auf sowohl Kollagen-induzierte Formänderung und die maximalen Aggregation aber 10-fach niedrigere Konzentrationen (100 uM)nicht die Thrombozytenaggregationsantwort des Farbstoffs beeinflussen. Nach Ansicht des Wissenschaftlichen Stellungnahme zur Neubewertung von Brilliant Blue FCF (E133) als Lebensmittelzusatzstoff , herausgegeben von der European Food Safety Authority 24, die maximal zulässige Konzentration von Brilliantblau FCF (Molekulargewicht = 792,84 g / mol) 500 mg / kg der Nahrung. Für H 2 O, würde dies auf 0,63 mM entspricht, die eine 1,59-fach niedrigere Konzentration als die Aggregation in unseren Experimenten der Kollagen-induzierten Thrombozyten Hemmen ist. Unter der Annahme, dass nur ein kleiner Bruchteil des Farbstoff wird in dem Darm nach oraler Aufnahme absorbiert werden, und dass der Farbstoff wird schließlich in den 5-L Volumen von Blut einer erwachsenen Person verdünnt werden, die tägliche Einnahme von dieser blauen Lebensmittelfarbe wahrscheinlich hat weitgehend die ein normales Niveau zu überschreiten, bevor irgendwelche Nebenwirkungen auf die Thrombozytenaggregation erwartet werden kann. Mögliche Nebenwirkungen der höchsten Konzentration des Farbstoffs in unseren Experimenten auf Lebensfähigkeit der Blutplättchen zum Beispiel warendurch die Anwesenheit von festen Aggregationsreaktionen zu einem anderen Agonisten (AA) ausgeschlossen. Diese unbeeinflusst AA Antworten bestätigte auch, dass hemmende Wirkung von Brilliant Blue FCF scheinen speziell auf die Kollagen-Signalweg beteiligt. Dies ist in Einklang mit unserer früheren Studie 7 die spezifische Stelle für die ATP - Freisetzung durch Panx1 Kanäle in der Kollagen-induzierten Plättchenaggregationsantwort Detaillierung.
Durch die Anpassung des Protokolls von gewaschenen Thrombozyten Isolierung dieser Studie beschreiben wir eine einfache und unkomplizierte Methode für Blutplättchen aus menschlichem Blut isoliert. Nach mehreren Waschschritten durch Zentrifugation im wesentlichen durchgeführt, werden Blutplättchen in einem Medium resuspendiert, die genaue physiologische Bedingungen, einschließlich pH achtet, Arbeitstemperatur und Konzentration an zweiwertigen Ionen, sondern sichert die Abwesenheit von Plasmaproteinen. Dies ist ein Vorteil dieser Technik gegenüber alternativen Methoden wie Gelfiltration, in der Eliminierung von Plasma Kompoents tritt nicht auf 25.
Alle Schritte des Waschvorgangs sind von entscheidender Bedeutung, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wenn gewaschenen Plättchen verwendet wird. Eine Vielzahl von Medikamenten kann Plättchenreaktivität beeinflussen, so ist es wichtig, dass die gesunden Probanden gebeten, nicht für mindestens 10 Tage keine Medikamente nehmen Blutentnahme vorhergehenden. Darüber hinaus erfordert die Blutentnahme , dass darauf geachtet wird Vene Trauma zu vermeiden oder zu langsam fließen , da dies die Bildung von Thrombin und anschließende Plättchenaktivierung 22 führen kann. In der gleichen Richtung, potentielle Blutplättchen - Aktivierung während der Zentrifugations- und Waschschritte kann 2 durch die wiederholte Anwendung von PGI vermieden werden. Aufgrund seiner sehr geringen Stabilität, PGI 2 sollte vor jeder Zentrifugation sofort zu jedem Waschschritt hinzugefügt werden. Die Resuspension der Thrombozyten in TA-Puffer (bei einem physiologischen pH-Wert) enthält, stellt sicher, daß Apyrase plättchen Reaktionen bleibenintakt. Die Anwesenheit von Apyrase in der Plättchensuspension ist wichtig, den Abbau von ATP und ADP zu ermöglichen, um Blutplättchen aus einer Desensibilisierung ihrer purinerger Rezeptoren zu bewahren. Da die Panx1 Signalweg P2X1 - Rezeptor - Aktivierung in menschlichen Blutplättchen auf Kollagenrezeptoraktivierung umfasst, fügten wir eine relativ hohe Konzentration von Apyrase (0,32 U / ml) zu der Plättchensuspension , um P2X1 Desensibilisierung 7 zu vermeiden. Um densensitization anderer purinerger Rezeptoren in Blutplättchen, niedrigere Konzentrationen von Apyrase zu vermeiden würden ausreichen , um 10.
Obwohl das Verfahren von seriellen Zentrifugationen und Waschschritte sind arbeitsintensiv und erfordern mehr Zeit, die erhaltenen gewaschenen Plättchen unter Verwendung dieses Protokolls bieten den Vorteil einer höheren Stabilität bei 37 ° C (5-8 h) im Vergleich zu Blutplättchen direkt von PRP verwendet (1 -3 h). Allerdings sollte die Wahl PRP oder gewaschenen Plättchen der Verwendung hergestellt werden CAUsichtig und soll für das Experiment zur Verfügung Überlegungen wie die Blutmenge umfasst, auf den Agonisten sowie die Frage verwendet werden, das angegangen werden. Zum Beispiel, wie an aktivierte α2β3-Integrine der Fibrinogenbindung ist der Hauptmechanismus vermittelnde Thrombozytenaggregation, Abwesenheit von Fibrinogen in gewaschenen Thrombozyten könnte die Reaktion beeinflussen; Insbesondere dann , wenn schwache Agonisten (wie ADP) 13 werden verwendet. Dieses Problem ist weniger kritisch, wenn ein leistungsstarker Agonist verwendet wird, wie Thrombin oder Kollagen, die von selbst in der Lage sind, die Freisetzung von Fibrinogen aus α-Granula zu induzieren. Dennoch fügen wir routinemäßig exogene Fibrinogen an die gewaschenen humanen Plättchensuspension, um durch Kollagen induzierte die Amplitude der Aggregationsreaktion zu erhöhen.
Abschließend durch menschliche mit gewaschenen Blutplättchen und Turbidimetrie, fanden wir, dass der Lebensmittelfarbstoff Brillantblau FCF, durch seine hemmende Wirkung auf Panx1 stelltein potentieller Inhibitor der Thrombozytenfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfond (310030_162579 / 1 bis Brenda Renata Kwak und 320030_144150 zu Pierre Fontana) sowie durch einen Zuschuss von der Schweizerischen Herzstiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
