Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

подготовки и Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

Эта рукопись описывает эффективный, невирусный доставку MIR к эндотелиальным клеткам вектора ОГО / МНПА и их намагниченность. Таким образом, в дополнение к генетической модификации, такой подход позволяет магнитным руководством клеток и МРТ обнаружения. Метод может быть использован для улучшения характеристик терапевтических продуктов клеток.

Abstract

На сегодняшний день, доступные хирургические и фармакологические методы лечения сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) являются ограниченными и часто паллиативный. В то же время, генная и клеточная терапия являются весьма перспективными альтернативными подходами к лечению сердечно-сосудистых заболеваний. Однако широкое клиническое применение генной терапии в значительной степени ограничено отсутствием подходящих систем доставки генов. Разработка соответствующих векторов доставки генов может обеспечить решение текущих задач в клеточной терапии. В частности, существующие недостатки, такие как ограниченная эффективность и низка удержание клеток в поврежденном органе, может быть преодолено с помощью соответствующей клеточной инженерии (т.е. генетического) до трансплантации. Представлены протокол описывает эффективное и безопасное кратковременное изменение эндотелиальных клеток с использованием полиэтилениминовой суперпарамагнитные магнитной наночастицы (ПЙ / MNP) основой вектора доставки. Кроме того, алгоритм и методы клеточной характеристики определены. Успешное intracelluлар доставка микроРНК (MIR) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs) была достигнута без влияния на жизнеспособность клеток, функциональность, или межклеточной коммуникации. Более того, этот подход был доказан, чтобы вызвать сильный функциональный эффект введен экзогенный MIR. Важно отметить, что применение этого МНП на основе вектора обеспечивает клеточную намагниченность, с сопутствующими возможностями магнитного нацеливания и прослеживания неинвазивной МРТ. Это может обеспечить основу для магнитно-управляемых, генетически модифицированных терапевтических клеток, которые могут контролироваться неинвазивным с МРТ.

Introduction

Генная и клеточная терапия являются мощными инструментами, которые имеют потенциал для решения текущих задач в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на то , что оба этих подходы в настоящее время проходит испытания в клинических испытаниях, они еще не готовы для широкого клинического применения 1. Следует отметить, что общий подход к решению проблем, связанных с генной и клеточной терапии является разработка многофункциональных векторов доставки генов, пригодных для клинического применения. Отсутствие надежных и эффективных систем доставки генов является основной проблемой генной терапии. В то же время, генная инженерия клеточных продуктов до трансплантации может преодолеть серьезные проблемы клеточной терапии, такие как низкая эффективность (например, в сердечной области, только ~ 5% функциональное улучшение достигается после трансплантации стволовых клеток 1 ) и плохое удерживание / приживления на месте повреждения (то есть, задержка элемента падает ниже 5 - 10% в течение нескольких минут до нескольких часов рост-приложение, независимо от способа введения 2, 3, 4).

На сегодняшний день, вирусные векторы значительно превышают невирусные системы с точкой зрения эффективности, что привело к их более широкому применению в клинических испытаниях (~ 67%) 5. Тем не менее, вирусные транспортные средства несут серьезные риски, такие , как иммуногенность (и последующий воспалительный ответ, с тяжелыми осложнениями), онкогенность и ограничение в размере переносимого генетического материала 6. Из - за этих проблем безопасности и высокой стоимости производства вирусного вектора, использование невирусных систем является предпочтительным в некоторых случаях , 7, 8. Это особенно подходит для лечения расстройств , которые требуют коррекции переходных процессов генетической, такие , как экспрессия факторов роста , контролирующих ангиогенез (например, для лечения сердечно - сосудистых заболеваний) или deliveRy вакцин.

В нашей группе, система доставки была разработана путем комбинирования разветвленного 25-кД полиэтиленимина (PEI) и наночастиц суперпарамагнитного оксида железа (MNP) связаны друг с другом с помощью биотин-стрептавидина взаимодействия 9. Этот вектор является потенциальным инструментом для генной инженерии клеток, что позволяет их одновременного намагничивания до трансплантации. Последнее дает основание для магнитного наведения / удержания, что особенно перспективным в настоящее время, так как современные методы магнитные адресности успешно развиваются 10. Кроме того, в результате магнитно - чувствительные клетки имеют потенциал , чтобы быть неинвазивно контролируется магнитно - резонансной томографии (МРТ) или визуализации магнитных частиц 11, 12.

В случае вектора ОГО / МНПА, полиамин обеспечивает конденсацию нуклеиновой кислоты, и, таким образом защиту от унижающего фактора s, вектор интернализация в клетках, и эндосый побег 5. MNPS дополняют свойства ПЭИ, а не только с точки зрения магнитной ориентации, но также и за счет снижения токсичности известного PEI 7, 13, 14. Ранее, векторные свойства ПЭИ / МНП были скорректированы с точки зрения эффективности доставки (то есть, пДНК и микроРНК) и безопасности при использовании фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток человека 15, 16.

В этой рукописи, подробный протокол о применении PEI / MNPS для генерации микроРНК-модифицированных клеток описана 17. Для этой цели используется HUVECs и представляет собой установленную модель для ангиогенеза в пробирке. Они являются сложными для трансфекции и восприимчивы к воздействию токсичных 18, 19,осел = "Xref"> 20. Кроме того, мы предлагаем алгоритм для оценки таких клеток в пробирке, в том числе их адресности, межклеточной связи и обнаружения МРТ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Человеческие пуповины для выделения клеток были получены после родов из информированных, здоровых женщин , которые дали свое письменное согласие на использование этого материала для исследования в соответствии с Хельсинской декларацией. Этический комитет университета Ростока одобрил представленный исследование (рег. № А 2011 06, продолжительная 23 сентября 2013).

1. Подготовка трансфекции комплексов

  1. Биотинилирование полиэтиленимина (ПЭИ).
    1. Растворите разветвленный PEI в сверхчистой воде при перемешивании магнитной мешалки при 300 - 400 об в течение 24 ч при комнатной температуре (RT) и защищенный от света, чтобы получить раствор 0,18 мМ. Хранить раствор при температуре 4 ° С.
    2. Измерение концентрации первичных аминогрупп в полученном растворе 21, 22.
      1. С помощью 2% -ного раствора реагента нингидрином в качестве реагента 23 обнаружения амина путем смешивания 100 мкл прediluted образец (1: 200 сверхчистой водой) и 75 мкл реагента нингидрина. Инкубируют в течение 30 мин при 80 ° С. Охладить его и добавить 100 мкл 50% -ного этанола для стабилизации. Измерьте оптическую плотность при 550 нм на спектрофотометре поглощения.
      2. Создать стандартную кривую с использованием глицина.
        1. Готовит 0,1 М амина-N маточного раствора (0,75 г глицина в 100 мл деионизированной воды) и ее разведения, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200 и 1: 400, 1: 600. Измерить эти решения как на этапе 1.1.2.1 и создать участок с концентрацией и абсорбцией на осях.
        2. На основании полученного участка и измеренной оптической плотности раствора PEI, определяют концентрацию альфа-аминогруппы в PEI.
          Примечание: Внимание. раствора реагента нингидрина исключительно необходимо использовать под капотом и должны храниться в атмосфере азота. Это не может использоваться, когда цвет раствора изменяется из-за окисления.
    3. Растворяют 100 мг биотина линкера в сверхчистой воды непосредственно перед использованием, чтобы получить раствор 0,01 мМ. Рассчитать необходимое количество биотина, чтобы добавить к PEI путем умножения концентрации альфа-аминогруппы в ПЭИ (измеренное на этапе 1.1.2) на 20, чтобы получить необходимое количество (в моль) реагента биотинилирования.
      1. Добавьте биотин раствора к раствору PEI при рН 8-9 и инкубируют в течение 16 ч при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре.
    4. Удалить непрореагировавшую биотину с помощью гель-хроматографии на 23. Используйте коммерчески доступные столбцы, содержащие гель-фильтрацию среду, подходящую для очистки 25-кД PEI и следовать инструкциям производителя. Взять аликвот после очистки для измерения концентрации амина с использованием реагента амина обнаружения (этап 1.1.2) и определить эффективность биотина конъюгации (этап 1.2.2). Хранить полученный биотинилированный PEI при 4 ° С.
  2. символзации биотинилированного PEI.
    1. Определить концентрацию альфа-аминогруппы в PEI после биотинилирования, как описано в шаге 1.1.2.
    2. Определить степень PEI биотинилирования проверить процедуру сопряжения. Для количественного определения использует коммерчески доступный набор, который основан на применении HABA красителя (4'-hydroxyazobenzene-2-карбоновая кислота), чтобы обеспечить правильное колориметрическое определение уровней биотинилирования 24, 25. Следуйте инструкции производителя.
  3. Фильтрация MNPS и их характеристики.
    1. Фильтр имеющегося в продаже покрытого стрептавидина MNP через 0,45 мкм шприц-фильтр привод 16 с тем чтобы исключить большие токсичные агрегаты. Измерьте конечную концентрацию железа с использованием стандартного фотометрического анализа 26.
    2. Проверьте качество отфильтрованного MNPS путем записикривая намагничивания и визуализации TEM в соответствии со стандартными протоколами 27, 28.
      1. Развести суспензии MNP с дистиллированной водой и помещают 3 мкл полученной суспензии на 300 меш формвар угольным покрытием медную сетку для анализа ПЭМ. Затем поместите эту сетку на предметное стекло на нагревательную плиту и дайте ему высохнуть.
      2. Анализ образца с помощью просвечивающего электронного микроскопа при 120 кВ и проверить содержание элементарного с использованием детектора 27 рентгеновского излучения.
  4. 3-цветная маркировка трансфекции комплексов для сверхвысокого разрешения микроскопии.
    1. Добавьте 0,5% измеренные первичных аминогрупп в PEI с NHS-Эстер Атто 488 красителем следующих инструкциями изготовителя. Удалить избыток несвязанного красителя с помощью гель-хроматографии, как описано выше (этап 1.1.4). Измерьте полученную концентрацию аминогрупп с использованием нингидрином ASSAу (этап 1.1.2).
    2. Этикетка коммерчески доступный скремблированный MIR (И-MIR) с Cyanine5 красителем с использованием подходящего набора маркировки (15 , указанный в списке материалов). Измерьте полученную концентрацию флуорофор-MIR спектрофотометрически.
    3. Свеже этикетке МНП каждый раз с биотин-конъюгированного красителя (например, атто 565-биотин) в соотношении 1: 1000 вес / вес соотношение. Непосредственно применять краску после добавления MNP в MIR / PEI во время формирования трансфекции комплексов, в деталях в Delyangina и соавт. 16.

2. Приготовление клеток

  1. HUVEC изоляция.
    1. Изолировать клетки из пуповинной непосредственно после получения шнуры с использованием коллагеназы пищеварение из внутренней части шнура вены; следовать ранее разработанному протоколу 29.
      1. Инкубируют каждый шнур с ~ 60 ед / мл раствора коллагеназы типа IV в буфере - загруженный в тон пупочная вена - при 37 ° С в течение 13 мин.
    2. Для всех экспериментов, бассейн на HUVECs минимум от 5 пациентов.
      Примечание: Культивирование не должно превышать 4-5 пассажей. Не использовать клетки, зараженные микоплазмы, так как это приводит к снижению эффективности трансфекции. Загрязнение микоплазмы должны быть проверены на перед запуском протокола с использованием набора ПЦР для высокочувствительного обнаружения микоплазм.
      1. Тест на наличие микоплазмы.
        1. Центрифуга 1 мл клеточной культуральной надосадочной жидкости в течение 10 мин (13000 Xg). Приостановка осадок в 17 мкл дН 2 O и кипения (93 ° С) в течение 3 мин. Используйте 2 мкл суспензии для амплификации области ДНК, которая кодирует высоко консервативный рибосомный РНК (16S-рРНК) различных видов микоплазм.
        2. Выполните ПЦР с использованием 10 пмоль каждого праймера (прямого праймера: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; обратный праймер: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') в гребенкеination с коммерческим набором ПЦРА при следующих условиях: 94 ° C в течение 3 мин; 45 циклов при 94 ° С в течение 30 сек, 50 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 30 с; и конечное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин.
        3. Анализ ПЦР-продукта (292 п.н.) с помощью электрофореза в агарозном геле.
    3. Либо хранить Полученные клетки на долгий срок в жидком азоте или их культуры в среде для роста эндотелия с добавлением 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° С в атмосфере увлажняемом фи -е изд , содержащей 5% CO 2.
  2. HUVEC характеристика.
    1. Охарактеризуйте изолированный HUVECs с точкой зрения их функциональных возможностей , чтобы построить трубы в матрице базальной мембраны (например, Матригель) и их экспрессии эндотелиальных маркеров CD31 (тромбоциты эндотелий молекулы клеточной адгезии, РЕСЫ-1) в соответствии со стандартными протоколами 30, 31.

3. Трансфекция

  1. Trypsinize культуры акций HUVEC (смотрите стадию 4.1.2.) И вручную подсчитывать клетки с использованием гемоцитометра. Семя HUVECs на пластиковых культуры клеток - луночных планшеты подходящего размера, с начальной плотностью клеток приблизительно 13000 клеток / см 2 поверхности роста, 48 ч до трансфекции до 70-80% слияния пока не будет достигнуто.
  2. Приготовьте свежий микроРНК / PEI / MNP комплексов каждый раз.
    Примечание: Во-первых, микроРНК / PEI комплексы должны быть получены (шаги 3.2.1 - 3.2.3); Впоследствии, MNPS должны быть добавлены к раствору микроРНКа / PEI (этап 3.2.4), чтобы получить окончательную формулировку микроРНКа / ПЙ / MNP, используемую для трансфекции (этап 3.3).
    1. Рассчитать количество соответствующего коммерчески доступного MIR (омлет, помеченный или функциональные, смотрите шаг 4), используя концентрацию акций, предоставленных производителем. Используйте 2,5 пмоль MIR / см 2 поверхности роста клеток. Развести MIR в 5% растворе глюкозы к оbtain конечной концентрации 0,125 пмоль / мкл микроРНК.
    2. На основе количества микроРНК из стадии 3.2.1 и оптимальное соотношение NP 25 32, рассчитать необходимое количество PEI , используя его измеренной концентрации (этап 1.1.2). Развести PEI (за вычисленный требуемый объем) в равном объеме 5% раствора глюкозы. Добавьте полученный предварительно разбавленные ПЙ к раствору микроРНКа (со стадии 3.2.1) и вихрем полученной смеси в течение 30 сек.
    3. Инкубируйте полученный микроРНК / PEI смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
    4. Разрушать ультразвук MNPS при 35 кГц в течение не менее 20 мин в ванне ультразвука воды (список материалов) при комнатной температуре, добавляют соответствующее количество раствора МНПА в MIR / ПЙ (5 - 25 мкг железа / мл приготовленного MIR / ПМ / МНП смесь 16), вихревое течение 30 с, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре до готовности.
  3. Добавляют по каплям смесь, подготовленную микроРНК / ПЭИ / MNP непосредственно в культуральной среде на клетки. Используйте полученную смесь клеток кульр среда с MIR / ПМ / МНПОМ разводила в глюкозе в качестве раствора для трансфекции. Заменить эту смесь свежей культуральной среды 6 ч после трансфекции.

4. Анализ Вектор безопасности

  1. Исследование жизнеспособности клеток.
    1. Трансфекции HUVECs высевают в культуральный планшет 24-луночный (этапы 3.1 и 3.2); использовать Cy-3 MIR как пробники и скремблируются MIR (И-MIR) в качестве контрольных литниковых зондов для проточной цитометрии. Инкубируют при 37 ° С в атмосфере увлажняемом фи -е изд , содержащей 5% СО 2 в течение 24 ч.
    2. Собирают супернатант и клетки, трансфицированные от трипсином, используя 1x трипсин-ЭДТА в PBS, разбавленный добавляли к клеткам в течение 4 мин при 37 ° С. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин и использовать для анализа.
    3. Изучение жизнеспособности клеток и эффективность поглощения MIR через 24 ч после трансфекции с использованием проточной цитометрии с применением коммерчески доступное пятна различать живой / мертвые клетки; используют стандартные протоколы 15
  2. Изучить безопасность комплексов микроРНК / PEI / MNP для клеток в функциональных тестах.
    1. Оценка активности пролиферации трансфекции клеток.
      1. Трансфекцию HUVECs высевают в культуральную пластину 12-луночного (этапы 3.1 и 3.2) с функциональной антисмысловой микроРНК (например, анти-miR92a для HUVECs 31) и инкубируют при 37 ° С в увлажняемом атмосфере фи -е изд , содержащей 5% СО 2 в течение 24 ч.
      2. Использование коммерчески доступного набора для определения числа пролиферирующих клеток путем окрашивания Эду (5-этинил-2'-дезоксиуридина) и сканирование с лазером на основе конфокальной микроскопии. Используйте следующие параметры: микроскопию цель 40X с масляной иммерсии; лазерное возбуждение 633 нм (для 647-нм краситель в); 5 случайных полей, которые будут записаны в каждом образце. Вычислить скорость пролиферирующих клеток пути деления числа EDU-окрашенные ядер по количеству всех ядер (Hoechй окрашенных).
    2. Оценить способность трансфекции клеток с образованием трубки-подобные структуры, как описано ранее , 17, 31.
      1. Трансфекции HUVECs высевают в культуральный планшет 24-луночный (этапы 3.1 и 3.2) с Scr-Mir и инкубируют в течение 48 ч при 37 ° С в атмосфере увлажняемом фи -е изд , содержащей 5% CO 2. Сбор трансфицированных клеток (как на этапе 4.1.1).
      2. Семенной 3,5 х 10 4 модифицированных HUVECs в 24-луночных планшетах , покрытых 140 мкл базальной мембраны матрицы. Инкубировать в течение 18 ч при 37 ° С в атмосфере увлажняемом фи -е изд , содержащей 5% CO 2.
      3. Запись изображения 10 случайных полей в каждую лунку с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (дифференциальный интерференционный контраст) и анализируют с использованием программного обеспечения ImageJ с плагином «Ангиогенез Analyzer». Включают в себя такие параметры, как общая длина ветвей, число ветвей, и количества junctiДополнения в оценке. Сравните это с необработанным контролем.
  3. Изучение возможного токсического влияния трансфекции комплексов на щелевых контактах (ГДж) -опосредованные межклеточную коммуникацию (GJIC) путем тестирования 3D восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) 33 в 3D.
    1. Семенной клеток на покрытый желатин предметных стекол с тонким дном, подходящим для живых клеток изображений (масло погружения). Трансфекции клеток, как описаны выше на стадии 3.2 с немеченым, нефункциональным микроРНКом (Scr-MIR) и инкубируют в течение 24 ч.
    2. Подготовка клетки для визуализации, загрузив их с Кальцеином непосредственно перед микроскопией. В частности, заменить культуральной среды свежей средой, содержащей 5 мкМ кальцеина, инкубируют в течение 20 мин, промывают PBS и добавляют свежую культуральную среду. Предварительно нагреть инкубатор микроскопа до 37 ° С и регулировать концентрацию СО 2 до 5%.
      Примечание: Все реагенты должны быть теплыми, чтобы избежать клеток ContracТион перед измерением.
    3. Использование лазерного возбуждения на 561 нм для визуализации клеток и эксперимента FRAP. Во-первых, вручную выбрать ячейки для измерения в качестве областей интереса (ROI); тест-клетка, должна иметь по крайней мере 3 соседние клетки. Определить опорную ячейку с яркой, стабильной флуоресценции, которая не будет беленой. Определение пределов в г-стека. Регистрируют флуоресценцию от верхней части клеток к нижней части, чтобы включать в себя 10 - 15 слоев.
    4. Отбеливатель тестовых клеток с использованием 100% мощности лазера и регистрируют последующее восстановление флуоресценции (за счет ГДж-специфического переноса красителя из соседних сот) в течение следующих 15 мин. Запись необработанных данных в Z-стеки каждые 60 сек. В общей сложности выполнения измерений FRAP с не менее 5 - 10 тестовых клеток на эксперимент. Сравните результаты нетрансфецированные клеток.

5. Тестирование эффективности трансфекции

  1. Исследование поглощения микроРНК.
    1. Подготовка проб, как описано в STEп 4,1 и использовать их одновременно, чтобы определить поглощение MIR с проточной цитометрии.
  2. Подтверждение и описать внутриклеточную локализацию трансфекции комплексов с помощью конфокальной и структурировано сверхразрешения освещения микроскопии (SIM).
    1. Семя HUVECs на покрытый желатин покровных стекол, помещенных в лунках 24-луночных культуральных планшетов, как описано выше (этап 3.1). Трансфекции клеток с 3-цветной маркировкой микроРНК / ПЭИ / МНП (этап 1.4) и инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С в атмосфере увлажняемом фи -е изд , содержащей 5% CO 2.
    2. Промыть покровные сначала с 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатно-солевом буфере (PBS), а затем с помощью только PBS. Закрепить клетки путем инкубации в 4% параформальдегида (PFA) при 37 ° С в течение 15 мин и тна ядер с DAPI следующими стандартными протоколами 16. Промыть 3 раза на шейкере (15 мин каждый), чтобы удалить избыток красителя.
      Примечание: PFA является канцерогенным и должен быть обработан тщательно.
    3. Поместите прepared покровные на предметные стекла микроскопа с использованием подходящего монтажного среды, дайте им высохнуть, по крайней мере в течение 1 ч, и использовать их для микроскопии, как описано ниже.
    4. Получение изображений с использованием цели масла погружения 63x и следующие SIM настройки: 405-, 488-, 561- и 633-нм лазерные линии для возбуждения; Режим г-стек с глубиной 32-битной на 5 углов, 5 фаз, с усреднением 4; Сетки G2 с 405 лазерной линии, G3 с 488, G4 с 561, и G5 с 633.
  3. Оценка функциональности поставляемого MIR с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени в MIR / ПЭИ / МНП-HUVECs по сравнению с необработанными.
    1. Трансфекции HUVECs высевают в шагах 12-луночный планшет для культивирования (3.1 и 3.2) с функциональной антисмысловой MIR (например, анти-miR92a для HUVECs 31) и инкубируют в течение 48 ч при 37 ° С в увлажняемом атмосфере фи -е изд , содержащей 5% CO 2.
    2. Оценить доставку анти-miR92a и обработку с RT-КПЦР с использованием коммерчески доступных наборов (см материалов); следовать тон инструкции изготовителя, как описано в другом месте 17, 31. Параллельно с этим , рассмотрим экспрессию гена - мишени (например, 31 ИНТЕГРИН АЛЬФА-5).
      Примечание: AntagomiR поставка против эндогенного MIR предпочтительнее мимики, так как она обеспечивает измерение фактических результатов от MIR, а не просто его внутриклеточного накопления.

6. Cell Таргетинг оценки и Magnetic разделения клеток

  1. Ориентации в статических условиях в пробирке клетки.
    1. Трансфекции HUVECs в 24-луночный планшет (2,5 пмоль / см 2 SCR-микроРНК, NP 25, и 15-25 мкг / мл МНП), инкубировать в течение 24 ч, мыть и собирать , как описано выше (этап 4).
    2. Смешайте полученный осадок клеток от 1 хорошо с 1 мл свежей культуральной среды и поместить его в лунки 12-луночного планшета. Фикс небольшого магнита локально (на стороне) в нижней части пластины с помощью ленты.
    3. Инкубируйте клеточную суспензию в течение 24 ч и наблюдать за прикрепление клеток и рост в области над магнитом и в области без магнита. Для качественной оценки, с помощью обычного инвертированного микроскопа.
  2. Ориентации в смоделированных динамических условиях в пробирке клетки.
    1. Трансфекции HUVECs в 24-луночный планшет на шагах 3.1 и 3.2 (2,5 пмоль / см 2 Cy- 3 микроРНК, NP 25, и 15 - 25 мкг / мл МНП), инкубируют в течение 24 ч, промыть, и собирать с помощью обработки трипсином , используя 1x Трипсин-ЭДТА разводили в PBS добавл ли к клеткам в течение 4 мин при 37 ° с. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин.
    2. Смешайте полученный осадок клеток от 1 хорошо с 1 мл свежей культуральной среды и поместить его в лунку 12-луночного планшета. Фикс небольшой магнит локально (на стороне скважины) с помощью ленты. Место культуры пластины на шейкере и инкубировать клеточную суспензию в течение 12 ч при 150 оборотах в минуту для имитации динамических условий 34.
    3. Вымойте клетки и исправитьих с помощью 4% PFA. Пятно ядер с DAPI 16. Запись прикрепление клеток с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с лазерным возбуждением на 514 нм, режим Z-стека (5 - 12 ломтиков), чтобы получить исходные данные, а максимальная интенсивность обработки проекции изображения для создания изображения для анализа.
  3. Количественный анализ магнитно-реагирующих и не реагирующих клеток.
    1. Трансфекции HUVECs в 24-луночный планшет (2,5 пмоль / см 2 SCR-микроРНК, NP 25, и 15-25 мкг / мл МНП), инкубируют в течение 24 ч, мыть и собирать , как описано выше (этап 6.2.1) , Предварительно теплой PBS и сортировки клеток буфер (стерилизуют фильтрацией, см Перечень материалов) до 37 ° С. Повторный приостановить осадок клеток, полученный из каждой лунки 500 мкл буфера для сортировки клеток.
    2. Применение этой клеточной суспензии до магнитных столбцов сортировки, установленных прилагаемого магнит, мыть колонки на магните 3 раза свежей сортировки клеток буфера, и собирают проточный как Маньетитически не реагирует фракция (маг-).
    3. Удалить столбцы из магнита и сразу собирает фракцию магнитно отзывчивый клеток (МАГ +), нажав свежие клетки сортировки буфера через колонку с помощью плунжера.
    4. Центрифуга как и маг- МАГ + при 300 мкг в течение 10 мин. Повторный приостановить осадок клеток в PBS, подсчет клеток, и оценить жизнеспособность клеток с синим пробирным 35 запретным Трипановым. Используйте полученный осадок клеток либо для долгосрочного анализа (т.е. повторного семени и оценки после 24, 48 и 72 ч в культуре 17) или непосредственно для проточной цитометрии (шаг 4.1.).
  4. Определение железа загрузки трансфицированных клеток.
    Примечание: В процессе подготовки, любой контакт зондов клеток с оксидом железа материалов и инструментов следует избегать.
    1. Сбор трансфицированного HUVECs и нетрансфецированный контроль (как на этапе 4.1.1). Промывают собранные клетки дважды в 2% BSA в PBS 36 б у тщательно перемешивая клетки с 1 мл этого буфера для промывки, а затем центрифугировали при 300 х г в течение 10 мин. Повторное приостановить полученный осадок клеток в 250 мкл PBS, добавляют 100 мкл 4% PFA, и инкубируют в течение 20 мин, чтобы исправить клетки. Промыть 3 раза PBS, как описано выше.
    2. Повторное приостановить полученный фиксированный осадок клеток в 110 мкл PBS и передать его на 100-мкл ПЦР-пробирки.
      1. Возьмите 10-мкл аликвоты для подсчета клеток и использовать оставшийся образец для магнитной спектроскопии частиц (MPS).
    3. Выполните измерение на коммерчески доступное устройстве MPS. Во время измерения, применяются следующие параметры: магнитное поле В приводе = 25 мТл и частоту F 0 = 25 кГц. Для количественного определения железа образцов, нормализуют третьей гармоники A 3 от MPS-спектра в соответствующую A 3, исх из эталонного образца с МНП с известным количеством железа 2,1 мкгXref "> 37. Использование необработанных клеток в качестве контроля.

7. Пределы обнаружения Определение МРТ

  1. Подготовка клеток.
    1. Семенное HUVECs в 6-луночном планшете и трансфекции (2,5 пмоля / см 2 И-микроРНК, NP 25, и 15 - 25 мкг / мл МНП) в двух экземплярах или трех повторах в соответствии с требуемым количеством клеток (для фантомнога подготовки). Инкубируйте клетки в течение 24 ч и мыть, собирать, и зафиксировать их с 4% PFA, как описано выше (этап 4).
    2. Количество полученных клеток, готовят аликвоты с соответствующими количествами клеток (например, 10 3, 10 4, 10 5 и т.д.), и корректировать их объем до 50 мкл.
  2. Агарозном подготовка фантом
    1. Подготовьте несколько слоев 2% агарозов в 50-мл пробирке с различными количествами трансфицированных клеток встроенных между слоями 38. Во время подготовки, и разрушать ультразвук центрифуги горячего агарозном 38уничтожать воздушные пузырьки, которые вызывают артефакты.
      Примечание: Важно отметить, что фантомы , содержащие 5,5 × 10 5 HUVECs обработанного немагнитным микроРНКа / PEI комплексы должны быть приготовлены таким же образом , чтобы служить в качестве контроля.
  3. Сканирование полученный в пробирке фантомов с системой МРТ 7,1 Т животного после размещения фантом централизованно в катушке, параллельно оси магнитного поля.
    1. Применяют следующие параметры последовательности для получения последовательности градиентного эхо: TR = 66 мс; ТЕ 1 / ТЕ 2 / ТЕ 3 / TE 4 / TE 5 / ТЕ 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 мс; флип угол = 3 °; Матрица = 128 × 128, интерполированное до 256 х 256; поле зрения = 42 мм; 100%; средние = 1, эхо длина поезда = 1; толщина среза = 1,5 мм; и 16 ломтиков.
    2. Оценка и ослабление сигнала всех четырех эхо - сигналов от времени и вычислить R2 * карты (R2 * = 1 / T2 *) , используя соответствующее программное обеспечение, как описано в другом месте 39,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Основной целью предлагаемого протокола является создание магнитно - реагирующие микроРНК-модифицированных клеток и провести их точную характеристику (рисунок 1). В результате эффективно трансфицированные клетки, реагирующие на магнитную селекцию и руководство и обнаруживаемые с МРТ, должны быть получены.

Во- первыхи, тождество изолированного HUVECs было подтверждены типичным окрашиванием с эндотелиальными маркерами CD31 (РЕСЫ) (рис 2A) и их способностью образовывать трубки на соответствующей матрице базальной мембраны (рис 2В). Полученные клетки взяли вверх по микроРНКу введенного PEI / МНП очень эффективно; микроскопии показали , что все клетки были положительными для сигнала меченой MIR (Су3) 24 ч после трансфекции (фиг 3A). Важно отметить, что ни смерть клеток не была зафиксирована по сравнению с необработанными клетками (рис 3B), и пНПУ внешний вид сохранялся (фиг.3А). Как наблюдали с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, сигнал Cy3-Mir в основном находится внутри клеток. Кроме того, более детальное исследование внутриклеточной локализации всех частей вектора трансфекции и MIR проводили с более высоким разрешением, используя 3-цветных меченых комплексов. SIM, MIR, PEI, и МНП сигналы были все обнаруженные в цитоплазме в перинуклеарной области (рис 3C).

Кроме того, детальное исследование трансфекции вектор безопасности доказало , что микроРНК / ПЙ / МНП-HUVECs способен образовывать трубки на соответствующей матрице базальной мембраны , и что в результате сеть сравнима с таковым необработанными клетками , используемых в качестве положительного контроля (рис 4A ). Кроме того, трансфицированные клетки поддерживали GJIC, так как 3D-FRAP эксперименты показали. В частности, когда клетки загружаются с флуоресцентным ГДж-permeaBLE краситель и один из них отбеливают, его флуоресценция восстанавливается из - за взаимодействия с соседними клетками и передачи полученного красителя (фиг.4В).

Важно отметить, что из - за присутствия суперпарамагнитного соединения 40 (фиг.5А), применение ОГО / МНП позволяет не только трансфекции клеток, но также и одновременное намагниченность. В результате чего количество внутриклеточного железа измеряли с помощью MPS (фигура 5В) для всех применяемых концентраций MNP в пределах оптимального диапазона (2,5 пмоль / см 2 микроРНК, НП 25 дополнена 5-25 мкг / мл МНП): 0,37 ± 0,079 до ± 0,7 0,150 пг железа / 17 клеток. Поскольку использование магнитных разделительных колонок продемонстрировано, для всех этих концентраций MNP, количество магнитно - чувствительных клеток в общем объеме трансфицированных клеток составляет ~ 70% (5С). Кроме того, трансфицировал HUVECs видны с МРТ (рис 5D) внутри пробирке агарозных фантомов в, имитируя восприимчивость мыши ткани. Кроме того, магнитное нацеливание трансфектированного HUVECs в динамических условиях смоделированных в пробирке было доказано, что эффективность (рисунок 6). В этой экспериментальной установке, даже постоянное энергичное движение культуральной среды не помешало преобладающих роста клеток в области вблизи применения магнита.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение производства Намагниченной микроРНК-модифицированный HUVECs и их анализ. ПЭИ / МНП (полиэтиленимин / вектор суперпарамагнитны на основе наночастиц) применяется для доставки микроРНК (MIR) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs). Полученный клеток продукт характеризуется следующими параметрами: безопасность (в том числе жизнеспособность клеток, функциональныйность и способность к межклеточной коммуникации); эффективность трансфекции (т.е. микроРНК эффективность поглощения и функциональность впоследствии); Магнитная ориентация в пробирке в статических и динамических условиях моделируемых; магнитно-резонансная томография обнаружения (МРТ). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Определение характеристик изолированного HUVEC. А. Представитель образом изолированного и культивируемого HUVECs , окрашенный с эндотелиальной CD31 маркером. Ядра контрастно с DAPI (синий). Шкалы составляет 20 мкм. Б. Представитель результат анализа формирования трубки , выполняемый на изолированном HUVECs; изображение было зафиксировано с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (дифференциальный томФеренц контраст) 18 ч после посева клеток на матрице базальной мембраны. Шкалы составляет 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. микроРНК Доставка в HUVECs с помощью PEI / MNP. А. Поглощение меченых микроРНК (Cy3, красный) 24 ч после трансфекции (2,5 пмоль / см 2 Cy- 3 меченой MIR, NP 25 и МНП 25 мкг / мл) и поддержания нормального внешнего вида клеток проиллюстрированы. Изображения были сделаны с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием возбуждения лазера на 514 нм (Cy3, красный) и контраст дифференциальной интерференции. Шкалы составляет 50 мкм. Б. жизнеспособность клеток через 24 ч после трансфекции оценивали с помощью проточной цитометрии. Участок представляет собой результаты, полученные для HUVECы обрабатывают с помощью следующих сложных композиций: 2,5 пмоль / см 2 Cy3-MIR; NP отношение 25 дополнена 5 до 25 мкг / мл MNPS. Столбики изображают соотношение между средним количеством жизнеспособных клеток и населением целых клеток (N = 6; Столбики ошибок: SEM). С. Структурированное освещение микроскопии (SIM) , визуализация 3-цвета помечены микроРНК / ПЭИ / MNP комплексы , занимаемого HUVECs. Клетки трансфицировали, как описано выше, инкубируют, и фиксировали 24 ч после обработки; ядер контрастно с DAPI. Необработанные данные SIM были записаны в Z-стеке и обрабатываются; представительные изображения являются результатом максимальной проекции интенсивности. Были применены следующие лазеры возбуждения: 405 нм (DAPI, синий), 488 нм (Atto488-PEI, оранжевый), 565 нм (Atto565-MNP, голубой) и 633 нм (Cy5-Mir, красный). Шкалы составляет 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Безопасность HUVECs Модификации с MIR / ПМ / МНПОМ. А. Анализ образования трубки проводили с трансфектированных клеток (2,5 пмоль / см 2 СКЛ-MIR; NP 25 и МНП 25 мкг / мл) 48 ч после обработки. Изображения были получены с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (то есть, дифференциальный интерференционный контраст) 18 ч после посева клеток на базальной мембраны матрицы. HUVECs трансфицированных MIR / ПМ были использованы в качестве контроля токсичности и необработанные клеток в качестве положительного контроля. Шкалы составляет 100 мкм. График отражает соотношение между трансфицированным HUVECs и необработанными клетками с использованием нескольких параметров: длиной трубки, количества ветвей, и переходы (п = 3, Столбики ошибок: SEM). В. щелевая-опосредованный межклеточная связь микроРНК / ПЙ / МНП-модифицированный HUVECs оценивали через 24 ч после transfecТион. Для этой цели клетка была нагружена кальцеином в ГДже проницаемого красителя (оранжевый); восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) исследовали в 3D путем сканирования тестовых клеток в Z-стеков. Типичные изображения кальцеиновых нагруженных клеток перед отбеливанием, непосредственно после отбеливания, и 15 мин после отбеливание (с восстановленной флуоресценцией) изображены. Шкалы составляет 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Сотовая Намагниченность Результирующее из PEI трансфекции / МНПОМ и его применение. А. Представитель изображения фильтрованной MNPS, взятое с ТЕМ, иллюстрирующим их кластерной морфологией. Небольшой размер (~ 5 - 15 нм) одиночных частиц оксида железа (в результате суперпарамагнетизму) является, таким образом,подтверждено. Шкалы составляет 100 нм. В. Внутриклеточная загрузка трансфицированных клеток оценивали с помощью магнитно - спектроскопии частиц (MPS) 24 ч после трансфекции. Представитель панель изображает спектр MPS исследованных образцов. В частности, чистый МНП суспензия (50 мкл) служила в качестве эталона (синие квадраты); круги являются спектры МПС двух трансфицированных клеточных образцов (красные кружки: MNP 25 мкг / мл; зеленые кружки: МНП 5 мкг / мл), в то время как серые треугольники показывают обнаруженный фоновый спектр, полученный с помощью измерения без какого-либо образца. Обратите внимание на логарифмическую шкалу амплитуды (А). С. Количество магнитно - модифицированной клетки количественно оценивали путем применения трансфицированных HUVECs (2,5 пмоль / см 2 микроРНК, НП 25 дополнена 5-25 мкг / мл МНП), собранные трипсинизацией 24 ч после обработки, чтобы магнитный столбец разделения клеток. В результате магнитно - положительная дробь (то есть, что осталось в колонке)подсчитывали, и его процент от общего количества трансфицированных клеток отражается на графике для каждой концентрации МНП (красные треугольники). Жизнеспособность клеток затем исследовали с помощью трипанового синего анализа (серые ромбы). Данные представлены как среднее значение ± SEM (п = 3). Д. Иллюстративный МРТ изображение трансфицированной HUVECs (300000 клеток; 2,5 пмоль / см 2 микроРНК; NP 25 и 25 мкг / мл МНП) встроен в агарозном фантома был записан с 7.1 T системы МРТ животных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. In Vitro Magnetic нацеливание MIR / ПЭИ / МНП-HUVECs в моделированной динамических условиях. HUVECs было собрано 24 ч после трансфекцииион (2,5 пмоль / см 2 Cy3-MIR; NP 25 & МНП 25 мкг / мл) и повторно высевали в свежей культуральной среде в скважинах, с небольшим магнитом локально прикрепленной к боковой стенке. В свою очередь, эта культура пластина была прикреплена к мешалке, вращающейс со скоростью 150 оборотов в минуту. Прикрепление клеток и рост оценивали 12 ч позже путем фиксации клеток с PFA, окрашивая их ядер с DAPI, и выполнения лазерного сканирования конфокальной микроскопии (лазеры возбуждения: 405 нм, DAPI, синий; 514 нм, Су3, оранжевый). Представительные изображения показывают рост клеток в области с применением магнита; без применения магнита; и в центре культуры скважины, где поток жидкости обогатительной клетки. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Производство генетически модифицированные клетки, нагруженные суперпарамагнитными наночастицы для их дальнейших магнитно контролируемого руководства представлено в текущем протоколе. Успешное применение этой стратегии позволяет для решения некоторых трудностей клеточной терапии, такие как низкая удержания и плохое приживление в поврежденной области 2, 3, 4, обеспечивая нацеливаемый продукт клеток для трансплантации. Кроме того, одновременное введение должным образом выбранного генетического материала может способствовать свойства клеток и , таким образом , может повысить функциональную выгоду 41.

Текущий протокол был разработан на HUVECs в качестве модели. Эти клетки , как известно, трудно трансфекции и чувствительны к токсическому воздействию 18, 19, 20. демonstrated уровень флуорофора меченных поглощение микроРНК более 95% после того, как ПЭИ / МНП трансфекции обычно получают с помощью векторов на основе PEI , и обычно используется катионных липидов на основе трансфекции реагентов (например, Липофектамин) 42. Кроме того, оптимальное соотношение NP 25 соответствует ранее опубликованным значениям 20 - 40 для NP. Тем не менее, высокоэффективное поглощение испытуемой флуорофора меченных MIR не обязательно гарантирует правильную обработку и функцию MIR после родов 43. Этот момент особенно актуально в случае PEI, с его жесткой электростатической конденсацией NA. Таким образом, в результате чего функциональная способность поставляемого MIR также должны быть испытаны. Здесь, функциональный микроРНК эндогенно выражен в HUVEC, микроРНК-92a 31, был выбран, и анти-микроРНК против него был доставлен с помощью ОГО и PEI / MNP. В результате, почти полный нокдаун целевой микроРНК-92а доказал эффективное высвобождение анти-микроРНК еПЗУ трансфекции комплексов.

Важно отметить, что в предыдущих работах, успешное применение вектора ПЭИ / МНП была продемонстрирована для доставки плазмидной ДНК (пДНК) и MIR на другие типы клеток, как липкое (например, COS7, мезенхимальных стволовых клеток человека 15, 16) и в подвески (например, из костного мозга CD133 + гемопоэтических стволовых клеток 44). Все эти эксперименты подтвердили известный факт , что эффективность трансфекции и токсичность являются зависящим от типа клеток 45. Таким образом, выбор оптимального векторного состава (то есть, количество микроРНК, отношение НП, а количество железа МНП) следует проводить для каждого конкретного типа клеток, используя ранее установленные оптимальные условия в качестве опорных точек.

Кроме того, переходный характер достигнутого генетической модификации должны быть учтены. С одной стороны, ят очень подходит для определенной функции, такие как краткосрочная доставка факторов роста. С другой стороны, длительность выражения не может длиться достаточно долго для различных целей, требующих длительного выражения. Тем не менее, доказали безопасность вектора ОГО / МНПА поддерживает его возможное повторное введение после того, как условия дополнительно оптимизированы.

ПЙ и его производные , которые обычно используются из - за их высокую эффективность по сравнению с другими невирусными транспортными средствами и их гибкость модификации 7. Однако, несмотря на успех PEI в пробирке и в естественных условиях, его применение в клинических испытаниях очень ограничено (то есть, несколько фаз 1 и 2 испытания или больной раком) 7, 14 из - за токсичности PEI 7, 13. В предыдущих работах нашей группы 16, а также этот протокол, показали, MNPSспособны существенно снизить токсичность PEI. В частности, микроРНК / АЯ трансфекция повредила способность образовывать HUVECs трубок на их матрице, тем самое не основные функциональный тест в пробирке для этих клеток. В противоположность этому, трубки производительности образование MIR / ПЭИ / МНП-HUVECs была сравнима с необработанными клетками. Следует отметить, что это снижение токсичности PEI было достигнуто путем введения низких уровней компонентов , такие как оксид железа, которые являются биосовместимыми и обычно используются в качестве контрастного реагента в людях 40.

Помимо поддержания функциональных свойств, важно , что модифицированные клетки способны устанавливать межклеточную коммуникацию, так как эта функция необходима для правильной интеграции клеток терапевтическом после трансплантации 46. Кроме того, модифицированные клетки могут быть использованы в качестве носителей для доставки терапевтического MIR до 47 поврежденных тканей. В этом случае их Capaciти для обмена молекул с соседними клетками определяет их успех в качестве транспортного средства. Поскольку PEI / MNP трансфекция позволяет GJIC в модифицированном HUVECs, у них есть потенциал для интеграции в естественных условиях и обеспечить MIR доставку поврежденных участков.

Следует отметить, что ранее опубликованные работы по клеточной намагниченности для последующего нацеливания сообщили загрузку ячейки ~ 4 и 30 мкг / железа клеток 48, 49, 50, 51. Эти цифры значительно превышают значения ~ 0.16-0.7 пга / клетки, которые являются достаточными для нацеливание NA / ОГО / МНП-HUVECs в статических и динамических условиях смоделированных в пробирке. Такие суммы с низким содержанием железа выгодны с точки зрения безопасности: широко известный механизм оксида железа наночастиц-ассоциированной токсичности (то есть, производство активных форм кислорода (АФК)) , как известно, напрямую связана с количеством Internalized наночастицы 40. Кроме того, некоторые исследования показали , что высокие внутриклеточные уровни наночастиц оксида железа могут привести к зависимой от дозы цитоскелета дезорганизации и повреждения 52, 53. Важно отметить, что большинство зарегистрированных случаев клеточной намагниченности для таргетинга не включают в себя манипуляции с генетической клетки. В противоположность этому, вектор микроРНК / ПЭИ / МНП дает возможность одновременно изменять ячейки и добавлять магнитные свойства.

Однако низкая МНП нагрузка может быть недостаточна для магнитной ориентации в турбулентной среде с потоком крови. Для того , чтобы приблизиться к сложной ситуации в естественных условиях, динамические условия были смоделированы в пробирке: культуральные планшеты с намагниченным MIR / ПМ / МНПОМ-HUVECs в суспензии были размещены на вращающемся шейкере 34. Этот эксперимент явно не может охватить все взаимодействия , которые происходят вестественные условия. Тем не менее, это привело к более глубокому пониманию таргетирования потенциала PEI / MNP-модифицированных клеток. В результате высокой эффективности клеток нацеливание было продемонстрировано , когда даже активные встряхивание культуральной среды не мешать движение клеток в стороне магнита 54. Для этой цели микроРНК-модифицированные HUVECs были загружены по крайней мере ~ 0,16 пг / клетку железа. Кроме того, магнитно-чувствительные клетки могут быть отсортированы. Процедура разделения клеток магнита на основе применяется к текущему исследовании не нарушена жизнеспособность / ПЭИ / MNP-клеток Mir. Важно отметить, что применение статического магнитного поля (т.е. ориентация эксперименты , которые участвуют применение магнитного поля в течение 12 - 24 ч) не оказывают повреждающее воздействие на клетках - мишенях. Таким образом, показано , производство намагниченных генетически модифицированные клетки обеспечивает основу для дальнейшего в естественных условиях исследования , посвященное эффективность удержания клеток обеспечиваются магнитная силы. Следует отметить, что йе наиболее успешный в естественных условиях исследования , использующее нацеливание намагниченных элементов 51, 54, 55 б удержания клеток после местной администрации вместо руководства клеток после внутривенной инъекции. Таким образом, магнит на основе удержания на месте инъекции представляется желательным для дальнейшего в естественных условиях применения микроРНК / ПЭИ / МНП-модифицированных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас нет конкурирующих финансовых интересов раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Г. Фульда (электронная микроскопия центр, Ростока университет, Германия) за техническую поддержку в приобретении ПЭМ изображений отфильтрованных суперпарамагнит- наночастиц и при выполнении их рентгеноструктурный анализ. Работа осуществляется в РТК Ростоке был поддержан Федеральным министерством образования и научных исследований Германии (ФКЗ 0312138A, ФКЗ 316159 и VIP + 03VP00241) и Государственный Мекленбург-Передняя Померания с Структурных фондов ЕС (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 и ФЭБ / IV-БМ-B35-0010 / 12), а также ДФГ (DA), 1296-1 Влажный-Foundation, и немецкого фонда сердца (F / 01/12). Франк Уикхорст был поддержан научно-исследовательской программы FP7 ЕС "Nanomag" FP7-NMP-2013-LARGE-7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Tags

Медицина выпуск 123 эндотелиальные клетки клеточная инженерия микроРНК полиэтиленимин магнитные наночастицы целеуказание МРТ
подготовки и<em&gt; In Vitro</em&gt; Характеристика замагниченного MIR-модифицированная эндотелиальные клетки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter