Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

fremstilling og Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

Dette manuskript beskriver effektiv, ikke-viral administration af miR til endotelceller ved en PEI / MNP vektor og deres magnetisering. Således, ud over genetisk modifikation muliggør denne fremgangsmåde til magnetisk celle vejledning og MRI påviselighed. Teknikken kan anvendes til at forbedre egenskaberne af terapeutiske celleprodukter.

Abstract

Til dato, de tilgængelige kirurgiske og farmakologiske behandlinger for hjerte-kar-sygdomme (CVD) er begrænset og ofte palliativ. Samtidig, gen- og celleterapi er yderst lovende alternative metoder for CVD behandling. Imidlertid er bred klinisk anvendelse af genterapi stærkt begrænset af manglen på egnede genafgivelsessystemer. Udvikling af passende genafgivelse vektorer kan give en løsning på de aktuelle udfordringer i celleterapi. Især eksisterende ulemper, såsom begrænset effektivitet og lave tilbageholdelse celle i den skadede organ, kunne overvindes ved passende manipulation (dvs. genetisk) før transplantation. Den præsenterede protokol beskriver effektiv og sikker forbigående modificering af endotelceller ved anvendelse af en polyethylenimin superparamagnetisk magnetisk nanopartikel (PEI / MNP) -baseret levering vektor. Desuden er algoritmen og fremgangsmåder til celle karakterisering defineret. Den vellykkede intracellular levering af microRNA (MIR) i humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC'er), er nået uden at påvirke cellernes levedygtighed, funktionalitet, eller intercellulær kommunikation. Desuden blev denne fremgangsmåde vist sig at forårsage en stærk funktionel effekt i indførte eksogene miR. Vigtigere, anvendelsen af ​​denne MNP-baseret vektor sikrer celle magnetisering med ledsagende mulighederne for magnetisk målretning og ikke-invasiv MRI sporing. Dette kan tilvejebringe et grundlag for magnetisk styrede, gensplejsede celle terapeutiske midler, der kan overvåges non-invasivt med MRI.

Introduction

Gen- og celleterapi er effektive værktøjer, der har potentiale til at løse de aktuelle udfordringer i CVD behandling. På trods af, at begge disse tilgange bliver i øjeblikket testet i kliniske forsøg, er de endnu ikke klar til bred klinisk anvendelse 1. Især en fælles tilgang til at tackle udfordringerne i gen- og celleterapi er at udvikle multifunktionelle gen indføringsvektorer egnede til klinisk anvendelse. Manglen af ​​sikre og effektive genafgivelsessystemer er den største bekymring af genterapi. Samtidig, gensplejsning af cellulære produkter forud for transplantation kunne overvinde de alvorlige udfordringer celleterapi, såsom lav effektivitet (fx i hjerte- område er kun ~ 5% af funktionel forbedring opnået efter stamcelletransplantation 1 ) og dårlig retention / indpodning på stedet for skaden (dvs. celletilbageholdelse falder til under 5 - 10% inden for minutter til timer post-anvendelse, uanset indgivelsesvejen 2, 3, 4).

Til dato, virale vektorer langt større end ikke-virale systemer med hensyn til effektivitet, hvilket har resulteret i en bredere anvendelse i kliniske forsøg (~ 67%) 5. Imidlertid virale køretøjerne alvorlige risici, såsom immunogenicitet (og den efterfølgende inflammatoriske reaktion, med alvorlige komplikationer), onkogenicitet og begrænsninger i størrelsen af carried genetiske materiale 6. På grund af disse sikkerhedshensyn og de høje omkostninger ved viral vektor produktion, anvendelse af ikke-virale systemer foretrækkes i visse tilfælde 7, 8. Det er særligt egnet til sygdomme, der kræver transient genetisk korrektion, såsom ekspressionen af vækstfaktorer, der kontrollerer angiogenese (for eksempel til CVD behandling) eller levering perry af vacciner.

I vores gruppe, blev et system levering designet ved at kombinere forgrenet 25 kDa polyethylenimin (PEI) og superparamagnetiske jernoxidpartikler nanopartikler (MNP) bundet sammen af biotin-streptavidin interaktion 9. Denne vektor er et potentielt værktøj til gensplejsning af celler, hvilket muliggør deres samtidige magnetisering før transplantation. Sidstnævnte giver et grundlag for magnetisk vejledning / fastholdelse, som er særligt lovende dag, som avancerede magnetiske målretning teknikker bliver med succes udviklet 10. Endvidere er de resulterende magnetisk reagerende celler har potentialet til at være ikke-invasivt overvåget ved magnetisk resonans (MRI) eller magnetisk partikel billeddannelse 11, 12.

I tilfælde af PEI / MNP vektor, polyamin sikrer nukleinsyre kondensation og dermed beskyttelse mod nedbrydende faktor s, vektor internalisering i celler, og endosomal undslippe 5. Den MNP'er supplerer egenskaberne af PEI, ikke blot med hensyn til magnetisk vejledning, men også ved at reducere den kendte PEI toksicitet 7, 13, 14. Tidligere blev PEI / MNP vektor egenskaber tilpasset med hensyn til levering effektivitet (dvs. pDNA og miRNA) og sikkerhed ved anvendelse fibroblaster og humane mesenkymale stamceller 15, 16.

I dette manuskript, er en detaljeret protokol om anvendelse af PEI / MNP'er til generering af miRNA-modificerede celler beskrevet 17. Til dette formål er HUVEC'er anvendes og udgør en etableret model for in vitro angiogenese. De er udfordrende at transfektion og er modtagelige for giftige indflydelse 18, 19,ass = "xref"> 20. Derudover giver vi en algoritme til at vurdere sådanne celler in vitro, herunder deres målretning, intercellulær kommunikation, og MR afsløring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane navlestrenge til celleisolering blev opnået postpartum fra informerede, raske kvinder, der gav deres skriftlige samtykke til brugen af dette materiale til forskning i henhold til Helsinki-deklarationen. Den etiske komité fra University of Rostock har godkendt præsenterede undersøgelse (reg. Nr Et 2011 06, forlænget 23 september, 2013).

1. Fremstilling af transfektionskomplekser

  1. Biotinylering af polyethylenimin (PEI).
    1. Opløs forgrenet PEI i ultrarent vand under magnetisk omrøring ved 300 - 400 rpm i 24 timer ved stuetemperatur (RT) og beskyttet mod lys til opnåelse af en 0,18-mM opløsning. opløsningen ved 4 ° C lagre.
    2. Måle koncentrationen af primære aminogrupper i den opnåede opløsning 21, 22.
      1. Anvende 2% ninhydrinreagens opløsning som aminpåvisningsreagens 23 ved blanding af 100 pi prediluted prøve (1: 200 med ultrarent vand) og 75 pi ninhydrinreagens. Inkuber i 30 minutter ved 80 ° C. Køle det ned og tilsæt 100 ul 50% ethanol til stabilisering. Mål absorbansen ved 550 nm på absorptionen spektrofotometer.
      2. Skabe en standardkurve under anvendelse af glycin.
        1. Forberede 0,1M amino-N-stamopløsning (0,75 g glycin i 100 ml deioniseret vand) og dets fortyndinger, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40 1:80, 1: 100, 1: 200 og 1: 400, 1: 600. Måle disse opløsninger som i trin 1.1.2.1 og skabe et plot med koncentrationen og absorbansen på akserne.
        2. Baseret på den opnåede plot og den målte absorbans af PEI-opløsning, definerer koncentrationen af ​​a-aminogrupperne i PEI.
          BEMÆRK: Forsigtig. Ninhydrinreagens løsning skal udelukkende anvendes under hætten og skal opbevares under en nitrogenatmosfære. Det er ikke brugbar, når opløsningens farve skifter på grund af oxidation.
    3. Opløs 100 mg biotinlinkeren i ultrarent vand umiddelbart før anvendelse til opnåelse af en 0,01-mM opløsning. Beregn den nødvendige mængde biotin at tilføje til PEI ved at gange koncentrationen af ​​a-aminogrupper i PEI (målt i trin 1.1.2) med 20 for at opnå den nødvendige mængde (i mol) biotinylerende reagens.
      1. Tilsæt biotin løsning på PEI-opløsning ved pH 8-9, og der inkuberes i 16 timer under magnetisk omrøring ved stuetemperatur.
    4. Fjern den ureagerede biotin ved gelpermeationskromatografi 23. Anvende kommercielt tilgængelige søjler indeholdende et gelfiltreringsmedium passende til oprensning af 25-kDa PEI og følge producentens anvisninger. Tage prøver efter oprensning at måle aminkoncentrationen anvendelse af en amin påvisningsreagens (trin 1.1.2) og til bestemmelse af biotin konjugation effektivitet (trin 1.2.2). Opbevar opnåede biotinyleret PEI ved 4 ° C.
  2. Karakterization af biotinyleret PEI.
    1. Bestemme koncentrationen af ​​a-aminogrupper i PEI efter biotinylering som beskrevet i trin 1.1.2.
    2. Bestem graden af ​​PEI biotinylering at verificere konjugation procedure. Til kvantificering, bruge et kommercielt tilgængeligt kit, der er baseret på anvendelsen af HABA farvestof (4'-hydroxyazobenzene-2-carboxylsyre), at sikre en korrekt kolorimetrisk bestemmelse af biotinyleringsbetingelserne niveauer 24, 25. Følg anvisningerne fra producenten.
  3. Filtrering af MNPS- og deres karakterisering.
    1. Foretage kommercielt tilgængelige streptavidinovertrukket MNP gennem et 0,45 um sprøjte-drevet filter 16 for at udelukke større toksiske aggregater. Måle den endelige jern koncentration på en standard fotometrisk assay 26.
    2. Undersøge kvaliteten af ​​de filtrerede MNP'er ved optagelsemagnetiseringskurven og ved TEM billeddannelse i overensstemmelse med standardprotokoller 27, 28.
      1. Fortynde MNP suspension med destilleret vand og sæt 3 pi af den opnåede suspension på en 300-mesh Formvar carbon-kobbernet til TEM-analyse. Efterfølgende placere denne gitter på et objektglas på en varmeplade og lad det tørre.
      2. Analyser præparatet med en transmissionselektronmikroskop ved 120 kV og kontrollere det elementære indhold ved hjælp af en X-ray detektor 27.
  4. 3-farve mærkning af transfektionskomplekser til super-opløsning mikroskopi.
    1. Label 0,5% af de målte primære aminogrupper i PEI med NHS-Ester Atto 488 farvestof efter fabrikantens anvisninger. Fjerne det overskydende ubundne farvestof ved gelpermeationschromatografi, som beskrevet ovenfor (trin 1.1.4). Måle den resulterende koncentration af aminogrupper ved anvendelse af en ninhydrin ASSAy (trin 1.1.2).
    2. Mærke kommercielt tilgængelige scrambled miR (scr-miR) med Cyanine5 farvestof ved anvendelse af et egnet mærkningskit 15 (angivet i listen Materials). Måle den resulterende fluorofor-miR koncentration spektrofotometrisk.
    3. Frisk mærke MNP hver gang med biotinkonjugeret farvestof (fx ATTO 565-biotin) ved en 1: 1000 vægt / vægt-forhold. Direkte anvende farvestoffet efter tilsætning MNP til miR / PEI under dannelsen af transfektionskomplekser, pr detaljerne i Delyangina et al. 16.

2. Cellefremstilling

  1. HUVEC isolation.
    1. Isolere celler fra navlestrenge umiddelbart efter opnåelse snorene under anvendelse collagenasefordøjelse fra det indre af ledningen vene; følge en tidligere udviklet protokol 29.
      1. Inkubere hver snor med ~ 60 enheder / ml collagenase type IV-opløsning i puffer - fyldt i than navlevene - ved 37 ° C i 13 min.
    2. For alle eksperimenter, pool det HUVEC'erne fra et minimum på 5 patienter.
      BEMÆRK: Dyrkning bør ikke overstige 4-5 passager. Brug ikke celler forurenet med mycoplasma, som dette medfører et fald i transfektionseffektiviteten. Mycoplasma bør testes for før start protokollen ved anvendelse af et PCR-kit til den yderst følsomme påvisning af mycoplasma.
      1. Test for mycoplasma tilstedeværelse.
        1. Centrifuge 1 ml cellekultursupernatanten i 10 min (13.000 xg). Suspender pelleten i 17 pi dH2O og kog (93 ° C) i 3 min. Anvende 2 pi af suspensionen at amplificere DNA-region, der koder for højt konserverede ribosomale RNA'er (16S-rRNA) af forskellige mycoplasma arter.
        2. Udføre PCR under anvendelse af 10 pmol af hver primer (forward primer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; revers primer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') i kamgelse med et kommercielt PCR-kit under følgende betingelser: 94 ° C i 3 min; 45 cykler af 94 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; og en endelig udvidelse ved 72 ° C i 10 min.
        3. Analyser af PCR-produktet (292 bp) ved anvendelse af agarosegelelektroforese.
    3. Enten gemme de opnåede celler langsigtet i flydende nitrogen eller kultur dem i endotelvækstfaktor medium suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C i en humidi fi ceret atmosfære indeholdende 5% CO2.
  2. HUVEC karakterisering.
    1. Karakterisere isoleret HUVEC'er med hensyn til deres funktionelle kapacitet til at bygge rør i basalmembranmatrix (fx Matrigel) og deres ekspression af endotel markør CD31 (blodplader endotelcelle-adhæsionsmolekyle, PECAM-1) efter standardprotokoller 30, 31.

3. Transfektion

  1. Trypsinisér bestanden HUVEC kultur (se trin 4.1.2.) Og manuelt tælle cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Pode HUVEC'er på plast cellekultur brønds plader af passende størrelse, med en begyndende celledensitet på ca. 13.000 celler / cm2 vækstoverflade, 48 timer før transfektion indtil 70-80% konfluens er nået.
  2. Forbered frisk miR / PEI / MNP komplekser hver gang.
    BEMÆRK: Først bør opnås miR / PEI-komplekser (trin 3.2.1 - 3.2.3); efterfølgende bør MNP'er sættes til miR / PEI-opløsning (trin 3.2.4) for at få den endelige miR / PEI / MNP formulering anvendt til transfektion (trin 3.3).
    1. Beregne mængden af ​​passende kommercielt tilgængelige miR (krypteret, taggede eller funktionelle, se trin 4) ved anvendelse af koncentrationen af ​​bestanden tilvejebragt af fabrikanten. Anvende 2,5 pmol af miR / cm2 af cellevækst overflade. Fortynde miR i 5% glucoseopløsning til obtain en slutkoncentration på 0,125 pmol miR / pl.
    2. Baseret på miR mængde fra trin 3.2.1 og den optimale NP-forhold på 25 32, beregnes den nødvendige mængde PEI ved hjælp af dens målte koncentration (trin 1.1.2). Fortynd PEI (per den beregnede nødvendige volumen) i et lige volumen af ​​en 5% glucoseopløsning. Tilsæt opnåede præ-fortyndet PEI til miR-opløsning (fra trin 3.2.1) og vortexes den opnåede blanding i 30 s.
    3. Inkubere det opnåede miR / PEI blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur.
    4. Sonikeres MNP'er på 35 kHz for mindst 20 min i sonikering vandbad (se Materialer List) ved stuetemperatur, tilsættes en passende mængde af MNP løsning på miR / PEI (5 - 25 ug af jern / ml fremstillet miR / PEI / MNP blanding 16), vortex i 30 sekunder, og der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur indtil den er klar.
  3. Tilsæt fremstillet miR / PEI / MNP blandingen dråbevis direkte til dyrkningsmediet på cellerne. Bruge den resulterende blanding af celle culTure medium med miR / PEI / MNP fortyndet i glucose som transfektionsopløsningen. Erstat denne blanding med frisk dyrkningsmedium 6 timer efter transfektion.

4. Analyse af vektor Safety

  1. Undersøgelse af cellelevedygtighed.
    1. Transficere HUVEC'er podet i en 24-brønds kulturplade (trin 3.1 og 3.2); bruge Cy3-miR som prøvespidserne og krypteret miR (scr-miR) som kontrol- gating prober for flowcytometri. Der inkuberes ved 37 ° C i en humidi fi ceret atmosfære indeholdende 5% CO2 i 24 timer.
    2. Indsamle supernatanten og transficerede celler ved trypsinisering ved anvendelse 1x trypsin-EDTA fortyndet i PBS sat til cellerne i 4 minutter ved 37 ° C. Centrifugere ved 300 xg i 10 minutter og bruge til analysen.
    3. Undersøge cellelevedygtighed og miR optagelseseffektivitet 24 timer efter transfektion ved anvendelse af flowcytometri ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt plet at skelne mellem levende / døde celler; anvender standardprotokoller 15
  2. Undersøge sikkerheden af ​​miR / PEI / MNP-komplekser for celler i funktionelle assays.
    1. Evaluere spredning aktivitet af transficerede celler.
      1. Transficere HUVEC'er podet i en 12-brønds dyrkningsplade (trin 3.1 og 3.2) med funktionel antisense miR (fx anti-miR92a for HUVEC'er 31) og inkuber ved 37 ° C i en humidi fi ceret atmosfære indeholdende 5% CO2 i 24 timer.
      2. Anvende et kommercielt tilgængeligt kit til at definere antallet af prolifererende celler ved farvning med edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridin) og scanning med laserbaseret konfokal mikroskopi. Brug følgende mikroskopi indstillinger: 40X objektiv med immersionsolie; 633-nm excitation laser (for et 647-nm farvestof); 5 tilfældige felter, der skal registreres i hver prøve. Beregne hastigheden af ​​prolifererende celler ved at dividere antallet af edu-farvede kerner med det samlede kerner nummer (Hoechst-farvet).
    2. Vurdere evnen af transficerede celler til dannelse rørlignende strukturer, som tidligere beskrevet 17, 31.
      1. Transficere HUVEC'er podet i en 24-brønds kulturplade (trin 3.1 og 3.2) med scr-miR og inkuberes i 48 timer ved 37 ° C i en humidi fi ceret atmosfære indeholdende 5% CO2. Indsamle de transficerede celler (som i trin 4.1.1).
      2. Frø 3,5 x 10 4 af modificerede HUVEC'er i plader med 24 brønde overtrukket med 140 pi basalmembranmatrix. Inkuber i 18 timer ved 37 ° C i en humidi fi ceret atmosfære indeholdende 5% CO2.
      3. Optag billeder af 10 tilfældige felter i hver brønd med laserscanning konfokal mikroskopi (differential interferens kontrast) og analysere ved hjælp ImageJ software med "Angiogenese Analyzer" plugin. Omfatter parametre såsom den samlede længde af grene, antallet af grene, og antallet af junctions i evalueringen. Sammenlign dette med den ubehandlede kontrol.
  3. Undersøge den mulige toksiske indflydelse transfektionskomplekser på gap junction (GJ) -medieret intercellulær kommunikation (GJIC) ved at teste 3D fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) 33 i 3D.
    1. Pode celler på gelatineovertrukne objektglas med en tynd bund egnet til live-cell imaging (olieimmersionslinse). Transficere celler som beskrevet ovenfor i trin 3.2 med ikke-mærkede, ikke-funktionel miR (scr-miR) og inkuberes i 24 timer.
    2. Forbered celler til billeddannelse ved at lægge dem med calcein umiddelbart før mikroskopi. Især udskiftes dyrkningsmediet med frisk medium indeholdende 5 uM calcein, inkuberes i 20 minutter, vask med PBS, og der tilsættes frisk dyrkningsmedium. Pre-varme inkubatoren af mikroskopet til 37 ° C og juster CO 2 koncentration til 5%.
      BEMÆRK: Alle reagenser skal være varm for at undgå celle entreption før måling.
    3. Brug en 561-nm excitation laser til celle visualisering og FRAP eksperimentet. Først vælger celler til måling som regioner af interesse (ROI) manuelt; testceller skal have mindst 3 naboceller. Definere en reference celle med lyse, stabil fluorescens, som ikke vil blive bleget. Afgrænse en z-stak. Optage fluorescensen fra toppen af ​​cellerne til bunden til at omfatte 10 - 15 lag.
    4. Blege testcellerne anvendelse af 100% lasereffekt og registrere den efterfølgende generhvervelse af fluorescens (grundet GJ-specifikt farvestof overførsel fra naboceller) under følgende 15 min. Optag de rå data i Z-stakke hver 60 s. I alt udføre FRAP målinger med ikke mindre end 5 - 10 test celler pr eksperiment. Sammenlign resultaterne til utransficerede celler.

5. Test af transfektionseffektiviteten

  1. Undersøgelse af miR optagelse.
    1. Forbered prober som beskrevet i step 4,1 og bruge dem samtidigt for at definere miR optagelse med flowcytometri.
  2. Bekræfte og beskrive den intracellulære lokalisering af transfektionskomplekser ved konfokal og superresolution struktureret belysning mikroskopi (SIM).
    1. Pode HUVEC'er på gelatinebelagte dækglas placeret i brøndene i 24-brønds dyrkningsplader, som beskrevet før (trin 3.1). Transficere cellerne med 3-farve mærket miR / PEI / MNP (trin 1.4) og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C i en humidi fi ceret atmosfære indeholdende 5% CO2.
    2. Vask dækglassene først med 2% bovint serumalbumin (BSA) i phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter med blot PBS. Fix celler ved inkubation i 4% paraformaldehyd (PFA) ved 37 ° C i 15 min og bejdse kerner med DAPI følgende standard protokoller 16. Vask 3 gange på rysteapparatet (15 min hver) for at fjerne overskydende farve.
      BEMÆRK: PFA er kræftfremkaldende og skal håndteres forsigtigt.
    3. Placer PRepared dækglas på mikroskopglasplader med egnet monteringsmedium, lad dem tørre i mindst i 1 time, og bruge dem til mikroskopi, som beskrevet nedenfor.
    4. Erhverve billeder ved hjælp af en 63X oliebestandighedsobjektets og følgende SIM-indstillingerne: 405-, 488-, 561- og 633-nm laser linjer for excitation; z-stak tilstand med en 32-bit dybde på 5 vinkler, 5 faser, med gennemsnit af 4; G2 gitter med en 405 laser linje, G3 med en 488, G4 med en 561, og G5 med en 633.
  3. Evaluere funktionaliteten af ​​den leverede miR ved RT-qPCR i miR / PEI / MNP-HUVEC'er versus ubehandlet.
    1. Transficere HUVEC'er podet i en 12-brønds dyrkningsplade trin (3.1 og 3.2) med funktionel antisense miR (fx anti-miR92a for HUVEC'er 31) og inkuberes i 48 timer ved 37 ° C i en humidi fi ceret atmosfære indeholdende 5% CO2.
    2. Evaluere anti-miR92a levering og forarbejdning med RT-qPCR anvendelse af kommercielt tilgængelige kits (se materialer); følge than producentens anvisninger, som beskrevet andetsteds 17, 31. Parallelt hermed undersøge ekspressionen af målgenet (f.eks ITGA5 31).
      BEMÆRK: AntagomiR levering mod endogent miR foretrækkes frem efterligner fordi den sikrer en måling af faktiske resultat af miR og ikke blot dets intracellulære akkumulering.

6. Celle Målretning Evaluering og magnetisk Cell Separation

  1. Celle målretning i statiske forhold in vitro.
    1. Transficere HUVEC'er i en 24-brønds plade (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 og 15-25 pg / ml MNP), inkuberes i 24 timer, vaskes, og indsamle som beskrevet ovenfor (trin 4).
    2. Bland cellepelleten opnået fra 1 brønd med 1 ml frisk kulturmedium og placere den i brøndene i en plade med 12 brønde. Fastsætte en lille magnet lokalt (på side) i bunden af ​​pladen ved hjælp af tape.
    3. Inkuber cellesuspensionen i 24 timer og observere cellebinding og vækst i området over magneten og i området uden en magnet. For en kvalitativ evaluering, en konventionel omvendt mikroskop.
  2. Celle målretning i simulerede dynamiske forhold in vitro.
    1. Transficere HUVEC'er i en 24-brønds plade pr trin 3.1 og 3.2 (2,5 pmol / cm2 Cy3-miR, NP 25 og 15 - 25 ug / ml MNP), inkuberes i 24 timer, vaskes, og indsamle ved trypsinisering hjælp 1x trypsin-EDTA fortyndet i PBS sat til cellerne i 4 minutter ved 37 ° C. Centrifugere ved 300 xg i 10 minutter.
    2. Bland cellepelleten opnået fra 1 brønd med 1 ml frisk dyrkningsmedium og placere den i brønden i en plade med 12 brønde. Fastsætte en lille magnet lokalt (på siden af ​​en brønd) under anvendelse af tape. Placer dyrkningspladen på rysteapparatet og inkuberes cellesuspensionen i 12 timer ved 150 omdrejninger i minuttet for at simulere dynamiske forhold 34.
    3. Vask cellerne og løsedem under anvendelse af 4% PFA. Farv kernerne med DAPI 16. Registrere cellevedhæftning hjælp laserscanning konfokal mikroskopi med en 514-nm excitation laser, z-stak tilstand - for at (5 12 skiver) opnå rå data, og maksimal intensitet projektion billedbehandling til at skabe billeder til analyse.
  3. Kvantitativ analyse af magnetisk reagerende og ikke-reagerende celler.
    1. Transficere HUVEC'er i en 24-brønds plade (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 og 15-25 pg / ml MNP), inkuberes i 24 timer, vaskes, og indsamle som beskrevet før (trin 6.2.1) . Pre-varm PBS og cellesortering puffer (steriliseret ved filtrering, se Materialer List) til 37 ° C. Resuspender cellepelleten opnået fra hver brønd med 500 pi cellesortering puffer.
    2. Anvende denne cellesuspension til et magnetisk sorteringskolonnerne fastsat af den medfølgende magnet, vaskes kolonnerne på magneten 3 gange med frisk cellesortering puffer, og indsamle gennemløbet som Magnetimatisk reagerer fraktion (magne-).
    3. Fjerne kolonner fra magneten og straks indsamle magnetisk responderende cellefraktion (mag +) ved at skubbe frisk cellesortering puffer gennem søjlen under anvendelse af et stempel.
    4. Centrifuge både magne- og mag + ved 300 xg i 10 minutter. Resuspender cellepelleten i PBS, tælle cellerne, og evaluere cellelevedygtighed med en trypanblåt -eksklusionsassay 35. Bruge den opnåede cellepellet enten til langsigtet analyse (dvs. re-frø og evaluere efter 24, 48 og 72 timer i kultur 17) eller direkte til flowcytometri (trin 4.1.).
  4. Definer jern belastning af de transficerede celler.
    BEMÆRK: Under tilberedningen skal enhver kontakt af cellen prober med jernoxid materialer og instrumenter undgås.
    1. Indsamle de transficerede HUVEC'er og utransficerede kontrol (som i trin 4.1.1). Vask de opsamlede celler to gange i 2% BSA i PBS 36 b y omhyggeligt blanding af cellerne med 1 ml af denne vaskebuffer og derefter centrifugering ved 300 xg i 10 minutter. Resuspender den opnåede cellepellet i 250 pi PBS, tilsættes 100 pi 4% PFA, og inkuberes i 20 min for at løse celler. Vask 3 gange med PBS, som beskrevet ovenfor.
    2. Resuspender den resulterende faste cellepellet i 110 pi PBS og overføre den til 100-pi PCR-rør.
      1. Tage 10-pi alikvoter til celletælling og bruge den resterende prøve til magnetisk partikel spektroskopi (MPS).
    3. Udføre målingen på en kommercielt tilgængelig MPS enhed. Under målingen anvende følgende indstillinger: magnetfelt B drev = 25 mT og frekvensen f 0 = 25 kHz. For jern kvantificering af prøverne, normalisere den tredje harmoniske A 3 i MPS-spektret til den tilsvarende A 3, ref af en MNP referenceprøve med en kendt jern på 2,1 ugxref "> 37. Brug ubehandlede celler som kontroller.

7. Definition MRI Detection Grænser

  1. Cell forberedelse.
    1. Seed HUVEC'er i en 6-brønds plade og transficere (2,5 pmol / cm2 scr-miR, NP 25 og 15 - 25 ug / ml MNP) i duplikater eller triplikater i overensstemmelse med den nødvendige mængde celler (for phantom forberedelse). Inkubér cellerne i 24 timer og vask, indsamle, og fastgør dem med 4% PFA, som beskrevet før (trin 4).
    2. Tæl opnåede celler, forberede portioner med passende celleantal (fx 10 3, 10 4, 10 5, etc.), og justere deres rumfang på 50 pi.
  2. Agarose forberedelse phantom
    1. Forberede flere lag af 2% agarose i 50-ml-rør med forskellige mængder af transficerede celler indlejret mellem lagene 38. Under forberedelse, soniker og centrifuger varme agarose 38 tilødelægge luftbobler, der forårsager artefakter.
      BEMÆRK: er vigtigt, at fantomer indeholdende 5,5 x 10 5 HUVEC'er behandlet med ikke-magnetiske miR / PEI-komplekser fremstilles på samme måde for at tjene som kontroller.
  3. Scanning den opnåede in vitro fantomer med en 7,1 T dyr MRI-system efter anbringelse fantomet centralt i spolen, parallelt med z-aksen af det magnetiske felt.
    1. Anvende følgende sekvens parametre for en gradient-ekko datafangstsekvens: TR = 66 ms; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; flipvinkel = 3 °; matrix = 128 × 128, interpoleres til 256 x 256; synsfelt = 42 mm; 100%; gennemsnit = 1, ekko toglængde = 1; skivetykkelse = 1,5 mm; og 16 skiver.
    2. Vurdere signal henfald af alle fire ekko gange og beregne R2 * kort (R2 * = 1 / T2 *) ved hjælp af passende software, som beskrevet andetsteds 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hovedformålet med den foreslåede protokol er at producere magnetisk reagerende miR-modificerede celler og til at udføre deres nøjagtige karakterisering (figur 1). Som følge heraf effektivt transficerede celler, der reagerer på magnetisk selektion og vejledning og påviselige med MRI, skal indhentes.

Først blev identiteterne af isolerede HUVEC'er bekræftet ved typisk farvning med endotel markør CD31 (PECAM) (figur 2A) og ved deres evne til at danne rør på passende basalmembranmatrix (figur 2B). De opnåede celler indtog miR indført ved PEI / MNP meget effektivt; mikroskopi viste, at alle celler var positive for et signal af mærket miR (Cy3) 24 timer efter transfektion (figur 3A). Vigtigere, blev ingen celledød optaget sammenlignet med ubehandlede celler (figur 3B), og normal udseende blev opretholdt (figur 3A). Som observeret med konfokal laserscanningsmikroskopi blev signalet af Cy3-miR primært lokaliseret inde i cellerne. Desuden blev en mere detaljeret undersøgelse af den intracellulære lokalisering af alle dele af transfektionsvektor og miR udført med højere opløsning ved anvendelse af 3-farvet mærkede komplekser. SIM, MIR, PEI, og MNP signaler blev alle påvist i cytoplasmaet i perinukleære region (figur 3C).

Endvidere har en detaljeret undersøgelse af transfektionsvektor sikkerhed bevist, at miR / PEI / MNP-HUVEC'er stand til at danne rør på den relevante basalmembranmatrix og at det resulterende netværk er sammenlignelig med den for ubehandlede celler, der anvendes som en positiv kontrol (figur 4A ). Desuden transficerede celler opretholdes GJIC, som 3D-FRAP eksperimenter afsløret. Især når celler er fyldt med fluorescerende GJ-Permeable farvestof og en af dem er bleget, dets fluorescens genvinder grund af kommunikationen med naboceller og den resulterende farveoverførsel (figur 4B).

Vigtigere, på grund af tilstedeværelsen af den superparamagnetiske forbindelse 40 (figur 5A), PEI / MNP program giver ikke kun celletransfektion, men også den samtidige magnetisering. Den resulterende mængde af intracellulært jern blev målt ved anvendelse MPS (figur 5B) for alle anvendte MNP koncentrationer inden det optimale område (2,5 pmol / cm2 miR, NP 25 suppleret med 5-25 pg / mL MNP): 0,37 ± 0,079 til 0,7 ± 0,150 pg jern / celle 17. Da anvendelsen af magnetiske separationskolonner demonstreret, for alle disse MNP koncentrationer, mængden af magnetisk reagerende celler i den samlede mængde af transficerede celler er ~ 70% (figur 5C). Derudover transficerede HUVECs er synlige med MRI (figur 5D) indeni in vitro agarose fantomer, efterligner musevæv modtagelighed. Endvidere blev magnetisk målretning af transficerede HUVEC'er i dynamiske forhold simuleret in vitro vist sig at være effektiv (figur 6). I denne forsøgsopstilling, engang den konstante kraftig bevægelse dyrkningsmedium ikke forhindre fremherskende cellevækst i området nær magnetanvendelse.

figur 1
Figur 1. Skematisk illustration af Produktion af Magnetized miR-modificerede HUVEC'er og deres analyse. PEI / MNP (polyethylenimin / superparamagnetiske nanopartikel-baseret vektor) påtrykkes levere microRNA (miR) til humane navleveneendotelceller (HUVEC'er). Det opnåede celleprodukt er karakteriseret ved følgende parametre: sikkerhed (herunder cellelevedygtighed, funktionelleity, og evne til intercellulær kommunikation); transfektion effektivitet (dvs. miR optagelse effektivitet og funktionalitet bagefter); magnetisk målretning in vitro i statiske og simulerede dynamiske forhold; magnetisk resonans (MRI) påvisning. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2. Karakterisering af Isoleret HUVEC. A. Repræsentative billede af isolerede og dyrkede HUVEC'er farvet med endotel CD31 markør. Kernerne modfarvet med DAPI (blå). Skalalinjen er 20 um. B. repræsentant resultat af dannelsen rørbestemmelse udført på isolerede HUVEC'er; billedet blev optaget med en laser konfokalt (forskellen mellemferencen kontrast) 18 timer efter cellepodning på basalmembranmatrix. Skalalinjen er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3. miR Levering til HUVEC'er hjælp PEI / MNP. A. Optagelsen af mærkede miR (Cy3, rød) 24 timer efter transfektion (2,5 pmol / cm2 Cy3-mærkede miR, NP 25 og MNP 25 pg / ml), og opretholdelse af normal celle udseende er illustreret. Billeder blev taget ved konfokal laserscanningsmikroskopi ved anvendelse af en 514-nm excitation laser (Cy3, rød) og differentiel interferens kontrast. Skalalinjen er 50 um. B. Cellelevedygtighed 24 h efter transfektion blev vurderet ved flowcytometri. Plottet viser resultaterne opnået for HUVECs behandlet med følgende komplekse sammensætninger: 2,5 pmol / cm2 Cy3-miR; NP-forhold 25 suppleret med 5 til 25 pg / ml MNP'er. Søjlerne afbilder forholdet mellem det gennemsnitlige antal levedygtige celler og hele cellepopulationen (n = 6; fejlsøjler: SEM). C. Struktureret belysning mikroskopi (SIM) afbildning af 3-farvet mærket miR / PEI / MNP-komplekser optages af HUVEC'er. Cellerne blev transficeret som beskrevet ovenfor, inkuberes og fikseret 24 timer efter behandling; kernerne blev modfarvet med DAPI. Raw SIM oplysninger er registreret i z-stakke og behandles de repræsentative billeder er resultatet af den maksimale intensitet projektion. Følgende excitation lasere blev anvendt: 405 nm (DAPI, blue), 488 nm (Atto488-PEI, orange), 565 nm (Atto565-MNP, cyan) og 633 nm (Cy5-miR, rød). Skalalinjen er 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4. Safety of HUVEC'er Modifikation med miR / PEI / MNP. A. En rørdannelse blev udført med transficerede celler (2,5 pmol / cm2 scr-miR; NP 25 og MNP 25 pg / ml) 48 timer efter behandling. Billeder blev optaget med en laser konfokalt mikroskop (dvs. differentiel interferens kontrast) 18 timer efter cellepodning på basalmembranmatrix. HUVEC'er transficeret med miR / PEI blev anvendt som en toksicitetskontrol og ubehandlede celler som en positiv kontrol. Skalalinjen er 100 um. Plottet afspejler forholdet mellem de transficerede HUVEC'er og de ubehandlede celler ved hjælp af flere parametre: rørlængde, antal grene, og kryds (n = 3, fejlsøjler: SEM). B. gap junction-medieret intercellulær kommunikation af miR / PEI / MNP-modificeret HUVEC'er blev vurderet 24 timer efter transfection. Til dette formål blev celler belastet med GJ-permeable farvestof calcein (orange); fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) undersøgt i 3D ved scanning prøveceller i z-stakke. Repræsentative billeder af calceinholdige loaded celler før blegning, direkte efter blegning og 15 min post-blegning (med udvundne fluorescens) er afbildet. Skalalinjen er 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 5
Figur 5. Cell magnetisering Resulterende fra transfektion med PEI / MNP og applikationer. A. Repræsentative billede af filtreret MNP'er, taget med TEM, som illustrerer deres klyngemorfologi. En lille størrelse (-5 - 15 nm) på enkelte jernoxidpartikler (resulterer i superparamagnetisme) er dervedbekræftet. Skalalinjen er 100 nm. B. Den intracellulære belastning af transficerede celler blev vurderet ved magnetisk partikel spektroskopi (MPS) 24 timer efter transfektion. Den repræsentative panel afbilder MPS-spektret af undersøgte prøver. Især ren MNP suspension (50 pi) tjente som reference (blå firkanter); cirklerne er MPS spektre af to transficerede celleprøver (røde cirkler: MNP 25 pg / mL; grønne cirkler: MNP 5 ug / ml), mens de grå trekanter viser det detekterede baggrund spektrum opnået ved en måling uden nogen prøve. Bemærk den logaritmiske skala af amplituden (A). C. Mængden af magnetisk modificerede celle blev kvantificeret ved anvendelse af transficerede HUVEC'er (2,5 pmol / cm2 miR, NP 25 suppleret med 5-25 pg / ml MNP), opsamlet ved trypsinering 24 timer efter behandling, til et magnetisk celleseparation kolonne. Den resulterende magnetisk positive fraktion (dvs. der forblev i kolonnen)blev talt, og dens procentdel af den samlede mængde af transficerede celler afspejles på grunden for hver MNP koncentration (røde trekanter). Cellelevedygtighed blev efterfølgende undersøgt af trypanblåt -eksklusionsassay (grå rhomber). Dataene er vist som middelværdi ± SEM (n = 3). D. En illustrativ MRI billede af transficerede HUVEC'er (300.000 celler; 2,5 pmol / cm2 miR, NP 25 & 25 pg / ml MNP) indlejret i en agarose fantom blev registreret med en 7,1 T dyr MRI-system. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 6
Figur 6. In vitro Magnetic målretning af miR / PEI / MNP-HUVEC'er i simulerede dynamiske betingelser. HUVEC'er blev opsamlet 24 timer efter transficereion (2,5 pmol / cm2 Cy3-miR; NP 25 & MNP 25 pg / ml) og re-podet i frisk dyrkningsmedium i brøndene, med en lille magnet lokalt tilsluttet til sidevæggen. Til gengæld blev denne kultur plade fastgjort til en rysteapparat, der roterede ved 150 rpm. Cellevedhæftning og vækst blev vurderet 12 timer senere ved fiksering celler med PFA, farvning deres kerner med DAPI, og udførelse af laserscanning konfokal mikroskopi (excitation lasere: 405 nm, DAPI, blue, 514 nm, Cy3, orange). Repræsentative billeder skildrer cellevækst i området med magnet ansøgning; uden magnet ansøgning; og i midten af ​​kulturen godt, hvor væskestrømmen koncentrerede cellerne. Skalabjælkeme er 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Produktionen af ​​genetisk manipulerede celler belastet med superparamagnetiske nanopartikler for deres videre magnetisk styret føring præsenteres i den nuværende protokol. Den vellykkede anvendelse af denne strategi muliggør løsning af visse problemer af celleterapi, såsom lav tilbageholdelse og dårlig indpodning i den skadede område 2, 3, 4, ved at tilvejebringe en målrettes celle produkt til transplantation. Endvidere kunne den samtidige indførelse af passende valgt genetisk materiale fremme celleegenskaber og kunne således forøge funktionel fordele 41.

Den nuværende protokol er blevet udviklet på HUVECer som en model. Disse celler vides at være vanskelige at transficere og modtagelige for giftige indflydelse 18, 19, 20. DEMonstrated niveau af fluorofor-mærket miR optagelse over 95% efter PEI / MNP transfektion opnås typisk med PEI-baserede vektorer og almindeligt anvendte kationiske lipid-baserede transfektionsreagenser (fx Lipofectamine) 42. Derudover optimale NP-forhold på 25 svarer til tidligere offentliggjorte værdier på 20 - 40 for NP. Ikke desto mindre den meget effektiv optagelse af testede fluorophor-mærket miR ikke nødvendigvis en garanti for korrekt miR behandling og funktion efter levering 43. Dette punkt er særlig relevant i tilfælde af PEI, med sin stramme elektrostatiske kondensering af NA. Således skal den resulterende funktionelle kapacitet leveret miR også testes. Her, en funktionel miR endogent udtrykt i HUVEC, blev miR-92a 31, valgt, og anti-miR imod det blev leveret under anvendelse af PEI og PEI / MNP. Som følge heraf en næsten fuldstændig knockdown af mål-miR-92a bevist effektiv frigivelse af det anti-miR fra de transfektionskomplekser.

Vigtigere, i tidligere værker, blev den vellykkede anvendelse af PEI / MNP vektor påvist for levering af plasmid-DNA (pDNA) og miR til andre celletyper, både klæbende (fx COS7, humane mesenkymale stamceller 15, 16) og i suspension (fx knoglemarv-afledte CD133 + hæmatopoietiske stamceller 44). Alle disse forsøg har bekræftet kendt faktum, at transfektionseffektiviteten og toksicitet er celletypeafhængig 45. Således er valget af den optimale vektor sammensætning (dvs. miR beløb, NP-forhold, og mængden af MNP jern) bør udføres for hver særlig celletype, ved anvendelse af tidligere etablerede optimale betingelser som referencepunkter.

Desuden skal der redegøres for den forbigående karakter af den opnåede genetiske modifikation. På den ene side, jegt er meget velegnet til bestemt funktion, såsom kortfristede levering af vækstfaktorer. På den anden side, kan varigheden af ​​udtrykket ikke vare længe nok til mange forskellige formål, som kræver langvarig udtryk. Ikke desto mindre er bevist sikkerhed PEI / MNP vektor understøtter dens mulige gentagen administration, når betingelserne er optimeret yderligere.

PEI og dets derivater er almindeligt anvendt på grund af deres høje effektivitet i forhold til andre ikke-virale vehikler og deres fleksibilitet til ændring 7. Men trods PEI succes in vitro og in vivo, dens anvendelse i kliniske forsøg er meget begrænset (dvs. få fase 1 og 2 forsøg eller cancerpatienter) 7, 14 på grund af PEI toksicitet 7, 13. Som tidligere værker af vores gruppe 16, samt denne protokol, har vist, MNP'erer i stand til at falde PEI toksicitet signifikant. Især har miR / PEI transfektion beskadiget evne HUVEC'er at danne rør på deres matrix, så der ikke er en primær in vitro funktionel test for disse celler. I modsætning hertil kanaldannelse ydeevne miR / PEI / MNP-HUVEC'er var sammenlignelig med ubehandlede celler. Især var dette fald på PEI toksicitet opnås ved indførelse af lave niveauer af komponenter, såsom jernoxid, som er biokompatible og rutinemæssigt som en kontrast reagens i humane individer 40.

Bortset fra at opretholde funktionelle egenskaber, er det vigtigt, at modificerede celler er i stand til etablere intercellulær kommunikation, da denne funktion er nødvendigt for en korrekt integration af celle terapeutiske efter transplantationen 46. Derudover kan modificerede celler udnyttes som bærere til levering af terapeutiske miR til skadede væv 47. I dette tilfælde, deres kapaciteterty til at udveksle molekyler med naboceller definerer deres succes som en bærer. Siden PEI / MNP-transfektion tillader GJIC i modificerede HUVECer, de har potentiale til integration in vivo og give miR levering til beskadigede områder.

Især har tidligere publicerede værker på celle magnetisering til efterfølgende målretning rapporteret cellefyldning på ~ 4 og 30 pg af jern / celle 48, 49, 50, 51. Disse numre væsentligt overstige de værdier ~ 0,16-0,7 pg / celle, der var tilstrækkelige til in vitro-målretning af NA / PEI / MNP-HUVEC'er i statiske og simulerede dynamiske betingelser. Sådanne jern mængder lave er gavnlige med hensyn til sikkerhed: en almindelig kendt mekanisme jernoxid nanopartikel-associeret toksicitet (dvs. produktion af reaktive oxygenarter (ROS)) vides at være direkte forbundet med mængden af internalized nanopartikler 40. Desuden har flere undersøgelser vist, at høje intracellulære niveauer af jernoxidpartikler nanopartikler kan føre til dosisafhængig cytoskeletale desorganisering og skade 52, 53. Vigtigt er det, de fleste rapporterede tilfælde af celle magnetisering til at målrette formål omfatter ikke genetisk celle manipulation. I modsætning hertil miR / PEI / MNP vektor giver mulighed for samtidig at modificere celler og til at tilføje magnetiske egenskaber.

Dog kan lav MNP loading være ikke tilstrækkeligt til magnetisk målretning i et turbulent miljø med blodgennemstrømning. For at komme tættere på den udfordrende in vivo-situationen, blev dynamiske betingelser simuleret in vitro: dyrkningsplader med magnetiseret miR / PEI / MNP-HUVEC'er i suspension blev anbragt på den roterende rysteapparat 34. Dette eksperiment kan tydeligvis ikke dække alle de samspil, der opstår ivivo. Men det førte til en bedre forståelse af den målrettet potentiale PEI / MNP-modificerede celler,. Som et resultat blev højeffektive celle målretning demonstreret når selv aktiv omrystning af dyrkningsmediet ikke forstyrre celle bevægelse mod magneten 54. Til dette formål blev miR-modificerede HUVEC'er lastet med mindst ~ 0,16 pg af jern / celle. Desuden kan magnetisk reagerende celler sorteres. En magnet-baserede celleseparation procedure anvendt på den aktuelle undersøgelse har ikke kompromitteret levedygtighed MIR / PEI / MNP-celler. Vigtigt er det, at anvende en statisk magnetfelt (dvs. rettet mod eksperimenter, der involverede anvendelsen af et magnetfelt i 12 - 24 t) ikke har en skadelig virkning på målrettede celler. Derfor demonstreret produktion af magnetiseret genetisk modificerede celler danner grundlag for yderligere in vivo undersøgelser vedrørende effektiviteten af celletilbageholdelse sikres ved magnetisk kraft. Især the mest succesfulde in vivo undersøgelser under anvendelse af målretning af magnetiserede celler 51, 54, 55 brugte celletilbageholdelse efter lokal administration i stedet for celle vejledning efter intravenøs injektion. Synes derfor ønskeligt magnet-baserede tilbageholdelse ved injektionsstedet til yderligere in vivo anvendelser af miR / PEI / MNP-modificerede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen konkurrerende økonomiske interesser til at videregive.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke G. Fulda (Electron Microscopy Centre, Rostock Universitet, Tyskland) for den tekniske support i at erhverve TEM billeder af filtrerede superparamagnetiske nanopartikler og ved udførelse af deres røntgenanalyse. Det arbejde, der udføres på RTC Rostock blev støttet af Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning Tyskland (FKZ 0312138A, FKZ 316.159 og VIP + 03VP00241) og staten Mecklenburg-Vorpommern med EU 's strukturfonde (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 og ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) og af DFG (DA 1296-1), Damp-instituttet, og den tyske Heart Foundation (F / 01/12). Frank Wiekhorst blev støttet af EU FP7 forskningsprogram "NANOMAG" FP7-NMP-2013-STOR-7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Tags

Medicin endotelceller manipulation miRNA polyethylenimin magnetiske nanopartikler målretning MRI
fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter