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Medicine

制备和 Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

这个手稿描述的miR的有效的，非病毒递送通过PEI / MNP矢量和它们的磁化与内皮细胞。因此，除了遗传修饰，该方法允许用于磁性细胞的指导和MRI可检测性。该技术可以被用来改善的治疗性细胞产品的特性。

Abstract

迄今为止，用于治疗心血管疾病的可用外科和药物治疗（CVD）是有限的，经常姑息。与此同时，基因和细胞的疗法可用于CVD处理极有希望的替代方法。然而，基因治疗的广泛临床应用极大地受到缺乏合适的基因递送系统的限制。的合适的基因递送载体的发展可以提供解决方案，以在细胞疗法目前的挑战。特别是，现有的缺点，例如，在受伤器官限定的效率和低的细胞保留，可以通过适当的细胞工程来克服移植（ 即遗传）之前进行。所提出的协议描述了使用聚乙烯亚胺的超顺磁性纳米颗粒（PEI / MNP）系递送载体的内皮细胞的有效且安全的瞬时变形。此外，算法和细胞表征方法定义。成功intracellu微RNA（MIR）到人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的拉尔递送已经在不影响细胞生存力，功能，或者细胞间的通信被实现。此外，这种方法被证明会导致导入的外源的miR强大的功能效果。重要的是，这种基于MNP-矢量的应用确保细胞磁化，伴随磁靶向和非侵入性的MRI跟踪的可能性。这可以提供对于可以非侵入性地监测与MRI磁性引导，遗传工程细胞疗法的基础。

Introduction

基因和细胞治疗是必须要解决的CVD处理当前挑战的潜在的强大工具。尽管这两种方法，目前正在临床试验，他们还没有准备好广泛的临床应用1。值得注意的是，以解决基因和细胞治疗的挑战的共同方法是开发适合于临床应用的多官能基因递送载体。缺乏安全，高效的基因传递系统是基因治疗的主要关注点。同时，细胞产物的基因工程移植前可以克服细胞治疗的严重挑战，如低效率（ 例如，在心脏字段，只有约5％的功能改善，实现后干细胞移植1 ）和差保留/植入在损伤部位（ 即，细胞保留低于5 - 10％几分钟到几小时内口服ST-应用，无论给药途径2,3，4）。

迄今为止，病毒载体大大超过在效率，这导致了在临床试验中其广泛应用方面非病毒系统（〜67％）5。然而，病毒载体携带在携带的遗传物质6的尺寸严重的风险，如免疫原性（和随后的炎症反应，有严重的并发症），致癌性，和限制。由于这些安全问题和病毒载体的生产成本高，使用非病毒系统的是在某些情况下7,8优选的。它特别适合用于需要瞬时遗传校正病症，诸如的调控血管生成（ 例如，用于CVD处理）的生长因子的表达或国内配送疫苗的RY。

本组的递送系统通过结合支链25-kDa的聚乙烯亚胺（PEI），并通过生物素-链霉亲和相互作用9结合在一起的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（MNP）而设计的。该载体是用于细胞基因工程，从而允许他们的移植之前同时磁化的潜在工具。后者提供了一种用于磁性引导/保持，这是特别有前途的今天，先进的磁性靶向技术正在研制成功10的基础。此外，所得到的磁响应的细胞必须是潜在的非侵入性通过磁共振成像（MRI）或磁性粒子成像11,12监测。

在PEI / MNP载体的情况下，聚胺保证了从低分子化因子核酸缩合，从而保护 s时，细胞载体内化和内体逃逸5。所述的MNP补充PEI的特性，不仅在磁性引导的方面，还通过降低已知的PEI毒性7，13，14。此前，PEI / MNP载体性质在输送效率（ 即，质粒DNA和miRNA）和安全性方面，通过使用成纤维细胞和人类间质干细胞15,16调整。

在该手稿上PEI /的MNP的对于miRNA修饰细胞的生成应用程序的详细方案描述17。为了这个目的，将HUVEC被使用并且表示用于在体外血管生成一个建立的模型。他们是具有挑战性的转染，并很容易受到有毒影响18，19，屁股= “外部参照”> 20。另外，我们提供一种算法来评估这些细胞在体外 ，包括它们的定位，细胞间通讯，和MRI检测。

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Protocol

从谁根据赫尔辛基宣言给他们的书面同意使用这种材料的研究得知，健康的妇女获得了细胞分离人类脐带产后 。罗斯托克大学的伦理委员会批准了提交研究报告（登记号：2011年的06，延长2013年9月23日）。

1.转染复合物的制备

  1. 聚乙烯亚胺的生物素化（PEI）。
    1. 溶解在300磁力搅拌下支链PEI的超纯水中 - 400rpm下在室温（RT）24个小时并避光以获得0.18 1mM溶液。存储在4℃下该溶液中。
    2. 测量在所获得的溶液21中 ，22个伯氨基的浓度。
      1. 通过混合100μL的PR的使用2％茚三酮试剂溶液作为胺检测试剂23ediluted样品（1：200，用超纯水）和茚三酮试剂的75μL。在80℃下温育30分钟。冷却下来并添加100μL50％乙醇的用于稳定。测量在对吸收分光光度计550nm处的吸光度。
      2. 创建使用甘氨酸的标准曲线。
        1. 制备0.1M的氨基-N原液及其稀释液（在100mL的去离子水0.75克甘氨酸），1：1,1：5，1:10，1:20，1:40，1:80，1： 100，1：200和1：400，1：600。测量这些溶液作为步骤1.1.2.1和创建与上轴进行的浓度与吸光度的曲线图。
        2. 基于所获得的曲线图和PEI溶液的测定吸光度，定义PEIα-氨基的浓度。
          注意：注意。茚三酮试剂的解决方案必须专门罩下使用，并且应在氮气气氛下储存。当溶液的颜色变化，由于氧化这是不可用的。
    3. 溶解100毫克在超纯水中生物素接头的即将使用前，得到0.01-1mM溶液。计算所需的生物素的量通过用生物素酰化20试剂的α氨基基团的PEI中的浓度（在步骤1.1.2测量）相乘以获得必要的量（摩尔）添加至PEI。
      1. 添加生物素溶液至PEI溶液在pH 8-9和在室温下孵育磁力搅拌下16个小时。
    4. 去除由尺寸排阻色谱23未反应的生物素。使用含有凝胶过滤介质适用于25-kDa的PEI的纯化市售的列，并按照制造商的说明。取等分试样进行纯化后使用胺检测试剂（步骤1.1.2）来测量，胺的浓度，并确定生物素缀合效率（步骤1.2.2）。存储所获得的生物素化的PEI在4℃下。
  2. 字符生物素化的PEI化。
    1. 确定PEIα氨基基团的浓度生物素化后，如在步骤1.1.2说明。
    2. 确定PEI生物素化的程度来验证偶联过程。为了定量，使用市售的试剂盒，其基于HABA染料（4'-羟基偶氮-2-羧酸）的应用，以确保生物素化水平24,25的正确的比色测定。按照制造商提供的说明。
  3. 的MNP及其表征的过滤。
    1. 通过0.45微米的注射器驱动的过滤器16，以便排除更大的毒性聚集体过滤市售streptavidin包MNP。测量使用标准光度测定法26的最终铁浓度。
    2. 检查过滤的MNP的通过记录质量按照标准协议27,28的磁化曲线和通过TEM成像。
      1. 稀释MNP悬浮液用蒸馏水和放置获得的悬浮液3微升在300目的Formvar碳涂布的铜用于TEM分析的网格。随后，放置在在加热板上的载玻片该栅格，并让它干燥。
      2. 分析在120千伏的透射电子显微镜试样和使用X射线检测器27验证该元素含量。
  4. 转染复合超分辨率显微镜的三色标记。
    1. 标签在PEI按照制造商的说明书测量伯氨基与NHS酯阿托488染料的0.5％。通过尺寸排阻色谱法除去过量的未结合的染料，上述（步骤1.1.4）中所述。使用茚三酮ASSA测量产生的氨基基团的浓度Y（步骤1.1.2）。
    2. 使用合适的标记试剂盒15（在材料清单表示）Cyanine5染料标记市售无规miR（SCR-MIR）。用分光光度法测量产生的荧光团的miR浓度。
    3. 用生物素缀合的染料（ 例如，ATTO 565 -生物素），每次新鲜标记MNP以1：1,000 w / w的比率。在Delyangina 等人的转染复合物的形成过程中加入MNP与miR / PEI，每细节后直接应用的染料。 16。

2.细胞制备

  1. HUVEC隔离。
    1. 隔离来自脐带细胞中获得使用胶原酶消化从脐带静脉的内部的帘线后就直接遵循以前开发协议29。
      1. 孵育与每个帘线〜60个单位/在缓冲IV型胶原酶溶液毫升 - 装入吨他脐静脉 - 在37℃下13分钟。
    2. 对于所有的实验，从最小的5例患者汇集内皮细胞。
      注：栽培不应超过4-5通道。不要使用被污染的支原体细胞，因为这会导致在转染效率的下降。支原体污染应用于通过使用PCR试剂盒支原体的高度敏感的检测开始的协议之前进行测试。
      1. 试验支原体存在。
        1. 细胞培养物上清液离心1毫升10分钟（13000×g）离心。暂停用蒸馏水2 O的17μL和沸腾（93℃）3分钟沉淀。使用2微升该悬浮液以扩增DNA区域，对于各种支原体物种的高度保守的核糖体RNA（16S-rRNA的）码。
        2. 执行使用的每种引物10皮摩尔的PCR（正向引物：5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3';反向引物：5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3'）在梳萌发的与在以下条件下市售PCR试剂盒：94℃3分钟;的94℃的45个循环持续30秒，50℃30秒，72℃30秒;和在72℃最终延伸10分钟。
        3. 分析使用琼脂糖凝胶电泳PCR产物（292个碱基）。
    3. 任一存储所获得的细胞在液氮中或培养它们长期在含有5％CO 2中的加湿器连接ED气氛下，在37℃下在补充有100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素的内皮生长培养基中。
  2. HUVEC表征。
    1. 在其构建在基底膜基质管（ 例如，基质胶）功能的能力和它们的内皮细胞标记物CD31的表达（血小板内皮细胞粘附分子，PECAM-1）来表征分离的内皮细胞按照标准规程30,31。

3.转染

  1. 胰蛋白酶化股票HUVEC培养物（见步骤4.1.2。）和手动计数使用血球细胞。种子的HUVEC上合适尺寸的塑料细胞培养孔板中，用约13000细胞生长表面的/厘米2，48小时在转染前的起始细胞密度，直至达到70-80％汇合。
  2. 准备新鲜的miR / PEI / MNP复合物每次。
    注意：首先，的miR / PEI复合物应当获得（步骤3.2.1 - 3.2.3）;随后，应的MNP为了得到用于转染（步骤3.3）的最终的miR / PEI / MNP制剂被加入到所述miR / PEI溶液（步骤3.2.4）。
    1. 使用由制造商提供的库存的浓度计算合适的商购的miR的量（加扰的，标记的或功能性的，见步骤4）。使用2.5皮摩尔的细胞生长表面的的miR / cm 2以下。稀释所述miR在5％葡萄糖溶液与obtain 0.125皮摩尔的miR /μL的终浓度。
    2. 基于来自步骤3.2.1所述miR量和25 32的最佳NP比，使用它的测定浓度（步骤1.1.2）计算所需PEI量。在等体积的5％葡萄糖溶液稀释PEI（每计算的所需体积）。添加得到的预稀释的PEI与miR溶液（来自步骤3.2.1）并涡旋将得到的混合物30秒。
    3. 孵育所获得的miR / PEI混合物在RT下30分钟。
    4. 声处理的MNP在35千赫中在RT下超声处理水浴（参见材料列表）为至少20分钟，MNP溶液适量添加与miR / PEI（5 - 制备的miR / PEI的25微克铁/ mL的/ MNP混合物16），涡流30秒，并在室温下孵育30分钟，直到准备。
  3. 直接添加制备的miR / PEI / MNP混合物滴加至在细胞培养基中。使用所得到的细胞的CuI混合物用的miR / PEI / MNP TURE培养基稀释在葡萄糖作为转染溶液。更换新鲜培养基6小时转染后该混合物。

4.矢量安全性分析

  1. 细胞活力的考试。
    1. 转染的HUVEC在24孔培养板接种（步骤3.1和3.2）;使用的Cy3-MIR作为测试探针和无规miR（SCR-MIR）作为控制选通探针的流式细胞术。在含有5％CO 2 24小时一个加湿器音响编气氛孵育在37℃下。
    2. 收集上清液，并使用1×胰蛋白酶-EDTA在PBS中稀释加入到细胞4分钟，在37℃转染的细胞通过胰蛋白酶消化。离心机中以300×g离心10分钟，并使用用于分析。
    3. 检查转染了利用通过应用可商购的染色活/死细胞之间进行区分流式细胞仪24个小时后的细胞活力和miR吸收效率;使用标准的协议15
  2. 检查所述miR / PEI / MNP复合物在功能测定细胞的安全性。
    1. 评估转染细胞的增殖活性。
      1. 转染的HUVEC在12孔培养板中接种（步骤3.1和3.2）与官能反义的miR（ 例如，抗miR92a为内皮细胞31），并在含有5％CO 2 24小时一个加湿器音响编气氛下在37℃下孵育。
      2. 使用市售的试剂盒通过用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）和扫描染色用基于激光的共焦显微镜，以限定增殖细胞的数目。使用下面的显微镜设置：40X客观油浸泡; 633nm的激发激光（对于647纳米染料）;要被记录在每个样品中5个随机视野。通过由总细胞核数除以的EdU染色的核的数目计算增殖细胞的速率（HoechST-染色）。
    2. 评估转染的细胞，以形成管样结构的能力，如先前所描述17，31。
      1. 转染的HUVEC在24孔培养板接种（步骤3.1和3.2）与SCR-的miR并在含有5％CO 2中的加湿器连接ED气氛下在37℃下孵育48个小时。收集转染的细胞（如在步骤4.1.1）。
      2. 种子3.5×10在涂覆有基底膜基质的140μL24孔板改性HUVEC的4。在含有5％CO 2中的加湿器连接ED气氛下孵育18个小时，在37℃。
      3. 在每个孔中使用激光扫描共聚焦显微镜10个随机视野的记录图像（微分干涉对比）和分析使用ImageJ软件与“血管生成分析仪”插件。包括这样的参数作为分支的总长度，支链的数量，并且juncti的数量附加组件的评估。与此相比，未经处理的对照。
  3. 检查上间隙连接（GJ）转染复合物的可能的毒性影响在三维光漂白（FRAP）33后介导的通过测试3D荧光恢复细胞间通讯（GJIC）。
    1. 种子在明胶包被的载玻片上的细胞与适合于活细胞成像（浸油）的薄的底部。转染细胞，如步骤3.2与未标记的，非功能性的miR（SCR-MIR）如上所述，并培育24小时。
    2. 用显微镜前直接钙黄绿素加载它们准备用于成像的细胞。具体地，用含有5μM的钙黄绿素的新鲜培养基更换培养基，孵育20分钟，用PBS洗涤，并加入新鲜培养基。预暖显微镜至37℃培养箱并调整CO 2浓度为5％。
      注：所有试剂应该是温暖的，以避免电池承包商重刑测量前。
    3. 使用用于细胞可视化和FRAP实验一个561-nm激发激光。首先，手动地选择用于测量的作为关注区域（ROI）的细胞;试验细胞应具有至少3个相邻小区。定义一个不会被漂白明亮，稳定的荧光参考小区。定义一个Z堆叠的极限。记录从细胞至底部的顶部的荧光，包括10 - 15层。
    4. 漂白使用100％的激光功率的测试细胞，并记录随后的荧光恢复（由于来自相邻小区的GJ特异性染料转移）如下在15分钟内。在Z堆栈每60秒记录的原始数据。每个实验10测试细胞 - 总共具有不小于5执行FRAP测量。比较结果与未转染细胞。

5.转染效率的测试

  1. 的miR摄取的考试。
    1. 如STE描述制备探针P4.1中，并同时用它们来限定与流式细胞仪的miR摄取。
  2. 确认并通过共聚焦和超分辨率结构照明显微镜（SIM）描述的转染复合物的细胞内定位。
    1. 种子的HUVEC上放置在24孔培养板的孔中明胶包被的玻璃盖玻片上，如之前（步骤3.1）中描述的。转染用标记的miR / PEI / MNP（步骤1.4）3色的细胞，并在含有5％CO 2中的加湿器连接ED气氛下，在37℃下孵育24个小时。
    2. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）2％牛血清白蛋白（BSA）第一洗涤盖玻片，然后用PBS只是。通过在37℃下15个分钟，染色细胞核用DAPI按照标准规程在16 4％低聚甲醛（PFA）固定孵育细胞。摇床上洗涤3次（每次15分钟），以除去过量的染料。
      注：PFA是致癌的，必须谨慎处理。
    3. 放置PR上显微镜盖玻片epared载玻片使用合适的安装平台，让他们至少1个小时干燥，并使用它们用于显微术，如下面所述。
    4. 获得使用63X油浸物镜和下面的SIM卡设置图像：405- 488- 561- 633nm的激光线激发，，，和; Z-堆叠模式与32位的深度在5角，5个阶段，以4平均; G2栅极与405的激光线，G3与488，G4与561，和G5与633。
  3. 评估递送的miR的通过RT-qPCR中的miR / PEI / MNP-的HUVEC与未处理的功能。
    1. 转染的HUVEC在12孔培养板的步骤（3.1和3.2）与官能反义的miR（ 例如，抗miR92a用于将HUVEC 31）接种，并在含有5％CO 2中的加湿器连接ED气氛下在37℃下孵育48个小时。
    2. 评估抗miR92a传递和处理用RT-qPCR的使用市售试剂盒（参见材料）;遵循Ť他制造商的说明，与其他地方一样17,31描述。并行地，检查所述靶基因的表达（ 例如，ITGA5 31）。
      注：对源miR拮抗剂（antagomir）输送优于模拟物，因为它保证所述miR的实际结果，而不是仅仅其细胞内积累的测量。

6.细胞靶向和评价磁性细胞分离

  1. 细胞在体外静态条件定位。
    1. 转染的HUVEC在24孔板（2.5皮摩尔/ cm 2的SCR-的miR，NP 25，和15-25微克/毫升MNP），孵育24小时，洗涤，和以上（步骤4）所描述的收集。
    2. 混合来自1中获得的细胞沉淀以及用1mL新鲜培养基中，并放置在一个12孔板的孔中。在使用磁带的板的底部局部（上侧）固定一个小磁体。
    3. 孵育24个小时的细胞悬浮液，并观察在该区域在所述磁铁和该区域的细胞附着和生长而不磁体。对于定性评价，使用传统的倒置显微镜。
  2. 细胞在体外模拟动态条件定位。
    1. 转染的HUVEC以每步3.1和3.2 24孔板（2.5皮摩尔/ cm 2的的Cy3的miR，NP 25，和15 - 25微克/毫升MNP），孵育24个小时，洗涤，并使用通过胰蛋白酶消化收集1X在PBS中稀释的胰蛋白酶EDTA加入到细胞4分钟，在37℃。离心机中以300×g离心10分钟。
    2. 混合来自1中获得的细胞沉淀以及用1mL新鲜培养基中，并放置在一个12孔板的孔中。固定一个小磁体本地（在阱的一侧）使用磁带。放置在摇床上培养板并孵育12个小时的细胞悬浮液以150rpm以模拟动态条件34。
    3. 洗涤细胞并修复他们用4％PFA。用DAPI染色16细胞核。记录使用激光扫描共聚焦显微镜用514-nm激发激光的细胞附着，Z堆叠模式（5 - 12片），以获得原始数据，以及最大强度投影图像处理以创建用于分析图像。
  3. 磁响应和非反应性细胞的定量分析。
    1. 转染的HUVEC在24孔板（2.5皮摩尔/ cm 2的SCR-的miR，NP 25，和15-25微克/毫升MNP），孵育24个小时，洗涤，并如前面所述收集（步骤6.2.1） 。预温PBS和细胞分选缓冲液（过滤灭菌，参见材料列表）至37℃。重悬细胞与排序缓冲器500μL从每个孔获得细胞沉淀。
    2. 将此细胞悬浮液通过所供给的磁铁固定的磁分选柱，洗柱在磁体用新鲜的细胞分选缓冲液3次，并收集流通作为MAGNETI卡利反应迟钝馏分（MAG-）。
    3. 除去从磁铁的列，并立即通过收集使用柱塞通过该柱推动新鲜细胞分拣缓冲液中的磁响应的细胞级分（MAG +）。
    4. 在300×g离心10分钟，离心分离机既MAG-MAG和+。重悬在PBS中的细胞沉淀，计数细胞，并用台盼蓝排除测定35评估细胞生存力。使用所得到的细胞沉淀或者用于长期分析（ 即，重种子，并评估在培养后17，24,48和72小时），或者直接用于流式细胞术（步骤4.1）。
  4. 定义转染细胞的铁负荷。
    注：在制备过程中，必须避免与氧化铁材料和仪器的细胞探针的任何接触。
    1. 收集转染的HUVEC和未转染对照（如在步骤4.1.1）。洗收集的细胞两次在2％BSA在PBS 36b的 ÿ仔细混合将细胞与1mL该洗涤缓冲液中，然后在300×g下离心10分钟。重悬在PBS中的250μL的所得到的细胞沉淀物中，添加4％PFA的100μL，并孵育20分钟来固定细胞。用PBS洗涤3次，如上所述。
    2. 重悬在PBS中的110μL所得固定细胞沉淀，并转移至100-μLPCR管。
      1. 取10-μL等份用于细胞计数，并使用剩余的样品用于磁性粒子光谱（MPS）。
    3. 市售的MPS设备上进行测量。在测量期间，应用如下设置：磁场B 驱动 = 25 MT和频率f 0 = 25千赫。对于样品的铁定量，标准化MPS-光谱的三次谐波A 3到MNP参照样品的相应的A 3，参考文献为2.1微克的已知铁量外部参照“> 37。用未处理的细胞作为对照。

7.定义MRI检测极限

  1. 细胞制备。
    1. 在6孔板中并转染种子的HUVEC（2.5皮摩尔/ cm 2的SCR-的miR，NP 25，和15 - 25微克/毫升MNP）一式两份或一式三份根据所需的细胞量（虚线制备）。孵育细胞24个小时，并洗涤，收集，并用4％PFA固定它们，如之前（步骤4）中所述。
    2. 计数所获得的细胞，用适当的细胞数目（ 例如，10 3，10 4，10 5， 等 ）制备的等分试样，并调整其体积至50μl。
  2. 琼脂糖幻影准备
    1. 制备2％琼脂糖的若干层在50-mL管与不同量的嵌入层38之间的转染细胞的。在制备过程中，超声处理和离心热琼脂糖38到破坏气泡引起的伪影。
      注：重要的是，含有非磁性的miR / PEI复合物处理的5.5×10 5的HUVEC幻影应以相同的方式来制备，以用作对照。
  3. 在线圈的中心放置幻象后与 7.1Ť动物MRI系统体外幻影扫描所获得的，平行于磁场的z轴。
    1. 应用下面的序列参数的梯度回波序列采集：TR = 66毫秒; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01毫秒;翻转角= 3°;矩阵= 128×128，内插，以256×256;的视图=42毫米字段; 100％;平均值= 1，回波串长度= 1;切片厚度= 1.5毫米;和16片。
    2. 使用适当的软件评估所有四个回波时间的信号衰减，并计算R2 *映射（R2 * = 1 / T2 *），如别处所描述39。

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Representative Results

所提出的协议的主要目的是产生磁响应的miR-修饰的细胞，并进行其精确的表征（ 图1）。其结果是，有效地转染的细胞中，响应于磁选择和指导和可检测的与MRI，应当获得。

首先，分离的内皮细胞的身份，通过与内皮细胞标记物CD31染色的典型（PECAM）（ 图2A）和通过以在适当的基底膜基质（ 图2B）的管的能力证实。将所得到的细胞拿起所述miR非常有效地引入由PEI / MNP;显微镜表明，所有的细胞均为阳性标记的miR（Cy3标记）24小时后转染（ 图3A）的信号。重要的是，没有细胞死亡被记录相比，未经处理的细胞（ 图3B），并且normal外观保持（ 图3A）。如共聚焦激光扫描显微镜观察，的Cy3的miR的信号被主要位于细胞内。此外，转染载体和miR的所有部分的细胞内定位的更详细的调查，使用3色标记的复合物更高的分辨率下进行。 SIM，的miR，PEI，和MNP信号在核周区域（ 图3C）的细胞质中检测到的所有。

此外，转染载体的安全的详细调查已经证明了miR / PEI / MNP-的HUVEC能够在适当的基底膜基质和形成管的所产生的网络比得上用作阳性对照未处理的细胞（ 图4A ）。此外，转染的细胞保持GJIC，如3D-FRAP实验揭示。特别是，当细胞加载荧光GJ-柏美亚BLE染料和它们中的一个被漂白，其荧光恢复由于与相邻小区通信，将所得染料转移（ 图4B）。

重要的是，由于超顺磁性化合物40（ 图5A）的存在下，PEI / MNP应用不仅允许细胞转染，而且还同时磁化。使用MPS（ 图5B）为最佳的范围内的所有施加MNP浓度将得到的细胞内铁的量进行测定（2.5皮摩尔/ cm 2的的miR; NP 25补充了5-25微克/毫升MNP）：0.37±0.079至0.7± 0.150 PG铁/细胞17。由于使用磁分离柱的证明的，对于所有这些MNP浓度，磁响应细胞在转染细胞的总体积的量为〜70％（ 图5C）。此外，转^ hUVECs 在体外琼脂糖幻影的内部与MRI（ 图5D）可见，模仿小鼠组织易感性。此外，在体外模拟动态条件下转染的HUVEC的磁性靶向被证明是有效的（ 图6）。在这个实验装置，甚至培养基的不断剧烈运动并没有阻止在靠近磁体的应用领域盛行细胞生长。

图1
图1.磁化的miR-修改内皮细胞和他们的分析生产中的示意图。的PEI / MNP（聚乙烯亚胺/基于超顺磁性纳米颗粒载体）被施加到传送微RNA（MIR）到人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。将得到的细胞产物的特征在于如下参数：安全（包括细胞活力，功能两者均，以及用于细胞间通信容量）;转染效率（ 即，的miR吸收效率和之后的功能）;磁中的静态和动态模拟条件体外靶向;磁共振成像（MRI）检测。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.表征分离的HUVEC的。与内皮CD31标记染色分离培养的HUVEC A.代表性图像。细胞核复用DAPI（蓝色）。比例尺为20μm。对分离的内皮细胞进行的管形成测定的B.代表性结果;使用激光扫描共聚焦显微镜图像被记录（帧间差ference对比度）上基底膜基质细胞接种后18小时。比例尺为100μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. 交货的miR人脐静脉内皮采用PEI / MNP。 A.标记的miR的摄取（Cy3的红色）24小时后转染细胞和正常细胞的外观的维护（的Cy3标记的miR，NP 25和MNP 25微克/毫升的2.5皮摩尔/ cm 2）的被示出。图像使用一个514-nm激发激光（Cy3标记，红色）和微分干涉对比采取共聚焦激光扫描显微镜。比例尺为50μm。 B.细胞生存力24小时转染后，通过流式细胞术评估。该图表示HUVEC得到的结果S采用以下复杂组合物处理：的Cy3的miR的2.5皮摩尔/厘米2; NP比25补充有5至25微克/毫升的MNP的。杆描绘的平均数量的活细胞和整个细胞群体之间的比率（N = 6;误差条：SEM）。 3色的C.结构照明显微镜（SIM）成像标记的由血管内皮细胞吸收的miR / PEI / MNP络合物。如上所述，温育转染所述细胞，和固定24小时后处理;细胞核用DAPI复染。原始SIM数据记录在Z-栈和处理;代表图像是最大强度投影的结果。下面激发激光器施加：405纳米（DAPI，蓝色），488纳米（Atto488-PEI，橙），565纳米（Atto565-MNP，青色）和633纳米（Cy5的-MIR，红色）。比例尺为5μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4的HUVEC变形例的安全与的miR / PEI / MNP。 48小时后处理; A.甲管形成测定用转染的细胞（NP 25和MNP 25微克/毫升SCR-的miR的2.5皮摩尔/ cm 2）的执行。图像用激光扫描共聚焦显微镜获取（ 即，微分干涉对比）上基底膜基质细胞接种后18个小时。用的miR / PEI转染的HUVEC被用作一个控制毒性和未处理的细胞作为阳性对照。比例尺为100μm。该图反映了转染的HUVEC和使用若干参数未处理的细胞之间的比例：管长度，分枝数目，和结（n = 3时，误差条：SEM）。 B.的miR / PEI / MNP改性的HUVEC的间隙连接介导的细胞间通信，评价24小时后transfec灰。为了这个目的，将细胞装载有GJ可渗透染料钙黄绿素（橙色）;光漂白（FRAP）后荧光恢复是通过在Z-堆叠扫描测试细胞在三维检查。钙黄绿素装载的细胞的代表性图像漂白之前，直接漂白后，并在15分钟后的脱色（用回收的荧光）被描绘。比例尺为20μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.细胞磁化从与PEI / MNP及其应用转染得到的。过滤的MNP的A.形象代表，与TEM拍摄，说明他们的集群形态。一个小尺寸 - 单氧化铁颗粒（导致超顺磁性）的（〜5 15纳米）由此证实。的比例尺为100nm。 B.转染的细胞的细胞内装载物通过磁性粒子光谱（MPS）24小时后转染进行评估。代表面板描绘检查样品的MPS光谱。特别是，纯MNP悬浮液（50μL）作为参照（蓝色正方形）;圆圈是两个转染的细胞样品（红色圆圈：MNP 25微克/毫升;绿色圆圈：MNP 5微克/毫升）的MPS光谱，而灰色三角表示没有任何样品通过测量获得的检测到的背景光谱。注意的幅度（A）的对数标度。 C.磁性修饰的细胞的量通过转染的HUVEC的应用定量（2.5皮摩尔/ cm 2的的miR; NP 25补充了5-25微克/毫升的MNP），通过胰蛋白酶消化24小时后处理收集到的磁细胞分离柱。将得到的磁性阳性分数（ 即，残留在柱）进行计数，其百分比出转染细胞的整个量的被反映在曲线图对于每个MNP浓度（红色三角形）。细胞活力随后通过台盼蓝排除测定（灰色菱形）检查。数据表示为平均值±SEM（N = 3）。转染的HUVEC的D.说明性MRI图像（300,000个细胞; 2.5皮摩尔/ cm 2的的miR; NP 25 25微克/毫升的MNP）嵌入到琼脂糖幻像记录有7.1Ť动物MRI系统。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6. 在模拟动态条件的miR / PEI / MNP-HUVEC的 体外 磁性靶向。血管内皮细胞收集24小时后转染离子（2.5皮摩尔/厘米的Cy3的miR的2，NP 25 MNP 25微克/毫升），并重新接种在孔中的新鲜培养基，与本地连接到所述侧壁上的小磁铁。反过来，这培养板固定到摇床上以150rpm旋转。细胞附着和生长进行12个小时后评估通过用PFA固定细胞，用DAPI染色它们的原子核，并进行激光扫描共聚焦显微镜（激发激光器：405纳米，DAPI，蓝色; 514纳米，CY3，橙色）。代表性图像描绘与磁铁申请区域的细胞生长;无需磁铁应用;并在培养物的中心孔，其中，液体流被浓缩细胞。该比例尺是50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

生产装载有超顺磁性纳米颗粒和其进一步磁控制的指导基因工程细胞的呈现在当前协议。这种策略的成功应用允许的细胞治疗的一些困难，例如在受伤区域2，3，4低保留和植入差分辨率，通过对移植提供靶向细胞产物。此外，同时引入适当选择的遗传物质的可促进细胞特性，从而可以增加功能性益处41。

目前的协议已经开发了血管内皮细胞的一种模式。这些细胞被称为是难以转染和易受影响有毒18，19，20。该DEM典型地用基于PEI的载体获得的PEI / MNP转染后的荧光团标记的miR摄取onstrated水平超过95％，并且通常使用的基于阳离子脂质的转染试剂（ 例如，脂质体）42。对于NP 40 - 此外，25的最佳NP比率为20先前公布的值相对应。然而，测试的荧光团标记的miR的高效摄取并不一定保证递送43经过适当的miR处理和功能。这一点是在PEI的情况下特别相关的，与NA的其紧静电冷凝。因此，递送的miR的得到的功能容量也必须进行测试。这里，功能性内源的miR在HUVEC中表达，的miR-92A 31，选择，和针对其抗miR使用PEI和PEI / MNP递送。其结果，靶的miR-92a的几乎完全敲低证明了抗miR f的有效释放ROM中的转染复合物。

重要的是，在以前的工作中，PEI / MNP矢量的成功应用被证明用于递送质粒DNA（pDNA的）和miR的其它细胞类型，无论是贴壁（ 例如，COS7，人间质干细胞15，16）和在悬浮液（ 例如，骨髓衍生的CD133 +造血干细胞44）。所有这些实验都证实了众所周知的事实，转染效率和毒性是细胞类型相关的45。因此，最佳载体组合物的选择（ 即，量的miR，NP比，和MNP铁的量）应当为每一个特定的细胞类型中进行，使用作为基准点以前建立最佳条件。

此外，所获得的遗传修饰的瞬态字符应占。在一方面，我t是非常适合于某些功能，如生长因子的短期交货。在另一方面，表达的持续时间可能不会持续足够长的时间，适用于各种需要长期表达的目的。然而，证明了PEI / MNP矢量的安全支持其可以重复施用一旦条件进一步优化。

PEI及其衍生物由于常用于它们的高效率相比于其他非病毒载体和它们的柔性变形例7。然而，尽管在体外和体内 PEI的成功，其在临床试验中应用是非常有限的（ 即，几个阶段1和2的试验或癌症患者）7，14由于PEI毒性7,13。由于我们组16，以及该协议的早期作品中，已经证明，的MNP能够显著降低PEI的毒性。特别是，的miR / PEI的转染已损坏的HUVEC以在它们的基质管的能力，因而不能主体外功能试验这些细胞。与此相反，的miR / PEI / MNP-HUVEC的管形成性能与未处理的细胞。值得注意的是，这种降低PEI毒性的，通过引入组分，例如氧化铁，其是生物相容的和常规用作在人受试者40的造影剂的低含量来实现。

除了维持功能特性，重要的是，经修饰的细胞是能够建立细胞间通讯的，因为这个功能是必要的细胞治疗移植后46的适当整合。此外，经修饰的细胞可被利用作为用于递送治疗的miR的到受伤组织47的载体。在这种情况下，他们的卡帕奇TY与邻近细胞交换分子定义它们的作为车辆的成功。由于PEI / MNP转允许GJIC在修改内皮细胞，它们在体内的整合潜力和提供的miR运送到受灾地区。

值得注意的是，对细胞磁化先前发表的作品用于随后的定位已经报道〜4的小区负载和铁/小区48,49，50，51的30微克。这些数字显著超过值〜0.16-0.7 pg /细胞，这是足够用于静态和动态模拟条件的体外靶向NA / PEI / MNP-HUVEC的。这样低的铁的量是在安全性方面是有益的：（ 即，活性氧类别（ROS））是已知的铁氧化物纳米颗粒相关的毒性的一个公知的机构与INTE的量直接相关联rnalized纳米颗粒40。此外，几个研究已经证明，氧化铁纳米颗粒的高细胞内水平可导致剂量依赖的细胞骨架结构破坏和损伤52,53。重要的是，大多数报告的小区磁化的情况下，为了定位不包括遗传细胞操作。与此相反，所述miR / PEI / MNP向量提供了一个机会同时修改细胞和添加的磁特性。

然而，低负荷MNP可能是磁靶向随血流动荡的环境不够。为了更接近体内情况的具有挑战性的，动态条件进行了模拟在体外：在悬浮液与磁化的miR / PEI / MNP-的HUVEC培养板放置在旋转振荡器34。这个实验清楚地不能涵盖所有发生在相互作用体内。但是，这也促使人们更好地了解PEI / MNP修饰细胞的靶向的潜力。其结果是，甚至当培养基中的活性摇动没有朝向磁铁54与细胞的运动干扰高效细胞靶向证明。为了这个目的，的miR-改性将HUVEC装载有至少〜0.16皮克铁/细胞。此外，磁响应细胞进行排序。应用于当前研究基于磁铁细胞分离过程已不损害所述miR / PEI / MNP-细胞的活力。重要的是，静磁场的应用（ 即，针对所涉及的磁场的应用为12个实验- 24小时），并没有对靶细胞产生破坏性的影响。因此，证明了生产磁化遗传修饰的细胞的进一步提供了在解决由磁力确保细胞保留的效率的体内研究的基础。值得注意的是，日È最成功的在采用磁化细胞的靶向51，静脉注射后54后，用过的55细胞保留局部给药而不是细胞指导体内研究。因此，在注射部位的基于磁体的保留用于进一步合乎需要出现在的miR / PEI / MNP-修饰的细胞的体内应用。

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Disclosures

我们有没有竞争经济利益透露。

Acknowledgments

我们要感谢G·富尔达（电子显微镜中心，罗斯托克大学，德国）用于收购过滤顺磁纳米颗粒的TEM图像，并履行其X射线分析技术支持。在RTC罗斯托克进行的工作是由联邦教育与研究部德国（FKZ 0312138A，FKZ 316159和VIP + 03VP00241）和国家梅克伦堡 - 前波莫瑞州与欧盟结构基金（ESF / IV-WM-B34-支持0030/10和ESF / IV-BM-B35-0010 / 12）和由DFG（DA 1296-1），则湿热基金会和德国心脏基金会（F / 01/12）。弗兰克·威克霍斯特由欧盟第七框架计划的研究项目 “Nanomag” FP7-NMP-2013-大7的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

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医学，第123，内皮细胞，细胞工程，miRNA的，聚乙烯亚胺，磁性纳米粒子，靶向，MRI
制备和<em&gt;体外</em&gt;磁化的表征的miR-改性内皮细胞
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Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

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