Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fremstilling og Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

Dette manuskriptet beskriver effektiv, ikke-virale leverings av MIR til endotelceller ved en PEI / MNP-vektor og deres magnetisering. Derfor, i tillegg til genetisk modifisering, gir denne metode for magnetisk celle veiledningen og MRI detekterbarhet. Teknikken kan brukes til å forbedre egenskapene terapeutiske celleprodukter.

Abstract

Til dags dato, de tilgjengelige kirurgiske og farmakologisk behandling for hjerte- og karsykdommer (CVD) er begrenset og ofte palliativ. På samme tid, gen og cellen terapi er meget lovende alternative tilnærminger for CVD behandling. Imidlertid er det bred klinisk anvendelse av genterapi sterkt begrenset av mangelen på egnede genavleveringssystemer. Utvikling av hensiktsmessige genavleveringspartikler vektorer kan gi en løsning på aktuelle utfordringer i celleterapi. Spesielt kan eksisterende ulemper, så som begrenset virkningsgrad og lav celleansamling i den skadde organ, kunne overvinnes ved passende celleteknikk (dvs. genetisk) forut for transplantasjon. Den presenterte protokollen beskriver effektiv og sikker forbigående endring av endotelceller ved hjelp av et polyetylenimin superparamagnetisk nanopartikkel (PEI / MNP) -basert levering vektor. Dessuten er den algoritme og fremgangsmåter for celle karakterisering definert. Den vellykkede intracelluLar levering av mikroRNA (MIR) i humane navlevene-endotelceller (HUVEC) er oppnådd uten å påvirke cellenes levedyktighet, funksjonalitet, eller intercellulær kommunikasjon. Dessuten ble dette vist seg ikke å føre til en sterk funksjonell virkning på innførte eksogene mir. Viktigere, sørger for anvendelsen av denne MNP-basert vektor celle magnetiseringen, med tilhørende muligheter for magnetisk målretting og ikke-invasiv MRI tracing. Dette kan gi et grunnlag for magnetisk guidet, genetisk konstruerte celle terapeutiske midler som kan overvåkes uten inngrep med MRI.

Introduction

Gene og celleterapi er kraftige verktøy som har potensial til å løse dagens utfordringer i CVD behandling. Til tross for at begge disse tilnærmingene er under utprøving i kliniske studier, er de ennå ikke klar for bred klinisk anvendelse en. Spesielt, en felles tilnærming for å takle utfordringene i genet og celleterapi er å utvikle multifunksjonelle genavleveringspartikler vektorer som er egnet for klinisk anvendelse. Mangelen på en sikker og effektiv genavleveringssystemer er den største bekymringen for genterapi. På samme tid, den genetisk engineering av cellulære produkter før transplantasjon kunne overvinne de alvorlige utfordringene med celleterapi, slik som lav effektivitet (for eksempel i hjerte feltet, er bare ~ 5% av funksjonell forbedring oppnådd post-stamcelletransplantasjon 1 ) og dårlig retensjon / innpodning ved skadestedet (dvs. synker selvretensjon under 5 - 10% i løpet av minutter til timer post-program, uavhengig av tilførselsvei 2, 3, 4).

Til dags dato, virale vektorer i stor grad overstiger ikke-virale systemer når det gjelder effektivitet, noe som har resultert i sin bredere anvendelse i kliniske forsøk (~ 67%) 5. Imidlertid virale kjøretøyer bære alvorlige risiko, for eksempel immunogenisitet (og den påfølgende inflammatorisk respons, med alvorlige komplikasjoner), onkogenisitet, og begrensninger på størrelsen av det bårede genetisk materiale 6. På grunn av disse sikkerhetsproblemer og høye kostnader for viral vektor produksjon, er bruken av ikke-virale systemer foretrekke i visse tilfeller 7, 8. Den er spesielt egnet for lidelser som krever forbigående genetisk korreksjon, så som ekspresjon av vekstfaktorer kontrollere angiogenese (dvs. for behandling CVD) eller levere denRy av vaksiner.

I vår gruppe, ble et leveringssystem er designet ved å kombinere forgrenet 25-kDa polyetylenimin (PEI) og superparamagnetiske jernoksidpartikler nanopartikler (MNP) er bundet sammen ved hjelp av biotin-streptavidin interaksjon 9. Denne vektor er et potensielt verktøy for genetisk modifisering av celler, noe som muliggjør deres samtidige magnetisering før transplantasjon. Sistnevnte gir et grunnlag for magnetisk veiledning / etensjon som er spesielt lovende nå til dags, som avanserte magnetisk målretting teknikker blir hell utviklet 10. Videre er de resulterende magnetisk responsive celler har potensial til å være en ikke-invasiv overvåket ved magnetisk resonansavbildning (MRI) eller magnetisk partikkel avbildning 11, 12.

I tilfelle av PEI / MNP-vektor, sikrer polyamin nukleinsyre kondensasjon og således beskyttelse mot nedbrytende faktor s, vektor internalisering i celler, og endosomal unnslippe 5. Den MNPS utfyller egenskapene til PEI, ikke bare i form av magnetisk veiledning, men også ved å redusere den kjente PEI giftighet 7, 13, 14. Tidligere ble PEI / MNP vektoregenskaper justeres i forhold til leverings effektivitet (dvs. pDNA og miRNA) og sikkerhet ved hjelp av fibroblaster og humane stamceller 15, 16.

I dette manuskriptet, er en detaljert protokoll på anvendelse av PEI / MNPS for generering av miRNA-modifiserte celler som beskrevet 17. For dette formål er HUVEC brukt og representerer en etablert modell for in vitro-angiogenese. De er vanskelig å transfektere og er utsatt for toksiske påvirkning 18, 19,ass = "ekstern referanse"> 20. I tillegg gir vi en algoritme for å vurdere slike celler in vitro, inkludert deres målretting, intercellulær kommunikasjon, og MRI deteksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Navlestrenger fra mennesker for celleisolasjon ble oppnådd postpartum fra informerte, sunne kvinner som ga sitt skriftlige samtykke til bruk av dette materialet til forskning i henhold til Helsinkideklarasjonen. Den etiske komiteen ved Universitetet i Rostock har godkjent presenterte studien (reg. Nr A 2011 06, langvarig 23 september 2013).

1. Fremstilling av Transfeksjon komplekser

  1. Biotinylering av polyetylenimin (PEI).
    1. Oppløs forgrenet PEI i ultrarent vann under magnetisk omrøring ved 300-400 rpm i 24 timer ved romtemperatur (RT) og beskyttet fra lys for å oppnå en 0,18-mM løsning. Oppbevar løsningen ved 4 ° C.
    2. Måle konsentrasjonen av primære aminogrupper i den oppnådde oppløsning 21, 22.
      1. Bruke 2% ninhydrinreagens oppløsning som amin deteksjonsreagensen 23 ved å blande 100 ul prediluted prøve (1: 200 med ultrarent vann) og 75 ul av ninhydrin-reagens. Inkuber i 30 minutter ved 80 ° C. Kjøl den ned og tilsett 100 ul 50% etanol for stabilisering. Mål absorbansen ved 550 nm på absorpsjonen spektrofotometer.
      2. Opprette en standard kurve ved hjelp av glysin.
        1. Fremstill 0,1 M amino-N stamløsning (0,75 g glycin i 100 ml deionisert vann) og dets fortynninger, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200 og 1: 400, 1: 600. Måle disse oppløsninger som i trinn 1.1.2.1 og skape et tomt med konsentrasjonen og absorbans på aksene.
        2. Basert på det oppnådde plottet og den målte absorbans på PEI-løsning, definere konsentrasjonen av a-aminogruppene i PEI.
          MERK: Forsiktig. Ninhydrinreagens løsningen må utelukkende brukes under panseret og bør lagres under en nitrogenatmosfære. Det er ikke brukbart når fargen på løsningen endres på grunn av oksidasjon.
    3. Oppløs 100 mg biotin linker i ultrarent vann umiddelbart før bruk for å oppnå en 0,01 mM løsning. Beregne den nødvendige mengde av biotin for å legge til PEI ved å multiplisere konsentrasjonen av a-aminogrupper i PEI (målt i trinn 1.1.2) ved 20 for å oppnå den nødvendige mengden (i mol) av biotinylerende reagens.
      1. Tilsett biotin løsning PEI-løsning ved pH 8-9 og inkuberes i 16 timer under magnetisk omrøring ved romtemperatur.
    4. Å fjerne det uomsatte biotin ved størrelse-eksklusjonskromatografi 23. Bruke kommersielt tilgjengelige kolonner som inneholder et gelfiltreringsmedium egnet for rensingen av 25-kDa PEI og følge produsentens instruksjoner. Ta alikvoter etter rensing for å måle aminkonsentrasjonen ved hjelp av et amin deteksjonsreagensen (trinn 1.1.2) og for å bestemme den biotin konjugasjon effektivitet (trinn 1.2.2). Oppbevar det oppnådde biotinylert PEI ved 4 ° C.
  2. Karaktersasjon av biotinylert PEI.
    1. Bestem konsentrasjonen av a-aminogrupper i PEI etter biotinylering, som beskrevet i trinn 1.1.2.
    2. Bestemme graden av PEI biotinyleringsprosedyren for å bekrefte konjugasjonsprosedyren. For kvantifisering, bruke et kommersielt tilgjengelig kit, som er basert på anvendelse av HABA fargestoff (4'-hydroxyazobenzene-2-karboksylsyre), for å sikre korrekt kolorimetrisk bestemmelse av biotinylering nivåene 24, 25. Følg instruksjonene fra produsenten.
  3. Filtrering av MNPS og deres karakterisering.
    1. Filtrer kommersielt tilgjengelig streptavidin-belagt MNP gjennom et 0,45 pm sprøytedrevet filter 16 for å utelukke større toksiske aggregater. Måle den endelige jernkonsentrasjon ved anvendelse av en standard fotometrisk analyse 26.
    2. Undersøke kvaliteten på de filtrerte MNPS ved opptakmagnetiseringskurven og ved TEM-avbildning i samsvar med standard fremgangsmåter 27, 28.
      1. Fortynn MNP suspensjon med destillert vann og plasser 3 mL av den oppnådde suspensjonen på en 300-mesh Formvar karbonbelagt kobbergitter for TEM-analyse. Deretter plasserer dette gitter på et objektglass på en varmeplate og la det tørke.
      2. Analysere prøven med et transmisjonselektronmikroskop ved 120 kV og verifisere elementært innholdet ved hjelp av en røntgenstråledetektor 27.
  4. 3-farge merking av transfeksjons-komplekser for super-oppløsning mikroskopi.
    1. Etikett 0,5% av de målte primære aminogrupper i PEI med NHS-Ester Atto 488 fargestoff etter produsentens instruksjoner. Fjern overskudd av ubundet fargestoff ved størrelse-eksklusjonskromatografi, som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.4). Måle den resulterende konsentrasjon av aminogrupper ved anvendelse av en ninhydrin assay (trinn 1.1.2).
    2. Etikett kommersielt tilgjengelige egge MIR (scr-MIR) med Cyanine5 fargestoff ved hjelp av en passende merkingssett 15 (angitt i Materialer List). Måle den resulterende fluoroforen-MIR konsentrasjon spektrofotometrisk.
    3. Fersk merke MNP hver gang med biotin-konjugert fargestoff (f.eks atto 565-biotin) ved en 1: 1000 vekt / vekt-forhold. Direkte bruke fargestoffet etter tilsetning av MNP til mir / PEI under dannelsen av transfeksjon kompleksene, i henhold til detaljene i Delyangina et al. 16.

2. Cellefremstilling

  1. HUVEC isolasjon.
    1. Isolere celler fra navlestrengene direkte etter oppnåelse av snorene ved hjelp av kollagenase-spalting fra det indre av ledningen vene; følge en tidligere utviklet protokoll 29.
      1. Inkuber hver ledning med ~ 60 enheter / ml kollagenase type IV-oppløsning i buffer - lastet inn i than umbilical vene - ved 37 ° C i 13 min.
    2. For alle eksperimenter, basseng på HUVEC fra minimum 5 pasienter.
      MERK: Dyrking bør ikke overstige 4-5 passasjer. Ikke bruk celler forurenset med mykoplasma, da dette fører til en reduksjon i transfeksjon effektivitet. Mycoplasma forurensning bør testes for før start av protokollen ved anvendelse av en PCR-settet for den svært følsomme påvisning av mykoplasma.
      1. Test for mycoplasma nærvær.
        1. Sentrifuger 1 ml cellekultursupernatant i 10 minutter (13 000 x g). Suspendere pelleten i 17 mL av dH 2 O og koke (93 ° C) i 3 min. Bruk 2 mL av suspensjonen for å amplifisere DNA-regionen som koder for høyt konserverte ribosomale RNA (16S-rRNA) av forskjellige mycoplasma-arter.
        2. Utføre PCR ved bruk av 10 pmol av hver primer (forover-primer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ', revers primer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') i kamination med et kommersielt PCR-settet under følgende betingelser: 94 ° C i 3 minutter; 45 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 sekunder; og en sluttforlengelse ved 72 ° C i 10 min.
        3. Analyse av PCR-produkt (292 bp) ved hjelp av agarosegel-elektroforese.
    3. Enten lagre de oppnådde cellene lang sikt i flytende nitrogen eller kultur dem i den endoteliale vekstmediet supplert med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C i en humidi fi sert atmosfære inneholdende 5% CO2.
  2. HUVEC karakterisering.
    1. Karakter isolerte HUVEC i form av deres funksjonelle kapasitet til å bygge rørene i basalmembranen matriks (f.eks Matrigel) og deres ekspresjon av endotelial markør CD31 (plate endotelcelle adhesjonsmolekyl, PECAM-1) ved å følge standardprotokoller 30, 31.

3. Transfeksjon

  1. Trypsineres bestanden HUVEC-kultur (se trinn 4.1.2.) Og manuelt telle cellene ved bruk av et hemocytometer. Seed den HUVEC på plast cellekultur brønns plater av passende størrelse, med en utgangscelletetthet på omtrent 13.000 celler / cm2 i vekstflate, 48 timer før transfeksjon til 70-80% konfluens er nådd.
  2. Fremstill fersk MIR / PEI / MNP komplekser hver gang.
    NB: For det første, skulle oppnås en MIR / PEI-komplekser (trinn 3.2.1 - 3.2.3); Deretter MNPS bør tilsettes til den MIR / PEI-løsning (trinn 3.2.4) for å få den endelige MIR / PEI / MNP sammensetning som anvendes for transfeksjon (trinn 3.3).
    1. Beregne mengden av passende kommersielt tilgjengelig MIR (kryptert, tagget eller funksjonell, se trinn 4) ved anvendelse av konsentrasjonen av det lager som leveres av produsenten. Bruk 2,5 pmol av mir / cm 2 av cellevekstflate. Fortynn mir i 5% glukoseløsning til obtain en sluttkonsentrasjon på 0,125 pmol mir / pl.
    2. Basert på den mir mengde fra trinn 3.2.1 og den optimale NP-forhold på 25 32, beregne den nødvendige mengden av PEI med sin målte konsentrasjon (trinn 1.1.2). Fortynn PEI (per de beregnede nødvendige volum) i et likt volum av 5% glukoseløsning. Legge til den oppnådde pre-fortynnet PEI til den MIR løsning (fra trinn 3.2.1) og vortex den oppnådde blanding i 30 sek.
    3. Inkuber den oppnådde MIR / PEI blandingen i 30 minutter ved romtemperatur.
    4. Sonicate MNPS ved 35 kHz i minst 20 minutter i den sonikering vannbad (se Materials List) ved RT, tilsett passende mengde av MNP løsning på MIR / PEI (5 - 25 ug av jern / ml fremstilt mir / PEI / MNP blanding 16), vortex i 30 s, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur inntil den er klar.
  3. Tilsett fremstilt MIR / PEI / MNP blanding dråpevis direkte til dyrkningsmediet på cellene. Bruk av den resulterende blanding av celler Culture medium med MIR / PEI / MNP fortynnet i glukose som transfeksjon løsning. Erstatte denne blanding med ferskt kulturmedium i 6 timer post-transfeksjon.

4. Analyse av vektor Safety

  1. Undersøkelse av celle levedyktighet.
    1. Transfektere HUVEC podet i en 24-brønners kulturplate (trinn 3.1 og 3.2); bruke Cy3-MIR som testprobene og egge MIR (scr-MIR) som styreport prober for strømningscytometri. Inkuber ved 37 ° C i en humidi fi sert atmosfære som inneholdt 5% CO2 i 24 timer.
    2. Samle supernatanten og transfekterte celler ved trypsinering ved hjelp 1x Trypsin-EDTA fortynnet i PBS tilsatt til cellene i 4 minutter ved 37 ° C. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min, og bruk for analyse.
    3. Undersøke cellenes levedyktighet og MIR opptakseffektivitet 24 timer etter transfeksjon ved bruk av strømningscytometri ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig flekken for å skjelne mellom levende / døde celler; anvende standard protokoller 15
  2. Undersøke sikkerheten av mir / PEI / MNP-komplekser til celler i funksjonelle analyser.
    1. Evaluere proliferasjonsaktiviteten av transfekterte celler.
      1. Transfeksjon av HUVEC sådd i en 12-brønns kulturplate (trinn 3.1 og 3.2) med funksjonell antisense MIR (for eksempel, anti-miR92a for HUVEC 31) og inkuber ved 37 ° C i en humidi fi sert atmosfære som inneholdt 5% CO2 i 24 timer.
      2. Bruke et kommersielt tilgjengelig kit for å definere antall prolifererende celler etter farging med EDU (5-etynyl-2'-deoksyuridin) og scanning med laserbasert konfokal mikroskopi. Bruk følgende mikroskopi innstillinger: 40X objektiv med olje nedsenking; 633 nm eksitasjon laser (for en 647-nm fargestoff); 5 tilfeldig felt som skal registreres i hver prøve. Beregn hastighet av prolifererende celler ved å dividere antall EDU-fargede kjerner av det totale antall kjerner (Hoechst-farget).
    2. Evaluere evnen av transfekterte celler for å danne rørlignende, som tidligere beskrevet 17, 31.
      1. Transfektere HUVEC podet i en 24-brønners kulturplate (trinn 3.1 og 3.2) med SCR-MIR og inkuberes i 48 timer ved 37 ° C i en humidi fi sert atmosfære inneholdende 5% CO2. Samle de transfekterte cellene (som i trinn 4.1.1).
      2. Frø 3,5 x 10 4 av modifiserte HUVEC i 24-brønners plater belagt med 140 ul av basalmembran matrise. Inkuber i 18 timer ved 37 ° C i en humidi fi sert atmosfære inneholdende 5% CO2.
      3. Opptak av bilder av 10 tilfeldige felt i hver brønn ved anvendelse av laser scanning konfokal mikroskopi (differensial forstyrrelser kontrast) og analyseres ved hjelp av ImageJ programvare med "Angiogenesis Analyzer" plugin. Omfatter slike parametere som den totale lengden av grenene, antallet grener, og antallet junctions i evalueringen. Sammenlign dette til ubehandlet kontroll.
  3. Undersøke den mulige toksiske påvirkning av transfeksjons-kompleksene på gap junction (GJ) -mediert intercellulær kommunikasjon (GJIC) ved å teste 3D fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP) 33 i 3D.
    1. Seed cellene på gelatin-belagte glassplater med en tynn bunn er egnet for levende celler imaging (oljeimmersjon). Transfektere celler som beskrevet ovenfor i trinn 3.2 med ikke-merket, ikke-funksjonell MIR (scr-MIR) og inkuberes i 24 timer.
    2. Forbered cellene for avbildning ved å legge dem med calcein direkte før mikroskopi. Spesielt erstatte dyrkningsmediet med friskt medium inneholdende 5 mM kalsein, inkuber i 20 minutter, vask med PBS, og tilsett friskt kulturmedium. Forvarme inkubatoren av mikroskopet til 37 ° C og justere konsentrasjonen av CO 2 til 5%.
      MERK: Alle reagenser skal være varm for å unngå celle contracsjon før måling.
    3. Bruk en 561-nm eksitasjon laser for celle visualisering og FRAP eksperimentet. Først velger celler for måling som områder av interesse (ROI) manuelt; Testcellene bør ha minst 3 nabocellene. Definere en referansecelle med lys, stabil fluorescens som ikke vil bli bleket. Definere grensene for en z-stabel. Registrere fluorescens fra toppen av cellene til bunnen for å omfatte 10 - 15 lag.
    4. Bleke testcellene ved å bruke 100% lasereffekten og registrere den påfølgende fluorescensgjenvinning (på grunn av GJ-spesifikke farvestoffoverføring fra naboceller) under den etterfølgende 15 min. Spill rådata i z-stabler hver 60 s. Til sammen utføre FRAP målinger med ikke mindre enn 5 - 10 testceller per eksperiment. Sammenligne resultatene til utransfekterte celler.

5. Testing av Transfeksjon Effektivitet

  1. Undersøkelse av MIR opptak.
    1. Fremstille prober som er beskrevet i step 4,1 og bruke dem samtidig for å definere MIR opptak med flowcytometri.
  2. Bekreft og beskrive den intracellulære lokalisering av transfeksjons-komplekser ved hjelp av konfokal og superresolution strukturert belysning mikroskopi (SIM).
    1. Seed den HUVEC på gelatin-belagte dekkglass plassert i brønnene av 24-brønners kulturplater, som beskrevet tidligere (trinn 3.1). Transfektere cellene med tre-farge-merket MIR / PEI / MNP (trinn 1.4) og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C i en humidi fi sert atmosfære inneholdende 5% CO2.
    2. Vask objektglassene først med 2% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbufret saltvann (PBS) og deretter med bare PBS. Fix-celler ved å inkubere i 4% paraformaldehyd (PFA) ved 37 ° C i 15 min og flekk kjerner med DAPI følgende standardprotokoller 16. Vask 3 ganger på risteapparatet (15 min hver) for å fjerne overskudd av fargestoff.
      MERK: PFA er kreftfremkallende og må håndteres forsiktig.
    3. Plasser prepared Dekk på objektglass ved hjelp av passende monteringsmedium, la dem tørke i det minste i 1 time, og bruke dem for mikroskopi, som beskrevet nedenfor.
    4. Erverve bilder ved hjelp av et 63X oljeimmersjonsobjektiv og følgende SIM-innstillinger: 405-, 488, 561- og 633-nm laser linjer for eksitasjon; z-stabel modus med en 32-bits dybde på 5 vinkler, 5 faser, med gjennomsnitt av 4; G2 gitter med en 405 laserlinje, G3 med en 488, G4 med en 561, og G5 med en 633.
  3. Evaluere funksjonaliteten av den leverte mir ved RT-qPCR i MIR / PEI / MNP-HUVEC versus ubehandlede.
    1. Transfektere HUVEC sådd ut i en 12-brønns kulturplate trinn (3.1 og 3.2) med funksjonell antisens MIR (for eksempel, anti-miR92a for HUVEC 31) og inkuberes i 48 timer ved 37 ° C i en humidi fi sert atmosfære inneholdende 5% CO2.
    2. Evaluere den anti-miR92a levering, og behandling med RT-qPCR ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett (se materialer); følg than produsentens instruksjoner, som beskrevet andre steder 17, 31. Parallelt undersøke ekspresjon av målgenet (f.eks ITGA5 31).
      MERK: AntagomiR levering mot endogen MIR er foretrukket fremfor ligner da det sikrer måling av det faktiske resultat av MIR og ikke bare dens intracellulære akkumuleringen.

6. Cell målretting Evaluering og Magnetisk celleseparasjon

  1. Celle målretting i statiske betingelser in vitro.
    1. Transfektere HUVEC i en 24-brønners plate (2,5 pmol / cm2 scr-Mir, NP 25, og 15 til 25 mikrogram / ml MNP), inkuberes i 24 timer, vaskes, og samle som beskrevet ovenfor (trinn 4).
    2. Bland cellepelleten oppnådd fra en brønn med 1 ml friskt kulturmedium og plassere den i brønnene av en 12-brønners plate. Feste en liten magnet lokalt (på side) i bunnen av platen ved hjelp av tape.
    3. Inkuber cellesuspensjonen i 24 timer og observer de cellefesting og vekst i området over magneten og i området uten en magnet. For en kvalitativ vurdering ved å bruke en konvensjonell invertert mikroskop.
  2. Celle målretting i simulerte dynamiske betingelser in vitro.
    1. Transfektere HUVEC i en 24-brønners plate per trinn 3.1 og 3.2 (2,5 pmol / cm2 Cy3-Mir, NP 25, og 15 til 25 mikrogram / ml MNP), inkuber i 24 timer, vaskes, og oppsamle ved trypsinering ved hjelp 1x trypsin-EDTA fortynnet i PBS tilsatt til cellene i 4 minutter ved 37 ° C. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min.
    2. Bland cellepelleten oppnådd fra en brønn med 1 ml friskt kulturmedium og plassere den i brønnen i en 12-brønners plate. Feste en liten magnet lokalt (på siden av en brønn) ved hjelp av tape. Plasser kulturplaten på risteapparatet og inkuber cellesuspensjonen i 12 timer ved 150 rpm for å simulere dynamiske forhold 34.
    3. Vask cellene og fiksedem ved hjelp av 4% PFA. Flekk kjerner med DAPI 16. Ta opp den cellefesting ved hjelp av laser scanning konfokal mikroskopi med en 514-nm eksitasjon laser, z-stabel modus - til (5 12 stykker) oppnå rå data, og maksimal intensitet projeksjon bildebehandling for å skape bilder for analyse.
  3. Kvantitativ analyse av magnetisk reagerende og ikke-responderende celler.
    1. Transfektere HUVEC i en 24-brønners plate (2,5 pmol / cm2 scr-Mir, NP 25, og 15 til 25 mikrogram / ml MNP), inkuber i 24 timer, vaskes, og samle slik som beskrevet tidligere (trinn 6.2.1) . Pre-varm PBS og celle-sortering buffer (sterilisert ved filtrering, se Materialer List) til 37 ° C. * Resuspender cellepelleten ble oppnådd fra hver brønn med 500 ul av cellesortering buffer.
    2. Påfør denne cellesuspensjonen til en magnetisk sortering av kolonner festet ved den medfølgende magnet, vaskes kolonnene på magneten 3 ganger med frisk cellesortering buffer, og samle gjennomstrømnings som magnetitisk reagerer fraksjon (foredle).
    3. Fjern kolonnene fra magneten og umiddelbart samle magnetisk reaktive cellefraksjon (mag +) ved å presse frisk cellesortering bufferen gjennom kolonnen ved hjelp av et stempel.
    4. Sentrifuger både MAG- og mag + ved 300 xg i 10 min. * Resuspender cellepelleten i PBS, cellene telles, og evaluere cellenes levedyktighet med en trypanblått-eksklusjonsanalyse 35. Bruk den oppnådde cellepellet enten for langtids analyse (dvs. re-frø og vurdere etter 24, 48 og 72 timer i kultur 17) eller direkte til flowcytometri (trinn 4.1.).
  4. Definer jern lasting av de transfekterte cellene.
    MERK: Under fremstillingen må enhver kontakt av celle prober med jernoksyd-materialer og instrumenter unngås.
    1. Samle de transfekterte HUVEC og utransfekterte kontroll (som i trinn 4.1.1). Vask de oppsamlede cellene to ganger i 2% BSA i PBS 36 b y omhyggelig blanding av cellene med 1 ml av denne vaskebuffer og deretter sentrifugering ved 300 xg i 10 min. Re-suspendere den oppnådde cellepelleten i 250 ul PBS, tilsett 100 ul 4% PFA, og inkuber i 20 minutter for å fiksere cellene. Vask 3 ganger med PBS, som beskrevet ovenfor.
    2. Re-suspendere den resulterende faste cellepelleten i 110 ul PBS og overfør det til 100-pl PCR-rørene.
      1. Ta 10 ul aliquoter for celletelling, og bruk den gjenværende prøven for magnetisk partikkel-spektroskopi (MPS).
    3. Utføre målingen på en kommersielt tilgjengelig MPS-enhet. Under målingen, gjelder de følgende innstillinger: magnetfeltet B-stasjonen = 25 mT og frekvens f 0 = 25 kHz. For jern kvantifisering av prøvene, normalisere den tredje harmoniske A 3 av MPS-spekteret til det tilsvarende A 3, ref av en MNP referanseprøve med en kjent mengde jern på 2,1 ugxref "> 37. Bruk ubehandlede celler som kontroller.

7. Definere MR deteksjonsgrenser

  1. Cellepreparat.
    1. Seed HUVEC i en 6-brønns plate og transfeksjon (2,5 pmol / cm2 scr-Mir, NP 25, og 15 til 25 mikrogram / ml MNP) i duplikater eller tre paralleller i overensstemmelse med den nødvendige mengde av celler (for fantom forberedelse). Cellene inkuberes i 24 timer og vaskes, samle inn og feste dem med 4% PFA, som beskrevet tidligere (trinn 4).
    2. Telle de oppnådde celler, fremstille porsjoner med passende celle tall (f.eks, 10 3, 10 4, 10 5, etc.), og justere volumet til 50 mL.
  2. Agarose fantom forberedelse
    1. Forbered flere lag med 2% agarose i 50-ml rør med forskjellige mengder av transfekterte celler innleiret mellom sjiktene 38. Under forberedelse, sonikatet og sentrifuger varm agarose 38 tilødelegge luftbobler som forårsaker gjenstander.
      MERK: Viktigere, bør fantomene inneholdende 5,5 x 10 5 HUVEC som behandles med ikke-magnetiske MIR / PEI-kompleksene fremstilles på samme måte for å tjene som kontroller.
  3. Skanne oppnådd in vitro fantomer med en 7,1 T MR dyr system etter plassering av fantom sentralt i spolen, parallelt med z-aksen av det magnetiske felt.
    1. Anvende de følgende sekvensparametre for en sekvens anskaffelse gradient-ekko: TR = 66 ms; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; sprangvinkel = 3 °; matrise = 128 x 128, interpolert til 256 x 256; synsfeltet = 42 mm; 100%; gjennomsnitt = 1, ekkotog lengde = 1; snittykkelse = 1,5 mm; og 16 skiver.
    2. Vurdere signal nedbrytning av alle fire ekkotider og beregne R2 * kart (R2 * = 1 / T2 *) ved hjelp av egnet programvare, som beskrevet andre steder 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hovedformålet med den foreslåtte protokoll er å fremstille magnetisk responderende MIR-modifiserte celler, og til å utføre sin nøyaktig karakterisering (figur 1). Som et resultat, effektivt transfekterte celler som reagerer på magnetisk seleksjon og veiledning og detekterbare med MR, skal oppnås.

Først ble identiteten til isolerte HUVEC bekreftet ved typisk farging med endotel-markør CD31 (PECAM) (figur 2A) og ved deres evne til å danne rør på den aktuelle basalmembranen matriks (figur 2B). De oppnådde cellene tok opp mir innført av PEI / MNP meget effektivt; mikroskopi viste at alle cellene var positive for et signal fra merket MIR (Cy3) 24 timer etter transfeksjon (figur 3A). Viktigere, ingen celle-død ble notert sammenlignet med ubehandlede celler (figur 3B), og normal utseende ble opprettholdt (figur 3A). Som observert med konfokal laser-skanning mikroskopi, ble det signal av Cy3-MIR primært lokalisert inne i cellene. Dessuten, ble en mer detaljert undersøkelse av den intracellulære lokalisering av alle deler av transfeksjon vektoren og MIR utført med høyere oppløsning ved hjelp tre-farge-merkete komplekser. SIM, MIR, PEI, og MNP signaler ble alle funnet i cytoplasma i det perinukleære region (Figur 3C).

Videre er en detaljert undersøkelse av transfeksjon vektor sikkerhet bevist at MIR / PEI / MNP-HUVEC er i stand til å danne rør på den aktuelle basalmembranen matrise, og at det resulterende nettverket er sammenlignbar med den for ubehandlede celler anvendt som en positiv kontroll (figur 4A ). Videre transfekterte cellene holdt GJIC, som 3D-FRAP eksperimenter viste. Særlig når cellene er lastet med fluorescerende GJ-permeaold fargestoff og en av dem er bleket, gjenvinner sin fluorescens på grunn av kommunikasjonen med naboceller, og den resulterende farvestoffoverføring (figur 4B).

Viktigere, på grunn av tilstedeværelsen av det superparamagnetiske forbindelse 40 (figur 5A), gjør det mulig for PEI / MNP søknad ikke bare celletransfeksjon, men også den samtidige magnetisering. Den resulterende mengde av intracellulært jern ble målt ved bruk av MPS (figur 5B) for alle anvendte MNP konsentrasjoner innenfor det optimale område (2,5 pmol / cm2 mir; NP 25 supplert med 5-25 ug / ml MNP): 0,37 ± 0,079 til 0,7 ± 0,150 pg jern / celle 17. Etter hvert som bruken av magnetiske separasjonskolonner vist, for alle disse MNP konsentrasjoner, mengden av magnetisk responsive celler i totalvolumet av transfekterte celler er ~ 70% (figur 5C). I tillegg transfekteres HUVECs er synlige med MR (figur 5D) på innsiden av in vitro-agarose fantomer, etterligne musevev mottakelighet. Videre ble den magnetiske målretting av transfekterte HUVEC i dynamiske betingelser simulerte in vitro vist seg å være effektive (figur 6). I denne eksperimentelle oppsettet, ble til og med konstant kraftig bevegelse av kulturmedium ikke forhindre rådende cellevekst i området nær magneten søknad.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av den Fremstilling av magnetisert mir-modifiserte HUVEC og deres analyse. PEI / MNP (polyetylenimin / superparananopartikkel-basert vektor) påføres for å levere mikroRNA (MIR) til humane umbilikalvene-endotelceller (HUVEC). Det oppnådde produkt celle er kjennetegnet ved de følgende parametre: sikkerhet (inkludert cellenes levedyktighet, funksjonellligheten, og kapasitet for intercellulær kommunikasjon); transfeksjonseffektiviteten (dvs. MIR opptak effektivitet og funksjonalitet etterpå); magnetisk målretting in vitro i statiske og simulerte dynamiske betingelser; magnetisk resonansavbildning (MRI) deteksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Karakterisering av Isolert HUVEC. A. Representative bilde av isolert og dyrket HUVEC farget med endotel-CD31-markøren. Kjernen ble motfarget med DAPI (blå). Målestaven er 20 um. B. Representative resultat av røret formasjonsanalysen ble utført på isolert HUVEC; bildet ble tatt opp ved bruk av en laser scanning konfokalt mikroskop (differensial interientere kontrast) 18 timer etter celle-utsåing på basalmembranen matrisen. Målestaven er 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. MIR levering til HUVEC anvendelse av PEI / MNP. A. opptak av merkede MIR (Cy3, rød) 24 timer etter transfeksjon (2,5 pmol / cm 2 av Cy3-merket MIR, NP 25 og MNP 25 ug / ml), og å opprettholde normal celle utseende er illustrert. Bilder ble tatt ved hjelp av konfokal laser-skanning mikroskopi ved anvendelse av en 514-nm eksitasjon laser (Cy3, rød) og differensial forstyrrelser kontrast. Målestaven er 50 um. B. Cellelevedyktigheten til 24 timer post-transfeksjon ble bestemt ved flow-cytometri. Plottet viser verdiene oppnådd for HUVECs behandlet med de følgende komplekse sammensetninger: 2,5 pmol / cm 2 av Cy3-mir; NP-forhold 25 supplert med 5 til 25 ug / ml av MNPS. Stolpene viser forholdet mellom det gjennomsnittlige antall av levedyktige celler, og det hele cellepopulasjonen (n = 6; Feilstolpene: SEM). C. strukturert belysning mikroskopi (SIM) avbildning av tre-farge-merket MIR / PEI / MNP-komplekser som er tatt opp av HUVEC. Cellene ble transfektert som beskrevet ovenfor, inkuberes, og festet til 24 timer post-behandling; kjernene ble kontra med DAPI. Rå SIM-data ble tatt opp i z-stabler og behandles; de representative bildene er et resultat av den maksimale intensitet projeksjon. De følgende eksitasjons- lasere ble anvendt: 405 nm (DAPI, blå), 488 nm (Atto488-PEI, orange), 565 nm (Atto565-MNP, cyan), og 633 nm (Cy5-Mir, rød). Målestaven er 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Sikkerhets av HUVEC Modifisering med MIR / PEI / MNP. A. Et rør dannelsesbestemmelsen ble utført med transfekterte celler (2,5 pmol / cm2 av SCR-MIR, NP 25, og MNP 25 ug / ml) 48 timer etter behandling. Bilder ble ervervet med et laser scanning konfokalt mikroskop (dvs. differensial forstyrrelser kontrast) 18 timer etter celle-utsåing på basalmembran matrise. HUVEC transfektert med MIR / PEI ble brukt som en kontroll giftighet og ubehandlede celler som en positiv kontroll. Målestaven er 100 mikrometer. Plottet reflekterer forholdet mellom de transfekterte HUVEC og ubehandlede celler ved hjelp av flere parametere: rørlengde, antall grener, og knutepunktene (n = 3, feilfelt: SEM). B. gap junction-mediert intercellulær kommunikasjon av mir / PEI / MNP-modifisert HUVEC ble undersøkt 24 timer etter transfecsjon. For dette formål ble cellene belagt med den GJ-gjennomtrengelige fargestoff calcein (oransje); fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP) ble undersøkt i 3D ved å avsøke testceller i z-stabler. Representative bilder av Calcein belastede celler før bleking, umiddelbart etter bleking, og 15 minutter etter bleking (med retur fluorescens) er vist. Målestaven er 20 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Celle Magnetisering som resultat av transfeksjon med PEI / MNP og dens anvendelse. A. Representative bilde av filtrert MNPS, tatt med TEM, som illustrerer deres gruppert morfologi. En liten størrelse (~ 5 til 15 nm) på enkelt jernoxydpartikler (som fører til superparamagnetisme) er dermedbekreftet. Målestaven er 100 nm. B. Den intracellulære lasting av transfekterte celler ble evaluert ved magnetisk partikkel-spektroskopi (MPS) 24 timer etter transfeksjon. Den representative diagram avbilder den MPS spektrum av undersøkte prøver. Spesielt ren MNP-suspensjon (50 pl) tjente som en referanse (blå firkanter); sirklene er MPS-spektrene til to transfekterte celleprøver (røde sirkler: MNP 25 ug / ml; grønne sirkler: MNP 5 ug / ml), mens de grå triangler viser det detekterte bakgrunnsspekteret oppnådd ved en måling uten enhver prøve. Legg merke til logaritmisk skala av amplituden (A). C. Mengden av magnetisk modifiserte cellen ble kvantifisert ved anvendelse av transfekterte HUVEC (2,5 pmol / cm2 mir; NP 25 supplert med 5-25 ug / ml av MNP), oppsamlet ved trypsinering 24 timer etter behandling, til en magnetisk celleseparasjonskolonnen. Den resulterende magnetisk positiv fraksjon (det vil si, som forble i kolonnen)ble talt, og dens prosentandel av hele mengden av transfekterte celler er reflektert på tomten for hver MNP-konsentrasjon (røde trekanter). Cellelevedyktigheten ble deretter undersøkt ved hjelp av trypanblått-eksklusjonsanalyse (grå rhombuses). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). D. En illustrerende MR-bilde av transfektert HUVEC (300.000 celler; 2,5 pmol / cm2 Mir, NP-25 og 25 pg / ml av MNP) innebygd i en agarose fantom ble registrert med en 7,1 T dyr MRI-system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. In vitro magnetisk målretting av mir / PEI / MNP-HUVEC i simulert dynamiske forhold. HUVEC ble samlet 24 timer etter transfeksjonion (2,5 pmol / cm 2 av Cy3-mir; NP 25 & MNP 25 ug / ml) og på nytt utsådd i ferskt kulturmedium i brønnene, med en liten magnet lokalt festet til sideveggen. I sin tur, ble denne kulturen platen som er festet til en rystemaskin som roterte ved 150 rpm. Cellefesting og vekst ble evaluert 12 timer senere ved å feste celler med PFA, flekker sine kjerner med DAPI, og utfører laserskannings konfokal mikroskopi (eksitasjon lasere: 405 nm, DAPI, blå, 514 nm, Cy3, appelsin). Representative bilder viser cellevekst i området med magnet påføring; uten magnet påføring; og i sentrum av dyrkningsbrønn, hvor strømmen av væske ble konsentrering av cellene. Skalaen stolpene er 50 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Produksjonen av genetisk modifiserte celler ladet med superparamagnetiske nanopartikler for deres videre magnetisk kontrollert føring er presentert i den aktuelle protokoll. Den vellykkede anvendelse av denne strategien muliggjør oppløsningen av noen vanskeligheter med celleterapi, slik som lav retensjon og dårlig innpodingen i det skadde området 2, 3, 4, ved å tilveiebringe en celle kan målrettes produkt for transplantasjon. Videre kan den samtidige innføring av riktig valgt genetisk materiale fremme celleegenskaper og kan således øke funksjonelle fordeler 41.

Den nåværende protokoll er blitt utviklet på HUVEC som en modell. Disse celler er kjent for å være vanskelig å transfektere og utsatt for toksisk påvirkning 18, 19, 20. The demonstrated nivå av fluorofor-merkede MIR opptak over 95% etter PEI / MNP transfeksjon blir typisk oppnådd med PEI-baserte vektorer og vanlig anvendt kationisk lipid-baserte transfeksjonsreagenser (f.eks Lipofectamine) 42. I tillegg er den optimale NP forhold på 25 korresponderer med tidligere publiserte verdier på 20 - 40 for NP. Ikke desto mindre gjør den svært effektivt opptak av testet fluorofor-merket MIR ikke nødvendigvis å garantere riktig MIR prosessering og funksjon etter levering 43. Dette punktet er særlig relevant i tilfelle av PEI, med den tette elektro kondensasjon av NA. Således er den resulterende funksjonsevne levert mir må også bli testet. Her, en funksjonell MIR endogent uttrykt i HUVEC, ble MIR-92a 31, valgt, og anti-MIR mot den ble levert ved anvendelse av PEI og PEI / MNP. Som et resultat oppnås en nesten fullstendig knockdown av målet mir-92a viste seg å være en effektiv frigjøring av det anti-MIR fROM-transfeksjon komplekser.

Viktigere, i tidligere arbeider, ble den vellykkede anvendelse av PEI / MNP vektor demonstrert for levering av plasmid DNA (pDNA) og MIR til andre celletyper, både vedhengende (f.eks, COS7, humane stamceller 15, 16) og i suspensjonen (f.eks, benmarg-avledede CD133 + hematopoetiske stamceller 44). Alle disse forsøk har bekreftet det kjente faktum at transfeksjonseffektiviteten og giftighet er celletype-avhengige 45. Således er valget av den optimale vektor sammensetning (dvs. MIR mengde, NP-forhold, og mengden av MNP-jern) bør utføres for enhver spesiell celletype, ved hjelp av tidligere etablerte optimale betingelser som referansepunkter.

Videre bør den flyktige karakter av den oppnådde genetisk modifikasjon gjøres rede for. På den ene siden, jegt er svært godt egnet for bestemt funksjon, slik som den kortsiktige avgivelse av vekstfaktorer. På den annen side, kan varigheten av ekspresjonen ikke vare lenge nok for en rekke formål som krever lang uttrykk. Ikke desto mindre, den påviste sikkerheten til PEI / MNP-vektoren støtter dens mulige gjentatt administrering når betingelsene er ytterligere optimalisert.

PEI og dets derivater er vanligvis brukes på grunn av deres høye virkningsgrad sammenlignet med andre ikke-virale bærere og deres fleksibilitet modifisering 7. Imidlertid, til tross for PEI suksess in vitro og in vivo, og dens anvendelse i kliniske forsøk er meget begrenset (dvs. få fase 1 og 2 forsøk eller kreftpasienter) 7, 14 på grunn av PEI toksisitet 7, 13. Som tidligere verk av vår gruppe 16, samt denne protokollen, har vist, MNPSer i stand til å redusere toksisiteten PEI betydelig. Spesielt har MIR / PEI transfeksjon skadet evne til HUVEC til å danne rør på sin matriks, og dermed ikke en viktig in vitro funksjonell test for disse cellene. I motsetning til dette rør dannelse ytelsen til mir / PEI / MNP-HUVEC var sammenlignbare med ubehandlede celler. Spesielt, ble denne reduksjonen av PEI giftighet oppnås ved å innføre små mengder av komponenter slik som jernoksyd, som er biokompatibelt og som rutinemessig anvendes som et kontrast reagens i mennesker 40.

I tillegg til å opprettholde funksjonelle egenskaper, er det viktig at modifiserte celler er i stand til å etablere intercellulær kommunikasjon, da dette trekk er nødvendig for riktig integrering av celle-terapeutika post-transplantasjon 46. I tillegg kan modifiserte celler utnyttes som bærere for levering av terapeutiske MIR til skadet vev 47. I dette tilfellet, deres capacity til å utveksle molekyler med nabocellene definerer deres suksess som et kjøretøy. Etter PEI / MNP transfeksjon tillater GJIC i modifiserte HUVEC, de har potensiale for integrering in vivo, og for å tilveiebringe MIR levering til skadede områder.

Spesielt, har tidligere publiserte arbeider på cellemagnetiseringen av etterfølgende målretting rapportert cellen lasting av ~ 4 og 30 pg av jern / celle 48, 49, 50, 51. Disse tallene som vesentlig overstiger de verdier som ~ 0,16 til 0,7 pg / celle, som var tilstrekkelig for in vitro-målretting av NA / PEI / MNP-HUVEC i statiske og simulerte dynamiske betingelser. Slike lave mengder jern er fordelaktig når det gjelder sikkerhet: en kjent mekanisme av jernoksyd nanopartikkel-assosiert toksisitet (dvs. produksjon av reaktive oksygenarter (ROS)) er kjent for å være direkte forbundet med mengden av internalized nanopartikler 40. I tillegg har flere studier vist at høye intracellulære nivåer av jernoxydpartikler nanopartikler kan føre til at doseavhengig cytoskeletal uorden og skader 52, 53. Viktigere, de fleste rapporterte tilfeller av celle magnetisering for målretting formål inkluderer ikke genetisk celle manipulasjon. I motsetning til dette tilveiebringer fore MIR / PEI / MNP-vektoren en mulighet for samtidig å modifisere celler og for å legge til magnetiske egenskaper.

Imidlertid kan lave MNP lasting ikke være tilstrekkelig for magnetisk målretting i en turbulent miljø med blodstrømmen. For å komme nærmere den utfordrende in vivo situasjon ble simulert dynamiske betingelser in vitro: dyrkningsplater med magnetisert MIR / PEI / MNP-HUVEC i suspensjonen ble plassert på den roterende ryste 34. Dette eksperimentet åpenbart ikke kan dekke alle interaksjoner som oppstår ivivo. Men det førte til en bedre forståelse av målretting potensialet i PEI / MNP-modifiserte celler. Som et resultat, var svært effektiv celle målretting demonstrert da selv aktiv risting av dyrkningsmediet ikke forstyrret celle bevegelse mot magneten 54. For dette formål ble MIR-modifisert HUVEC lastet med i det minste ~ 0.16 pg av jern / celle. Videre kan magnetisk responsive celler sorteres. En magnet-baserte celleseparasjonsprosedyre anvendes på denne studien har ikke kompromittert levedyktigheten til mir / PEI / MNP-celler. Viktigere, påføring av et statisk magnetfelt (dvs. rettet mot eksperimenter som involverte påføring av et magnetisk felt i 12 - 24 t) ikke har en skadelig effekt på målrettede celler. Derfor tilveiebringer den viste produksjon av magnetiserte genetisk modifiserte celler grunnlaget for ytterligere in vivo-undersøkelser rettet mot effektiviteten av celle retensjon sikres ved hjelp av magnetkraft. Spesielt, the mest vellykkede in vivo-studier som anvender målretting av magnetiserte celler 51, 54, 55 brukte celle retensjon etter lokal administrering i stedet for celle veiledningen etter intravenøs injeksjon. Derfor, magnet-basert oppbevaring ved injeksjonsstedet synes ønskelig for ytterligere in vivo-anvendelser av MIR / PEI / MNP-modifiserte celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke G. Fulda (Elektronmikroskopi Center, Rostock Universitet, Tyskland) for teknisk støtte i å anskaffe TEM bilder av filtrert superparananopartikler og i å utføre sitt røntgenanalyse. Arbeidet utføres på RTC Rostock ble støttet av den føderale departementet for utdanning og forskning Tyskland (FKZ 0312138A, FKZ 316 159 og VIP + 03VP00241) og Statens Mecklenburg-Vorpommern med EUs strukturfond (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 og ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) og ved den DFG (DA 1296-1), den Damp-Foundation, og det tyske hjertet fundament (F / 01/12). Frank Wiekhorst ble støttet av EU FP7 forskningsprogrammet "Nanomag" FP7-NMP-2013-LARGE-7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Tags

Medisin endotelceller celle engineering miRNA polyethylenimin magnetiske nanopartikler målretting MRI
Fremstilling og<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av magnetisert mir-modifisert endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter