Summary
이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
현재까지, 심혈관 질환에 사용할 수있는 수술 및 약물 치료 (CVD)는 제한적이며 종종 완화. 동시에, 유전자 및 세포 치료는 CVD 치료에 매우 유망한 대안 적 방법을 제공합니다. 그러나, 유전자 치료의 다양한 임상 적 적용이 매우 적합 유전자 전달 시스템의 부족에 의해 제한된다. 적절한 유전자 전달 벡터의 개발은 세포 치료의 현재 문제점에 대한 해결책을 제공 할 수있다. 등 부상 기관에 제한 효율성과 낮은 세포 유지와 같은 특히, 기존의 단점에서, 적절한 세포 공학에 의해 (즉, 유전) 이전에 이식에 극복 할 수있다. 제시된 프로토콜은 폴리에틸렌 초상 자성 나노 입자 (PEI / MNP) 기반 전달 벡터를 사용하여 내피 세포의 효율적이고 안전한 과도 변형 례를 설명한다. 또한, 알고리즘과 셀 특성화 방법이 정의되어있다. 성공적인 intracellu마이크로 RNA 인간 제대 정맥 내피 세포로 (은 miR) (HUVEC를)의 경 전달 세포 생존, 기능, 또는 간 통신에 영향을주지 않고 달성되었다. 또한,이 방법은 소개 외생은 miR에서 강력한 기능 효과를 일으킬 것으로 입증되었다. 중요한 것은,이 MNP 기반 벡터의인가는 자기 타겟팅 및 비 침습성 MRI 추적 가능성을 수반 셀 자화를 보장한다. 이것은 MRI와 비 침습적 모니터링 할 수있는 자기 유도, 유 전적으로 조작 된 세포 치료제를위한 기초를 제공 할 수있다.
Introduction
유전자 및 세포 치료는 CVD 처리에 현재의 문제를 해결할 가능성이있는 강력한 도구입니다. 이러한 접근 방법 모두 현재 임상 실험에서 테스트되고 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 아직 다양한 임상 적 적용 일에 대한 준비가되지 않습니다. 특히, 유전자 및 세포 치료의 과제를 해결하는 일반적인 접근 방식은 임상 적 적용에 적합한 다기능 유전자 전달 벡터를 개발하는 것입니다. 안전하고 효율적인 유전자 전달 시스템의 부족은 유전자 치료의 주요 관심사입니다. 동시에, 세포 제품의 유전 공학 낮은 효율 (예를 들어, 심장 분야에서 기능 개선 만 ~ 5 % 달성 후 줄기 세포 이식 1과 세포 치료의 심각한 도전을 극복 할 수 이식에 앞서 시간 포 분 이내에 10 % -)와 가난한 유지 / 상해의 사이트에 생착이 (즉, 세포의 유지는 아래 5 방울세인트 애플리케이션, 투여 경로에 관계없이 2, 3, 4).
현재까지, 바이러스 벡터가 크게 임상 시험에서의 넓은 응용 가져왔다 효율의 관점에서 비 바이러스 시스템 (~ 67 %)를 초과 5. 그러나 바이러스 차량은 실시 유전 물질 (6)의 크기에 심각한 (심각한 합병증 및 후속 염증 반응) 등의 면역 원성 등의 위험, 관련한 종양 및 제한을 실시한다. 이러한 안전 문제 및 바이러스 벡터 생산의 높은 비용으로 인해, 비 바이러스 시스템의 사용은 어떤 경우 7, 8 바람직하다. 여기에는 (CVD 처리에 대한 예)를 제어 혈관 성장 인자의 발현 유전자로서 과도 보정을 필요 이상, 또는 대인 수수에 특히 적합백신의 스피.
우리 그룹에서, 전달 시스템은 지형 25 kDa의 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 비오틴 - 스트렙 트 아비딘 상호 작용 (9)에 의해 함께 결합 초상 자성 산화철 나노 입자 (MNP)를 조합하여 설계되었다. 이 벡터는 이전의 이식에 대한 그들의 동시 자화를 허용 세포의 유전 공학에 대한 잠재적 인 도구입니다. 후자는 고급 자기 타겟팅 기술이 성공적으로 10을 개발하고 있습니다로, 요즘 특히 유망 자기 안내 / 보존을위한 기초를 제공한다. 또, 얻어진 자기 응답 세포가 될 가능성이있는 비 침습적으로 자기 공명 영상 (MRI) 또는 자기 입자 이미지 (11) (12)에 의해 모니터링.
PEI는 / MNP 벡터의 경우에, 폴리아민은 분해 인자로부터 핵산 축합 따라서 보호를 보장 의, 세포에서 벡터의 국제화 및 엔도 좀은 5 탈출. MNPS 자기 유도의 관점에서뿐만 아니라, 공지 된 PEI 중독 7, 13, 14을 감소시킴으로써뿐만 아니라, PEI의 특성을 보완. 이전 PEI / MNP 벡터 성질은 섬유 아세포와 인간 중간 엽 줄기 세포 (15, 16)를 사용하여 전달 효율 (즉,과의 pDNA의 miRNA) 및 안전성의 관점에서 조정 하였다.
이 논문에서 miRNA의 변성 세포의 발생에 대한 PEI / MNPS의 애플리케이션에 대한 상세한 프로토콜은 17을 설명한다. 이를 위해, HUVECs를 사용하고 체외 혈관 신생에 대한 확립 된 모델을 나타내고있다. 그들은 형질에 도전하고 독성 영향 (18), (19)에 취약엉덩이 = "외부 참조"> 20. 또한, 우리는 그들의 타겟팅, 세포 간 통신 및 MRI 탐지를 포함하여 체외에서 이러한 세포를 평가하는 알고리즘을 제공한다.
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Protocol
세포 분리를위한 인간 탯줄은 헬싱키 선언에 따라 연구를 위해이 물질의 사용에 자신의 서면 동의를 준 통보, 건강한 여성에서 분만을 얻었다. 로스 토크 대학의 윤리위원회는 제시된 연구 (REG. 호 2011 년 6 장기간 2013년 9월 23일)를 승인했다.
형질 착물의 제조 1
- 폴리에틸렌 이민의 바이오 티 닐화 (PEI).
- 300에서 자기 교반하에 초순수에 용해 지형 PEI - 실온 (RT)에서 24 시간 동안 400 rpm으로 0.18 mm의 용액을 얻었다 빛으로부터 보호. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
- 수득 된 용액을 21, 22 차 아미노기의 농도를 측정한다.
- PR 100 μL를 혼합하여 아민 검출 시약 (23) 2 % 닌히 드린 시약 용액을 사용하여ediluted 샘플 (1 초순수 200) 및 닌히 드린 시약 75 μL. 80 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션. 그것을 아래로 냉각 안정화를 위해 50 % 에탄올 100 μL를 추가합니다. 흡수 분광 광도계의 550 nm에서의 흡광도를 측정한다.
- 글리신을 사용하여 표준 곡선을 작성합니다.
- 1 : 1 : 0.1 M 아미노 N 원액과 희석액 (100 ml의 탈 이온수에 글리신 0.75 g), 1- 준비 5 1:10, 1:20 1시 40분, 1:80, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400, 1 : 600. 단계 1.1.2.1에서 이러한 솔루션을 측정 축에 농도와 흡광도와 플롯을 생성한다.
- 얻어진 플롯 및 PEI 용액의 흡광도에 기초하여, PEI의 α - 아미노기의 농도를 정의한다.
참고 :주의. 닌히 드린 시약 용액 전용 후드 사용해야하며, 질소 분위기하에 저장한다. 용액의 색은 산화에 의한 변경시는 사용할 수 없습니다.
- 0.01 mm의 용액을 얻었다 사용 직전 초순수에 비오틴 링커 100mg을 녹인다. biotinylating 시약 (몰 단위) 필요량을 얻었다 (20)에 의해 (단계 1.1.2로 측정)에서의 α-PEI의 아미노기의 농도를 곱함으로써 PEI에 추가 비오틴의 요구량을 계산한다.
- pH를 8-9로 PEI 용액 비오틴 용액을 첨가하고 실온에서 자기 교반하에 16 시간 동안 배양한다.
- 크기 배제 크로마토 그래피 (23)에 의해 미 반응 비오틴을 제거한다. 25-kDa의 PEI의 정화를위한 겔 여과 매체의 적절한를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 열을 사용하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 아민 검출 시약 (단계 1.1.2)를 사용하여 아민 농도를 측정하여 바이오틴 결합 효율 (단계 1.2.2)을 결정하기 위해 정제 후 분취 량을 취. 4 ° C에서 얻어진 바이오틴 PEI를 저장합니다.
- 캐릭터바이오틴 PEI의 화.
- 단계 1.1.2에서 설명 된 바와 같이, 바이오 티 닐화 한 후 PEI의 α - 아미노기의 농도를 결정한다.
- 공액 절차를 확인하기 위해 PEI의 바이오 티 닐화의 정도를 결정합니다. 정량은 바이오 틸 레벨 (24) (25)의 정확한 색채 판정을 위해, HABA 염료 (4'- hydroxyazobenzene -2- 카복실산)의 적용에 기초한 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용한다. 제조업체가 제공하는 지침을 따르십시오.
- MNPS과 특성의 여과.
- 더 큰 독성 집계를 배제하기 위해 0.45 μm의 주사기 기반 필터 (16)를 통해 상업적으로 이용 가능한 스트렙 타비 딘 코팅 된 MNP를 필터링합니다. 표준 광도 분석을 사용하여 (26), 최종 철 농도를 측정한다.
- 녹화에 의해 필터링 된 MNPS의 품질을 검사표준 프로토콜 27, 28에 따른 자화 곡선 TEM 이미징에 의한.
- 증류수 MNP 현탁액을 희석하고, TEM 분석 300 메쉬 Formvar 탄소 코팅 된 구리 그리드에 현탁시키고 3 μL를 배치했다. 그 후, 가열판에서 유리 슬라이드에 격자를 배치하고 건조하자.
- 120 kV의 투과형 전자 현미경으로 시료를 분석 및 X 선 검출기 (27)를 이용하여 원소의 함량을 확인.
- 슈퍼 해상도 현미경 형질 단지의 3 색 라벨.
- 제조업체의 지침에 따라 NHS-에스더 아토 488 염료와 PEI에서 측정 된 차 아미노기의 0.5 % 레이블. (단계 1.1.4) 전술 한 바와 같이, 크기 - 배제 크로마토 그래피에 의해 결합되지 않은 과량의 염료를 제거한다. ASSA 닌 하이 드린을 사용 아미노기 얻어진 농도를 측정Y (단계 1.1.2).
- Cyanine5 염료 (재료 목록 표시) 적절한 라벨링 키트 (15)를 이용하여 시판되는 스크램블링은 miR (SCR은 miR-)를 라벨. 얻어진 분광 형광 - 미르 농도를 측정한다.
- 갓 1에 MNP를 바이오틴 - 공액 염료 (예, 비오틴 ATTO 565) 각각의 시간 라벨 : 1000 비율 W / W. 직접 Delyangina 등의 세부 사항에 따라, 형질 감염 복합체 형성 동안 미르 / PEI에 MNP를 추가 한 후 염색을 적용한다. (16).
2. 전지 제조
- HUVEC 격리.
- 직접 탯줄 정맥의 내부로부터 콜라게나 제 소화를 사용하여 코드를 획득하면, 탯줄로부터 세포를 분리; 이전에 개발 된 프로토콜 29을 따르십시오.
- t에로드 - 60 개 단위 / 버퍼에서의 콜라게나 제 IV 형 용액의 ml를 각 코드 ~ 부화그 제대 정맥 - 13 분간 37 ℃.
- 모든 실험을 위해, 5 명 환자의 최소에서 HUVECs를 수영장.
참고 : 재배는 4 ~ 5 개 구절을 초과하지 않아야합니다. 이것은 형질 전환 효율의 감소를 원인으로, 마이코 플라스마 오염 된 세포를 사용하지 마십시오. 마이코 플라즈마 오염은 마이코 플라즈마의 고감도 검출을위한 PCR 키트를 사용하여 프로토콜을 시작하기 전에 테스트해야합니다.- 마이코 플라스마의 존재를 테스트합니다.
- 10 분 (13,000 XG)을위한 세포 배양 상등액을 원심 분리 한 용액. 3 분 동안 17 DH 2 O의 μL와 종기 (93 ° C)의 펠릿을 중단. DNA의 영역을 증폭하기 위해 서스펜션의 2 μL를 사용하는 다양한 미코 플라스마 종의 고도로 보존 리보솜 RNA를 (16S-rRNA의)에 대한 코드.
- PCR을 각각 10 pmol의 프라이머를 사용하여 수행 (정방향 프라이머 : 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ', 역방향 프라이머 : 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3')을 빗다음 조건에서 PCR 상업용 키트 ination 3 분 동안 94 ° C; 30 초, 30 초, 50 ° C, 30 초 동안 72 ° C, 94 ° C의 45 사이클; 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장.
- 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생성물 (292 bp의)을 분석.
- 마이코 플라스마의 존재를 테스트합니다.
- 어느 쪽의 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기 하에서 37 ℃에서 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신이 보충 된 내피 성장 배지에서 얻은 세포를 액체 질소 나 배양 그들에 장기간 저장한다.
- 직접 탯줄 정맥의 내부로부터 콜라게나 제 소화를 사용하여 코드를 획득하면, 탯줄로부터 세포를 분리; 이전에 개발 된 프로토콜 29을 따르십시오.
- HUVEC 특성.
- 3 표준 프로토콜 (30) 아래의 기저막 매트릭스 튜브 (예, 마트 리겔)를 구축하는 기능적 용량 및 내피 세포 마커 CD31의 발현 (혈소판 내피 세포 부착 분자, PECAM-1)의 측면에 격리 된 HUVEC 특성화1.
3. 형질
- 주식 HUVEC 문화 (단계 4.1.2을 참조하십시오.)를 Trypsinize 및 수동 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 70-80 % 컨 플루 언스 (confluence)에 도달 할 때까지 약 13,000 세포의 성장면의 / cm 2, 48 시간 이전에 형질 감염의 개시 세포 밀도, 적당한 크기의 플라스틱 세포 배양 웰 플레이트에 시드 된 HUVEC.
- 준비 신선한은 miR / PEI / MNP 때마다 착물.
참고 : 먼저 미르 / PEI 복합체가 얻어 져야한다 (단계 3.2.1 - 3.2.3) 이어서, 형질 MNPS (단계 3.3)에 사용되는 최종 결과 miR / PEI / MNP 제제를 얻기 위하여 미르 / PEI 용액 (단계 3.2.4)에 추가 될 것이다.- 적절한 상업적으로 이용 가능한 미르 양을 계산 제조업체에서 제공 한 주식의 농도를 사용 (태그 또는 기능, 스크램블, 4 단계 참조). 세포 성장 표면은 miR / cm 2의 2.5 pmol의를 사용합니다. O 5 % 글루코스 용액으로 희석 미르은 miR / μL 0.125 pmol의 최종 농도 btain.
- 단계 3.2.1에서 미르 량 25 (32)의 최적 NP 비율에 기초하여, 그 농도를 측정한다 (단계 1.1.2)를 사용하여 PEI의 요구량을 계산한다. 5 % 글루코스 용액을 같은 부피의 PEI를 (필요한 계산 체적 기준) 희석. (단계 3.2.1)에서 미르 용액 얻어진 예비 희석 PEI를 첨가하고 30 초 동안 얻어진 혼합물을 소용돌이.
- RT에서 30 분 동안 얻어진 결과 miR / PEI 혼합물을 인큐베이션.
- 실온에서 초음파 처리 수조 (재료 목록 참조)에서 적어도 20 분, 35 kHz에서의 MNPS 초음파 처리 미르 / PEI에 MNP 용액의 적당량을 추가 (5 - 조제은 miR / PEI의 철, 25 ㎍ / mL의 / MNP 혼합물을 16), 30 초 동안 소용돌이와 전까지 RT에서 30 분 동안 배양한다.
- 세포의 배양 배지에 직접 제조은 miR / PEI / MNP 혼합물 적가. 세포의 막 다른의 얻어진 혼합물을 사용하여은 miR / PEI / MNP로 해부 배지는 트랜 스펙 션 용액에 글루코스 희석 하였다. 신선한 배양액 6 시간 후 형질이 혼합물을 교체합니다.
벡터 안전 4. 분석
- 세포 생존율 검사.
- (3.1 및 3.2 단계)는 HUVEC를 24- 웰 배양 플레이트에 시딩 형질; 테스트 프로브로는 Cy3-은 miR를 사용하여 유동 세포 계측법에 대한 제어 게이트로 프로브은 miR (SCR은 miR-)를 스크램블링. 24 시간 동안 5 % 이산화탄소를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션.
- 상청액을 PBS 및 37 ℃에서 4 분 동안 세포에 첨가 희석 된 1X 트립신 EDTA를 이용하여 형질 감염된 세포를 트립신 수집. 10 분 동안 300 XG 원심 분리기 및 분석을 위해 사용한다.
- 24 시간 형질 전환은 거실 / 죽은 세포를 구별하기 위해 시중에서 판매하는 얼룩을 적용하여 유동 세포 계측법 사용 후 세포 생존 미르 흡수 효율을 검사; 사용하는 표준 프로토콜 (15)
- 기능 분석 세포에 미르 / PEI / MNP 단지의 안전성을 검사합니다.
- 형질 전환 된 세포의 증식 활동을 평가합니다.
- 형질 HUVEC를 기능적 안티센스은 miR (예, HUVECs를 31 항 miR92a)으로 12 웰 배양 플레이트 (3.1 및 3.2 단계)를 접종하고 24 시간 동안 5 % 이산화탄소를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기하에 37 ℃에서 배양한다.
- 레이저 기반 촛점 현미경 EDU (5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘)과 주사 염색에 의해 증식하는 세포의 수를 정의하기위한 시판 키트를 사용한다. 다음 현미경 설정을 사용하여 오일 침수와 40X 목표를; (a 647 나노 염료) 633 nm의 여기 레이저; (5 개) 임의의 필드는 각 샘플에 기록한다. (총 핵 번호 듀 염색 핵의 수를 나누어 Hoech 증식 세포의 비율을 계산) 세인트 스테인드.
- 이전 17 31 바와 같이, 튜브 형상 구조체를 형성하는 형질 세포의 능력을 평가한다.
- SCR-은 miR으로 (3.1 및 3.2 단계) HUVEC를는 24- 웰 배양 플레이트에 시딩 형질 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기 하에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다. (단계 4.1.1로) 형질 감염된 세포를 수집한다.
- 종자 기저막 매트릭스의 140 μL로 코팅 된 24 웰 플레이트에 변성 된 HUVEC 3.5 × 104. 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기에서 37 ° C에서 18 시간 동안 인큐베이션.
- 녹음 각 웰하여 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (10 개)의 임의의 필드 화상 (시차 간섭 콘트라스트)과는 '혈관 신생 분석기 "ImageJ에 플러그인 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 지점의 총 길이, 지점 수, juncti의 수와 같은 매개 변수를 포함평가의 기능. 처리되지 않은 컨트롤이 비교.
- 형질 전환 된 세포의 증식 활동을 평가합니다.
- 갭 정션 (GJ)에 형질 감염 복합체의 가능한 독성 영향을 검토하는 차원에서 (FRAP) 33 photobleaching에 후 3D 형광 복구를 테스트하여 세포 간 통신 (GJIC)를 매개 성.
- 라이브 세포 이미징 (오일 침지)에 적합한 얇은 바닥 젤라틴으로 코팅 된 유리 슬라이드에 세포를 시드. 비 표지, 비 기능은 miR (SCR은 miR-)와 단계 3.2에서 상술 한 바와 같이 세포를 형질 감염 24 시간 동안 배양한다.
- 현미경 전에 직접 칼 세인로로드하여 이미징을위한 세포를 준비합니다. 특히, 20 분 동안 배양, 5 μM의 칼 세인을 함유하는 신선한 배지로 배양 배지를 대체 PBS로 세척하고, 신선한 배지를 추가한다. 37 ° C의 배양기 현미경의 사전 가온하고 5 % 이산화탄소의 농도를 조정.
참고 : 모든 시약은 세포 contrac을 피하기 위해 따뜻한해야한다측정 전 기. - 세포의 시각화와 FRAP 실험을 위해 561 나노 미터 여기 레이저를 사용합니다. 첫째, 수동으로 관심 영역 (ROI) 등의 측정을위한 셀을 선택; 시험 셀은 적어도 3 개 개의 인접 셀을 가져야한다. 표백되지 밝고 안정된 형광 갖는 기준 셀을 정의한다. A부터 Z 스택의 한계를 정의한다. 층 (15) - (10)을 포함하는 바닥 셀의 상단에서 형광을 기록한다.
- 100 %의 레이저 파워를 이용하여 테스트 셀을 표백제 다음 15 분 동안 (이웃하는 셀로부터 GJ 특정 염료 전송하는) 후속 형광 회수를 기록한다. Z 축 (60)의 모든 스택의 원시 데이터를 기록한다. 실험 당 10 테스트 세포 - 총, 이하 5 이상으로 FRAP 측정을 수행합니다. 형질 감염되지 않은 세포에 결과를 비교.
형질 감염 효율 5. 시험
- 미르 흡수 시험.
- STE에 기재된 프로브를 준비P 4.1 유동 세포 계측법과 미르 흡수를 정의하는 동시에를 사용합니다.
- 확인하고 촛점 및 수퍼 해상도 구성된 조명 현미경 (SIM)에 의해 형질 감염 복합체의 세포 내 위치 파악을 설명한다.
- (단계 3.1) 이전에 설명한 바와 같이, 24 웰 배양 플레이트의 웰에 배치 젤라틴 - 코팅 유리 커버 슬립에서 HUVEC를 종자. 은 miR / PEI / MNP (단계 1.4) 표지 된 3 색으로 세포를 형질 감염 및 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 배양한다.
- 다만 후 PBS로 완충시킨 식염수 (PBS)에서의 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 커버 슬립 제 씻고. 표준 프로토콜 DAPI 16 다음 15 개 및 핵 염색을 위해 37 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 배양하여 세포를 고정한다. 과량의 염료를 제거 진탕 (15 분마다)를 3 회 반복한다.
참고 : PFA는 발암 신중하게 처리해야합니다. - 홍보를 놓습니다아래에 설명 된대로 현미경 epared 커버 슬립은, 적어도 1 시간 동안 그들을 건조하게하고, 현미경을 사용하고 적절한 설치 매체를 사용하여 슬라이드.
- 63X 오일 침지 대물 이미지를 사용하여 다음 SIM 설정 획득 : 여진 용 405-, 488-, 561- 및 633 nm의 레이저 라인; (4)의 평균 각도 5, 5 단계에서 32 비트 깊이와 Z 스택 모드; 633와 405 G2 레이저 라인 격자, 488와 G3하는 561 G4 및 G5.
- 미처리 대은 miR / PEI / MNP-된 HUVEC에서 RT-qPCR에 의해 전달 미르 기능을 평가한다.
- HUVEC를 기능적 안티센스은 miR로 12 웰 배양 플레이트 단계 (3.1 및 3.2) (예를 들어, HUVECs를 31 항 miR92a) 접종 형질 5 % CO 2를 함유하는 humidi 인터넷 ED 분위기 하에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다.
- (자료를 참조) 시판 키트를 이용하여 RT-qPCR을 갖는 안티 miR92a 전달 및 처리를 평가; t 따라그는 제조업체의 지침에 다른 곳에서 17, 31 설명한다. 병행하여, 표적 유전자의 발현을 조사 (예 ITGA5 31).
참고 :이 미르의 실제 결과와 단순히 그것의 세포 내 축적의 측정을 보장하기 때문에 내생은 miR에 대한 AntagomiR 배달 모방을 통해 바람직하다.
평가 및 자기 세포 분리를 대상으로 6 셀
- 체외에서 정적 조건에서 대상 셀.
- 24 웰 플레이트 (2.5 pmol의 / cm 2-SCR 미르 NP 25, 및 15 내지 25 ㎍ / ㎖의 MNP)는, 24 시간 동안 배양 세척하고 (단계 4) 상기와 같이 수집 된 HUVEC에서 형질.
- 물론, 신선한 배지 1 mL의 1로부터 얻은 세포 펠렛을 혼합하고 12 웰 플레이트에 배치. 테이프를 사용하여 플레이트의 하부에 국부적으로 (측면)에 작은 자석을 고정한다.
- 24 시간 동안 세포 현탁액을 부화 자석없이 자석을 통해 상기 영역의 면적의 세포 부착 및 성장을 관찰한다. 질적 평가를 위해 기존의 거꾸로 현미경을 사용합니다.
- 시험 관내 모의 동적 조건에 타겟팅 전지.
- 단계 3.1 및 3.2에 따라 24- 웰 플레이트에서 된 HUVEC 형질 (2.5 pmol의 / cm 2 인 Cy3-미르 NP 25, 15 - 25 ㎍ / mL의 MNP), 24 시간 동안 배양 씻어하여 트립신 처리에 의해 수집 1X PBS에 희석 트립신 EDTA, 37 ℃에서 4 분 동안 세포에 첨가 하였다. 10 분 동안 300 XG 원심 분리기.
- 물론, 신선한 배지 1 mL의 1로부터 얻은 세포 펠렛을 혼합하고, 12 웰 플레이트의 웰에 배치. 테이프를 사용하여 (a 웰의 측면에서) 로컬 작은 자석을 고정한다. 진탕 기에서 배양 플레이트를 놓고 동적 조건 (34)을 시뮬레이션 150 rpm에서 12 시간 동안 세포 현탁액을 배양한다.
- 세포를 세척하고 수정그들은 4 % PFA를 사용하여. DAPI (16)와 핵을 얼룩. 514 nm의 여기 레이저 스캐닝 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 세포 부착을 녹음, Z 스택 모드 (5-12 슬라이스) 분석을위한 이미지를 생성하는 원시 데이터, 및 최대 강도 투사 화상 처리를 얻었다.
- 자기 반응과 비 반응 세포의 정량 분석.
- 24 웰 플레이트에서 형질 된 HUVEC (2.5 pmol의 / cm 2-SCR 미르 NP 25, 및 15 내지 25 ㎍ / ㎖의 MNP), 24 시간 동안 배양 씻어 전에 기술 된 바와 같이 수집한다 (단계 6.2.1) . 사전 따뜻한 PBS 셀 정렬 버퍼 37 ℃로 (여과에 의해 멸균는 자재 목록 참조). 셀 정렬 버퍼 500 μL로 각 웰에서 얻은 세포 펠렛을 다시 일시.
- 자석 신선한 세포 선별 완충액으로 3 회 세척 컬럼 제공된 자석에 의해 고정하는 자기 정렬 열이 세포 현탁액을 적용 및 흐름을 통해 마그네로서 수집캘리 응답 분획 (MAG-).
- 자석의 열을 제거하고 즉시 플런저를 사용하여 칼럼을 통해 새로운 셀 정렬 버퍼 밀어 자기 반응성 세포 분획 (마그네틱 +)를 수집한다.
- 10 분 동안 원심 분리기 (300) XG MAG-과 탄 + 모두. PBS의 세포 펠렛을 일시 중지 다시, 세포를 계산하고, 트리 판 블루 배제 분석 (35)와 세포 생존 능력을 평가합니다. 얻어진 세포 펠렛 어느 장기 분석을 사용하여 (즉, 리 시드 및 후 24, 48, 72 및 17 시간 배양 평가) 또는 직접 유동 세포 계측법에 대해 (단계 4.1.).
- 형질 전환 된 세포의 철 로딩을 정의합니다.
참고 : 준비하는 동안, 철 산화물 재료 및 악기와 셀 프로브의 접촉을 피해야한다.- 형질 HUVEC를한다 (단계 4.1.1)를 형질 감염되지 않은 제어를 수집. PBS (36) B의 2 % BSA로 두 번 세포를 모아 세척 Y는주의 깊게 세척 완충액 1 ㎖로 세포를 혼합 한 후 10 분 동안 300 XG 원심 분리. , 250 μL의 PBS에서 얻어진 세포 펠렛을 다시 일시 중지 4 % PFA 100 ㎕를 추가하고, 20 분간 세포를 고정하는 동안 배양. 상술 한 바와 같이, PBS로 3 회 반복한다.
- PBS 110 μL의 고정 얻어진 세포 펠렛을 다시 중지하고 100 μL PCR 튜브에 옮긴다.
- 세포 계수를위한 10 μL 분취 액을 취하여, 자기 입자 분광법 (MPS)의 남은 샘플을 사용한다.
- 시중에서 판매하는 MPS 장치에서 측정을 수행합니다. 측정 중에, 다음의 설정을 적용 자기장 B 드라이브 = 25 (MT) 및 주파수 f 0 = 25 kHz로한다. 샘플의 철 정량 2.1 μg의 공지의 철의 양을 가진 MNP 참조 샘플 3, 대응 REF에 MPS 스펙트럼의 제 3 고조파를 정상화외부 참조 "> 37. 컨트롤로 치료 세포를 사용합니다.
7. 정의 MRI 검출 한계
- 셀 준비.
- 6- 웰 접시에 트랜 종자 된 HUVEC (2.5 pmol의 / cm 2 SCR-미르 NP 25, 15 - 25 ㎍ / mL의 MNP) (팬텀 제조) 세포의 요구량에 따라 중복 또는 삼중있다. 24 시간 동안 세포를 인큐베이션하고 세척 수집하고, (단계 4) 이전에 설명한 바와 같이, 4 % PFA로 고정합니다.
- 적합한 세포 수 (예를 들어, 103, 104, 105 등) 분취 량을 준비 얻어지는 세포 수 및 50 μL로 부피를 조절한다.
- 아가로 오스 팬텀 준비
- 층 (38) 사이에 삽입 된 형질 전환 세포를 상이한 양의 50 ㎖의 튜브에 2 % 아가로 여러 층을 준비한다. 준비, 초음파 처리 및 원심 분리기 뜨거운 아가로 오스 38시유물의 원인이 공기 방울을 파괴한다.
참고 중요한 비자은 miR / PEI 복합체로 처리 5.5 × 105 HUVEC를 함유 팬텀은 동일한 방식으로 제조한다 대조군 역할을한다.
- 층 (38) 사이에 삽입 된 형질 전환 세포를 상이한 양의 50 ㎖의 튜브에 2 % 아가로 여러 층을 준비한다. 준비, 초음파 처리 및 원심 분리기 뜨거운 아가로 오스 38시유물의 원인이 공기 방울을 파괴한다.
- 상기 코일 중앙에 환상을 배치 한 후 7.1 T 동물 MRI 시스템 체외 팬텀 얻어진 스캔 자계의 Z 축에 평행.
- 구배 에코 획득을위한 시퀀스의 다음 시퀀스 파라미터 적용 : TR = 66 MS; TE 1 / 2 TE / TE 3 / 4 TE / TE 5 / 6 TE = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01 MS; 플립 각 = 37 °; 매트릭스 = 256 X 256 보간 128 × 128; 도 = 42mm의 필드; 100 %; 평균 = 1, 에코 열차 길이 = 1; 슬라이스 두께 = 1.5 mm; 16 개 조각.
- 다른 39 바와 같이, 적절한 소프트웨어를 사용하여 (R2 * = 1 / T2 *)를 네 번 에코의 신호 감쇠 평가 및 R2 * 맵을 계산할.
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Representative Results
제안 된 프로토콜의 주요 목적은 자기 반응은 miR-수정 세포를 생산하기 위해 자신의 정확한 특성 (그림 1)을 수행하는 것입니다. 따라서, MRI 자기장으로 선택하고 안내 및 검출 응답을 효율적으로 형질 감염된 세포를 수득한다.
먼저, 절연 된 HUVEC의 신원은 내피 세포 마커 CD31 전형적인 염색 (PECAM) (도 2a)에 의해 적절한 기저막 매트릭스 (도 2b)의 튜브를 형성하는 능력에 의해 확인되었다. 얻어진 세포는 미르가 매우 효율적으로 PEI / MNP 도입 채택했다; 현미경 모든 셀은 miR 태그 (Cy3가) 24 시간 후 형질 감염 (도 3a)의 신호에 대해 양성인 것으로 보였다. 중요한 것은, 어떤 세포 사멸은 미처리 세포 (도 3B)에 비해 기록되지 및 Normal 외관 (도 3a)를 유지 하였다. 공 초점 레이저 주사 현미경으로 관찰 된 바와 같이,는 Cy3-미르 신호는 주로 세포 내에 위치 하였다. 또한, 형질 전환 벡터 미르의 모든 부분의 세포 내 편재 자세한 연구가 더 높은 해상도 3 컬러 표지 복합체를 사용하여 수행 하였다. SIM 미르, PEI, 및 MNP 신호는 모두 핵 주변 영역 (도 3c) 내의 세포질에서 발견되었다.
또한, 형질 전환 벡터 안전성의 상세한 조사 미르 / PEI / MNP-된 HUVECs는 (도 4a 결과 네트워크는 양성 대조군으로 사용 된 비 처리 된 세포의 것과 비교 될 적절한 기저막 매트릭스 것을 튜브를 형성 할 수 있음을 입증 ). 3D-FRAP 실험 밝혀 더욱이, 형질 세포 GJIC을 유지 하였다. 특히, 세포는 형광 GJ-permea로로드BLE 염료 중 하나가 탈색되고, 그 형광 때문에 이웃 셀과 통신하고, 생성 된 염료 전사 (도 4b)로 복원한다.
중요한 인해 상자성 화합물 (40) (도 5a)의 존재로, PEI / MNP 애플리케이션뿐만 아니라 형질 전환 세포뿐만 아니라, 동시 자화를 허용한다. 세포 내 철의 생성 양을 최적 범위 내의 모든인가 MNP 농도위한 MPS (도 5B)를 사용하여 측정 하였다 (2.5 pmol의 / cm 2은 miR; NP 25 ~ 25 ㎍ / ㎖의 MNP 보완) : 0.37 ± 0.079 0.7 ± 행 0.150 PG 철 / 셀 (17). 자기 분리 컬럼의 입증 된 바와 같이, 이러한 모든 MNP 농도를 들어, 형질 감염된 세포의 총 부피의 자기 응답 세포의 양이 70 % (도 5C) ~하다. 또한, H를 형질UVECs 마우스 조직의 감수성을 모방 체외 아가 팬텀 내부 MRI (도 5D)로 표시된다. 또한, 시험 관내에서 모사 동적 조건에서 형질 전환 된 HUVEC의 자기 타겟팅 효율 (도 6)으로 입증되었다. 이 실험 설정에서 문화 매체의 경우에도 지속적인 활발한 움직임은 자석 응용 근처 영역에서 세포의 성장을 널리 방지하지 않았다.
그림 1. 자화은 miR-수정 된 HUVECs와 그 분석의 생산의 개략도. PEI는 / MNP (폴리에틸렌 이민 / 상자성 나노 입자 - 기반 벡터)는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC에)에 마이크로 RNA (은 miR)를 제공하기 위해 적용된다. 얻어진 셀 제품은 다음과 같은 매개 변수에 의해 특징되어 안전 (포함한 세포 생존을 기능적성만 및 간 통신 용량); 형질 전환 효율 (즉, 미르 흡수 효율과 이후 기능); 정적 및 동적 시뮬레이션 조건에서 시험 관내 타겟팅 자석; 자기 공명 영상 (MRI) 검출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고립 된 HUVEC 2. 특성을 그림. 내피 CD31 마커로 염색 고립 배양 된 HUVECs의 A. 대표 이미지. 핵은 DAPI (파란색)으로 대조된다. 스케일 바는 20㎛가. 격리 된 HUVEC에서 수행 된 관 형성 어 세이의 결과 B. 주제; 화상은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 기록 하였다 (시차 간콘트라스트 ference) 기저막 매트릭스에서 세포 파종 후 18 시간. 스케일 바는 100 ㎛의 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PEI / MNP를 사용 된 HUVECs에 그림 3. 미르 배달. A. 태그 미르 통풍 관 (Cy3가 적색) 24 시간 후 형질 정상 세포 모양의 유지 (Cy3가 표지 된 미르 NP 25 MNP 25 ㎍ / mL의 2.5 pmol의 / cm 2)가 도시되어있다. 이미지는 514 nm의 여기 레이저 (Cy3에, 적색)과 미분 간섭 콘트라스트를 이용하여 공 초점 레이저 주사 현미경으로 촬영 하였다. 스케일 바는 50㎛의 것이다. B. 세포 생존율 24 시간 후 형질 감염은 유동 세포 계측법으로 측정 하였다. 플롯은 HUVEC에 대해 얻어진 결과를 나타낸다다음 복잡한 조성물로 처리 S : Cy3가 - 미르 2.5 pmol의 / cm 2; NP 비 25 MNPS 5 행 25 ㎍ / mL로 보충. (; SEM 오차 막대 N = 6)를 바 생존 세포의 평균 수와 전체 세포 집단의 비율을 나타낸다. 3 색의 구조적 C. 조명 현미경 (SIM)에 의해 촬상 된 HUVEC는 용해은 miR / PEI / MNP 착체 표지. 세포를 전술 한 바와 같이 배양 한 형질 감염 24 시간 후 처리를 고정시켰다; 핵은 DAPI으로 대조되었다. 원시 데이터는 SIM Z-스택에 기록 처리 하였다; 대표적인 이미지는 최대 강도 투영의 결과이다. 다음 여기 레이저 적용되었다 : 405 nm의 (DAPI 청색), 488 나노 미터 (Atto488-PEI, 오렌지), 565 나노 미터 (Atto565-MNP, 시안), 및 633 nm의 (-Cy5에 미르 적색). 스케일 바는 5㎛이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4.은 miR / PEI / MNP와 HUVECs를 수정의 안전. 48 시간 후 처리] A. 관 형성 분석법 형질 세포 (NP 25 MNP 25 ㎍ / mL의 SCR-미르 2.5 pmol의 / cm 2)를 수행 하였다. 화상은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 수집 하였다 (즉, 미분 간섭 대비) 18 시간 기저막 매트릭스 세포 파종 후. 은 miR / PEI로 형질 된 HUVEC는 양성 대조군으로 독성 제어 및 미처리 세포로 사용 하였다. 스케일 바는 100 ㎛의 것이다. 플롯은 형질 HUVEC를 여러 개의 파라미터 미처리 세포의 비율을 반영 튜브 길이, 브랜치 수 및 분기점 (N = 3, 오차 막대 : SEM). B. 결과 miR / PEI / MNP 변성 된 HUVEC의 갭 정션 매개 세포 간 통신 평가 24 시간 후 transfec기. 이를 위해, 세포를 GJ 투과성 염료 칼 세인 (오렌지)로 로딩 하였다; (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구 Z-스택의 시험 셀을 3D 스캐닝하여 조사 하였다. 대표적인 표백 전 칼 세인로드 셀의 이미지를 직접 표백 후 및 (회 형광)와 함께 15 분 후 표백 도시된다. 스케일 바는 20㎛가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PEI / MNP 및 그 용도에 따른 형질도 5 셀 자화. 그들의 클러스터의 형태를 나타내는 TEM으로 촬영 여과 MNPS A.의 대표 이미지. 소형 - (초상 자성 결과) 싱글 산화철 입자 (~ 5 내지 15)은 이에이며확인했다. 스케일 바는 100 ㎚이다. B. 형질 감염된 세포의 세포 내로드 자분 분광법 (MPS) 24 시간 후 형질 감염에 의해 평가 하였다. 대표적인 패널 조사 샘플의 MPS 스펙트럼을 나타낸다. 특히 순수한 MNP 서스펜션 (50 μL)을 기준 (청색 사각형)로 제공; 회색 삼각형이 어떤 샘플없이 측정에 의해 얻어진 검출 배경 스펙트럼을 표시하면서 :; 원 두 형질 세포 샘플 (MNP 5 ㎍ / ㎖의 녹색 원 MNP 25 ㎍ / mL의 적색 원)의 MPS 스펙트럼이다. 진폭 (A)의 로그 스케일 참고. C.는 자기 변형 셀의 양은 형질 된 HUVEC의인가에 의해 정량화 하였다 (2.5 pmol의 / cm 2은 miR; NP 25 5-25 μg의 MNP의 / mL로 보충) 자기로 트립신 처리 24 시간 후 처리로 수집, 세포 분리 컬럼. 얻어진 자화 양성 분획 (즉, 열이 남아)계산 한 후, 형질 감염된 세포의 전량 중 그 비율은 각 MNP 농도 (적색 삼각형)에 대한 플롯에 반영된다. 세포 생존율이어서 트리 판 블루 배제 분석법 (회색 rhombuses)에 의해 검사 하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다 (N = 3). 형질 전환 된 HUVEC의 D. 예시 MRI 이미지 (300,000 세포 2.5 pmol의 / cm 2은 miR; NP 25 및 25 μg의 MNP의 / ㎖) 아가 팬텀에 매립은 7.1 T MRI 동물 시스템으로 기록 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시뮬레이션 동적 조건 미르 / PEI / MNP-된 HUVECs의 체외 자기 타겟팅에서 그림 6.. HUVECs를 24 시간 후 트랜를 수집이온 (2.5 pmol의 / cm 인 Cy3-미르 2; NP 25 MNP 25 ㎍ / ㎖) 및 다시 시드 로컬 측벽에 부착 된 작은 자석 웰 신선한 배지에서. 차례로,이 배양 용기는 150 rpm의 회전 진탕에 고정시켰다. 세포 부착 및 성장은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경, PFA로 세포를 고정 DAPI 자신의 핵을 염색하고 수행하여 12 시간 후에 평가 하였다 (여기 레이저 : 블루 405 nm의 DAPI, 514 nm의 인 Cy3, 오렌지). 대표적인 이미지는 자석 응용 프로그램 영역의 세포 증식을 도시한다; 자석 응용 프로그램없이; 액체의 흐름은 세포 농축 하였다 웰 배양의 중심이다. 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
상기 자기 자신의 제어 지침 상자성 나노로드 유 전적으로 조작 된 세포의 제조는 현재의 프로토콜에 제공된다. 이 전략의 성공적인 응용 프로그램은 이식에 대한 타겟팅 전지 제품을 제공함으로써, 같은 부상 영역 2, 3, 4, 낮은 유지와 가난한 생착 등 세포 치료의 어려움의 해결을 위해 수 있습니다. 또한, 적절히 선택 유전 물질의 동시 도입은 전지 특성을 촉진 할 수있어 기능적 이득 (41)을 증가 할 수있다.
현재의 프로토콜은 모델로 된 HUVECs에 개발되었다. 이러한 세포 독성 영향이 18, 19, 20의 형질 어렵고 민감한 것으로 알려져있다. 민주PEI / MNP 형질 전환 후 95 % 이상의 형광 표지 미르 흡수 onstrated 수준은 일반적 PEI 계 벡터로 얻어진 통상 양이온 계 지질 형질 전환 시약을 사용한다 (예를 들면, 리포 펙 타민) 42. NP 40 - 또한, (25)의 최적의 비율은 NP (20)의 이전에 발행 된 값에 대응한다. 그럼에도 불구하고, 테스트 형광 - 태그 미르 고효율 흡수는 반드시 배달 43 이후 적절한 미르 처리 및 기능을 보장하지 않습니다. 이 점 NA의 긴밀한 정전 축합와 PEI의 경우에 특히 적합하다. 따라서, 전달 미르 결과 기능적 능력도 시험해야한다. 여기서, 기능적 내생 미르 HUVEC 표현 미르-92A (31)가 선택하고, 그것에 대하여 반 미르 PEI 및 PEI / MNP를 사용하여 전달 하였다. 결과적으로, 타겟은 miR-92A의 거의 완전한 녹다운 항은 miR F의 효율적인 분리를 증명트랜 단지를 ROM.
중요한 것은, 이전의 작품에서 PEI / MNP 벡터의 성공적인 응용 프로그램은 다른 세포 유형에 플라스미드 DNA (pDNA에) 미르의 전달, 모두 부착 (예를 들어, COS7, 인간 중간 엽 줄기 세포 15, 16)과에서 증명되었다 현탁액 (예, 골수 유래 CD133 + 조혈 줄기 세포 (44)). 모든 실험은 형질 전환 효율과 세포 독성 형태 45 의존적이라는 알려진 사실을 확인했다. 따라서, 최적의 벡터 성분의 선택 (즉, 미르 양 NP 비율 및 MNP 철의 양)를 기준점으로서 미리 설정된 최적의 조건을 이용하여, 각 특정 세포 유형에 대해 수행되어야한다.
또한, 달성 유전자 변형의 과도 특성이 고려되어야한다. 한편으로, 나는t는 성장 인자의 단기 납기 등의 특정 기능에 매우 적합하다. 반면에, 표현의 기간은 장기간의 발현을 요구하는 다양한 목적을 위해 충분히 오래 지속되지 않을 수 있습니다. 상기 조건이 최적화되면 역시, PEI / MNP 벡터의 안전성이 입증은 반복 가능한 관리를 지원한다.
PEI 및 그 유도체는 일반적으로 다른 비 바이러스 성 차량과 7, 수정하는 유연성에 비해 높은 효율성으로 인해 사용됩니다. 그러나, 생체 외 및 생체 내에서 PEI의 성공에도 불구하고, 임상 시험에서의 적용은 매우 (즉, 몇 단계 1, 2 시험 또는 암 환자) 7, 14 인해 PEI 독성 (7), (13)로 제한됩니다. 우리 그룹 (16)뿐만 아니라,이 프로토콜의 이전 작품으로, MNPS을 증명하고있다크게 PEI 독성을 감소 할 수 있습니다. 특히 미르 / PEI 형질 감염시켜 이들 세포에 대한 시험 관내 기능 테스트 메인 실패들이 행렬에 튜브를 형성하기 위해 HUVEC를 능력을 손상하고있다. 반면 미르 / PEI / MNP-된 HUVECs 관 형성의 성능은 비 처리 세포와 비교 하였다. 특히, PEI 독성의 감소는 생체 일상적 피험자 40 대조 시약으로 사용되는 철 산화물 성분의 낮은 레벨을 도입함으로써 달성 하였다.
그렇다 기능적 특성을 유지에서,이 기능은 세포 치료제 이식 후 46의 적절한 통합에 필요로 변형 세포, 간 통신을 구축 할 수있는 것이 중요하다. 또한, 변형 된 세포는 조직 손상 치료 47 미르 전달을위한 담체로서 이용 될 수있다. 이 경우, 자신의 capaci이웃하는 셀을 갖는 분자를 교환 타이 수단으로 성공을 정의한다. PEI / MNP 형질 수정 된 HUVEC에서 GJIC을 허용하기 때문에, 생체 내에서의 통합 가능성을 손상 부위에 미르 전달을 제공한다.
특히, 다음 타겟팅 세포 자화에 이전에 출판 된 작품은 셀 ~ 4의 로딩 및 철 / 셀 48, 49, 50, 51의 30 페이지를보고했다. 이러한 수치는 유의 값 ~ 관내 정적 및 동적 시뮬레이션 조건에서 NA / PEI / MNP-HUVEC를 타겟팅 충분했다 0.16-0.7 PG / 셀을 초과한다. 낮은 철 량은 안전성면에서 유리하다 : 산화철 나노 입자 - 관련 독성의 공지기구 (즉, 활성 산소 종의 생성 (ROS))은 직접 INTE의 크기와 관련된 것으로 알려진rnalized 40 나노 입자. 더하여, 몇몇 연구는 산화철 나노 입자의 세포 내 농도가 높은 농도 의존적 해체 골격 손상 (52), (53)으로 이어질 수 있다는 것을 증명하고있다. 중요한 것은, 대부분의 유전자 세포 조작을 포함하지 않는 타겟팅 용도 세포 자화의 사례를보고했다. 반대로, 미르 / PEI / MNP 벡터를 동시에 세포를 수정하고 자기 특성을 추가 할 수있는 기회를 제공한다.
그러나, 낮은 MNP 로딩은 혈액의 흐름과 난류 환경에서 대상으로 자기에 충분하지 수 있습니다. 생체 내 상황에 도전 가까이 제공하기 위해, 동적 인 조건은 시험 관내 모의했다 : 현탁액 자화은 miR / PEI / MNP-HUVEC를 가진 배양 플레이트는 회전 진탕 기 (34) 상에 배치했다. 이 실험은 명확에서 발생하는 모든 상호 작용을 포함 할 수생체. 그러나, PEI / MNP 변형 된 세포의 대상으로 잠재력을 더 잘 이해되었다. 배양액의 흔들림에도 활성 자석 (54)으로 세포 이동을 방해하지 않았던 결과, 고효율 셀 타겟팅 입증되었다. 이를 위해 미르 수정 된 HUVECs 철 / 셀의 최소 ~ 0.16 페이지로드되었다. 또한, 자기 반응성 세포를 정렬 할 수 있습니다. 본 연구에 적용된 자석 계 세포 분리 과정 미르 / PEI / MNP 세포의 생존력을 손상하지 않았다. 중요한 것은, 정적 자기장의 응용 프로그램 (즉, 12 자기장의 응용 프로그램을 포함 실험 대상 - 24 시간) 표적 세포에 손상 영향을 미치지 않았다 있습니다. 따라서, 자화 된 유전자 변형 세포의 생산 입증 자력에 의해 확실하게 고정 셀의 효율을 다루는 생체 내 연구에있어서의 기초를 제공한다. 특히, 일즉 51, 54, 55 사용되는 셀 보유 국소 투여가 아닌 세포 유도 후에 정맥 주사 후 자성 세포의 표적화를 이용한 생체 내 연구에 가장 성공적인. 따라서, 주사 부위에 자석 기반 유지 미르 / PEI / MNP는 변성 세포의 생체 내 적용에 대해 더 바람직 나타난다.
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Disclosures
우리는 공개 경쟁 금융 관심 회원이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 필터링 된 초상 자성 나노 입자의 TEM 이미지를 획득과 자신의 X 선 분석을 수행하기에 기술 지원을위한 G. 풀다 (전자 현미경 센터, 로스 토크 대학, 독일)에 감사드립니다. RTC 로스 토크에서 수행 작업은 연방 교육 연구부 독일 (FKZ 0312138A, FKZ 316159 및 VIP + 03VP00241) 및 EU 구조 기금과 국가 메 클렌 부르크 - 서쪽 포메 라니아 (ESF / IV-WM-B34-에 의해 지원되었다 0030/10와 ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) 및 DFG (DA 1296-1), 축축한 재단 및 독일 심장 재단 (F는 / 01 / 12)에 의해. 프랭크 위호스트 EU FP7 연구 프로그램 "Nanomag"FP7-NMP-2013-LARGE-7에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
| Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 µm |
| Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120 kV | |
| Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
| Cell culture plastic | TPP | ||
| NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
| NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
| Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
| Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
| MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
| Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
| Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
| Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
| NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
| hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
| FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
| ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
| RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
| 18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | ||
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
| MPS device | Bruker Biospin | ||
| Matlab software | Mathworks | ||
| Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
| FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |
References
- Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
- Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
- Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
- Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
- Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
- Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
- Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
- Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
- Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
- Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
- Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
- Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
- Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
- Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
- Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
- Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
- Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
- Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
- Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
- Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
- Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
- Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
- Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
- Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
- Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
- Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
- Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
- Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
- Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
- Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
- Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
- Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
- Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
- Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
- Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
- Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
- Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
- Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
- Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
- Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
- Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
- Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
- Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
- Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
- Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
