Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إعداد و Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

توضح هذه المخطوطة كفاءة، والتسليم غير فيروسي مير إلى الخلايا البطانية التي كتبها ناقل PEI / MNP ومغنطة بهم. وهكذا، بالإضافة إلى التعديل الوراثي، ويسمح هذا النهج لتوجيه الخلايا المغناطيسي MRI والكشف. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحسين خصائص المنتجات خلية العلاجية.

Abstract

حتى الآن، فإن العلاجات الجراحية والدوائية المتاحة لأمراض القلب والأوعية الدموية (الأمراض القلبية الوعائية) محدودة وغالبا ما الملطفة. وفي الوقت نفسه، الجينات والخلايا العلاجات هي النهج البديلة واعدة للغاية لعلاج الأمراض القلبية الوعائية. ومع ذلك، فإن التطبيق السريري واسعة من العلاج الجيني يقتصر إلى حد كبير بسبب عدم وجود أنظمة توصيل الجينات المناسبة. تطوير ناقلات توصيل الجينات المناسبة يمكن أن توفر حلا للتحديات الراهنة في العلاج بالخلايا. وعلى وجه الخصوص، السلبيات الموجودة، مثل كفاءة محدودة ومنخفضة الاحتفاظ الخلايا في الجهاز المصاب، يمكن التغلب عليها عن طريق الهندسة الخلية المناسبة (أي الوراثية) قبل الزرع. يصف بروتوكول المعروضة تعديل عابر فعالة وآمنة من الخلايا البطانية باستخدام جسيمات متناهية الصغر polyethyleneimine مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic المغناطيسي (PEI / MNP) المستندة إلى متجه التسليم. أيضا، يتم تعريف خوارزمية والأساليب لتوصيف الخلية. وintracellu ناجحةوقد حقق تسليم لار من الرنا الميكروي (مير) في الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) دون التأثير على بقاء الخلية، وظائف، أو الاتصالات بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، فقد أثبت هذا النهج لإحداث تأثير وظيفي قوي في خارجية المنشأ قدم مير. الأهم من ذلك أن تطبيق هذا ناقل القائمة MNP-يضمن مغنطة الخلية، مع المرافق إمكانيات استهداف المغناطيسي MRI وتتبع غير الغازية. وهذا قد تقدم أساسا لتسترشد مغناطيسيا، علاجات الخلايا المعدلة وراثيا التي يمكن رصدها غير جراحية مع التصوير بالرنين المغناطيسي.

Introduction

الجينات والعلاج بالخلايا هي أدوات قوية لديها القدرة على حل التحديات الراهنة في علاج الأمراض القلبية الوعائية. وعلى الرغم من أن كلا من هذين النهجين يجري حاليا اختبارها في التجارب السريرية، فهي ليست مستعدة بعد للالتطبيق السريري واسعة 1. والجدير بالذكر أن نهج مشترك لمواجهة التحديات من الجينات والعلاج بالخلايا هو تطوير ناقلات توصيل الجينات متعددة الوظائف مناسبة لتطبيق السريرية. عدم وجود أنظمة توصيل الجينات آمنة وفعالة هو مصدر القلق الرئيسي من العلاج الجيني. في الوقت نفسه، والهندسة الوراثية من المنتجات الخلوية قبل الزرع يمكن التغلب على التحديات الخطيرة للعلاج الخلايا، مثل انخفاض الكفاءة (على سبيل المثال، في مجال القلب، ويتحقق فقط ~ 5٪ من تحسين وظيفي بعد الخلايا الجذعية زرع 1 ) وضعف الاحتفاظ / engraftment في موقع الإصابة (أي الاحتفاظ خلية تنخفض 5-10٪ في غضون دقائق إلى ساعات بوالحادي والتطبيق، بغض النظر عن مسار إدارة 2، 3، 4).

حتى الآن، ناقلات فيروسية تتجاوز الى حد كبير أنظمة غير الفيروسية من حيث الكفاءة، مما أدى إلى تطبيقها على نطاق أوسع في التجارب السريرية (~ 67٪) 5. ومع ذلك، والمركبات الفيروسية تحمل مخاطر جسيمة، مثل المناعية (والاستجابة الالتهابية لاحقة، مع مضاعفات خطيرة)، قدرة التوريم، والقيود في حجم المادة الوراثية تنفيذ 6. بسبب هذه المخاوف المتعلقة بالسلامة وارتفاع تكاليف الإنتاج ناقلات فيروسية، واستخدام أنظمة غير الفيروسية هو الأفضل في بعض الحالات 7 و 8. انها مناسبة خاصة للاضطرابات التي تتطلب التصحيح الجيني عابرة، مثل التعبير عن عوامل النمو السيطرة على الأوعية الدموية (على سبيل المثال، لعلاج الأمراض القلبية الوعائية) أو deliveراي من اللقاحات.

في مجموعتنا، تم تصميم نظام التسليم عن طريق الجمع بين تشعبت 25 كيلو دالتون polyethyleneimine (PEI) وجزيئات أكسيد الحديد مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (MNP) تربطهم البيوتين streptavidin التفاعل 9. هذه النواقل هو أداة محتملة للهندسة الوراثية للخلايا، مما يسمح للمغنطة في وقت واحد من قبل الزرع. يوفر هذا الأخير أساسا لالمغناطيسي التوجيه / الاحتفاظ بها، وهي واعدة خاصة في الوقت الحاضر، وأساليب الاستهداف المتقدمة المغناطيسي ويجري حاليا وضع بنجاح (10). وعلاوة على ذلك، مما أدى الخلايا تستجيب مغناطيسيا لديها القدرة على أن تكون غير جراحية رصدها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) أو التصوير الجسيمات المغناطيسية 11 و 12.

في حالة حدوث الموجه PEI / MNP، البولي أمينات يضمن التكثيف الحمض النووي، وبالتالي الحماية من عامل المهينة الصورة، استيعاب ناقلات في الخلايا، وendosomal الهروب 5. وMNPs تكمل خصائص جزيرة الأمير إدوارد، وليس فقط من حيث التوجيه المغناطيسي، ولكن أيضا عن طريق الحد من المعروف PEI سمية 7 و 13 و 14. سابقا، تم تعديل PEI / MNP خصائص ناقلات من حيث الكفاءة والتسليم (أي PDNA وميرنا) والسلامة باستخدام الخلايا الليفية والخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان 15 و 16.

في هذه المخطوطة، يوصف بروتوكول مفصلة على تطبيق مبادرة التعليم الفلسطينية / MNPs لتوليد الخلايا المعدلة ميرنا 17. لهذا الغرض، وتستخدم HUVECs وتمثل نموذجا أنشئت لفي المختبر الأوعية الدموية. فهي صعبة ل transfect وعرضة للتأثير السام 18، 19،الحمار = "XREF"> 20. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم خوارزمية لتقييم مثل هذه الخلايا في المختبر، بما في ذلك الاستهداف، والاتصالات بين الخلايا، وكشف التصوير بالرنين المغناطيسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم الحصول على الحبل السري الإنسان لعزل الخلايا بعد الولادة من علم والنساء الأصحاء الذين أعطى موافقتهم الخطية على استخدام هذه المواد لأغراض البحث وفقا لإعلان هلسنكي. وافقت لجنة أخلاقية من جامعة روستوك الدراسة التي قدمت (ريج. رقم أ 2011 06، لفترة طويلة 23 سبتمبر 2013).

1. إعداد ترنسفكأيشن مجمعات

  1. Biotinylation من polyethyleneimine (PEI).
    1. حل تشعبت PEI في الماء عالى النقاء تحت التحريك المغناطيسي في 300-400 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) ومحمية من الضوء للحصول على حل 0.18 ملم. تخزين الحل في 4 درجات مئوية.
    2. قياس تركيز الجماعات الأمينية الأساسية في حل حصلت 21 و 22.
      1. استخدام 2٪ النينهيدرين حل كاشف باسم كاشف كشف أمين 23 عن طريق خلط 100 ميكرولتر من العلاقات العامةعينة ediluted (1: 200 مع الماء عالى النقاء) و 75 ميكرولتر من كاشف النينهيدرين. احتضان لمدة 30 دقيقة في 80 ° C. تبريده وإضافة 100 ميكرولتر من 50٪ من الإيثانول لتحقيق الاستقرار. قياس الامتصاصية في 550 نانومتر على معمل الامتصاص.
      2. إنشاء منحنى قياسي باستخدام الجلايسين.
        1. تحضير 0.1 M الأمينية-N حل سهم (0.75 غرام من الجلايسين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات) والتخفيفات في، 1: 1، 1: 5، 01:10، 01:20، 01:40، 1:80، 1: 100، 1: 200، و 1: 400، 1: 600. قياس هذه الحلول كما في الخطوة 1.1.2.1 وخلق مؤامرة مع تركيز والامتصاصية على المحاور.
        2. وبناء على هذه المؤامرة التي تم الحصول عليها والامتصاصية يقاس من الحل PEI، تحديد تركيز مجموعات α الأمينية في جزيرة الأمير إدوارد.
          ملاحظة: الحذر. يجب أن تستخدم حصرا النينهيدرين حل كاشف تحت غطاء محرك السيارة ويجب أن يتم تخزين تحت جو النيتروجين. أنها ليست صالحة للاستعمال عندما يتغير لون الحل المناسب للأكسدة.
    3. حل 100 ملغ من رابط البيوتين في الماء عالى النقاء مباشرة قبل الاستعمال للحصول على حل 0،01 ملم. حساب الكمية المطلوبة من البيوتين إضافة إلى PEI بضرب تركيز مجموعات α الأمينية في جزيرة الأمير إدوارد (تقاس في الخطوة 1.1.2) بنسبة 20 إلى الحصول على المبلغ اللازم (في مول) من كاشف biotinylating.
      1. إضافة الحل البيوتين إلى حل PEI في درجة الحموضة 8-9 واحتضان لمدة 16 ساعة مع التحريك المغناطيسي في RT.
    4. إزالة البيوتين غير المتفاعل من حجم الاستبعاد اللوني 23. استخدام الأعمدة المتاحة تجاريا تحتوي على هلام الترشيح المتوسطة مناسبة لتطهير 25 كيلو دالتون PEI واتبع تعليمات الشركة الصانعة. خذ أجزاء مأخوذة بعد تنقيتها لقياس تركيز الأمينات باستخدام كاشف الكشف عن الأمينات (الخطوة 1.1.2) وتحديد كفاءة البيوتين الاقتران (الخطوة 1.2.2). تخزين PEI البيروكسيديز حصلت على 4 درجات مئوية.
  2. حرفسعودة من المعقدة البيروكسيديز PEI.
    1. تحديد تركيز مجموعات α الأمينية في جزيرة الأمير إدوارد بعد biotinylation، كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.
    2. تحديد درجة PEI biotinylation للتحقق من إجراء الاقتران. لالكمي، استخدم أدوات المتاحة تجاريا، والتي تقوم على تطبيق صبغ HABA (حمض 4'-hydroxyazobenzene-2-متيل)، لضمان تحديد اللونية الصحيح للمستويات biotinylation 24 و 25. اتبع الإرشادات المتوفرة من قبل الشركة المصنعة.
  3. ترشيح MNPs وتوصيف بهم.
    1. تصفية المتاحة تجاريا streptavidin المغلفة MNP من خلال 0.45 ميكرومتر يحركها حقنة تصفية 16 من أجل استبعاد المجاميع السامة أكبر. قياس تركيز الحديد النهائي باستخدام فحص الضوئية القياسية 26.
    2. دراسة نوعية MNPs تصفيتها عن طريق تسجيلمنحنى مغنطة والتصوير TEM وفقا للبروتوكولات القياسية 27 و 28.
      1. تمييع تعليق MNP مع الماء المقطر ووضع 3 ميكرولتر من تعليق حصلت على 300 شبكة Formvar الكربون المغلفة الشبكة النحاسية لتحليل TEM. وفي وقت لاحق، وضع هذه الشبكة على شريحة زجاجية على لوحة التدفئة واتركها لتجف.
      2. تحليل العينة مع المجهر الإلكتروني نقل 120 كيلو فولت والتحقق من محتوى عنصري باستخدام كاشف الأشعة X 27.
  4. وضع العلامات 3-لون المجمعات ترنسفكأيشن للفائقة الدقة المجهر.
    1. تسمية 0.5٪ من المجموعات الأمينية الأساسية قياس في جزيرة الأمير إدوارد مع NHS-إستر أتو 488 صبغ باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إزالة الصبغة غير منضم الزائد عن طريق اللوني الحجم الاستبعاد، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.1.4). قياس تركيز الناتجة من مجموعة الأمينية باستخدام أسا النينهيدرينص (الخطوة 1.1.2).
    2. تسمية المتاحة تجاريا سارعت مير (SCR-مير) مع Cyanine5 صبغ يستخدم وضع العلامات عدة مناسبة 15 (المشار إليها في قائمة المواد). قياس تركيز fluorophore-مير الناتجة طيفيا.
    3. حديثا تسمية MNP في كل مرة مع صبغ البيوتين مترافق (على سبيل المثال، أتو 565 البيوتين) في 1: 1000 ث / ث نسبة. تطبيق مباشرة الصبغة بعد إضافة MNP إلى مير / PEI خلال تشكيل المجمعات ترنسفكأيشن، في التفاصيل في Delyangina وآخرون. 16.

2. خلية التحضير

  1. HUVEC العزلة.
    1. عزل الخلايا من الحبل السري مباشرة بعد الحصول على الحبال باستخدام كولاجيناز الهضم من داخل الوريد الحبل. اتباع البروتوكول وضعت سابقا 29.
      1. احتضان كل الحبل مع ~ 60 وحدة / مل من نوع كولاجيناز حل رابعا في المخزن - تحميلها في رانه الوريد السري - عند 37 درجة مئوية لمدة 13 دقيقة.
    2. لجميع التجارب، تجميع HUVECs من حد أدنى من 5 المرضى.
      يجب أن لا تتجاوز زراعة 4-5 المقاطع: ملاحظة. لا تستخدم الخلايا الملوثة مع الميكوبلازما، وهذا يؤدي إلى انخفاض في كفاءة ترنسفكأيشن. وينبغي اختبار التلوث الميكوبلازما لقبل البدء في بروتوكول باستخدام عدة PCR للكشف عن درجة عالية من الحساسية مسببة.
      1. اختبار لوجود الميكوبلازما.
        1. الطرد المركزي 1 مل من الخلايا طاف الثقافة لمدة 10 دقيقة (13000 x ج). تعليق بيليه في 17 ميكرولتر من درهم 2 O ويغلي (93 ° C) لمدة 3 دقائق. استخدام 2 ميكرولتر من تعليق لتضخيم المنطقة الحمض النووي التي رموز لالرنا الريباسي الحفظ جدا (16S-الريباسي) من الأنواع الميكوبلازما المختلفة.
        2. أداء PCR باستخدام 10 بمول من كل التمهيدي (التمهيدي إلى الأمام: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '؛ عكس التمهيدي: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') في مشطination مع مجموعة PCR التجارية وفقا للشروط التالية: 94 ° C لمدة 3 دقائق. 45 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
        3. تحليل المنتج PCR (292 بي بي) باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام.
    3. إما تخزين الخلايا التي تم الحصول عليها على المدى الطويل في النيتروجين أو ثقافة لهم السائل في المتوسط نمو بطانة تستكمل مع 100 البنسلين U / مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو فاي إد humidi تحتوي على 5٪ CO 2.
  2. HUVEC التوصيف.
    1. تميز HUVECs معزولة من حيث قدرتها الوظيفية لبناء أنابيب في مصفوفة الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، matrigel) والتعبير عنها من CD31 علامة البطانية (الصفائح الدموية البطانية خلية التصاق جزيء، PECAM-1) التالية البروتوكولات القياسية 30، 31.

3. ترنسفكأيشن

  1. يعرض للتريبسين الثقافة الأسهم HUVEC (راجع الخطوة 4.1.2.) ويدويا عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. البذور وHUVECs على لوحات ثقافة الخلية جيدا بلاستيكية ذات حجم مناسب، مع بدء كثافة الخلايا ما يقرب من 13000 خلية / سم 2 من سطح النمو، 48 ساعة قبل ترنسفكأيشن حتى يتم التوصل إلى التقاء 70-80٪.
  2. إعداد الطازجة مير / PEI / MNP مجمعات في كل مرة.
    ملاحظة: أولا، ينبغي الحصول على المجمعات مير / PEI (خطوات 3.2.1 - 3.2.3)؛ بعد ذلك، يجب إضافة MNPs إلى حل مير / PEI (الخطوة 3.2.4) من أجل الحصول على صياغة مير / PEI / MNP النهائية تستخدم لترنسفكأيشن (الخطوة 3.3).
    1. حساب كمية مناسبة متاحة تجاريا مير (مخلوط، الموسومة أو وظيفية، راجع الخطوة 4) باستخدام تركيز الأسهم المقدمة من قبل الشركة المصنعة. استخدام 2.5 بمول من مير / سم 2 من سطح نمو الخلايا. تمييع مير في 5٪ محلول الجلوكوز إلى سbtain تركيز النهائي من 0.125 بمول من مير / ميكرولتر.
    2. على أساس كمية مير من الخطوة 3.2.1 ونسبة NP المثلى من 25 32، وحساب الكمية المطلوبة من PEI باستخدام تركيز يقاس بها (الخطوة 1.1.2). تمييع PEI (للحجم المطلوب محسوب) في حجم مساو من 5٪ محلول الجلوكوز. إضافة حصلت قبل المخفف PEI إلى حل مير (من الخطوة 3.2.1) ودوامة الخليط التي تم الحصول عليها لمدة 30 ثانية.
    3. احتضان الحصول مير / PEI الخليط لمدة 30 دقيقة في RT.
    4. يصوتن MNPs في 35 كيلوهرتز للا يقل عن 20 دقيقة في حمام ماء sonicating (انظر قائمة المواد) في RT، إضافة كمية مناسبة من محلول MNP إلى مير / PEI (5-25 ميكروغرام من الحديد / مل من إعداد مير / PEI / MNP خليط 16)، دوامة لمدة 30 ثانية، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT لتصبح جاهزة.
  3. إضافة أعد مير / PEI / MNP خليط قطرة قطرة مباشرة إلى مستنبت على الخلايا. استخدام الخليط الناتج من طريق مسدود خليةمتوسطة تلح مع مير / PEI / MNP المخفف في الجلوكوز هو الحل ترنسفكأيشن. استبدال هذا الخليط مع الطازجة مستنبت 6 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

4. تحليل السلامة المتجهات

  1. دراسة بقاء الخلية.
    1. Transfect وHUVECs المصنف في لوحة الثقافة 24 أيضا (الخطوات 3.1 و 3.2)؛ استخدام CY3-مير كما تحقيقات اختبار وسارعت مير (SCR-مير) كما تحقيقات النابضة السيطرة على التدفق الخلوي. احتضان عند 37 درجة مئوية في جو فاي إد humidi تحتوي على 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
    2. جمع طاف والخلايا transfected بواسطة trypsinization باستخدام 1X التربسين-EDTA المخفف في برنامج تلفزيوني إضافة إلى الخلايا لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة واستخدام للتحليل.
    3. دراسة بقاء الخلية ومير كفاءة امتصاص 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن باستخدام التدفق الخلوي من خلال تطبيق وصمة عار المتاحة تجاريا للتمييز بين العيش / الخلايا الميتة. استخدام البروتوكولات القياسية 15
  2. فحص سلامة المجمعات مير / PEI / MNP للخلايا في المقايسات الفنية.
    1. تقييم نشاط تكاثر الخلايا transfected.
      1. المصنف Transfect HUVECs في لوحة الثقافة 12 أيضا (الخطوات 3.1 و 3.2) مع العقاقير وظيفية مير (على سبيل المثال، ومكافحة miR92a لHUVECs 31)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في جو فاي إد humidi تحتوي على 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
      2. استخدام عدة متاحة تجاريا لتحديد عدد الخلايا المتكاثرة التي تلطيخ مع ايدو (5 إيثينيل-2'-deoxyuridine) والمسح الضوئي مع القائم ليزر متحد البؤر المجهري. استخدام الإعدادات المجهر التالية: الهدف 40X مع الغمر النفط. 633 نانومتر الإثارة ليزر (لصبغ 647 نانومتر)؛ 5 حقول عشوائية ليتم تسجيلها في كل عينة. حساب معدل الخلايا المتكاثرة بقسمة عدد من نوى الملون EDU من قبل عدد إجمالي النوى (Hoechشارع الملطخة).
    2. تقييم قدرة الخلايا transfected لتشكيل أنبوب يشبه الهياكل، كما هو موضح سابقا 17، 31.
      1. Transfect وHUVECs المصنف في لوحة الثقافة 24 أيضا (الخطوات 3.1 و 3.2) مع قرار مجلس الأمن-مير واحتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو فاي إد humidi تحتوي على 5٪ CO 2. جمع الخلايا transfected (كما في الخطوة 4.1.1).
      2. البذور 3.5 × 10 4 من HUVECs المعدلة في 24 لوحات جيدا المغلفة مع 140 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي. احتضان لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو فاي إد humidi تحتوي على 5٪ CO 2.
      3. تسجيل صور من 10 حقول عشوائية في كل متحد البؤر المجهري جيدا باستخدام المسح الضوئي ليزر (التفاضل تدخل على النقيض) وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ مع البرنامج المساعد "الأوعية الدموية محلل". وتشمل هذه المعالم كما يبلغ طول الفروع، وعدد من الفروع، وعدد من junctiالإضافات في التقييم. قارن هذا إلى سيطرة غير المعالجة.
  3. دراسة تأثير سمية ممكن من المجمعات ترنسفكأيشن على الفجوة تقاطع (GJ) بوساطة الاتصالات بين الخلايا (GJIC) عن طريق اختبار الانتعاش مضان 3D بعد photobleaching من (FRAP) 33 في 3D.
    1. البذور الخلايا على الشرائح الزجاجية المغلفة الجيلاتين مع قاع رقيقة مناسبة للتصوير الخلايا الحية (الغمر النفط). Transfect الخلايا كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.2 مع غير المسمى، مير غير وظيفية (SCR-مير)، واحتضان لمدة 24 ساعة.
    2. إعداد الخلايا للتصوير من خلال تحميلها مع calcein مباشرة قبل المجهر. على وجه الخصوص، تحل محل الثقافة المتوسطة مع المتوسطة الطازجة تحتوي على 5 ميكرومتر calcein، واحتضان لمدة 20 دقيقة، ويغسل مع PBS، وإضافة مستنبت الطازجة. قبل تدفئة الحاضنة من المجهر إلى 37 درجة مئوية، وضبط تركيز CO 2 إلى 5٪.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف الدافئ لتجنب العقود مع خليةنشوئها قبل القياس.
    3. استخدام 561 نانومتر الإثارة ليزر لتصور الخلايا والتجربة FRAP. أولا، يدويا تحديد خلايا للقياس المناطق ذات الاهتمام (ROI)؛ يجب أن يكون خلايا اختبار لا يقل عن 3 الخلايا المجاورة. تحديد مرجع الخلية مع مشرق مضان ومستقر لن يكون ابيض. تعريف حدود ض المكدس. تسجيل مضان من الجزء العلوي من الخلايا إلى أسفل لتشمل 10-15 طبقات.
    4. تبييض الخلايا باستخدام اختبار قوة الليزر 100٪ وتسجيل انتعاش مضان لاحقا (بسبب نقل صبغ GJ محددة من الخلايا المجاورة) خلال دقيقة 15 التالية. تسجيل البيانات الخام في Z-أكوام كل 60 ثانية. في المجموع، وإجراء القياسات FRAP مع ما لا يقل عن 5-10 خلايا اختبار في التجربة. مقارنة النتائج للخلايا untransfected.

5. اختبار الكفاءة ترنسفكأيشن

  1. فحص مير امتصاص.
    1. إعداد تحقيقات كما هو موضح في الظريفص 4.1 واستخدامها في وقت واحد لتحديد مير امتصاص مع التدفق الخلوي.
  2. تأكيد ووصف توطين الخلايا من المجمعات ترنسفكأيشن التي كتبها متحد البؤر وsuperresolution منظم إضاءة المجهر (SIM).
    1. البذور وHUVECs على coverslips الزجاج الجيلاتين المغلفة توضع في الآبار لوحات ثقافة 24-جيدا، كما هو موضح من قبل (الخطوة 3.1). Transfect الخلايا مع 3-لون المسمى مير / PEI / MNP (الخطوة 1.4)، واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو فاي إد humidi تحتوي على 5٪ CO 2.
    2. غسل لل coverslips أولا مع 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وبعد ذلك فقط مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا التي تفرخ في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وصمة عار نوى مع دابي التالية البروتوكولات القياسية (16). يغسل 3 مرات على شاكر (15 دقيقة لكل منهما) لإزالة الصبغة الزائدة.
      ملاحظة: PFA غير مسرطنة ويجب التعامل معها بعناية.
    3. ضع العلاقات العامةcoverslips epared على المجهر الشرائح باستخدام المتوسطة المتزايدة مناسبة، والسماح لهم الجافة على الأقل لمدة 1 ساعة، واستخدامها للفحص المجهري، كما هو موضح أدناه.
    4. الحصول على صور باستخدام الهدف الغمر النفط 63X وإعدادات SIM التالية: 405-، 488-، 561-، وخطوط ليزر 633 نانومتر لإثارة. وضع ض المكدس وعلى عمق 32 بت في 5 زوايا، 5 مراحل، مع المتوسط ​​من 4. شبكة G2 مع خط 405 ليزر، G3 مع 488، G4 مع 561، وG5 مع 633.
  3. تقييم الأداء الوظيفي للمير القاه RT-QPCR في مير / PEI / MNP-HUVECs مقابل دون علاج.
    1. Transfect وHUVECs المصنف في 12 جيدا الخطوات وحة الثقافة (3.1 و 3.2) مع العقاقير وظيفية مير (على سبيل المثال، ومكافحة miR92a لHUVECs 31)، واحتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو فاي إد humidi تحتوي على 5٪ CO 2.
    2. تقييم تسليم مكافحة miR92a وتجهيز مع RT-QPCR باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا (انظر المواد)؛ اتبع رانه تعليمات الشركة الصانعة، كما هو موضح في أماكن أخرى 17، 31. في موازاة ذلك، دراسة التعبير عن الجينات المستهدفة (على سبيل المثال، ITGA5 31).
      ملاحظة: تسليم AntagomiR ضد الذاتية مير ويفضل أكثر من يقلد لأنه يضمن قياس نتائج الفعلية للمير وليس مجرد تراكمه داخل الخلايا.

6. خلية استهداف التقييم والمغناطيسي فصل خلية

  1. خلية تستهدف في ظروف ثابتة في المختبر.
    1. Transfect وHUVECs في 24 لوحة جيدا (2.5 بمول / سم 2-قرار مجلس الأمن مير، NP 25، و15-25 ميكروغرام / مل MNP)، احتضان لمدة 24 ساعة، ويغسل، وجمع على النحو المبين أعلاه (الخطوة 4).
    2. مزيج بيليه الخلية التي تم الحصول عليها من 1 جيدا مع 1 مل من مستنبت الطازجة ووضعها في الآبار من لوحة ال 12 أيضا. إصلاح مغناطيس صغير محليا (على جنب) في الجزء السفلي من لوحة باستخدام الشريط.
    3. احتضان تعليق خلية لمدة 24 ساعة ومراقبة مرفق الخلية والنمو في المنطقة خلال المغناطيس وفي المنطقة دون المغناطيس. للتقييم النوعي، واستخدام المجهر المقلوب التقليدية.
  2. خلية تستهدف في ظروف ديناميكية محاكاة في المختبر.
    1. Transfect وHUVECs في 24 لوحة جيدا في الخطوات 3.1 و 3.2 (2.5 بمول / سم 2 CY3-مير، NP 25، و15-25 ميكروغرام / مل MNP)، واحتضان لمدة 24 ساعة، ويغسل، وجمع من قبل trypsinization باستخدام 1X التربسين- EDTA المخفف في برنامج تلفزيوني إضافة إلى الخلايا لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
    2. مزيج بيليه الخلية التي تم الحصول عليها من 1 جيدا مع 1 مل من مستنبت الطازجة ووضعها في بئر من لوحة ال 12 أيضا. إصلاح مغناطيس صغير محليا (على جانب بئر) باستخدام الشريط. وضع لوحة الثقافة على شاكر واحتضان تعليق خلية لمدة 12 ساعة عند 150 دورة في الدقيقة لمحاكاة الظروف الديناميكية 34.
    3. غسل الخلايا وإصلاحلهم باستخدام 4٪ PFA. وصمة عار على النوى مع دابي 16. تسجيل مرفق الخلية باستخدام ليزر المسح المجهري متحد البؤر مع 514 نانومتر الإثارة ليزر، ووضع ض المكدس (5-12 شرائح) للحصول على البيانات الخام، وأقصى كثافة معالجة الصور إسقاط لخلق صور لتحليلها.
  3. التحليل الكمي من الخلايا المستجيبة مغناطيسيا وغير متجاوبة.
    1. Transfect وHUVECs في 24 لوحة جيدا (2.5 بمول / سم 2-قرار مجلس الأمن مير، NP 25، و15-25 ميكروغرام / مل MNP)، واحتضان لمدة 24 ساعة، ويغسل، وجمع كما هو موضح من قبل (الخطوة 6.2.1) . قبل دافئ PBS والفرز الخلية عازلة (تعقيمها عن طريق الترشيح، راجع قائمة المواد) إلى 37 درجة مئوية. إعادة تعليق بيليه خلية تم الحصول عليها من كل بئر مع 500 ميكرولتر من خلية عازلة الفرز.
    2. تطبيق هذا تعليق خلية إلى أعمدة الفرز المغناطيسي الذي تحدده المغناطيس الموردة، وغسل الأعمدة على مغناطيس 3 مرات مع خلية جديدة فرز العازلة، وجمع من خلال تدفق مثل المغناطيسيساتيا جزء لا تستجيب (المغنطيسية).
    3. إزالة الأعمدة من المغناطيس، وجمع على الفور جزء الخلية استجابة مغناطيسيا (ماج +) عن طريق دفع الخلايا فرز عازلة جديدة من خلال العمود باستخدام المكبس.
    4. أجهزة الطرد المركزي على حد سواء المغنطيسية وماج + في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إعادة تعليق بيليه خلية في برنامج تلفزيوني، عد الخلايا، وتقييم قابلية الخلية مع التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة 35. استخدام بيليه الخلية التي تم الحصول عليها إما عن تحليل طويل الأجل (أي إعادة البذور وتقييم بعد 24، 48، و 72 ساعة في الثقافة 17) أو مباشرة عن التدفق الخلوي (الخطوة 4.1).
  4. تحديد تحميل الحديد من خلايا transfected.
    ملاحظة: خلال فترة الإعداد، يجب تجنب أي اتصال من تحقيقات الخلية مع المواد والأدوات أكسيد الحديد.
    1. جمع HUVECs transfected والسيطرة untransfected (كما في الخطوة 4.1.1). غسل الخلايا التي تم جمعها مرتين في 2٪ BSA في PBS 36 ب ذ خلط بعناية الخلايا مع 1 مل من غسل العازلة هذا ثم الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. اعادة تعليق بيليه الخلية التي تم الحصول عليها في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ PFA، واحتضان لمدة 20 دقيقة لإصلاح الخلايا. يغسل 3 مرات مع PBS، كما هو موضح أعلاه.
    2. اعادة تعليق الناتجة بيليه خلية ثابتة في 110 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتحويلها إلى 100 ميكرولتر أنابيب PCR.
      1. خذ أجزاء مأخوذة 10 ميكرولتر لعد الخلايا واستخدام العينة المتبقية للالطيفي المغناطيسي الجسيمات (MPS).
    3. إجراء القياس على جهاز MPS متاحة تجاريا. أثناء القياس، وتطبيق الإعدادات التالية: المجال المغناطيسي B محرك = 25 طن متري، والتردد f 0 = 25 كيلو هرتز. لتقدير الحديد من العينات، تطبيع الثالث التوافقي A 3 من MPS الطيف إلى المناظرة 3، المرجع من عينة مرجعية MNP مع كمية الحديد معروفة من 2.1 ميكروغرامXREF "> 37. استخدام الخلايا غير المعالجة والضوابط.

7. حدود تعريف كشف التصوير بالرنين المغناطيسي

  1. إعداد الخلية.
    1. HUVECs البذور في لوحة 6 جيدا وtransfect (2.5 بمول / سم 2 قرار مجلس الأمن-مير، NP 25، و15-25 ميكروغرام / مل MNP) في مكررة أو يثلث وفقا للكمية المطلوبة من الخلايا (لإعداد الوهمية). احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة ويغسل، وجمع، واصلاحها مع 4٪ PFA، كما هو موضح من قبل (الخطوة 4).
    2. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها، وإعداد أجزاء مأخوذة مع أرقام الخلية المناسبة (على سبيل المثال، 10 3، 10 4، 10 5، الخ)، وضبط حجمها إلى 50 ميكرولتر.
  2. إعداد الوهمية الاغاروز
    1. إعداد عدة طبقات من 2٪ الاغاروز في أنابيب 50 مل مع كميات مختلفة من الخلايا transfected جزءا لا يتجزأ من بين طبقات 38. أثناء الإعداد، يصوتن وأجهزة الطرد المركزي في الاغاروز الساخن 38 إلىتدمير فقاعات الهواء التي تسبب التحف.
      ملاحظة: الأهم من ذلك، الخيالات التي تحتوي على 5.5 × 10 5 HUVECs تعامل مع المجمعات مير / PEI غير المغناطيسية يجب أن تكون مستعدة بنفس الطريقة لتكون بمثابة الضوابط.
  3. مسح تم الحصول عليها في المختبر الأشباح مع نظام MRI 7.1 T الحيوانات بعد وضع الوهمية مركزيا في الملف، بالتوازي مع ض محور الحقل المغناطيسي للأرض.
    1. تطبيق المعلمات التسلسل التالي لتسلسل الحيازة التدرج الصدى: TR = 66 مللي ثانية. TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE = 1.44 6 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01 مللي ثانية. الوجه زاوية = 3 °؛ مصفوفة = 128 × 128، محرف إلى 256 × 256. مجال الرؤية = 42 مم؛ 100٪؛ المتوسطات = 1، طول القطار صدى = 1؛ شريحة سمك = 1.5 مم؛ و 16 شرائح.
    2. تقييم تسوس إشارة في جميع الأوقات صدى أربعة وحساب خرائط R2 * (R2 * = 1 / T2 *) باستخدام البرنامج المناسب، كما هو موضح في أماكن أخرى 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

والغرض الرئيسي من البروتوكول المقترح هو إنتاج الخلايا المستجيبة مغناطيسيا مير المعدلة وإجراء توصيف دقيق لها (الشكل 1). ونتيجة لذلك، والخلايا transfected بكفاءة، تستجيب لاختيار المغناطيسية والتوجيه وكشف مع التصوير بالرنين المغناطيسي، يجب الحصول على.

أولا، تم التأكد من هويات HUVECs معزولة من تلطيخ نموذجي مع CD31 البطانية علامة (PECAM) (الشكل 2A) وقدرتها على تشكيل الأنابيب على المناسبة مصفوفة الغشاء القاعدي (الشكل 2B). أخذت الخلايا التي تم الحصول عليها حتى مير عرضته PEI / MNP بكفاءة عالية. أثبت الفحص المجهري أن كل الخلايا كانت إيجابية للإشارة مير الموسومة (CY3) 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 3A). الأهم من ذلك، تم تسجيل أي موت الخلايا بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة (الشكل 3B)، و nواستمر ظهور أرمال (الشكل 3A). كما لوحظ مع متحد البؤر المجهر الليزر، إشارة من CY3-مير كانت تقع في المقام الأول داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تم إجراء تحقيق أكثر تفصيلا للتوطين الخلايا من جميع أنحاء ناقلات ترنسفكأيشن ومير بها مع دقة أعلى باستخدام 3-لون المجمعات المسمى. تم الكشف عن SIM، مير، PEI، وMNP الإشارات كلها في السيتوبلازم في منطقة محيط بالنواة (الشكل 3C).

وعلاوة على ذلك، أثبت تحقيق مفصل من سلامة ناقلات ترنسفكأيشن أن مير / PEI / MNP-HUVECs قادرون على تشكيل الأنابيب على مصفوفة الغشاء القاعدي المناسبة وأن الشبكة الناتجة مماثلة لتلك الخلايا غير المعالجة تستخدم كعنصر تحكم إيجابية (الشكل 4A ). وعلاوة على ذلك، حافظت خلايا transfected GJIC، حيث كشفت التجارب 3D-FRAP. على وجه الخصوص، عندما يتم تحميل الخلايا مع الفلورسنت GJ-permeaصبغ بلي والمبيضة واحد منهم، مضان لها يتعافى ويرجع ذلك إلى التواصل مع الخلايا المجاورة ويترتب عليه من نقل صبغ (الشكل 4B).

الأهم من ذلك، بسبب وجود مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic مركب 40 (الشكل 5A)، وتطبيق مبادرة التعليم الفلسطينية / MNP يسمح ليس فقط ترنسفكأيشن الخلية، ولكن أيضا مغنطة في وقت واحد. وقد تم قياس المبلغ الناتج من الحديد داخل الخلايا باستخدام MPS (الشكل 5B) لجميع التركيزات MNP المطبقة داخل نطاق الأمثل (2.5 بمول / سم 2 مير، NP 25 تستكمل مع 5-25 ميكروغرام / مل MNP): 0.37 ± 0،079-0،7 ± 0.150 خريج الحديد / خلية 17. كما أظهر استخدام أعمدة الفصل المغناطيسي، لجميع هذه التركيزات MNP، وكمية من الخلايا التي تستجيب مغناطيسيا في الحجم الكلي للخلايا transfected هو ~ 70٪ (الشكل 5C). وبالإضافة إلى ذلك، transfected HUVECs هي واضحة مع التصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 5D) داخل في المختبر الاغاروز الأشباح، ومحاكاة قابلية الأنسجة الماوس. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن استهداف المغناطيسي للHUVECs transfected في ظروف ديناميكية محاكاة في المختبر لتكون فعالة (الشكل 6). في هذا الإعداد التجريبية، لم حتى حركة قوية ثابتة من مستنبت لا يمنع نمو الخلايا السائدة في المنطقة القريبة من تطبيق المغناطيس.

شكل 1
الشكل 1. توضيح تخطيطي لإنتاج HUVECs ممغنط مير المعدلة وتحليلها. تطبيق مبادرة التعليم الفلسطينية / MNP (polyethyleneimine / ناقل القائمة جسيمات متناهية الصغر مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic) لتسليم الرنا الميكروي (مير) إلى الخلايا البشرية السري الوريد البطانية (HUVECs). يتميز المنتج الخلية التي تم الحصول عليها من قبل المعلمات التالية: السلامة (بما في ذلك بقاء الخلية، وظيفيةإيتي، والقدرة على التواصل بين الخلايا)؛ كفاءة ترنسفكأيشن (أي مير كفاءة امتصاص وظائف بعد ذلك). المغناطيسي تستهدف في المختبر في ظروف ديناميكية ثابتة والمحاكاة. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الكشف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. توصيف المعزولة HUVEC. ألف صورة الممثل من HUVECs معزولة ومثقف ملطخة علامة CD31 البطانية. وcounterstained نوى مع دابي (الأزرق). شريط المقياس هو 20 ميكرون. B. الممثل نتيجة الفحص تشكيل أنبوب أجريت على HUVECs معزولة. وسجلت الصورة باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (بين التفاضليةعلى النقيض ference) 18 ساعة بعد البذر الخلية على مصفوفة الغشاء القاعدي. شريط المقياس هو 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مير التسليم إلى HUVECs باستخدام PEI / MNP. A. ويوضح امتصاص الموسومة مير (CY3 والأحمر) 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن (2.5 بمول / سم 2 من الموسومة CY3-مير، NP 25 و MNP 25 ميكروغرام / مل) والحفاظ على المظهر الطبيعي للخلايا. وقد أخذت صور من متحد البؤر المجهر الليزر باستخدام 514 نانومتر الإثارة ليزر (CY3 والأحمر) وعلى النقيض تدخل الفرق. شريط المقياس هو 50 ميكرون. وجرى تقييم B. بقاء الخلية 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن التدفق الخلوي. وتمثل مؤامرة النتائج التي تم الحصول عليها عن HUVECق تعامل مع تركيبة معقدة التالية: 2.5 بمول / سم 2 من CY3-مير. NP نسبة 25 تستكمل مع 5-25 ميكروغرام / مل من MNPs. أشرطة تصور النسبة بين متوسط ​​عدد خلايا قابلة للحياة والسكان خلية كاملة (ن = 6؛ أشرطة الخطأ: SEM). C. منظم إضاءة المجهر (SIM) التصوير 3-لون صفت المجمعات مير / PEI / MNP تناولها من قبل HUVECs. و transfected الخلايا كما هو موضح أعلاه، المحتضنة، والثابتة 24 ساعة بعد العلاج؛ تم counterstained نوى مع دابي. تم تسجيل البيانات الخام SIM في زي رزمة ومعالجتها. الصور التمثيلية هي نتيجة لأقصى كثافة الإسقاط. تم تطبيق الليزر الإثارة التالية: 405 نانومتر (دابي والأزرق)، 488 نانومتر (Atto488-PEI، برتقالي)، 565 نانومتر (Atto565-MNP، السماوي)، و 633 نانومتر (Cy5-مير، أحمر). شريط المقياس هو 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. سلامة HUVECs تعديل مع مير / PEI / MNP. A. تم إجراء فحص تشكيل أنبوب مع خلايا transfected (2.5 بمول / سم 2 من قرار مجلس الأمن-مير، NP 25 و MNP 25 ميكروغرام / مل) 48 ساعة بعد تلقي العلاج. تم الحصول على الصور مع المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر (أي فارق تدخل على النقيض) 18 ساعة بعد البذر الخلية على مصفوفة الغشاء القاعدي. واستخدمت HUVECs transfected مع مير / PEI كعنصر تحكم سمية والخلايا غير المعالجة كعنصر تحكم إيجابية. شريط المقياس هو 100 ميكرون. وتعكس مؤامرة النسبة بين HUVECs transfected والخلايا غير المعالجة باستخدام العديد من المعلمات: طول الأنبوب، وعدد من الفروع، وتقاطعات (ن = 3، أشرطة الخطأ: SEM). B. تم تقييم الفجوة بوساطة تقاطع الاتصالات بين الخلايا HUVECs مير / PEI / MNP تعديل 24 ساعة بعد transfecنشوئها. لهذا الغرض، تم تحميل الخلايا مع صبغة calcein-GJ نفاذية (برتقالي)؛ تم فحص الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) في 3D عن طريق مسح خلايا اختبار في زي مداخن. وصفت الصور ممثل الخلايا تحميل calcein قبل التبييض، ومباشرة بعد التبييض، و 15 دقيقة بعد التبييض (مع مضان استرداد). شريط المقياس هو 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل المغنطة 5. الخلية الناتجة من ترنسفكأيشن مع PEI / MNP وتطبيقاته. ألف صورة الممثل من MNPs تصفيتها، إذا أخذ مع TEM، مما يدل التشكل متفاوت المسافات. حجم صغير (~ 5-15 نانومتر) من جسيمات أكسيد الحديد احدة (مما أدى إلى superparamagnetism) هو بذلكتم تأكيد. شريط المقياس هو 100 نانومتر. B. تم تقييم تحميل الخلايا من الخلايا transfected التي كتبها المغناطيسي الجسيمات الطيفي (MPS) 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. لوحة تمثيلية يصور الطيف MPS العينات التي تم فحصها. على وجه الخصوص، نقية MNP تعليق (50 ميكرولتر) بمثابة إشارة (المربعات الزرقاء)؛ الدوائر هي أطياف MPS من عينتين transfected الخلية (الدوائر الحمراء: MNP 25 ميكروغرام / مل؛ الدوائر الخضراء: MNP 5 ميكروغرام / مل)، في حين تشير مثلثات الرمادية الطيف خلفية الكشف عن الحصول عليها عن طريق قياس دون أي عينة. لاحظ مقياس لوغاريتمي من السعة (A). C. كان كميا كمية من الخلايا المعدلة مغناطيسيا من تطبيق HUVECs transfected (2.5 بمول / سم 2 مير، NP 25 تستكمل مع 5-25 ميكروغرام / مل من MNP)، التي تم جمعها من قبل trypsinization 24 ساعة بعد العلاج، لالمغناطيسي عمود فصل الخلية. الناتج جزء إيجابي مغناطيسيا (أي التي بقيت في العمود)وقد عدها، وينعكس نسبة للخروج من كمية كبيرة من خلايا transfected على قطعة أرض لكل تركيز MNP (المثلثات الحمراء). تم فحص بقاء الخلية في وقت لاحق من قبل التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة (معينات الرمادية). وتعرض البيانات كما يعني ± SEM (ن = 3). D. صورة MRI توضيحي من HUVECs transfected (300،000 الخلايا؛ 2.5 بمول / سم 2 مير، NP 25 و 25 ميكروغرام / مل من MNP) سجلت جزءا لا يتجزأ إلى شبح الاغاروز مع T نظام MRI الحيوان 7.1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. في المختبر استهداف المغناطيسي مير / PEI / MNP-HUVECs في مقلد دينامية الشروط. تم جمع HUVECs 24 ساعة بعد transfectأيون (2.5 بمول / سم 2 من CY3-مير، NP 25 و MNP 25 ميكروغرام / مل) وإعادة المصنف في مستنبت الطازجة في الآبار، مع مغناطيس صغير تعلق محليا إلى الجدار الجانبي. في المقابل، تم إصلاح هذا الطبق الثقافة شاكر الدورية في 150 دورة في الدقيقة. تم تقييم مرفق الخلية والنمو بعد 12 ساعة عن طريق تحديد الخلايا مع PFA، تلطيخ النوى مع دابي، وأداء المسح بالليزر متحد البؤر المجهري (الليزر الإثارة: 405 نانومتر، دابي والأزرق، 514 نانومتر، CY3 والبرتقالي). صور تمثيلية تصور نمو الخلايا في المنطقة مع تطبيق المغناطيس. دون تطبيق المغناطيس. وفي مركز ثقافة أيضا، حيث تدفق السائل وتركز الخلايا. القضبان على نطاق وهي 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم تقديم إنتاج خلايا معدلة وراثيا محملة النانوية مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic لتوجيهاتهم مزيد من التحكم مغناطيسيا في البروتوكول الحالي. التطبيق الناجح لهذه الاستراتيجية تسمح لتسوية بعض الصعوبات من العلاج بالخلايا، مثل انخفاض الاحتفاظ والفقراء engraftment في المنطقة أصيب 2، 3، 4، من خلال تقديم منتج خلية استهدافه للزرع. وعلاوة على ذلك، يمكن إدخال وقت واحد من المادة الوراثية المختارة بشكل صحيح تعزيز خصائص الخلايا، وبالتالي يمكن أن تزيد الفوائد الوظيفية 41.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول الحالي على HUVECs كنموذج. وتعرف هذه الخلايا لتكون صعبة ل transfect وعرضة للتأثير السام 18 و 19 و 20. في ماركايتم الحصول على مستوى onstrated من المسمى fluorophore مير امتصاص أكثر من 95٪ بعد PEI / MNP ترنسفكأيشن عادة مع ناقلات القائم PEI وتستخدم عادة الموجبة الكواشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس (على سبيل المثال، Lipofectamine) 42. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة NP المثلى من 25 يتوافق مع القيم التي تم نشرها مسبقا من 20 - 40 لNP. ومع ذلك، فإن امتصاص كفاءة عالية من اختبار مير الموسومة fluorophore لا يضمن بالضرورة معالجة مير السليم وظيفة بعد الولادة 43. هذه النقطة ذات أهمية خاصة في حالة PEI، مع التكثيف في كهرباء ضيق NA. وبالتالي، يجب أيضا اختبار القدرات الوظيفية الناتجة من مير تسليمها. هنا، ومير وظيفية أعرب التطور الطبيعي في HUVEC، مير 92A 31، وقد تم اختيار، ومكافحة مير ضدها تم تسليمها باستخدام PEI وPEI / MNP. ونتيجة لذلك، وهي ضربة قاضية كاملة تقريبا من الهدف مير 92A أثبتت الافراج الفعال لمكافحة مير وROM المجمعات ترنسفكأيشن.

الأهم من ذلك، في الأعمال السابقة، وقد تجلى التطبيق الناجح لناقلات PEI / MNP لإيصال DNA البلازميد (PDNA) ومير لأنواع الخلايا الأخرى، سواء تمسكا (على سبيل المثال، cos7، الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية 15، 16) وفي تعليق (على سبيل المثال، العظام المستمدة من نخاع CD133 + الخلايا الجذعية المكونة للدم 44). وقد أكدت كل هذه التجارب والمعروف أن كفاءة ترنسفكأيشن وسمية هي 45 يعتمد نوع الخلية. وهكذا، (أي كمية مير، نسبة NP، وكمية الحديد MNP) ينبغي أن يتم اختيار التشكيل الأمثل ناقلات من كل نوع خلية معينة، وذلك باستخدام المحددة سابقا الظروف المثلى كنقاط مرجعية.

وعلاوة على ذلك، ينبغي أخذها في الاعتبار الطابع العابر للتعديل الجيني التي تحققت ل. من جهة، طتي هو مناسب جدا لوظيفة معينة، مثل تسليم المدى القصير من عوامل النمو. من ناحية أخرى، ومدة التعبير قد لا تستمر طويلا بما فيه الكفاية لمجموعة متنوعة من الأغراض التي تتطلب التعبير على المدى الطويل. ومع ذلك، فإن سلامة ثبت للناقلات PEI / MNP تدعم إدارة الممكنة المتكررة بمجرد مزيد من الأمثل الظروف.

تستخدم PEI ومشتقاته عادة بسبب كفاءتها العالية بالمقارنة مع غيرها من المركبات غير الفيروسية ومرونتها للتعديل 7. ومع ذلك، على الرغم من نجاح مبادرة التعليم الفلسطينية في التجارب المختبرية والحية، وتطبيقه في التجارب السريرية محدودة جدا (أي عدد قليل من المرحلة 1 و 2 المحاكمات أو مرضى السرطان) 7 و 14 بسبب PEI سمية 7 و 13. كما يعمل السابقة من مجموعتنا 16، وكذلك هذا البروتوكول، أثبتت، MNPsتكون قادرة على خفض PEI سمية بشكل ملحوظ. على وجه الخصوص، مير / PEI ترنسفكأيشن أضرت بقدرة HUVECs لتشكيل أنابيب على مصفوفة، وبالتالي فشلها في المختبر اختبار وظيفي رئيسي لهذه الخلايا. في المقابل، كان أداء تشكيل أنبوب مير / PEI / MNP-HUVECs مماثلة لخلايا غير المعالجة. والجدير بالذكر، وقد تحقق هذا الانخفاض سمية PEI من خلال تقديم مستويات منخفضة من مكونات مثل أكسيد الحديد، والتي هي حيويا وتستخدم بشكل روتيني كما كاشف التباين في المواد البشرية 40.

وبصرف النظر عن الحفاظ على الخصائص الفنية، من المهم أن الخلايا المعدلة وقادرة على إقامة اتصال بين الخلايا، كما هي هذه الميزة الضرورية لتحقيق التكامل السليم للخلية علاجات ما بعد زراعة 46. وبالإضافة إلى ذلك، وخلايا معدلة يمكن استغلالها كما ناقلة لتسليم مير العلاجية إلى الأنسجة جرح 47. في هذه الحالة، كاباتشي بهمتي واي لتبادل الجزيئات مع الخلايا المجاورة يحدد نجاحها كوسيلة. منذ PEI / MNP ترنسفكأيشن يسمح GJIC في HUVECs تعديل، لديهم القدرة على الاندماج في الجسم الحي، وتقديم تسليم مير إلى المناطق المتضررة.

والجدير بالذكر أن وأفادت الأعمال المنشورة سابقا على مغنطة خلية للاستهداف لاحقا تحميل خلية من ~ 4 و 30 خريج من الحديد / خلية 48، 49، 50، 51. تتجاوز هذه الأرقام بشكل كبير من القيم ~ ،16-،7 الغرام / خلية، والتي كانت كافية لفي المختبر استهداف NA / PEI / MNP-HUVECs في ظروف ديناميكية ثابتة والمحاكاة. هذه المبالغ الحديد المنخفضة هي مفيدة من حيث السلامة: آلية المعروف من أكسيد الحديد سمية المرتبطة جسيمات متناهية الصغر (أي إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)) ومن المعروف أن يرتبط مباشرة مع كمية من الأسواق العالمية ضغطهاrnalized النانوية 40. وبالإضافة إلى ذلك، وقد أثبتت العديد من الدراسات أن مستويات الخلايا عالية من جزيئات أكسيد الحديد يمكن أن يؤدي إلى الفوضى هيكل الخلية تعتمد على الجرعة وتلف 52 و 53. الأهم من ذلك، فإن معظم الحالات المبلغ عنها من مغنطة خلية لاستهداف أغراض لا تشمل معالجة الخلية الوراثية. في المقابل، يوفر ناقل مير / PEI / MNP فرصة لتعديل في وقت واحد الخلايا ولإضافة خصائص مغناطيسية.

ومع ذلك، قد تكون منخفضة MNP تحميل لا يكفي لاستهداف المغناطيسي في بيئة مضطربة مع تدفق الدم. من أجل الاقتراب من صعوبة في وضع الجسم الحي، ومحاكاة الظروف الديناميكية في المختبر: وضعت لوحات الثقافة مع ممغنط مير / PEI / MNP-HUVECs في تعليق على شاكر الدورية 34. هذه التجربة بشكل واضح لا يمكن أن تغطي جميع التفاعلات التي تحدث فيالجسم الحي. ومع ذلك، فإنه أدى إلى فهم أفضل لإمكانية استهداف الخلايا PEI / MNP تعديل. ونتيجة لذلك، وقد تجلى استهداف خلية ذات كفاءة عالية حتى عندما تهز نشط في مستنبت لم تتدخل مع حركة الخلية نحو المغناطيس 54. لهذا الغرض، تم تحميلها HUVECs مير تعديل مع ما لا يقل عن 0.16 ~ خريج من الحديد / الخلية. وعلاوة على ذلك، الخلايا المستجيبة مغناطيسيا يمكن فرزها. إجراء فصل الخلية على أساس المغناطيس تطبيقها على الدراسة الحالية وعدم المساس جدوى / PEI / MNP خلايا مير. الأهم من ذلك، وتطبيق مجال مغناطيسي ثابت (أي استهداف التجارب التي تنطوي على تطبيق مجال مغناطيسي ل12-24 ساعة) لم يكون لها تأثير ضار على الخلايا المستهدفة. ولذلك، فإن إنتاج أظهرت الخلايا المعدلة وراثيا ممغنط يوفر الأساس لمزيد من الدراسات المجراة معالجة كفاءة الاحتفاظ الخلايا التي تكفلها القوة المغناطيسية. والجدير بالذكر، الالبريد أنجح الدراسات المجراة توظيف استهداف خلايا الممغنطة 51، 54، 55 المستخدمة الاحتفاظ الخلية بعد الإدارة المحلية بدلا من توجيه الخلية بعد الحقن في الوريد. لذلك، الاحتفاظ القائم على المغناطيس في موقع الحقن يبدو مرغوبا فيه لمزيد من التطبيقات في الجسم الحي من خلايا مير / PEI / MNP تعديل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا مصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.

Acknowledgments

ونود أن نشكر G. فولدا (مركز المجهر الإلكتروني، جامعة روستوك، ألمانيا) للدعم الفني في الحصول على الصور TEM النانوية مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic تصفيتها وفي إجراء تحليل الأشعة السينية الخاصة بهم. وأيد الأعمال التي تقوم بها في RTC روستوك من قبل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث ألمانيا (FKZ 0312138A، FKZ 316159 وVIP + 03VP00241) والدولة كروا مكلنبورغ الغربية مع الصناديق الهيكلية للاتحاد الأوروبي (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 وكلية العلوم التربوية / IV-BM-B35-0010 / 12) والتي DFG (DA 1296-1)، والرطوبة، مؤسسة، ومؤسسة القلب الألمانية (F / 01/12). وأيد فرانك ويخورست من قبل برنامج أبحاث الاتحاد الأوروبي FP7 "Nanomag" FP7-NMP-2013-الكبيرة-7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Tags

الطب، العدد 123، الخلايا البطانية والهندسة الخلية، ميرنا، polyethyleneimine، النانوية المغناطيسية، والاستهداف، MRI
إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter