Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הכנה Published: May 2, 2017 doi: 10.3791/55567
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

Summary

כתב היד הזה מתאר את משלוח יעיל, שאינו ויראלי של miR לתאי אנדותל ידי וקטור PEI / MNP ו המגנטיזציה שלהם. לכן, בנוסף שינוי גנטי, גישה זו מאפשרת להדרכת תא מגנטית ויכולת גילוי MRI. הטכניקה יכולה לשמש כדי לשפר את המאפיינים של מוצרי תא טיפוליים.

Abstract

נכון להיום, הטיפולים כירורגיים תרופתיים הזמינים עבור מחלות לב וכלי דם (CVD) מוגבלים ולעתים קרובות פליאטיבי. במקביל, טיפולי גני תא הם מאוד גישות חלופיות מבטיחות לטיפול CVD. עם זאת, היישום הקליני הרחב של ריפוי גנטי מוגבל מאוד על ידי חוסר מערכות למסירת הגן מתאימות. ההתפתחות של וקטורים למסירת הגן מתאימים יכולה לספק פתרון לאתגרים נוכחיים טיפול בתא. בפרט, חסרונות קיימים, כגון יעילות מוגבלת ושימור תאי נמוך ב האיבר נפצע, ניתן להתגבר על ידי הנדסת תא מתאימה (כלומר, גנטי) לפני ההשתלה. הפרוטוקול המובא מתאר את השינוי החולף היעיל ובטוח של תאי האנדותל באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים פאראמגנטי polyethyleneimine (PEI / MNP) וקטור משלוח מבוסס. כמו כן, האלגוריתם ושיטות לאפיון תאים מוגדרים. Intracellu המוצלחמסירה של microRNA (miR) לתוך האדם ורידים טבורי תאים אנדותל (HUVECs) הושגה מבלי להשפיע על כדאיות התא, פונקציונליות, או תקשורת בין תאיים. יתר על כן, גישה זו הוכחה לגרום השפעה תפקודית חזקה מיר exogenous הציג. חשוב לציין, היישום של וקטור זה מבוסס MNP מבטיח מגנטיזציה התא, עם אפשרויות נלוות של מיקוד מגנטי לא מעקב פולשני MRI. זה עשוי לספק בסיס מגנטי מונחה, מהונדס גנטית תרפויטים תא שניתן לפקח ללא פולשנית עם MRI.

Introduction

ג'ין וטיפול תא הם כלים רבים עצמה יש פוטנציאל לפתור אתגרים נוכחיים בטיפול CVD. למרות העובדה כי הן הגישות הללו נבדקות כעת בניסויים קליניים, הם עדיין אינם מוכנים ליישום קליני רחב 1. יש לציין, גישה משותפת להתמודדות עם האתגרים של גן לבין טיפול בתא היא לפתח וקטורים למסירת גן רבים תכליתיים מתאימים ליישום קליני. היעדר מערכות למסירת הגן בטוחות ויעילות הוא הדאגה העיקרית של ריפוי גנטי. במקביל, ההנדסה הגנטית של מוצרי הסלולר לפני ההשתלה יכולה להתגבר על האתגרים הרציניים של טיפול בתא, כגון יעילות נמוכה (למשל, בתחום הלב, רק ~ 5% של שיפור תפקודי מושגת פוסט-תאי גזע להשתלת 1 ) ושימור / engraftment עני באתר של פציעה (כלומר, החזקת תא יורד מתחת 5 - 10% בתוך דקות עד שעות POst-יישום, ללא קשר לתוואי ממשל 2, 3, 4).

נכון להיום, וקטורים ויראליים מאוד יעלו מערכות שאינן ויראליות במונחים של יעילות, אשר הביאה היישום הרחב יותר שלהם בניסויים קליניים (~ 67%) 5. עם זאת, כלי רכב ויראלי לשאת בסיכונים חמורים, כגון חיסוני (ואת התגובה הדלקתית שלאחר מכן, עם סיבוכים חמורים), oncogenicity, ומגבלות בגודל של החומר הגנטי הנישא 6. בשל חששות בטיחות אלה לבין העלויות הגבוהות של ייצור וקטור ויראלי, השימוש במערכות הלא-ויראלית עדיף במקרים מסוימים 7, 8. היא מתאימה במיוחד עבור הפרעות הדורשות תיקון גנטי חולף, כגון הביטוי של גורמי גדילה השליטה אנגיוגנזה (למשל, לטיפול CVD) או deliveר"י של חיסונים.

בקבוצה שלנו, מערכת מסירה תוכננה על ידי שילוב מסועף 25-kDa polyethyleneimine (תש"ן) ואת חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (MNP) קשורים יחדיו על ידי האינטראקציה ביוטין- streptavidin 9. וקטור זה הוא כלי פוטנציאלי עבור הנדסה גנטית של תאי, המאפשר המגנטיזציה שלהם סימולטני לפני ההשתלה. זה האחרון מספק בסיס הדרכה / שימור מגנטי, אשר מבטיחה במיוחד בימינו, כמו טכניקות מיקוד מגנטיות מתקדמות מפותח בהצלחה 10. יתר על כן, התא מגנטי תגובה וכתוצאה מכך יש את הפוטנציאל להיות פולשני במעקב דימות בתהודה מגנטית (MRI) או הדמית חלקיקים מגנטית 11, 12.

במקרה של וקטור PEI / MNP, polyamine מבטיח התעבות חומצות גרעין ובכך הגנה מפני גורם משפיל ים, הפנמת וקטור בתאים, ו endosomal להימלט 5. MNPs משלימים את המאפיינים של PEI, לא רק במונחים של הדרכה מגנטי, אלא גם על ידי הפחתת הרעילות 7 הידוע PEI, 13, 14. בעבר, תש"ן / נכסים וקטור MNP הותאמו מבחינת יעילות משלוח (כלומר, pDNA ו מירנה) ובטיחות באמצעות פיברובלסטים ותאי גזע mesenchymal אנושי 15, 16.

בכתב היד הזה, פרוטוקול מפורט על היישום של PEI / MNPs עבור הדור של תאי-modified מירנה מתואר 17. לשם כך, HUVECs משמש ומהווה מודל הוקם עבור אנגיוגנזה במבחנה. הם מאתגר transfect והם רגישים השפעה רעילה 18, 19,התחת = "Xref"> 20. בנוסף, אנו מספקים אלגוריתם להעריך תאים כאלה במבחנה, כולל מיקוד שלהם, תקשורת בין-תאית, וזיהוי MRI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מייתרי טבור אדם בידוד תא התקבלו לאחר לידה מ הודיעו, נשים בריאות שנתנו הסכימו בכתב אל השימוש בחומר זה לצורך המחקר על פי הצהרת הלסינקי. הוועדה האתית של אוניברסיטת רוסטוק אישרה את המחקר הציג (reg. מס '2011 06, ממושכת 23 בספטמבר, 2013).

1. הכנת מתחמי Transfection

  1. Biotinylation של polyethyleneimine (תש"ן).
    1. להתמוסס מסועף PEI במים ultrapure תחת בחישה מגנטית ב 300 - 400 סל"ד עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר (RT) ומוגן מפני אור כדי להשיג פתרון 0.18 מ"מ. אחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס.
    2. מדדו את הריכוז של קבוצות אמינו העיקרי בפתרון שהושג 21, 22.
      1. השתמשו 2% פתרון ריאגנט ninhydrin כמו מגיב לגילוי אמין 23 על ידי ערבוב 100 μL של יחסי ציבורמדגם ediluted (1: 200 עם מים ultrapure) ו 75 μL של מגיב ninhydrin. דגירה של 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס. תֵרָגַע למטה ולהוסיף 100 μL של 50% אתנול עבור ייצוב. מדוד את הספיגה ב 550 ננומטר על ספקטרופוטומטר הקליטה.
      2. צור עקומת סטנדרט באמצעות גליצין.
        1. כן 0.1 M פתרון מניות אמינו-N (0.75 גרם של גליצין 100 מיליליטר של מים ללא יונים) הדילולים שלה, 1: 1, 1: 5, 01:10, 01:20, 01:40, 1:80, 1: 100, 1: 200, ו 1: 400, 1: 600. מדוד פתרונות אלה כמו בשלב 1.1.2.1 וליצור עלילה עם הריכוז ספיג על הצירים.
        2. בהתבסס על העלילה שהושגה ואת ספיגת הנמדד של פתרון PEI, להגדיר את הריכוז של קבוצות אמינו-α ב PEI.
          הערה: זהירות. פתרון ריאגנט Ninhydrin חייב לשמש אך ורק מתחת למכסה המנוע יש לאחסן תחת חנקן אווירה. זה לא שמיש כאשר הצבע של הפתרון משתנה עקב חמצון.
    3. ממיסים 100 מ"ג של והמקשר ביוטין במים ultrapure מיד לפני השימוש כדי להשיג פתרון 0.01 מ"מ. לחשב את הסכום של ביוטין נדרש להוסיף PEI ידי הכפלת הריכוז של קבוצות-אמינו α ב PEI (נמדד צעד 1.1.2) על ידי 20 כדי להשיג את הסכום הדרוש (ב mol) של ריאגנט biotinylating.
      1. מוסיפים את פתרון ביוטין לפתרון PEI ב- pH 8-9 דגירה במשך 16 h תחת בחישה מגנטית ב RT.
    4. הסר את ביוטין unreacted ידי כרומטוגרפיה בגודל הדרה 23. השתמש זמינות מסחרי עמודות המכילות מתאים בינוני ג'ל סינון עבור הטיהור של PEI 25-kDa ובצע את הוראות היצרן. קח aliquots לאחר הטיהור למדוד את הריכוז האמין באמצעות ריאגנט זיהוי אמין (שלב 1.1.2) ולקבוע את יעילות נטיית ביוטין (שלב 1.2.2). אחסן את PEI biotinylated שהושג ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. אופיization של biotinylated PEI.
    1. קבע את הריכוז של קבוצות אמינו-α ב PEI לאחר biotinylation, כפי שמתואר בשלב 1.1.2.
    2. לקבוע את מידת biotinylation PEI לאמת את הליך הנטייה. עבור כימות, להשתמש ערכה זמינה מסחרי, אשר מבוססת על היישום של צבע חבה (4'-hydroxyazobenzene-2-קרבוקסילית חומצה), על מנת להבטיח את נחישות colorimetric הנכונה של רמות biotinylation 24, 25. עקוב אחר ההוראות המופיעות על ידי היצרן.
  3. סינון של MNPs והאפיון שלהם.
    1. מסנן זמין מסחרי streptavidin מצופה MNP דרך פילטר 0.45 מיקרומטר מונחה מזרק 16 כדי להוציא גושים רעילים גדולים. למדוד את ריכוז הברזל הסופי באמצעות assay פוטומטרי תקן 26.
    2. בדוק את איכות MNPs המסונן על ידי הקלטהעקומת המגנטיזציה ועל ידי הדמיה TEM בהתאם פרוטוקולים סטנדרטיים 27, 28.
      1. לדלל את ההשעיה MNP עם מים מזוקקים ומקום 3 μL של ההשעיה המתקבל על רשת נחושת 300-רשת Formvar מצופים פחמן לניתוח TEM. לאחר מכן, למקם רשת זו בשקופית זכוכית על צלחת חימום ולתת לו להתייבש.
      2. לנתח את הדגימה עם מיקרוסקופ אלקטרונים חודר ב 120 ק"ג ולאמת את תוכן היסודות באמצעות גלאי רנטגן 27.
  4. תיוג 3-צבע של מתחמי transfection למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה.
    1. סמן 0.5% מקבוצות אמינו העיקריות נמדדות PEI עם NHS-אסתר Atto 488 צבע בעקבות הוראות היצרן. הסר את צבע מאוגד עודף ידי כרומטוגרפיה בגודל הדרה, כפי שתואר לעיל (שלב 1.1.4). מדדו את הריכוז וכתוצאה של קבוצות אמינו באמצעות אסא ninhydriny (שלב 1.1.2).
    2. תווית הזמינה מסחרי המקושקש Mir (SCR-Mir) עם צבע Cyanine5 באמצעות ערכת תיוג מתאימה 15 (מצוינת רשימת החומרים). למדוד את ריכוז fluorophore מיר וכתוצאה spectrophotometrically.
    3. טרי התווית MNP כל הזמן עם צבע ביוטין מצומדות (למשל, atto 565-ביוטין) בבית 1: 1000 w / פרופורציות. להפעיל ישירות את הצבע לאחר הוספת MNP כדי מיר / PEI במהלך היווצרות של קומפלקסים transfection, לכל הפרטים Delyangina ואח. 16.

2. תא הכנה

  1. בידוד HUVEC.
    1. לבודד תאים מן הטבור מיד לאחר קבלת מיתרי באמצעות עיכול collagenase מן הפנים של וריד טבורי; לעקוב אחרי פרוטוקול בעבר פתח 29.
      1. דגירה כל כבל עם ~ 60 יחידות / מ"ל ​​של פתרון מסוג IV collagenase במאגר - טעון לתוך tהוא וריד הטבור - ב 37 מעלות צלזיוס למשך 13 דקות.
    2. עבור כל הניסויים, לרכז את HUVECs מתוך מינימום של 5 חולים.
      הערה: טיפוח לא יעלה על 4-5 קטעים. אין להשתמש בתאים נגועים עם mycoplasma, כמו זו גורמת לירידה היעילה transfection. זיהום Mycoplasma צריך להיבדק על לפני תחילת פרוטוקול באמצעות ערכת PCR לזיהוי רגיש מאוד של mycoplasmas.
      1. מבחן עבור נוכחות mycoplasma.
        1. צנטריפוגה 1 מ"ל של supernatant תרבית תאים עבור 10 דקות (13,000 XG). להשעות גלולה ב 17 μL של DH 2 O ו לרתיחה (93 מעלות צלזיוס) במשך 3 דקות. השתמש 2 μL של ההשעיה כדי להגביר את אזור DNA כי קודי RNAs ריבוזומלי השמור ביותר (16S-rRNA) של מינים שונים mycoplasma.
        2. בצע את PCR באמצעות 10 pmol של כל צבע יסוד (פריימר קדימה: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; פריימר הפוכה: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') ב מסרקination עם ערכת PCR מסחרית בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 45 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 50 מעלות צלזיוס למשך 30 s, ו 72 מעלות צלזיוס למשך 30 s; וכן רחבה סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
        3. נתח את המוצר PCR (292 נ"ב) באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose.
    3. כך או לאחסן את התאים המתקבלים בטווח ארוך בחנקן נוזלי או תרבות אותם מדיום הצמיחה אנדותל בתוספת 100 U / mL פניצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ב 37 ° C באווירת ed humidi fi המכילה 5% CO 2.
  2. אפיון HUVEC.
    1. איפיון HUVECs מבודד מבחינת היכולת התפקודית שלהם לבנות צינורות במטריצת קרום במרתף (למשל, matrigel) והביטוי שלהם של CD31 סמן אנדותל (מולקולת הדבקה תא האנדותל טסיות, PECAM-1) הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים 30, 31.

3. Transfection

  1. Trypsinize תרבות HUVEC המניות (ראה שלב 4.1.2.) באופן ידני לספור את התאים באמצעות hemocytometer. זרעי HUVECs על צלחות היטב בתרבות תא פלסטיק בגודל מתאים, עם צפיפות תא ההתחלתי של כ 13,000 תאים / סנטימטר 2 של שטח צמיחה, 48 שעות לפני transfection עד מפגש 70-80% הוא הגיע.
  2. כן טרי miR / PEI / MNP מתחמים בכל פעם.
    הערה: ראשית, miR / PEI מתחמים צריכים להתקבל (צעדים 3.2.1 - 3.2.3); לאחר מכן, יש להוסיף MNPs לפתרון miR / PEI (שלב 3.2.4) כדי לקבל את הניסוח miR / PEI / MNP הסופי המשמש transfection (שלב 3.3).
    1. לחשב את הכמות המתאימה הזמינה מסחרי Mir (מקושקש, מתויג או פונקציונלי, ראה שלב 4) באמצעות הריכוז של המנייה שמספקת יצרן. השתמשו 2.5 pmol של miR / ס"מ 2 של משטח צמיחת תאים. לדלל את מיר פתרון גלוקוז 5% ל obtain ריכוז סופי של 0.125 pmol של miR / μL.
    2. בהתבסס על כמות מיר צעד 3.2.1 ואת יחס NP האופטימלי של 25 32, לחשב את הכמות הנדרשת של PEI באמצעות הריכוז הנמדד שלה (שלב 1.1.2). לדלל את PEI (לפי נפח הנדרש מחושב) בנפח שווה של פתרון גלוקוז 5%. מוסיף את PEI מראש המדולל שהושגה לפתרון Mir (משלב 3.2.1) ו מערבולת את התערובת המתקבלת עבור 30 s.
    3. דגירה את תערובת miR / PEI המתקבלת עבור 30 דקות ב RT.
    4. Sonicate MNPs ב 35 kHz עבור לפחות 20 דקות באמבט מים sonicating (ראה רשימת חומרים) ב RT, להוסיף את הכמות המתאימה של פתרון MNP כדי מיר / PEI (5 - 25 מיקרוגרם של ברזל / מ"ל ​​של הכינו miR / PEI / MNP תערובת 16), מערבולת 30 s, דגירה במשך 30 דקות ב RT עד מוכן.
  3. מוסיפים את תערובת dropwise miR / PEI / MNP הכין ישירות המדיום תרבות על התאים. השתמש התערובת המתקבלת של מבוי סתום תאהמדיום ture עם miR / PEI / MNP מדולל גלוקוז כפתרון transfection. החלף תערובת זו עם 6 בינוני תרבות טרי שעות לאחר transfection.

4. ניתוח של בטיחות וקטור

  1. בחינת כדאיות התא.
    1. Transfect HUVECs שנזרעו צלחת תרבות 24-היטב (צעדים 3.1 ו 3.2); Cy3 מיר להשתמש כמו חלליות הבדיקה מקושקשות Mir (SCR מיר) כמו חלליות gating מלאה עבור cytometry הזרימה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירה ed fi humidi המכיל 5% CO 2 עבור 24 h.
    2. איסוף supernatant ותאי טרנספקציה ידי trypsinization באמצעות 1x טריפסין- EDTA מדולל PBS מתווסף תאים עבור 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ולהשתמש לניתוח.
    3. בדוק כדאיות התא ויעילות ספיגת miR 24 שעות לאחר השימוש transfection cytometry זרימה באמצעות החלת כתם זמין מסחרית להבחין בין החיים / תאים מתים; להשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים 15
  2. בחן את הבטיחות של מתחמי miR / PEI / MNP עבור תאי מבחנים תפקודיים.
    1. הערכת פעילות תרבות תאי טרנספקציה.
      1. Transfect HUVECs שנזרעו צלחת תרבות 12-היטב (צעדים 3.1 ו 3.2) עם antisense פונקציונלי Mir (למשל, אנטי-miR92a עבור HUVECs 31) לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירה ed fi humidi המכיל 5% CO 2 עבור 24 h.
      2. השתמש בערכה זמינה מסחרי כדי להגדיר את מספר התאים מתרבים על ידי צביעה עם EDU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) וסריקה עם מיקרוסקופיה confocal מבוסס ליזר. השתמש בהגדרות מיקרוסקופיה הבאות: מטרת 40X עם טבילת שמן; 633 ננומטר לייזר עירור (עבור צבע 647 ננומטר); 5 שדות אקראיים שיירשמו בכל מדגם. חישוב שיעור תאים מתרבים על ידי חלוקת מספר הגרעינים מוכתמים edu במספר הגרעינים הכוללים (Hoechst-צבעוני).
    2. להעריך את היכולת של תאי טרנספקציה להקים מבנים דמויי צינור, כפי שתואר לעיל 17, 31.
      1. Transfect HUVECs שנזרעו צלחת תרבות 24-היטב (צעדים 3.1 ו 3.2) עם SCR מיר דגירה במשך 48 שעות ב 37 ° C באווירה ed fi humidi המכיל 5% CO 2. אוספים את התאים טרנספקציה (כמו בשלב 4.1.1).
      2. זרע 3.5 x 10 4 של HUVECs השונה ב 24 גם צלחות מצופות 140 μL של מטריקס קרום במרתף. דגירה של 18 שעות ב 37 ° C באווירה ed fi humidi המכיל 2 5% CO.
      3. תמונות שיא של 10 שדות אקראיים בכל מיקרוסקופיה confocal סריקת ליזר באמצעות היטב (בניגוד התערבות הפרש) ולנתח באמצעות תוכנת ImageJ עם התוסף "מנתח אנגיוגנזה". כלול פרמטרים כגון האורך הכולל של סניפים, מספר הסניפים, ומספר junctions בהערכה. תשווה את זה קבוצת הביקורת.
  3. בחן את ההשפעה רעילה האפשרית של מתחמי transfection על צומת פער (GJ) בתיווך תקשורת הבינה תאית (GJIC) על ידי בדיקת התאוששות קרינת 3D לאחר photobleaching (FRAP) 33 ב 3D.
    1. זרעי התאים בשקופיות זכוכית מצופה ג'לטין עם תחתית דקה מתאימה Live- תא הדמיה (טבילת שמן). Transfect התאים כמתואר לעיל בשלב 3.2 עם אי שכותרתו, הלא-תפקודית Mir (SCR-Mir) דגירה במשך 24 שעות.
    2. הכן את התאים עבור הדמיה ידי טעינתם עם calcein ישירות לפני במיקרוסקופ. בפרט, להחליף את התרבות הבינונית עם בינוני טרי המכיל 5 מיקרומטר calcein, דגירה של 20 דק ', לשטוף עם PBS, ולהוסיף בינוני תרבות טרי. טרום לחמם החממה של מיקרוסקופ כדי 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ריכוז CO 2 עד 5%.
      הערה: כל ריאגנטים צריך להיות חם כדי למנוע contrac התאtion לפני המדידה.
    3. השתמש לייזר עירור 561 ננומטר עבור להדמיה התא הניסוי FRAP. ראשית, לבחור תאים ידניים למדידה כמו אזורים של עניין (ROI); תאים המבחן צריך להיות לפחות 3 תאים שכנים. גדר תא התייחסות עם קרינה בהירה, יציבה כי לא יהיה מולבנת. הגדר את הגבולות של Z- מחסנית. רשום את הקרינה מהחלק העליון של התאים לחלק התחתון לכלול 10 - 15 שכבות.
    4. להלבין את תאי בדיקה באמצעות 100% כוח הליזר ולהקליט את התאוששות הקרינה הבאה (בשל העברת צבע GJ ספציפית מתאי שכנות) במהלך 15 הדקות הבאות. רשום את הנתונים הגולמיים של Z- ערימות בכל 60 s. בסך הכל, לבצע מדידות FRAP עם לא פחות מ 5 - 10 תאי מבחן לכל ניסוי. השווה את התוצאות לתאי untransfected.

5. בדיקה של יעילות transfection

  1. בדיקת ספיגת מיר.
    1. הכן את הבדיקות כמתוארות step 4.1 ולהשתמש בהם בעת ובעונה אחת כדי להגדיר ספיגת miR עם cytometry הזרימה.
  2. אשר ולתאר את הלוקליזציה התאית של מתחמי transfection על ידי מיקרוסקופ תאורה מובנית confocal ו superresolution (SIM).
    1. זרעי HUVECs על coverslips זכוכית מצופה ג'לטין להציב בארות של צלחות תרבות 24-היטב, כפי שתואר קודם לכן (שלב 3.1). Transfect התאים עם 3-צבע שכותרתו miR / PEI / MNP (שלב 1.4) ו דגירה של 24 שעות ב 37 ° C באווירה ed fi humidi המכיל 5% CO 2.
    2. שטפו את coverslips הראשון עם אלבומין 2% שור (BSA) ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) ולאחר מכן עם רק PBS. תקן תאים על ידי דוגרי 4% paraformaldehyde (PFA) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות גרעינים כתמים עם DAPI הבא פרוטוקולים סטנדרטיים 16. לשטוף 3 פעמים על שייקר (15 דקות כל אחד) כדי להסיר עודפי צבע.
      הערה: PFA הרסני חייב להיות מטופל בזהירות.
    3. מניחים את יח"צcoverslips epared על מיקרוסקופ שקופיות באמצעות הרכבה בינונית מתאים, ולתת להתייבש להם לפחות 1 h, ולהשתמש בהם במיקרוסקופ, כמתואר להלן.
    4. לרכוש תמונות באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 63X ואת הגדרות ה- SIM הבאים: 405-, 488-, 561-, וקווי לייזר 633 ננומטר עבור עירור; Z- מחסנית במצב עם עומק 32 סיביות ב- 5 זוויות, 5 שלבים, עם ממוצע של 4; רשת G2 עם קו לייזר 405, G3 עם 488, G4 עם 561, ו G5 עם 633.
  3. להעריך את התפקוד של מיר מועברים על ידי RT-qPCR מיר / PEI / MNP-HUVECs מול מטופל.
    1. Transfect HUVECs שנזרע צעדי צלחת תרבות 12-היטב (3.1 ו 3.2) עם miR antisense התפקודית (למשל, אנטי-miR92a עבור HUVECs 31) דגירה במשך 48 שעות ב 37 ° C באווירת ed fi humidi המכילה 5% CO 2.
    2. הערכת המשלוח והעיבוד אנטי miR92a עם RT-qPCR באמצעות ערכות זמינות מסחרי (ראה חומרים); בצע tהוא הוראות היצרן, כמתואר במקום אחר 17, 31. במקביל, בוחנים את הביטוי של גן המטרה (למשל, ITGA5 31).
      הערה: AntagomiR משלוח נגד אנדוגניים miR עדיף על מחקה שכן הוא מבטיח למדידת התוצאה בפועל של מיר ולא רק ההצטברות התאית שלה.

6. תא מיקוד ערכת הפרדת Cell מגנטי

  1. תא מיקוד בתנאים סטטיים במבחנה.
    1. Transfect HUVECs בתוך צלחת 24-היטב (2.5 pmol / ס"מ 2 SCR-מיר, 25 NP, ו 15-25 מיקרוגרם / מ"ל MNP), דגירה של 24 שעות, לשטוף, ולאסוף כפי שתואר לעיל (שלב 4).
    2. מערבבים את התא גלולה המתקבל 1 היטב עם 1 מ"ל של מדיום תרבות טריים ולמקם אותו בבארות של צלחת 12-היטב. תקן מגנט קטן מקומי (בצד) בתחתית הצלחת באמצעות קלטת.
    3. לדגור על השעיית התא עבור 24 h ולבחון את הקובץ המצורף תא וצמיחה בתחום מעל המגנט באזור ללא מגנט. לקבלת הערכה איכותני, השתמש במיקרוסקופ קונבנציונלי הפוך.
  2. תא מיקוד בתנאים דינאמיים מדומים במבחנה.
    1. Transfect HUVECs בתוך צלחת 24-היטב לכל צעדים 3.1 ו 3.2 (2.5 pmol / ס"מ 2 Cy3-מיר, 25 NP, ו 15 - 25 מיקרוגרם / מ"ל MNP), דגירה של 24 שעות, לשטוף, ולאסוף ידי trypsinization באמצעות 1x טריפסין-EDTA מדולל PBS מתווסף תאים עבור 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה XG 300 10 דקות.
    2. מערבבים את התא גלולה המתקבל 1 היטב עם 1 מ"ל של מדיום תרבות טריים למקם אותו גם צלחת 12-היטב. תקן מגנט קטן מקומי (בצד של באר) באמצעות קלטת. מניח את צלחת התרבות על שייקר דגירת השעית התא עבור 12 שעות ב 150 סל"ד לדמות 34 תנאים דינמיים.
    3. שוטפים את התאים ולתקןאותם באמצעות 4% PFA. כתם הגרעינים עם DAPI 16. הקלט את הקובץ המצורף תא באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר עם לייזר עירור 514 ננומטר, מצב Z- מחסנית (5 - 12 פרוסות) כדי להשיג את הנתונים הגולמיים, ועיבוד תמונה הקרנת העוצמה המרבית כדי ליצור תמונות עבור ניתוח.
  3. ניתוח כמותי של תאי מגיבים ושאינם מגיבים מגנטיים.
    1. Transfect HUVECs בתוך צלחת 24-היטב (2.5 pmol / ס"מ 2 SCR-מיר, 25 NP, ו 15-25 מיקרוגרם / מ"ל MNP), דגירה של 24 שעות, לשטוף, ולאסוף כפי שתואר קודם לכן (שלב 6.2.1) . חיץ טרום חם מיון PBS והתא (מעוקר על ידי סינון, לראות את רשימת החומרים) כדי 37 מעלות צלזיוס. Re- להשעות את התא גלולה המתקבל מכל טוב עם 500 μL של חיץ מיון התא.
    2. החל השעית תא זה על עמודות מיון מגנטי קבועות על ידי המגנט המסופק, לשטוף את העמודות על המגנט 3 פעמים עם חיץ מיון תא טרי, ולאסוף את הזרימה דרך כמו המגנטיםשבריר להגיב קאלי (MAG-).
    3. הסר את העמודות מן המגנט ומייד לאסוף את שבר תא המגיב המגנטי (mag +) על ידי דחיפת חיץ מיון תא טרי דרך העמודה באמצעות בוכנה.
    4. צנטריפוגה שניהם + MAG- ו MAG XG 300 10 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב PBS, לספור את התאים, ולהעריך כדאיות התא עם assay הרחקה כחול Trypan 35. השתמש גלולת התא להשיג גם עבור ניתוח ארוך טווח (כלומר, מחדש זרע ולהעריך לאחר 24, 48, ו -72 שעות בתרבות 17) או ישירות עבור cytometry זרימה (שלב 4.1.).
  4. הגדר את טעינת הברזל של תאי transfected.
    הערה: במהלך ההכנה, כל מגע של חלליות התא עם חומרי תחמוצת ברזל ומכשירים יש להימנע.
    1. אסוף את HUVECs טרנספקציה ובקרה untransfected (כמו בשלב 4.1.1). שוטפים את התאים שנאספו פעמיים BSA 2% ב ב 36 PBS y ערבוב התאים בזהירות עם 1 מ"ל של חיץ הכביסה הזה ואז צנטריפוגה XG 300 10 דקות. Re- להשעות את התא גלול שהושג 250 μL של PBS, להוסיף 100 μL של 4% PFA, דגירה במשך 20 דקות כדי לתקן תאים. לשטוף 3 פעמים עם PBS, כפי שתואר לעיל.
    2. Re- להשעות את התא גלולה קבוע וכתוצאה מכך 110 μL של PBS ולהעביר אותו 100-μL צינורות PCR.
      1. קח aliquots 10-μL עבור ספירת תאים ולהשתמש המדגם שנותר ספקטרוסקופיה חלקיקים מגנטי (MPS).
    3. בצע את המדידה במכשיר MPS זמין מסחרי. במהלך המדידה, ולהחיל את ההגדרות הבאות: כונן B שדה מגנטי = 25 MT ו התדירות f 0 = 25 kHz. עבור כימות ברזל של הדגימות, לנרמל א 3 הרמונית השלישית של ספקטרום MPS אל המקביל ב -3, הנ"צ של מדגם התייחסות MNP עם כמות ברזל ידועה של 2.1 מיקרוגרםXref "> 37. השתמשו בתאים שלא טופלו כפי שולטת.

7. מגבלות זיהוי MRI הגדרת

  1. תא כנה.
    1. זרע HUVECs בתוך צלחת 6-היטב transfect (2.5 pmol / ס"מ 2 SCR-מיר, 25 NP, ו 15 - 25 מיקרוגרם / מ"ל MNP) ב כפילויות או triplicates בהתאם את הכמות הנדרשת של תאים (עבור הכנת פאנטום). דגירת התאים למשך 24 שעות ולאחר לשטוף, לאסוף, ולתקן אותם עם 4% PFA, כפי שתואר קודם לכן (שלב 4).
    2. ספירת התאים המתקבלים, להכין aliquots עם מספרים סלולריים מתאימים (למשל, 10 3, 10 4, 10 5, וכו '), ולהתאים את עוצמת הקול שלהם כדי 50 μL.
  2. הכנה פאנטום Agarose
    1. הכן מספר שכבות של agarose 2% ב 50 מ"ל צינורות עם כמויות שונות של תאים transfected משובצים בין שכבות 38. במהלך ההכנה, sonicate צנטריפוגות agarose החם 38 ללהרוס בועות אוויר שגורמים חפצים.
      הערה: חשוב לציין, רוחות רפאים המכילים 5.5 x 10 5 HUVECs טופל בתרופות נוגדות-מגנטי מתחמי miR / PEI צריכות להיות מוכנות באותו אופן לשמש שולטת.
  3. לסרוק את שהושגו הפנטומים במבחנה עם מערכת חיה MRI 7.1 T לאחר הצבת פאנטום מרכזי סליל, מקביל לציר z של השדה המגנטי.
    1. החל פרמטרי הרצף הבאים עבור רכישת רצף שיפוע-הד: TR = 66 ms; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01 ms; זווית להעיף = 3 °; מטריקס = 128 × 128, אינטרפולציה כדי 256 x 256; שדה ראייה = 42 מ"מ; 100%; ממוצעים = 1, אורך רכבת הד = 1; עובי פרוס = 1.5 מ"מ; ו 16 פרוסות.
    2. להעריך את ריקבון האות של כל ארבע פעמים הד ולחשב מפות * R2 (R2 * = 1 / T2 *) באמצעות תוכנה מתאימה, כפי שתואר במקום אחר 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המטרה העיקרית של הפרוטוקול המוצע היא לייצר מגנטי תגובת תאי miR-modified וכדי לנהל האפיון המדויק שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, תאי transfected ביעילות, מגיבים בחירה מגנטית והדרכה לזיהוי באמצעות MRI, יש לקבל.

ראשית, את זהותם של HUVECs מבודד אושרו על ידי מכתים טיפוסי עם CD31 סמן אנדותל (PECAM) (איור 2 א) ועל ידי היכולת שלהם ליצור צינורות על מטריצה הממברנה במרתף המתאים (איור 2B). התאים המתקבלים לקחו את מיר הציג ידי התש / MNP מאוד יעיל; מיקרוסקופיה הוכיח כי כל התאים היו חיוביות עבור אות של miR מתויג (Cy3) 24 שעות לאחר transfection (איור 3A). חשוב לציין, לא מוות של תאים נרשם בהשוואה לתאים שלא טופלו (איור 3B), ו nמראה ormal נשמר (איור 3 א). כפי שנצפה עם מיקרוסקופ סורק לייזר confocal, אות של Cy3 מיר היה ממוקם בעיקר בתוך התאים. יתר על כן, חקירה מפורטת יותר של הלוקליזציה התאית של כל חלקי וקטור transfection ומיר בוצעה עם רזולוציה גבוהה יותר באמצעות 3-צבע מתחמים שכותרתו. אותות ה- SIM, מיר, תש"ן, ועל MNP כל התגלו בציטופלסמה באזור perinuclear (איור 3 ג).

יתר על כן, בתחקיר מפורט של בטיחות וקטור transfection הוכיח כי miR / PEI / MNP-HUVECs מסוגל להרכיב צינורות על המטריצה הממברנה במרתף המתאימה וכי הרשת המתקבלת היא דומה לזו של תאי מטופל לשמש כביקורת חיובית (האיור 4A ). יתר על כן, תאי transfected מתוחזק GJIC, כמו ניסויי 3D-FRAP גילו. בפרט, כאשר תאים נטענים עם GJ-permea פלורסנטצבע ble ואחד מהם הוא מחומצן, הקרינה שלה משחזרת עקב התקשורת עם תאי שכנים והעביר צבע וכתוצאה מכך (איור 4 ב).

חשוב לציין, עקב הימצאותם של (איור 5 א) פאראמגנטי 40 במתחם, תש"ן / MNP היישום מאפשר לא transfection התא בלבד, אלא גם את המגנטיזציה סימולטני. הסכום שהתקבל ברזל תאיים נמדדה באמצעות MPS (איור 5) עבור כל ריכוזי MNP ליישם בטווח האופטימלי (2.5 pmol / ס"מ 2 miR; NP 25 השלים עם 5-25 מיקרוגרם / מ"ל MNP): 0.37 ± .079 כדי .7 ± 0.150 pg ברזל / תא 17. ככל ששימוש עמודות הפרדה מגנטיות הפגין, לכל אלה ריכוזי MNP, כמות התאי מגנטי תגובה בהיקף הכולל של תאי transfected היא ~ 70% (איור 5 ג). בנוסף, טרנספקציה HUVECs גלוי עם (5D איור) MRI בתוך במבחנת פנטומי agarose, מחק את רגישות רקמות עכבר. יתר על כן, המיקוד המגנטי של HUVECs טרנספקציה בתנאים דינאמיים המדומים במבחנה הוכח להיות יעיל (איור 6). ב התקנה זה הניסיון, אפילו בתנועה הנמרצת המתמדת של מדיום התרבות לא מנעה רווחת צמיחת תאים באזור קרוב יישום מגנט.

איור 1
איור 1. איור סכמטי של הפקה של ממוגנטים miR-modified HUVECs וניתוחן. פיי / MNP (polyethyleneimine / פאראמגנטי וקטור ננו-חלקיקים מבוססים) מוחלת לספק microRNA (Mir) לתאי אנדותל וריד אדם טבור (HUVECs). המוצר התא המתקבל מאופיין את הפרמטרים הבאים: בטיחות (כדאיות התא כולל, פונקציונליity, ויכולת תקשורת בין-תאית); יעילות transfection (כלומר, יעילות ספיגה מיר הפונקציונלית לאחר מכן); מגנטי מיקוד במבחנה בתנאים דינאמיים סטטי מדומה; הדמיה בתהודה מגנטית זיהוי (MRI). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אפיון מבודד HUVEC. תמונת נציג א של HUVECs המבודד והמתורבת מוכתם סמן CD31 האנדותל. הגרעינים הם counterstained עם DAPI (כחול). בר הסולם הוא 20 מיקרומטר. B. נציג תוצאה של assay היווצרות צינור שבוצעו על HUVECs מבודד; התמונה נרשמה באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר (שאר הפרשבניגוד ference) 18 שעות לאחר זריעת תאים על מטריצה ​​הממברנה במרתף. בר סולם הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
משלוח איור 3. מיר HUVECs באמצעות PEI / MNP. ספיגת א של miR מתויג (Cy3, אדום) 24 שעות לאחר transfection (2.5 pmol / ס"מ 2 של Cy3-tagged מיר, NP 25 ו MNP 25 מיקרוגרם / מ"ל) ואת התחזוקה של המראה בתא נורמלי מומחשים. תמונות צולמו על ידי מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה באמצעות לייזר עירור 514 ננומטר (Cy3, אדום) ואת התערבות ההפרש לעומת. בר הסולם הוא 50 מיקרומטר. תא הכדאיות ב 24 שעות לאחר transfection הוערכה על ידי cytometry הזרימה. העלילה מייצגת את התוצאות שהתקבלו עבור HUVECs שטופלו קומפוזיציות מורכבות הבאים: 2.5 pmol / ס"מ 2 של Cy3 מיר; 25 היחס NP השלים עם 5 עד 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של MNPs. הברים מתארים את היחס בין מספר הממוצע של תאי קיימא לבין אוכלוסיית התא כולו (n = 6; ברי שגיאה: SEM). ג מיקרוסקופיה תאורה מובנים (SIM) הדמיה של 3-צבע שכותרתו miR / PEI / מתחמי MNP נלקח על ידי HUVECs. התאים היו transfected כמתואר לעיל, וטופח, ותוקנו 24 שעות לאחר טיפול; את הגרעינים היו counterstained עם DAPI. נתוני SIM הגלם נרשמו Z- ערימות ומעובד; התמונות נציג הן תוצאה של הקרנת העוצמה המרבית. לייזרים עירור יושמו: 405 ננומטר (DAPI, כחול), 488 ננומטר (Atto488-PEI, כתום), 565 ננומטר (Atto565-MNP, ציאן), ו 633 ננומטר (Cy5-מיר, אדום). בר הסולם הוא 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. הבטיחות של שינוי HUVECs עם miR / PEI / MNP. א Assay היווצרות צינור בוצע עם תאים transfected (2.5 pmol / cm 2 של scr-miR, NP 25 ו MNP 25 מיקרוגרם / מ"ל) 48 שעות לאחר הטיפול. תמונות נרכשו עם מיקרוסקופ לייזר סריקה confocal ( כלומר, הפרעה הפרש בניגוד) 18 שעות לאחר זריעת תאים על המטריצה ​​במרתף במרתף. HUVECs transfected עם miR / PEI שימשו בקרת רעילות תאים מטופלים כמו שליטה חיובית. סרגל סולם הוא 100 מיקרומטר. העלילה משקפת את היחס בין HUVECs transfected לבין תאים מטופלים באמצעות מספר פרמטרים: אורך צינור, מספר סניפים, וצמתים (n = 3, סורגים שגיאה: SEM). ב צומת הפער בתיווך תקשורת בין תאיים של MIR / PEI / MNP-HUVECs שונה הוערך 24 שעות שלאחר transfection. לשם כך, תאים הועמסו עם calcein צבע GJ-חדיר (כתום); התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) נבדקה 3D ידי סריקת תאים מבחן Z- ערימות. נציג תמונות של תאים טעונים calcein לפני ההלבנה, מייד לאחר ההלבנה, ו 15 דקות הלבנת פוסט (עם קרינה התאוששה) מתוארות. בר הסולם הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. תא המגנטיזציה הנובע Transfection עם PEI / MNP ותחולתו. תמונת נציג א של MNPs המסונן, נלקחה עם TEM, הממחישות המורפולוגיה באשכולות שלהם. גודל קטן (~ 5 - 15 ננומטר) של חלקיקי תחמוצת ברזל אחד (וכתוצאה מכך פאראמגנטיות על) הוא בכךמְאוּשָׁר. בר הסולם הוא 100 ננומטר. ב טעינת תאיים של תאי transfected הוערכה על ידי ספקטרוסקופיה חלקיקים מגנטי (MPS) 24 שעות לאחר transfection. הפאנל נציג מתאר את ספקטרום MPS של דגימות שנבדקו. בפרט, השעית MNP טהורה (50 μL) שמשה כנקודת התייחסות (ריבועים כחולים); המעגלים הם ספקטרה MPS של שתי דגימות תאים טרנספקציה (עיגולים אדומים: MNP 25 מיקרוגרם / מ"ל; עיגולים ירוקים: MNP 5 מיקרוגרם / מ"ל), בעוד משולשים אפורים להראות הספקטרום רקע זוהה מתקבל על ידי מדידה ללא כל דגימה. הערת סולם הלוגריתמים של משרעת (א). ג כמות תאים מהונדסים מגנטית היה לכמת על ידי יישום של HUVECs טרנספקציה (2.5 pmol / ס"מ 2 miR; NP 25 השלים עם 5-25 מיקרוגרם / מ"ל של MNP), שנאספו על ידי trypsinization 24 h שלאחר הטיפול, על מגנטי טור הפרדה התא. השבר מגנטי החיובי וכתוצאה מכך (כלומר, כי נותר בטור)ייספר, ושיעורו מתוך הסכום כולו של תאי transfected משתקף על העלילה לכל ריכוז MNP (משולש אדום). כדאיויות תא נבדקו לאחר מכן על ידי assay הרחקה הכחול Trypan (מעוינים אפורים). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). ד תמונה MRI המחשה של טרנספקציה HUVECs (300,000 תאים; 2.5 pmol / ס"מ 2 miR; NP 25 & 25 מיקרוגרם / מ"ל של MNP) מוטבע לתוך פאנטום agarose נרשמה עם מערכת חיה MRI 7.1 T. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. מיקוד מגנטי חוץ גופית של miR / PEI / MNP-HUVECs בתנאי סימולציה דינמית. HUVECs נאספו 24 שעות לאחר transfectיון (2.5 pmol / ס"מ 2 של Cy3 מיר; NP 25 & MNP 25 מיקרוגרם / מ"ל) מחדש זרע בינוני תרבות טרי בארות, עם מגנט קטן מקומיות המחוברות אל הקיר בצד. בתורו, צלחת תרבות זו הייתה מחוברת היטב שייקר מסתובבת בבית 150 סל"ד. מצורף וצמיחה Cell הוערכו 12 h מאוחר יותר על ידי תיקון התאים עם PFA, מכתים גרעינים עם DAPI, וביצוע מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (לייזרים עירור: 405 ננומטר, DAPI, כחול; 514 ננומטר, Cy3, כתום). נציג תמונות מתארות צמיחת תאים באזור עם יישום מגנט; ללא יישום מגנט; ו במרכז התרבות היטב, שבו זרימת הנוזל היה ריכוז התאים. ברי המידה הם 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

את ייצור תאי מהונדסים גנטית עמוסה חלקיקים פאראמגנטי לקבלת הנחיות נוספות מגנטית נשלטת שלהם מוצג בפרוטוקול הנוכחי. היישום המוצלח של אסטרטגיה זו מאפשר לפתרון קשיים מסוימים של טיפול בתא, כגון החזקה נמוכה engraftment העני באזור נפצע 2, 3, 4, על ידי מתן מוצר תא למקד אליו להשתלה. יתר על כן, כניסתה סימולטני של חומר גנטי שנבחר כראוי יכולה לקדם מאפייני תא ובכך יכולה להגדיל יתרונות פונקציונליים 41.

הפרוטוקול הנוכחי פותח על HUVECs כמודל. תאים אלה ידועים להיות קשה transfect ו להשפעה רעילה 18, 19, 20. demרמת onstrated של ספיגת miR-שכותרתו fluorophore מעל 95% לאחר transfection PEI / MNP מתקבלת בדרך כלל עם וקטורים מבוססים PEI ו נפוצה ריאגנטים transfection שומנים מבוססים קטיוני (למשל, Lipofectamine) 42. בנוסף, יחס NP האופטימלי של 25 תואם ערכים שפורסמו בעבר של 20 - 40 עבור NP. אף על פי כן, הספיג היעיל ביותר של בעלי התיוג fluorophore נבדקה miR אינו מבטיח בהכרח עיבוד miR נאות ותפקוד לאחר לידת 43. נקודה זו רלוונטית במיוחד במקרה של PEI, עם התעבות אלקטרוסטטית ההדוקה של NA. לפיכך, היכולת התפקודית הנובעת ממנו נמסר miR חייבת גם להיבדק. כאן, miR פונקציונלי הביע באופן אנדוגני ב HUVEC, miR-92A 31, נבחרה, ואנטי-Mir נגדה נמסרה באמצעות PEI ותש / MNP. כתוצאה מכך, מציאה כמעט מוחלטת של יעד miR-92A הוכיח לשחרור יעיל של אנטי-Mir FROM מתחמי transfection.

חשוב לציין, בעבודות קודמות, היישום המוצלח של וקטור PEI / MNP הודגם עבור המשלוח של DNA פלסמיד (pDNA) ומיר סוגי תאים אחרים, הוא חסיד (למשל, cos7, המזנכימה אדם בתאי גזע 15, 16) ו ב ההשעיה (למשל, CD133 מח-העצם נגזר + בתאי גזע hematopoietic 44). כל הניסויים הללו אשרו את העובדה הידועה כי יעילות transfection והרעילה הן סוג תלוי תא 45. לכן, הבחירה של רכב הווקטור האופטימלי (כלומר, סכום מיר, יחס NP, וכמות ברזל MNP) צריכה להתבצע לכל סוג תא מסוים, באמצעות תנאים אופטימליים הוקמו בעבר כנקודות התייחסות.

יתר על כן, את האופי הזמני של ההנדסה הגנטית המושגת יטופל. מצד אחד, אניT מתאים מאוד לתפקוד מסוים, כגון משלוח לטווח קצר של גורמי גדילה. מאידך גיסא, משך הביטוי לא ימשך זמן רב מספיק למגוון מטרות הדורשות ביטוי לטווח ארוך. עם זאת, הבטיחות המוכחת של וקטור ה- PEI / MNP תומכת ביכולת ניהול חוזרת על עצמה, לאחר שהתנאים יעברו אופטימיזציה נוספת.

PEI ונגזרותיו משמשים בדרך כלל בשל היעילות הגבוהה שלהם בהשוואה לכלי רכב אחרים שאינם ויראליים והגמישות שלהם לשינוי. עם זאת, למרות ההצלחה PEI במבחנה ו in vivo , היישום שלה בניסויים קליניים הוא מוגבל מאוד ( כלומר, שלב 1 ו 2 ניסויים או חולי סרטן) 7 , 14 עקב רעילות PEI 7 , 13 . כמו עבודות קודמות של הקבוצה 16 שלנו, כמו גם זה פרוטוקול, הוכיחו, MNPsמסוגלים להקטין רעילות PEI משמעותית. בפרט, transfection miR / PEI פגע ביכולת של HUVECs ליצור צינורות על המטריצה שלהם, ובכך נכשל תקלה בצינור במבחנת מבחן פונקציונלי עבור תאים אלה. לעומת זאת, ביצועי היווצרות צינור של miR / PEI / MNP-HUVECs היו דומים בתאים שלא טופלו. יש לציין, ירידה זו של רעילות PEI הושג על ידי החדרת רמות נמוכות של רכיבים כגון תחמוצת ברזל, אשר ביולוגית בשימוש שגרתי כמו ריאגנט בניגוד בבני אדם 40.

מלבד שמירה על תכונות פעילות, חשוב כי תאים מהונדסים מסוגלים להקים תקשורת בין תאית, כמו תכונה זו היא הכרחית עבור האינטגרציה הנכונה של 46 לאחר השתלת תרופות תא. בנוסף, תאים מהונדסים ניתן לנצל כנישאים עבור המשלוח של miR הטיפולית רקמות פגועות 47. במקרה זה, הנפחים שלהםטאי להחליף מולקולות עם תאים שכנים מגדיר הצלחה שלהם ככלי. מאז תש"ן / MNP transfection מאפשר GJIC ב HUVECs שונה, יש להם את הפוטנציאל לשילוב in vivo ולספק משלוח miR לאזורים שנפגעו.

יש לציין, עבודות שפורסמו בעבר על המגנטיזציה התא לצורך מיקוד בהמשך דיווחו על עומס תא של ~ 4 ו 30 pg של ברזל / תא 48, 49, 50, 51. מספרים אלה חורגים משמעותיים בערכים ~ 0.16-0.7 pg / תא, אשר הספיק עבור במבחנת המיקוד של NA / PEI / MNP-HUVECs בתנאים דינאמיים סטטי מדומה. כמויות נמוכות ברזל כאלה הם מועילים מבחינת בטיחות: מנגנון הידוע בכינויו של רעילות הקשורים ננו-חלקיקים תחמוצת ברזל (כלומר, את הייצור של מינים ROS (reactive oxygen)) הוא ידוע כקשור ישירות עם סכום של internalized חלקיקים 40. בנוסף, מספר מחקרים הראו כי רמות תאיים גבוהות של חלקיקי תחמוצת ברזל יכולות להוביל לחוסר ארגון cytoskeletal תלוי מינון וניזק 52, 53. חשוב לציין, רוב המקרים מדווחים של המגנטיזציה תא למטרות מיקוד אינו כולל מניפולצית תא גנטית. לעומת זאת, וקטור miR / PEI / MNP מספק הזדמנות לשנות תאים בו זמנית כדי להוסיף תכונות מגנטיות.

עם זאת, טוען MNP נמוך עלול להיות לא מספיק עבור מגנטי מיקוד בסביבה סוערת עם זרימת הדם. כדי להתקרב אל המאתגר במצב vivo, בתנאים דינאמיים היו מדומים במבחנה: צלחות תרבות עם miR הממוגנט / PEI / MNP-HUVECs השעיה הונחו על שייקר מסתובב 34. ניסוי זה בבירור לא יכול לכסות את כל האינטראקציות המתרחשותvivo. עם זאת, זה הוביל להבנה טובה יותר של פוטנציאל המיקוד של PEI / תאי MNP-modified. כתוצאה מכך, מיקוד תא היעיל ביותר הודגם כאשר אפילו לחיצה פעילה של מדיום התרבות לא להפריע לתנועת תא לכיוון המגנט 54. לשם כך, HUVECs-modified מיר היו עמוס לפחות ~ 0.16 pg של ברזל / תא. ניתן למיין יתר על כן, מגנטי תאים מגיבים. הליך הפרדת תא מבוסס מגנט להחיל את המחקר הנוכחי לא נפגע יכולת הקיום של התאים-MNP miR / PEI /. חשוב לציין, היישום של שדה מגנטי סטטי (כלומר, מיקוד ניסויים מעורבים ביישום של שדה מגנטי במשך 12 - 24 שעות) לא הייתה השפעה מזיקה על תאים ממוקדים. לכן, ההפקה הפגינה תאים ממוגנטים מהונדסים גנטי מספקת את הבסיס נוסף במחקרי vivo פונים היעילות של שימור התא הבטיח בכוח מגנטי. יש לציין, הדואר המצליח ביותר במחקרי vivo המעסיקים את המיקוד של תאים ממוגנטים 51, 54, 55 שימור תא משומש לאחר ממשל מקומי במקום הדרכת תא לאחר הזרקה תוך ורידית. לכן, שימור מבוסס מגנט באתר של הזרקה מופיע רצוי נוסף ביישומי vivo של miR / PEI / תאי MNP-modified.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו שום אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות ג פולדה (מרכז מיקרוסקופי אלקטרונים, רוסטוק אונ', גרמניה) עבור התמיכה הטכנית ברכישת תמונות TEM של חלקיקים פאראמגנטי מסוננים בביצוע ניתוח רנטגן שלהם. העבודה מתבצעת על רוסטוק RTC נתמכה על ידי המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר גרמניה (FKZ 0312138A, FKZ 316,159 ו VIP + 03VP00241) ואת פומרניה מדינת מקלנבורג-מערב עם הקרנות המבניות של האיחוד האירופי (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 ו ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) ועל ידי DFG (DA 1296-1), ורטיבות-קרן, וקרן הלב גרמנית (F / 01/12). פרנק Wiekhorst נתמכה על ידי תוכנית המחקר FP7 האיחוד האירופי "Nanomag" FP7-NMP-2013-גדול 7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  3. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
  4. Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  5. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
  6. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
  7. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
  8. Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  9. Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
  10. Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
  11. Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
  12. Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
  13. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
  14. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
  15. Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  16. Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
  17. Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
  18. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  19. Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
  20. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  21. Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
  22. Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
  23. Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
  24. Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
  25. Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
  26. Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
  27. Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
  28. Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
  29. Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
  30. Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
  31. Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
  32. Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
  33. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  34. Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
  35. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
  36. Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
  37. Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
  38. Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
  39. Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
  40. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
  41. Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
  42. Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
  43. Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
  44. Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
  45. Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
  46. Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
  47. Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
  48. Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
  49. Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
  50. Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
  51. Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
  52. Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
  53. Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
  54. Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  55. Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).

Tags

לרפואה גיליון 123 תאי אנדותל הנדסת תא מירנה polyethyleneimine חלקיקים מגנטיים מיקוד MRI
הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, … More

Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter