Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

doi: 10.3791/55575 Published: April 27, 2017

Summary

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Abstract

fare embriyosu veya embriyonik kök hücrelerin (mESCs) gen mühendisliği bir proteinin fonksiyonunun çalışması için izin verir. Proteinler hücrenin workhorses ve genellikle translasyon sonrası modifikasyonlar ile etkilenebilir, birçok fonksiyonel bölgeye oluşmaktadır. koşullu veya kurucu knock-out (KO) farelerde tüm proteinin azalması dikkate bu işlevsel çeşitliliği ve düzenleme almaz. Bir Mesc hattı ve FLPe rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) için bir yanaşma Alanı ROSA26 (R26) bölgesi içinde yer alan içine yerleştirildiği bir türetilen fare modeli, daha önce bildirilmiştir. Burada, çok alanlı bir proteinin farklı işlevleri moleküler diseksiyon için izin veren bir yapı-fonksiyon yaklaşımı hakkında rapor. Bu amaçla, RMCE uyumlu farelere KO fareleri çapraz olması ve daha sonra RMCE uyumlu KO mESCs izole edilmelidir. Daha sonra, farazi kurtarma yapılarının bir paneli RMCE targeti ile R26 lokusu içine sokulabilirng. Aday kurtarma cDNA'lar kolayca rekombinasyon klonlama kullanarak hedefleme vektörünün RMCE siteler arasında eklenebilir. Daha sonra, KO mESCs bir FLPe yeniden bağlayıcı ifade plazmidi ile kombinasyon halinde Hedefleme vektörü ile transfekte edilmiştir. RMCE ROSA26 yerleştirme siteleri promotör-az neomisin direnç genini yeniden etkinleştirir ve doğru hedefleme olayı seçilmesine izin verir. Bu şekilde,% 100'e yakın yüksek hedefleme verimleri yarı yüksek verimli bir şekilde çok sayıda farazi kurtarma yapıları sokulması için izin elde edilir. Son olarak, R26 odaklı kurtarma yapılarının çok sayıda ebeveyn KO mESCs gözlendi fenotipi kurtarmak etme kabiliyetleri açısından test edilebilir. Bu p120 katenin (p120ctn), fenotipik okuma olarak embriyoit organları (EBS) endoderm farklılaşmasını kullanılarak KO mESCs bir kanıt-temel yapı-fonksiyon çalışma sunulmaktadır. Bu yaklaşım önemli etki alanlarının belirlenmesini, varsayılan alt yolları ve hastalıkla ilişki noktasını sağlayanBelirli bir protein için KO fenotipleri altında yatan mutasyonlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Memeli genomları yaklaşık 20,000 protein kodlama genleri ihtiva olduğu tahmin edilmektedir. Alternatif yapıştırma ve translasyon sonrası modifikasyonlar, protein repertuarı arttırır. Proteinler, modüler bir yapıya 1 ve genellikle farklı protein kompleksleri halinde kendi işe ve birden fazla hücresel süreçleri 2 katılımlarını izin birden fazla etkileşim bölgeleri içerir. Bir örnek p120ctn adlandırılan, çok fonksiyonlu bir proteindir. p120ctn Ctnnd1 geni tarafından kodlanan ve bir N-terminal ve C-terminal bölgesi tarafından kuşatılır geniş bir merkezi armadillonun tekrar alanı oluşur. p120ctn bir armadillonun alan, hücre-hücre adhezyonu ile ilgili olan klasik kaderinler, yüksek oranda korunan bir jukstamembran alanı bağlanan, ancak aynı zamanda transkripsiyonel represör Kaiso bağlanır. p120ctn N-terminal alanı, farklı kinaz, fosfataz, küçük RhoGTPases ve mikrotübüle bağlı p ile etkileşimeroteinler 3. İlginç bir şekilde, alternatif bağlantısının sonucu olarak, p120ctn izoformları dört alternatif bir başlangıç kodonu 4 elde edilebilir. başlatma kodonu de en çok 5' çevrilmiş ve tam uzunlukta, N-terminal segmenti ihtiva gibi p120ctn izoform 1A, en uzun. p120ctn 3 ve 4, bu N-terminal segmenti, kısmen ve tamamen sırasıyla silinir izoformları. farklı hücresel fonksiyonları protein (ya da protein izoformlarının) ve bunların bölgesinin tam rolünü anlamak bir sorun olmaya devam etmektedir.

mESCs gen hedefleme karşılık gelen genin genetik silerek bir proteinin fonksiyonunun çalışma sağlar ve yaygın olarak, gelişimsel olarak önemli ve hastalığa, ilgili genlerin ve yolların belirlenmesi katkıda bulunmuştur. Ters genetik Bu atılım nedeniyle homolog yeniden 5'e Mesc izolasyon ve gen hedefleme alanlarındaki gelişmelerin sonucuydu 6, 7 kullanılarak arttırılabilir, ancak ne yazık ki bu hedef dışı etkiler 8 yatkındır. Daha güvenilir bir teknik Gen hedefleme sağlamak için Cre / loxP veya FLPe / FRT gibi site-spesifik rekombinasyon sistemleri dayanmaktadır RMCE vardır. LoxP ve Frt dizisi bakteriyofaj P1 bulunurlar ve Saccharomyces cerevisiae ve sırasıyla site yönünü belirleyen bir asimetrik 8 bp sekansı da dahil olmak üzere, 34 bp oluşur. Diğer yandan, oryantasyonu, örneğin, bir DNA bölümü içindeki iki loxP floxed DNA kesilmiş olur belirlemek veya i olacaktırKre-aracılı rekombinasyon 9 üzerine nversed. iki site farklı kromozom üzerinde bulunan Üstelik, eğer Kre da translokasyon neden olabilir. RMCE çapraz reaksiyona girmez ve bir genomik gömülü heterospesifik rekombinasyon yararlanır. Aynı heterospesifik bölgeleri tarafından takviye eden bir DNA fragmanı ihtiva eden bir Verici plazmit varlığında, rekombinaz için çift eş zamanlı translokasyon (Şekil 1) RMCE uyumlu genomik bu DNA fragmanı ekleyecektir. Burada, sadece doğru RMCE hedefli klonlar geri gelen vektör üzerinde bir promotere ilaç direnci sayesinde işleyebilen bir "tuzak" promotör az Neomisin direnç geni yerleştirme hücreleri R26 genomunda bulunan (NeoR) (Şekil 1) 10, 11. Bu <% 100 11 ile çok yakındır çok yüksek hedefleme verimliliği, sonuçlanır/ sup> 12. Sonuç olarak, RMCE bazlı bir hedefleme son derece verimlidir ve yapı-işlev çalışmaları için kullanılabilir; Bununla birlikte, bu, önceden tasarlanmış bir genomik lokus gerektirir.

Şekil 1
RMCE aracılı Hedefleme Şekil 1 şematik gösterimi. Her iki heterospesifik FRT bölgeleri (beyaz ve kırmızı üçgenlerle gösterilir) liman halinde RMCE eden tanımlı bir genomik lokus gelen bir hedefleme vektörü DNA segmentlerinin alışverişine izin verir. Buna ek olarak, işlenmiş genomik bölgenin bir promotörsüz ve tepe bölümü kesik neomisin direnci (NeoR) genini içerir. Gelen DNA fragmanı kodonu bir promotörü ve başlangıç ​​olarak, yalnızca doğru rekombinasyon olayları, yüksek hedefleme verimi ile, neomisin direncini yeniden. T daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınOnun rakam.

mESCs içinde Genom mühendislik RMCE uyumlu farelerin üretilmesine imkan tanır. 1981 yılında, iki grup blastosist iç hücre kütlesinin (ICM) pluripotent hücreler yakalama ve kültür 13, 14 onları korumuştur. mESCs germ hücresi soyundan dahil embriyonik ve yetişkin hücrelerinin her türlü içine kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, mESCs içinde gen hedefleme konstitütif veya (Cre / LoxP sistemi kullanılarak) koşullu KO fareleri geliştirilmesi yoluyla ters genetik çalışmalar sağlar. Ancak, fare ES hücreleri izole etmek için klasik yol çok verimsizdir. Birkaç büyük gelişmeler büyük ölçüde SR ve fetal sığır serumu (FBS) 16 içeren Mesc ortam arasında değişen, 15 orta tanımlanmış serum yerine (SR) kullanımı da dahil olmak üzere, türetme Mesc hatları için başarı oranını artırmıştır ve İlaçlarla kullanımı adresBu tür pluripotin veya 2i 17 mantıksal bileşikler. Pluripotin, küçük sentetik bir molekül, lösemi inhibitör faktörü (LİF) ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) 18 yokluğunda farklılaşmamış bir halde mESCs arasında yayılmasını sağlar. Son olarak, mESCs SR / FBS ortamı değiştirme kuralı, 20, LİF ve 19 pluripotin birleştirildiğinde (% 100'e yakın), çok yüksek bir verimle izole edilebileceği gösterilmiştir. Bu protokoller, daha sonra yapı-işlev çalışmaları için kullanılabilir RMCE uyumlu KO mESCs etkili izolasyonunu sağlar.

Bu çalışma, spesifik bir hücre süreçlerinden sorumludur bir protein içinde anahtar alanları ya da kalıntılarını tanımlamak üzere sağlayan bir yöntemi tarif etmektedir. Bu amaçla, verimli Mesc izolasyonunu sağlayan gelişmiş teknolojilerin, hedefleme vektörü montaj ve Mesc hedeflemenin bir boru hattı oluşturmak oldud. Protein izoform alan mutantlar ve devamındaki efektörlere böyle büyük paneller KO mESCs sokulabilir ve in vitro KO fenotipi kurtarmak için kabiliyetleri açısından değerlendirilebilir gibi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

fareler üzerinde Tüm deneyler, kurumsal, ulusal ve Avrupa hayvan yönetmeliklere göre gerçekleştirilmiştir.

RMCE uyumlu KO mESCs 1. İzolasyonu

  1. Böyle ROSALUC fareler 10 veya ROSA26-iPSC fareler 21 olarak RMCE uyumlu farelere, heterozigot KO fareleri Breed. Her iki RMCE uyumlu farelere karışık 129 / C57BL6 / İsviçre arka plan üzerinde muhafaza edilmiştir.
    NOT: heterozigot KO fareleri geçerek homozigot KO farelerde embriyonik öldürücülüğü aşmak için tavsiye edilir.
  2. R26 odağına 12'de bir RMCE kasetini içeren heterozigot KO fareleri seçmek için PCR kullanın.
  3. heterozigot KO fareleri RMCE uyumlu, heterozigot KO fareleri Breed ve RMCE uyumlu, homozigot KO blastosistleri izole eder.
    1. Akşam zamanlı çiftleşmesi kurun ve çiftleşme ertesi sabah bujileri kontrol edin.
      NOT: Fişler erkek pıhtılaştırma ve veziküler bezlerinden pıhtılaşmış salgılarının yapılır.Bu fişler dişi vajinayı doldurup 8 süre devam - ıslahının sonra 24 saat. Tıkalı dişiler 0.5 DPC (gün sonra coitum) embriyolar taşıyan olduğu kabul edilir.
      1. , Fişler için kontrol onun kuyruk tabanı tarafından dişiyi kaldırıp bir beyazımsı kitle için onu vajinal açılış incelemek için. fiş görmek zordur hafifçe açılı bir prob ile vulva dudakları yayıldı. Onların erkek ayırın takılı kadın.
    2. 3.5 DPC'de blastokistlerle toplayın.
      1. Onaylanmış yöntemle (örneğin, servikal dislokasyon) tarafından hamile kadın öldürülür. Bir midventral kesi yapın ve rahim ve yumurtalık teşrih ince makas ve forseps kullanılarak (hala birbirlerine ekli).
      2. 45 ° açı ile bir 26-gauge iğne kır. Bu bükülmüş iğne M2 ortamı ile doldurulmuş bir 1 ml şırınga takın ve 10 cm'lik bir tabak kapağı içine rahim blastosistler temizlemek için kullanın.
        1. en yakın rahim ucuna iğne takınyumurta kanalı. ince forseps ile iğneyi yerinde tutarken pistonu iterek; rahim şişme başarılı kızarma gösterir.
      3. tüm embriyolar toplamak ve taze M2 ortamının bir damlası iki kez yıkayın - (200 um, 100 bir çapa sahip olan) bir ağız pipet kullanın. Hemen yıkamadan sonra, kültür plakalarına blastosistler aktarın (aşağıya bakınız).
        NOT: laminer hava akımı yapılmalıdır blastosist diseksiyon ve taşıma.
  4. RMCE uyumlu KO mESCs izole edin
    1. Mitomisin-C ile tedavi edilen DR4 MEF'ler ile 12-çukurlu bir plaka (Malzemelerin Tablo) blastosist izole bir gün önce hazırlayın.
      Not: Bu MEF'ler Dört ilaç seçilebilir genler içerir ve neomisin, puromisin, higromisin direnç kazandıran Tg (DR4) 1Jae / J farelerinden izole edilmiştir ve 22 6-tioguanin edildi.
      1. Kaplama,% 0.1 jelatin ile tüm kültür plakası. % 0.1 jelatin eklemeKültür plakaları,% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir, ve jelatin çözeltisi aspire. Tohum bir 12-çukurlu plaka içinde P2 MEF'ler bir şişe çeyrek ve MEF orta 2 mL büyümek (bakınız Tablo 1, Malzeme Tablo) bir konfluent tek tabaka 19.
      2. 3 saat, mitomisin-C (10 ug / mL) ile etkisiz hale getirilmesi ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 19 ile iki kez yıkayın.
    2. SR-ES hücre ortamı içinde mitomisin-C ile tedavi edilen MEF'ler ile, jelatinize 12 oyuklu plakalar üzerine blastosistlerine (1 de / embriyo) plaka, bir ağız pipet kullanılarak, (2 ml / çukur), ya 2 uM pluripotin veya 2i ile desteklenmiş (1 uM Erk inhibitörü PD0325901 ve 3 uM GSK3 inhibitörü CHIR99021). % 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edilir.
    3. 3 gün - her 2 (pluripotin veya 2i ile takviye edilmiş), SR-ES hücre ortamı yenileyin.
    4. Bir stereomicro altındaki her blastosist inceleyin4.0 x büyütme kapsamı ve MEF tabakaya yavru üretmesi ve bağlanması için kontrol edin.
      NOT: blastokistlerin ambar, bunları kapsüller zona pellucidanm kaybettiğinde. bekâr blastositlerle Wells ağız pipetleme kullanılarak yenilenmesi gerekir.
    5. tek kullanımlık uçları olan bir P10 pipet kullanarak kültür 12 gün - 10 sonra (Stereomikroskopta kullanarak) bireysel ICM çıkıntılar seçin. (Oda sıcaklığında) / göz PBS 30 uL ihtiva eden bir V-şekilli 96 oyuklu plakaya ortamın yaklaşık 10 uL aşırı büyümesini aktarın.
    6. Her bir çok kanallı bir pipet kullanılarak% 0.25 tripsin, 50 uL ilave edin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de 3 dakika süre ile inkübe edilir.
    7. Mesc ortamı FBS içeren 100 uL ilave et; 10-15 kez pipetleme suretiyle tek hücre halinde ICM çıkıntılar ayırmak; ve mitomisin-C ile tedavi edilen ayrışmış hücreleri transferi ICM koloniler toplanır bir gün önce hazırlandı 96 oyuklu MEF plakalar.
    8. Omi, itibaren bu adımda itibaren Mesc ortamından t pluripotin veya 2i. Sonraki gün, (oyuk başına 100 uL /) SR içeren Mesc ortamına FBS- gelen orta değiştirmek.
    9. 96- 24 oyuklu bir formatta 19 için kurulan Mesc hatları Expand.
      1. PBS 200 uL hücreleri yıkayın tripsin 50 uL ekleyin ve% 5 CO içinde 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe FBS göre Mesc ortamın 100 uL ekleyin.; 10 pipetleme ayrışan - çok kanallı pipet kullanılarak 15 kez; ve ayrışmış hücreleri transferi 24 oyuklu, MEF plakaları mitomisin-C ile tedavi edilen.
      2. ertesi gün SR tabanlı orta değiştirin. De 24 ila 6-gözlü formata benzer bir şekilde mESCs genişletin. Konfluent 6 plaka 19 4 freezings - 3 olun.
    10. Boş p120ctn için PCR'ler ve floxed allel daha önce tarif edilmiştir, bu durumda, p120ctn burada R26 lokusu 23 ve seçim KO alel (PCR primerleri kullanılarak RMCE uyumlu, homozigot KO mESCs belirlenmesilass = "xref"> 12).

tablo 1
Tablo 1. Kültür Ortamı. Tüm ortam, 4 ° C'de saklandı ve kullanılmadan önce 37 ° C'de 30 dakika ısıtıldı.

Rekombinasyon Klonlama kullanarak bir RMCE uyumlu Hedefleme Vector 2. Nesil

  1. Tabanlı veya 24 klonlama teknikleri PCR bazlı kurtarma restriksiyon enzimi (RE) kullanılarak rekombinasyon uyumlu vektörleri içine inşa Clone. cDNA'lar bir stop kodonu içermediğinden emin olun.
    1. Tasarım primerleri 24 attB-etiketli. Bir GGGG germe, bir AttB1 sitesi, bir bağlayıcı, bir Kozak dizisi ve (kendi ATG ile başlayarak) kurtarma cDNA yaklaşık olarak 25 nükleotid: ileri primer, şu öğeleri içerir emin olun. Bir GGGG streç bir AttB2 sitesi, bir bağlayıcı, ve yaklaşık 25 Nük: Ters primer, benzer bir bileşime sahip olduğundan emin olunKurtarma cDNA (ters tamamlayıcı) arasında leotides.
    2. AttB-kuşatılmış cDNA elde etmek PCR ile kurtarma cDNA yükseltin.
    3. AttB-kuşatılmış cDNA, 100 ng ve kanamisine dirençli gen ihtiva eden rekombinasyon uyumlu verici vektör, 150 ng, 10 uL BP reaksiyonu gerçekleştirmek.
    4. Isı-şoku-kompetan Escherichia coli MC1061 (E. coli) (adım 2.3 de tarif edilenlere benzer) bakteri BP karışımlarının 5 uL dönüşümü.
    5. Doğru kurtarma cDNA içeren vektörler ihtiva eden koloniler belirlenmesi (aşama tarif edilenlere benzer 2.4)
  2. Kurtarma cDNA ihtiva eden 100 ng vektör kullanılarak bir 10-uL LR reaksiyonu gerçekleştirmek; Kre-kesilmiş pRMCE-DV1 vektörü 11 (8195 LMBP) 150 ng; ve bir faj kodlanmış integraz ve excisionase ve bakteriyel entegrasyon konak faktörü içeren rekombinaz karışımı, 2 uL. 25 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
    NOT: Bir LR Reaksiyon bir rekombinasyon reaksiyona olduğuiyon olan attL siteleri ve attR bölgelerini içeren bir hedef vektör ihtiva eden bir giriş klon LR klonaz enzim karışımı ile yeniden birleştirilir. Bu ilgi genine komşu attB siteleri içeren bir ifade klon sonuçlanır.
  3. Isı-şoku-kompetan MC1061, E. Coli bakterisi içinde LR karışımlarının 5 uL dönüşümü.
    1. Bir oluklu 5 uL LR karışımlarını ekleme, ısı-şok-yeterli E. coli bakterilerinin 40 uL, 2 mL'lik vidalı kapaklı bir tüp etekli ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir.
    2. 1 ml Luria etsuyu (LB) ortamı ilave edin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edilir. Plaka ampisilin üzerinde 50 uL (Amp; 100 ug / mL) agar ihtiva eden ve 37 ° C 'de bir gece boyunca büyür.
  4. Doğru hedefleme vektörü ile koloniler tanımlayın.
    1. rasgele bir P200 ucu kullanılarak 5 koloniler. 2 ihtiva eden bir cam test tüpü ucu transfer - 5 ml LB ortamı içinde 37 ° C'de gece boyunca büyür.
    2. eskiticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak bakteriyel kültürlerden plazmid DNA sistemi.
    3. RE sindirir ve sıralama kullanarak bunları doğrulayın. 10 pL reaksiyon RE 0.2 uL kullanılarak plazmid (20 U / ml) ve karşılık gelen 10x tampon 1 uL 2 ug - 0.5 kesin. bir% 1 agaroz jeli üzerinde en az 1, 37 ° C de saat ve ayrı inkübe edin. DNA fragmanlarının tahmin edilen model ile koloniler için seçin.
      1. Sanger sıklıklaştırıcı kullanarak Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) ve IRES R (GGG GCG GAA TTC ATC GAT AAG) primerleri (5 pmol / uL) ile teyit vektörleri (50 ng / uL) analiz eder.

Rescue Hedefleme 3. RMCE aracılı Mesc R26 Locus'un oluşturur

  1. FBS merkezli Mesc ortamda MEFS üzerinde en az iki kez RMCE uyumlu KO mESCs ve geçit onları kültürünü başlatın. jelatin hale 6 plaka üzerinde mESCs bölün.
  2. Ertesi gün, 1.5 ile yaklaşık% 50 birbirine karıştığında, hücreleri yenilemekFBS tabanlı Mesc ortamı mL kurtarma cDNA içeren vektör hedefleyen bir Cre kesilmiş pRMCE-DV1 ile mESCs transfekte.
    1. DNA karışımını yapın. Saf DMEM ortamı 250 uL FLPe-sentezleme plasmidi 25 1 hedefleme vektörünün ug ve 1 ug ekleyin.
    2. Bir lipofeksiyon karışımını yapın. Lipofeksiyon bazlı transfeksiyon reaktifi (örneğin, Lipofectamine 2000), saf DMEM ortamı 250 uL ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) inkübe 7 uL ekleyin.
      NOT: Benzer RMCE hedefleyen verimlilik diğer lipofeksiyon- tabanlı reaktif (örneğin Lipofektamin LTX'e ve Effectene) kullanılarak elde edilmiştir.
    3. lipofeksiyon karışımı ile, DNA karışımı karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. yenilenir mESCs üzerine transfeksiyon karışımı pipetle. yavaşça karıştırınız ve bir gece bekletin.
  3. Transfeksiyondan bir gün sonra, bir birleşik DR4 MEF'lerin tabaka ve 10 ml FBS tabanlı m 10 cm'lik bir kültür tabağına 6-çukurlu plaka tüm mESCs bölünmüşESC ortamı.
  4. Transfeksiyondan iki gün sonra, ortam 0,2 mg / ml G418 (100 x) eklenerek doğru FLPe aracılı kaset değişimi ile Mesc klonları seçmek.
    NOT: Tüm mESCs öldürür G418 düşük konsantrasyon tespit etmek G418 her parti için bir öldürme eğrisini olun.
  5. G418 içeren Mesc ortamı ile günlük mESCs yenileyin. Koloniler 7 sonra görünmelidir - 10 gün, yani almak ve adım 1.4 göre bunlar genişler.
  6. PCR 11 üzerinden doğru klonları teyit edin.

Embriyoit Oluşumu mESCs 4. Farklılaşma (EBS)

  1. FBS merkezli Mesc ortamda MEFS üzerinde en az iki kez R26 odaklı kurtarma yapılara ve geçit onları birlikte KO mESCs kültürünü başlatın. bir kez Jelatinize 6-yuvalı plakalar üzerinde Passage mESCs MEFS kurtulmak için.
  2. PBS ile yıkayın ve neredeyse birbirine karışan Mesc kültürleri trypsinize. Plaka, yapışmayan, bakteriyel dereceli hayvan üzerine farklı seyreltilerde mESCs (1/20 ve 1/40) ayrışmışfarklılaştırma ortamının ri-yemekler.
  3. EBS 30 gün boyunca bu yemekler oluşmaya izin verin. 50 mL'lik bir tüpe EB süspansiyonu transfer, EBS yerçekimiyle yerleşmek izin Süpernatantı taze ortam ekleyin ve bir bakteriyel dereceli geri EB süspansiyonu transfer: aşağıdaki prosedür kullanılarak 3 gün - her 2 orta Yenile tabak.
  4. Daha önce 12 tarif edilmiştir protokoller kullanılarak immünofloresans ve transmisyon elektron mikroskobi ile hedeflenen mESCs ve EBS analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RMCE uyumlu KO Mesc hatları izole etmek için işlem, Şekil 2'de tasvir edilmiştir. İki ardışık breedings RMCE uyumlu KO blastokistlerle almaları gerekmektedir. İlk olarak, heterozigot KO fareleri RMCE uyumlu, heterozigot KO fareleri elde etmek RMCE uyumlu fare ile kesilmişlerdir. Bu fareler, daha sonra RMCE uyumlu 3,5-DPC, homozigot KO blastosistlerin elde etmek üzere başka heterozigot KO fareleri zamanlı eşleştirmesi için kullanılır. Mendel kalıtım ile tahmin edildiği üzere, böyle bir embriyo alınır şansı, sekiz biridir. Bu nedenle, etkin bir Mesc izolasyon protokolü gereklidir. pluripotin bazlı veya 2i esaslı protokolleri kullanılarak, sırasıyla, yaklaşık% 94 (n = 114 blastosist) ve% 64 (n = 22 blastosist) bir verimlilikle, RMCE uyumlu p120ctn KO mESCs içeren mESCs hatları izole etmek mümkün 12, 19. Tipik olarak, blastosistler kapağı sonra 3 ila 6 gün içinde vitro (DIV), kültür; Bu MEF'ler veya jelatin kaplı tabaklara ICM çıkıntılar bağlanması takip etmektedir. 12. günde, büyük ICM çıkıntılar sadakatle (Şekil 2) Mesc hatlarına yol oluşturulmaktadır. Bu nedenle yüksek verimli Mesc izolasyon prosedürüne, bir ya da iki takılı dişilerden RMCE uyumlu KO mESCs elde etmek mümkündür.

şekil 2
Şekil RMCE uyumlu KO mESCs 2. izolasyonu. (A) Damızlık stratejisi homozigot, RMCE uyumlu KO mESCs elde edildi. Pluripotin- veya 2i bazlı Mesc izolasyon prosedürü (B) Şema. Beyaz ölçek çubuğu: 25 mikron. Siyah ölçekli çubuklar: 100 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Alan adı veya am haritasını çıkarmak içinBelirli bir hücre fonksiyonları için önemlidir bir protein olan asitler ino, bir anda RMCE, tam uzunlukta veya KO mESCs mutant yapıları ile, yeniden sokulması ve KO fenotipi geri döndüren etme kabiliyetleri açısından test edin. Alan mutantlar ve nokta mutantlar birçok farklı için hedefleme vektörleri verimli rekombinasyonel klonlama (Şekil 3A) ile üretilebilir. Rekombinasyonel klonlama farklı plazmit arasında Öze-kuşatılmış DNA parçalarının bir değişim aracılık rekombinaz karışımı, spesifik bağlanma (Öze) DNA sekanslarının belirlenmesine dayanır. Rekombinasyonel klonlama sistemi, sadece doğru bir şekilde farklı antibiyotik direnç genleri içeren vektörler arasında geçiş yaparak ve karşı seçilebilir bir markörü "hücre ölümü B kontrolü" sokulmasıyla vektörleri yeniden birleştirilmiş seçer (ccdB) geni, hedef vektör içine (Şekil 3A) . (Neredeyse% 100 verimle bazı örnekler bir hedefleme vektörleri pRMCE-DV1 Cre kesilmiş üzerinde 25 Biz üretilip), Tablo 2'de gösterilen yeniden.

Tablo 2
Tablo Vektör Meclisi ve RMCE aracılı Mesc Hedefleme 2. Genel Bakış.

Vektör hedefleyen bir CRE-eksize pRMCE-DV1 gömülü Farklı kurtarma yapılar kolaylıkla RMCE (Şekil 3B) kullanılarak KO mESCs hedeflenebilir. Daha önce 93% 12 ortalama verimlilik ile RMCE yoluyla p120ctn KO mESCs ait R26 lokusu içine tanıtıldı 19 farklı kurtarma yapıları için 133 hedeflenen Mesc klon nesil bildirildi. Burada, CAAX etiketli p120ctn 1A dahil olmak üzere benzer yüksek verimlilikle ilave bir konstrüksiyona, hedeflemesine rapor epitel-to-mezenkimal p120ctn KO mESCs içinde geçiş (EMT) SNAI ve ZEB ailesinin indükleyicileriyle ve N-kaderin, ( Tablo 2).

Şekil 3,
Şekil 3. KO mESCs Hedeflemesi RMCE tabanlı. (A), RMCE uyumlu hedefleme vektörlerinin yeniden bağlayıcının aracı tertibatı. RMCE ile homozigot KO mESCs arasında R26 lokusuna putatif kurtarma yapıların hedeflenmesi (B). RMCE hedefli Mesc klonlarının (C), PCR-bazlı validasyon. DNA RMCE hedefli Mesc klonlardan ekstre edilmiş ve endojen R26 lokusu ve gelen pRMCE-DV1 yapısında bulunan bir ters primer gömülü olduğu bir ileri primer kullanılarak PCR ile büyütüldü. Bir 560-bp bandı doğru hedef klonlar için görülmektedir. Doğrulanmayan klonlar kırmızı renkle gösterilmiştir. M1: 1 kb DNA merdiveni. M2: 1 kb Artı DNA merdiveni. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

12 bir sonucu olarak kistik EBS içine ayırt etmek başarısız p120ctn gösterildi. Kistik EB morfolojisi farklı kurtarma yapıları (Şekil 4A) taranması için bir fenotipik okuma olarak kullanılabilir. kavram ispatı olarak, R26 odaklı p120ctn izoformu 1A (R_p120_1A) p120ctn KO fenotipi kurtarmak olduğunu gösterdi (Şekil 4B, 4C) 12. Buna ek olarak, bu ekran tanımlanan e-kaderin, ancak RhoA Ceninin tarifnamede (Şekil 4B ve C) 12 boyunca p120ctn önemli bir ortaktır. kurtarma uygulanmasının kolaylığı KO mESCs bize ek hipotezleri test izin p120ctn için oluşturur. İlk olarak, E-kaderin-bağımsız olacağını p120ctn membran ankraj kistik EB oluşumunu sağlamak? test etmek içinBu, biz p120ctn karboksi ucuna K-Ras zar-hedefleme motifi (CAAX) kaynaşık KO mESCs p120ctn için RMCE yoluyla kişiye ve onlardan EBS yaptı. Bununla birlikte, bu yapı p120ctn KO fenotipi (Şekil 4C) kurtarmak etmez, bunun sonucu olarak, bağlanma sağlar ve E-kaderin (Şekil 4D) stabilizasyonu ve bir dominant negatif vermektedir. İkincisi, katılan EMT indükleyicileri- nelerdir? EMT da Mesc farklılaşması sırasında meydana gelir ve direkt olarak e-kaderin 26, 27 gibi çeşitli epitelyal marker genleri baskılamak transkripsiyon faktörleri, SNAI ve ZEB ailesi tarafından idare edilen bir temel gelişimsel bir süreçtir. Bu bulgulara paralel olarak, EMT indükleyici ZEB2 ekspresyonu ancak p120ctn boş EBS (Şekil 4E) 'de, kontrol EBS bulunmuştur. Bununla birlikte, EMT indükleyiciler ZEB1, ZEB2 veya salyangoz ROSA26 tabanlı ifadeyle p120ctn KO mESCs kist geri başarısızic EB formasyonu (Şekil 4C). Üçüncü olarak, örneğin N-kadherin gibi diğer klasik kaderinler, fonksiyonel endoderm tarifname boyunca E-kaderin yerine? Bu sorunu çözmek için, N-kaderin kurtarma hatları oluşturuldu. Daha önce, bu p120ctn KO EBS E-kaderin ektopik ekspresyonu kısmen kistik EBS 12 oluşumunu kurtarıldı olduğu gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, benzer bir kurulumda, N-kadherin sentezleme E-kadherin EB yapışması için gerekli olan önemli bir kaderin alt tipidir ve N-kaderin ile ikame edilemez olduğunu gösterir (Şekil 4C ve F) kurtarmak için başarısız zorladı. Bunlar yukarıda belirtilen örnekler biyolojik sorular sistem tarafından ele alınması kolaylığını vurgulamak.

Şekil 4,
Şekil 4. RMCE hedefli kurtarma mESCs fenotipik tarama. (A), ışık mikroskopisi ile yakalanan kistik EBS (formasyonu; üst panols) ve transmisyon elektron mikroskobu ile çekilen EBS uygun endoderm polarizasyon (; alt panel) p120ctn KO fenotipi kurtarmak için hedeflenen mESCs kabiliyetini test etmek için fenotipik okuma olarak kullanılmıştır. Beyaz ölçek çubuğu: 25 mikron. Siyah ölçek çubuğu: 200 mikron. P120ctn kurtarma yapıların (B) genel bakış. p120ctn bir N-terminal alanının (NTD) ve C-terminal bölge (CTD) tarafından kuşatılır, dokuz armadilo tekrarlar (mavi kutular) 'den oluşan bir merkezi armadillo alanını ihtiva eder. p120ctn izoformları ya da iki Rho GTPaz bağlama alanlarını (RBDS) alternatif olarak kullanılabilir ekzon A ve C (siyah kutular) tarafından kodlanmış dizileri bulunur, ve bunlar arasında veya hariç, bir ilâ dört takım alternatif başlangıç ​​kodonları (oklar) içerir. p120ctn 1A ve Şekil 4A, sırasıyla, birinci ve dördüncü çeviri başlatma sitesi kullanımı izoformları. Önemli AA ve zar-hedefleme motifi (CAAX) yapay eklemenin mutasyonların konumu gösterilmektedir. EBV: E-kadherin bağlayıcı alan. (C), GrafikFarklı R26 odaklı kurtarma yapıları ifade p120ctn KO hücrelerinde temel veya kistik EB morfolojisi yüzdesini gösteren. (D) p120ctn (fare monoklonal anti-p120ctn) ve E-kaderin için immünofloresan boyama (fare monoklonal anti-E-kadherin) kontrol G4 mESCs veya izoformu 1A p120ctn CAAX-etiketli bir R26-tahrikli ifadesi ile p120ctn KO mESCs ile. insets tüm Mesc koloniyi göstermektedir. Ölçek çizgisi: 10 um. ZEB2 (E) immünohistokimya (fare monoklonal anti-ZEB2; 7F7, in-house ile üretilen) floxed (kontrol) ve p120ctn KO EBS. 3.5-kat büyütmeli alt panelinde gösterilmektedir. Ölçek çizgisi: 200 um (en), 100 um (alt). R26 promotöründen E- veya N-kaderin eksprese p120ctn KO hücrelerinden DIV12 EBS (F) Transmisyon elektron mikroskopi. Ölçek çizgisi: 10 um. Thi daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayıns rakam.

Sonuç olarak, biz vektör montaj hedeflemesi ve Mesc hedeflemesi olan Mesc izole yakın bir% 100 verim birleştiren sağlam teknolojilerin bir boru hattı hakkında rapor. Bu boru hattı mESCs yapı-fonksiyon testleri vasıtasıyla proteinlerin çok yönlülük çözülmeye olanak tanıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bizim Mesc izolasyon yöntemi kullanıcı dostu ve böyle blastosistindeki mikrocerrahi gibi gelişmiş beceri ve gereçlerine gerektirmez. Böylece, bu teknoloji bilim dünyasında büyük bir oranda erişilebilir. Temel hücre kültürü tecrübesi olan herkes ICM çıkıntılar yaymak ve mESCs hatları kurabilir. Ancak, blastosistindeki yıkama ve taşıma biraz pratik gerektirir. Ağız pipet blastosistler aktarmak için kullanılan ve bir mikropipet, bir mikro tutucu, boru ve bir aspiratör ağız parçasının 28 oluşur. Mikropipetler, bir kaç saniye için bir Pasteur pipeti en kısmını ısıtma alevden pipet çıkarılması ve her iki ucu çekilmek sureti ile özel yapılabilir. (- 200 ila 100 um) bir blastokist biraz daha büyük bir çapa sahip seçin iğneler. İğneler, damıtılmış su (3x) ve EtOH (3x) ile yıkandı, sonra yeniden kullanılabilir. Deneyimlerimize göre, pluripotin bazlı Mesc izolasyonun etkinliği 2'ye yüksek karşılaştırılırprotokoller 12. tabanlı. Ancak, yüksek konsantrasyonlarda pluripotin kullanımı genomik instabilite 19 indüklediği gösterilmiştir.

G418 seçiminden sonra 40 koloni - RMCE tabanlı tipik olarak 20 elde edilir mESCs içinde R26-hedefleme. daha koloniler gözlenmesi halinde, bu G418 konsantrasyonu optimal değildir ve genel hedefleme verimini etkileyen, hedeflenmeyen mESCs hayatta kalmak için izin verdiğini ima eder. Bu nedenle, her Mesc hattı için, tavsiye edilir ve her yeni G418 seri için, bir öldürme eğri olmayan tüm hedefli mESCs öldürür düşük G418 konsantrasyonunu belirlemek için yapılır. bir kolonileri gözlenir, bu verimsiz bir transfeksiyon göstergesidir. Bu durumda, EGFP ya da LacZ ekspresyonuna olanak raportör plasmidleri ile transfeksiyon yöntemi optimize etmek için faydalıdır. transfeksiyon protokol çalışmaları ancak yine hiçbir koloniler gözlenirse, RMCE uyumlu ve CRE-eksize pRMCE-DV1 vektör ve FLPe e kontrolRE ile sindirilmiş ve sıralama ile XPression plazmid. Ebeveyn mESCs ve FLPe vektörü büyük bir toplu iş yapmak için ve deneyler arasındaki farklılıkları azaltmak için onları birkaç alikotları dondurmak için tavsiye edilir.

Bu yapı-işlev stratejisinin bir dezavantajı kurtarma yapılar her yerde bulunan bir, orta derecede aktif bir promotör ile, daha ziyade ROSA26 lokus içinden, endojen mahal ifade edilmez olmasıdır. Suprafizyolojik aşırı ekspresyonu seviyeleri genellikle görülen diğer teknolojilere kıyasla, bu sistem, in vitro farklılaşma deneyler sırasında ve çeşitli hücre soyları arasında stabildir fizyolojik transgen ekspresyonunu sağlar. O heterozigot, vahşi tipli kontrol mESCs endojen p120ctn düzeylerinin yaklaşık yarısı fakat KO 12 fenotip gözlenmiştir p120ctn kurtarmak için yeterli bir p120ctn protein ekspresyonu ROSA26 aracılı transgen ekspresyonunun gözlenmiştir. Benzer bir şekilde, de olduheterozigot, ROSA26 aracılı Zeb2 transgen ekspresyon seviyesi, in vitro olarak ve çeşitli hücre soyları 29 in vivo olarak gözlenen Zeb2 nakavt fenotipleri kurtarmak için yeterli olan daha önce monstrated. Diğer bir potansiyel tehlike Mesc kendini yenileme için vazgeçilmezdir genler böyle yapı-fonksiyon çalışmaları için müsait olmadığı gerçektir. çoğalmasını, Koloni morfolojisi ve stemness genlerin ifadesini: Bu dışlamak için, yeni kurulan KO aşağıdaki kriterlere için mESCs karakterize tavsiye edilir. Ayrıca mESCs ve soy işlenen hücrelerde hem ilgilenilen genin ifadesini kontrol edilmesi tavsiye edilir.

yapısal KO mESCs yapı-fonksiyon çalışmalarını gerçekleştirmek için ek olarak, bir de, Cre / loxP sistemi kullanılarak bir koşullu bir yaklaşım olabilir. İkinci yaklaşım çevreleyen ve destekleyen hücreleri etkilemeden bir seri spesifik KO verir. Buna ek olarak, koşullu KO mESCs alloyapı-fonksiyon testleri performansı için ağırlık yapısal KO mESCs içinde fenotip varsa. RMCE uyumlu oluşturmak için, koşullu-KO mESCs bir hücre tipine özgü Cre sürücüsü ile homozigot floxed farenin RMCE uyumlu fareler ile beslenir; Mesc soylarına izole edilir. Bu sistemin avantajı, Cre rekombinazın mESCs ifade edilir ve mESCs ilgili hücre soyunda farklılaşmış zaman aktif hale gelir olmamasıdır. RMCE uyumlu, koşullu-KO mESCs olarak, Cre rekombinasyon şartlı pRMCE-DV1 hedefleme vektörü (LMBP 08870) 11 kullanarak endojen gen ve kurtarma yapısının R26 tahrikli ekspresyonunun aynı anda etkisiz hale neden olacaktır.

Buna ek olarak, yapı-fonksiyon sistemi, insan hastalığında bulunan ve proteinin fonksiyonları üzerine bu mutasyonların etkisini test etmemizi sağlayan mutasyonların çalışma için izin verir. Örnek olarak, biz ZEB2 mutat belirledikmiyeloproliferatif neoplazmı olan hastalarda iyonları, bu ZEB2 mutantlarını içeren hedefleme vektörlerinin yapımı RMCE ile Zeb2 KO mESCs arasında R26-lokusuna bunları mekik ve proteinin kendisinin 30 stabilitesi üzerindeki mutasyonlar üzerindeki etkisini inceledik. mESCs pluripotent olduğu için, bu teknoloji, mESCs böyle mutantların biyokimya, hem de herhangi bir soyun daha büyük bir anlayış verir.

Sonuç olarak bu Mesc merkezli yapı-fonksiyon yaklaşımı verimli Mesc izolasyonu ve hedefleme teknolojisine dayanmaktadır ve tanımlanmış biyolojik bağlamında önemli etki alanları ve belirli bir proteinin işlevlerinin tanımlanması için gereklidir. (Dondurulmuş sperm istek üzerine mevcuttur) ve plazmidler fareler paylaşarak (BCCM / LMBP ve Addgene dağıtılmış), biz tüm bilim dünyası için bu teknolojiyi açmak istiyorum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz onların mükemmel teknik destek için Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem Natalie farla Kelly Lemeire ve Riet De Rycke teşekkür ederim. Biz de onların uzman yardımı için Enflamasyon Araştırma Merkezi Biyogörüntüleme Çekirdek Tesis Eef Parthoens, Evelien Van Hamme, ve Amanda Goncalves teşekkür ederim. Biz değerli tartışmalar için araştırma grubunun üyelerini kabul eder. Bu çalışma Belçikalı Bilim Politikası tarafından desteklenmiştir (Belspo Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar - Ödül IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be) Kraliçe Elisabeth Tıp Vakfı, Belçika (GSKE 2008-2010 tarafından; http: // www )-gske.be .fmre ve Belçika Ghent Üniversitesi'nden (http://www.ugent.be/en/ghentuniv) ait Uyumlu Araştırma Eylemler (GOA 01G01908) tarafından. SG Flanders Araştırma Fonu (FWO-V) doktora sonrası araştırmacı olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ROSALUC Mice made in house frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice made in house frozen sperm available upon request
Vessel probe Fine Science Tools 10160-13 to check for copulation plugs
M2 medium Sigma-Aldrich M7167 make aliquots and store at -20 °C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) Fine Science Tools 11251-10 spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23 G needles Fine-ject 8697
1-mL syringes Soft-ject 6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)  Gosselin BB60-01
Mouth pipette made in house see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) ATTC SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice The Jackson Laboratory 3208
Mitomycin C  Sigma-Aldrich M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice JAX 3208 mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin Sigma-Aldrich G1393 Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C.
Trypsin (0.25%)  Gibco 25200-056
2 μM pluripotin Cayman Chemical 10009557
pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08870 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08195 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA  Addgene 20733
heat-shock competent DH5α bacteria  made in house
Gateway pDONR221 vector Thermo Fisher 12536-017 contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix Thermo Fisher 11789-020
LR clonase II mix Thermo Fisher 11791-020 
Luria Broth (LB) 
Ampicillin 
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer Thermo Fisher 3730XL
G418 Thermo Fisher 11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent Thermo Fisher 15338100
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
GATEWAY pENTR 1A vector Thermo Fisher A10462 recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody BD Transduction Laboratories 610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody BD Transduction Laboratories 610181
General equipment
Sterile dissection tools fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL
15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) 
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL) 
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light 
Culture media
MEF Medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 41965-062
10% fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-7524
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
Sodium pyruvate  (0.4 mM) Gibco 11360-039 
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
SR-based mESC medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
DMEM/F12 Gibco 31330-038 mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR) Gibco 10828–028
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
0.1 mM non-essential amino acids  Gibco 11140-050
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
β-mercaptoethanol (0.1 mM)  Sigma-Aldrich M 3148 
2,000 U/mL recombinant mouse LIF  (IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium) stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM Gibco 10829-018 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
Differention Medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 21980-032 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid   Gibco 11279-023 
2 mM L-glutamine Gibco 25030-024 
0.4 mM 1-thioglycerol Sigma-Aldrich M-6145
50 μg/mL ascorbic acid Sigma-Aldrich A-4544 
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901  Axon Medchem Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
  4. Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
  5. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
  6. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  7. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  8. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
  9. Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
  10. Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
  11. Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
  12. Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
  13. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  14. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
  15. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
  16. Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
  17. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
  18. Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
  19. Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
  20. Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
  21. Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
  22. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
  23. Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
  24. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  25. Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
  26. Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
  27. Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2016).
  28. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third edn (2003).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
  30. Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. (2016).
Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).More

Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter