Summary
Dit protocol beschrijft een methode om het vermogen van een eiwit om te co-sedimenteren met filamenteuze actine (F-actine) te testen en, als de binding wordt waargenomen, de affiniteit van de interactie te meten.
Abstract
Filamenteuze actine (F-actin) organisatie binnen cellen wordt gereguleerd door een groot aantal actine-bindende eiwitten die actin nucleatie, groei, cross-linking en / of demontage beheersen. Dit protocol beschrijft een techniek - de actin-co-sedimentatie, of pelletering, analyse - om te bepalen of een eiwit- of eiwitdomein F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet ( dwz de dissociatie-evenwichtskonstante). In deze techniek wordt eerst een eiwit van belang geïncubeerd met F-actine in oplossing. Daarna wordt differentiële centrifugatie gebruikt om de actinfilamenten te sedimenteren en het gepelleteerde materiaal wordt geanalyseerd door SDS-PAGE. Als het eiwit van belang F-actine bindt, komt het samen met de actinfilamenten. De producten van de bindingsreactie ( dwz F-actine en het eiwit van belang) kunnen gekwantificeerd worden om de affiniteit van de interactie te bepalen. De actinpelletingassay is een eenvoudige techniek om te bepalenAls een eiwit van belang F-actine bindt en om te beoordelen hoe veranderingen in dat eiwit, zoals ligandbinding, de interactie met F-actine beïnvloeden.
Introduction
Actin is een essentieel cytoskeletaal eiwit dat een cruciale rol speelt bij meerdere cellulaire processen, waaronder motiliteit, samentrekking, adhesie en morfologie 1 . Actin bestaat in twee vormen: monomeer globair actine (G-actine) en gepolymeriseerd filamenteuze actine (F-actine). Binnen de cellen wordt de F-actin organisatie gecontroleerd door een grote verzameling eiwitten die de nucleatie, groei, crosslinking en demontage van actinfilamenten 2 , 3 , 4 regelen. Echter, hoe meerdere actine-bindende eiwitten samenwerken om de actin netwerkorganisatie te regelen is nog steeds grotendeels onduidelijk.
De meting van eiwit-eiwit interacties is een belangrijke aanpak om te begrijpen hoe eiwitten hun effect op cellulaire gedrag op het biochemische niveau uitoefenen. Veel verschillende analyses kunnen worden gebruikt om interacties tussen gezuiverde eiwitten te detecteren.Gemeenschappelijke benaderingen voor oplosbare eiwitten omvatten aftrekkingen, fluorescentie polarisatie, isotherme titratie calorimetrie en oppervlakte plasmon resonantie. Het is van belang dat alle van deze analyses eiwitten oplosbaar zijn en dus moeilijk kunnen worden aangepast voor gebruik met een polymeer, filamentvormig eiwit, zoals F-actine. Hier beschrijven we een techniek - de actin co-sedimentatie, of pelletering, analyse - om te bepalen of een eiwit of eiwit domein F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet.
De actinpelletingassay is een relatief eenvoudige techniek die geen speciale apparatuur nodig heeft, afgezien van een ultracentrifuge. Alle reagentia kunnen worden gemaakt, met inachtneming van kennis van basis biochemie, of gekocht. Zodra bindend is aan F-actine is vastgesteld, kan de test gebruikt worden om de schijnbare affiniteit te meten ( dwz de dissociatie-evenwichtskonstante) 5 . Ook, zodra een affiniteit is vastgesteld, wordt de pelletietestIs een handig hulpmiddel om te meten hoe veranderingen in het eiwit van belang ( dat wil zeggen posttranslatie modificaties, mutaties of ligandbinding) de interactie met F-actine 6 beïnvloeden. De techniek heeft beperkingen (zie de discussie ) waaraan de onderzoeker zich moet bewust zijn voordat hij de test probeert.
Protocol
1. Bereid de materialen voor
- Zuiver het eiwit van belang (zie rubriek 2).
- Bereid of koop G-actin.
OPMERKING: G-actine kan geïsoleerd worden uit meerdere bronnen 1 ; Als alternatief kan het worden gekocht. Gekonstitueerde G-actine (in 5 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP (adenosine trifosfaat) en 0,5 mM dithiothreitol (DTT)) moeten worden gevriesd, opgeslagen bij -80 ° C en> 10 mg / ml In kleine (10-20 μL) porties, en ontdooid net voor gebruik. G-actin-aliquots mogen niet worden gesezen. - Bereid of koop een controle eiwit, zoals BSA (zie stap 4.4).
- Bereid 10x polymerisatiebuffer (200 mM imidazool pH 7,0, 1 M KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP en 10 mM EGTA (ethyleenglycol-bis (P-aminoethylether) -N, N, N ', N'- Tetraazijnzuur)). Maak een 10x voorraad en pas de pH aan na aanpassing van ATP, indien nodig. Aliquot (25 μL is een bruikbaar volume) en opslaan bij -80 & #176; C.
- Bereid 10x reactiebuffer (200 mM imidazool pH 7,0, 1,5 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP en 10 mM EGTA). Maak een 10x voorraad en pas de pH aan na aanpassing van ATP, indien nodig. Aliquot (50-100 μL is een bruikbaar volume) en opslaan bij -80 ° C.
OPMERKING: De samenstelling van de reactiebuffer is flexibel en kan worden aangepast om de achtergrond sedimentatie te verminderen, niet-specifieke binding te beperken en / of binding te verbeteren (stappen 1.5.1-1.5.3).- Pas de pH van de reactiebuffer tussen 6 en 8 aan om de stabiliteit van de eiwitten te optimaliseren. Bij een lagere of hogere pH, vervang een geschikte buffer voor imidazol.
OPMERKING: Gebruik de pH 7.0 als uitgangspunt, tenzij een eiwit een lagere of hogere pH voor stabiliteit vereist. Gebruik geen buffer met een pH lager dan 6,0 of hoger dan 8,0, omdat dit de actine kan verstoren. Aanbevolen buffers (eindconcentratie en optimale pH genoemd) omvatten: 20 mM MOPS (3- ( N- morpholino) propaan-sulfonzuur), pH= 6,5; 20 mM imidazool, pH = 7,0; 10 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur), pH = 7,5; En 20 mM Tris, pH = 8,0. - Varieer de zoutconcentratie van de reactiebuffer, afhankelijk van de behoeften van de test.
OPMERKING: Actin is een zuur eiwit, en bijna alle actine-bindende eiwitten zijn in zekere mate afhankelijk van elektrostatische interacties om te associëren met actine. Daarom vermindert de toename van de zoutconcentratie de actinbinding in de meeste gevallen. De reactiebuffer maakt gebruik van een fysiologisch gehalte aan zout (150 mM NaCl, werkconcentratie) en dit is het aanbevolen uitgangspunt. Indien nodig kan de zoutconcentratie verlaagd worden ( bijv. Tot 100 mM) om binding te bevorderen of te verhogen om de binding te beperken. - Verander de concentraties MgCl2, ATP of EGTA niet in de reactiebuffer, tenzij er specifieke redenen zijn om dit te doen.
- Pas de pH van de reactiebuffer tussen 6 en 8 aan om de stabiliteit van de eiwitten te optimaliseren. Bij een lagere of hogere pH, vervang een geschikte buffer voor imidazol.
2. Bereid het testproteïne voor de test op
- VoorbereiEa hoge zuiverheid eiwit met behulp van vloeistofchromatografie voor de beste resultaten 7 .
OPMERKING: Als u recombinante eiwitten gebruikt, dienen grote proteïne-labels, zoals glutathion-S-transferase (GST), te worden verwijderd door proteasesplyting uit het doelproteïne, aangezien ze bindend kunnen zijn. GST veroorzaakt ook homodimerisatie van fusie-eiwitten, die kunstmatig de affiniteit van actine binding kan verhogen. - Bepaal de eiwitconcentratie door de absorbantie op 280 nm te meten. Verdeel door de uitstootcoëfficiënt; De uitstootcoëfficiënt kan worden berekend uit de eiwitsequentie met behulp van sequentie analyse of online tools. Alternatief, bepaal de eiwitconcentratie met behulp van Bradford of BCA (bicinchoninezuur) methoden.
OPMERKING: Voor initiële experimenten is 50-100 μl eiwit bij 20-40 μM gewoonlijk voldoende. Dit zal de analyse van binding in het lage micromolaire bereik mogelijk maken, een bruikbaar uitgangspunt voor de meeste actine-bindende eiwitten. Een grotere quanTijden, en vaak is een hogere eiwitconcentratie nodig om een bindingskromme te genereren om de affiniteit te berekenen (zie rubriek 5). - Vlak voor gebruik, draai het eiwit (50.000-100.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C) om de aggregaten van onoplosbaar eiwit te verwijderen. Als oplosbaarheid een probleem is, meet de eiwitconcentratie opnieuw (stap 2.2) na centrifugeren.
3. Bereid de F-actine voor
- Verwijder een aliquot van G-actine uit de -80 ° C vriezer en ontdooi het snel.
- Voeg de 10x polymerisatiebuffer toe aan het G-actine tot een eindconcentratie van 1x. Zorg ervoor dat de G-actin concentratie in 1x polymerisatie buffer ten minste 10-20 μM ligt, ruim boven de kritische concentratie. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) om het actin te laten polymeriseren.
- Na polymerisatie bewaart u de F-actine in oplossing bij 4 ° C, waar het enkele weken stabiel blijft. Voordat u de F-actin weer na de opslag gebruikt, moet u omzichtig inverterenOf flip de buis meerdere malen om ervoor te zorgen dat alle actin opgelost en uniform in oplossing worden verdeeld.
OPMERKING: (Optioneel) Voeg phalloidine toe om een 1: 1 molaire verhouding van G-actine: phalloidine te bereiken. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT zodat de falloidine bindt aan het F-actine. Phalloidin stabiliseert F-actine en verwezenlijkt twee dingen: (i) het vermindert de hoeveelheid actine die niet sedimenteert tijdens centrifugeren en (ii) F-actine verdund kan worden onder de kritische concentratie (~ 0,5 μM), die vaak Noodzakelijk om de hoeveelheid F-actine te veranderen om een bindingscurve te genereren (zie sectie 5 over het meten van de affiniteit).
4. Pelleteringsassay - basisprotocol
OPMERKING: Het basisprotocol beschreven in sectie 4 wordt gebruikt om te bepalen of een eiwit van interesse co-sedimenten met F-actine. Zodra de binding aan F-actine is vastgesteld, kan de affiniteit van deze interactie worden gemeten volgens het protocol beschreven in sectie 5.
- Bereid de reactiebuffer op de gebruiksdag door de 10x voorraad tot 1x te verdunnen en voeg DTT toe aan een uiteindelijke concentratie van 1 mM.
OPMERKING: (Optioneel) Voeg polidocanol toe aan een uiteindelijke werkconcentratie van 0,02% in de reactiebuffer. Polidocanol is een oppervlakteactieve stof die niet-specifieke achtergrondbinding vermindert en helpt om te voorkomen dat hydrofobe eiwitten aan de ultracentrifugebuis vallen. - Verdun het eiwit van belang voor de gewenste concentraties in 1x reactiebuffer in ultracentrifugebuizen. Houd de monstervolumes laag (40-60 μL) om te vermijden dat grote hoeveelheden eiwitten worden gebruikt door middel van ultracentrifugebuizen met kleine minimumvolumes ( bijv . 7 x 20 mm buizen die elk 0,2 ml bevatten).
OPMERKING: Aangezien veel actine-bindende eiwitten een affiniteit hebben voor F-actine in het micromolaire bereik, wordt aanbevolen een eiwit van belang bij 2 en 10 μM te testen. Als binding niet wordt waargenomen bij 10 μM, is het onwaarschijnlijk dat binding bij hogere concentraties wordt waargenomen. Als deToegevoegde eiwitten vormen meer dan 10-20% van het uiteindelijke reactievolume, het kan nodig zijn om het eiwit in de reactiebuffer te dialyseren voordat het experiment wordt uitgevoerd. - Voeg F-actine toe aan de gewenste eindconcentratie.
OPMERKING: 2 μM is een bruikbare concentratie voor initiële experimenten omdat het goed boven de kritische concentratie ligt, waardoor actine in de filamenteuze toestand wordt gehandhaafd. Het zal een zichtbare pellet produceren wanneer geanalyseerd door SDS-PAGE (stap 4.10). - Bereid de volgende controles in ultracentrifugebuizen om de test informatief te maken.
- Bereiding monster (s) die het eiwit van belang zonder F-actine bevatten. Zorg ervoor dat de concentratie van eiwitten in deze monsters overeenstemt met de concentratie in de plus plus-actin-monsters.
OPMERKING: Deze monsters bepalen de hoeveelheid proteïne die in de afwezigheid van F-actine is geaggregeerd of vastzit aan de zijkanten van de ultracentrifugebuis. - Bereid negatieve controlemonsters opBij dezelfde of soortgelijke concentratie (en) die gebruikt worden voor het eiwit van belang. Gebruik een controle eiwit dat niet bindt aan F-actine, met en zonder F-actine.
OPMERKING: Dit is een belangrijke controle omdat eiwitten in actinfilamenten en pelletjes met F-actine kunnen worden gevangen, hoewel ze F-actine niet binden. De hoeveelheid van de vangst kan variëren afhankelijk van de F-actin bron, buffer omstandigheden, enz. Dus deze controle moet in alle experimenten worden opgenomen. Ideaal gezien zou het controleproteïne een molecuulgewicht hebben dat vergelijkbaar is met het eiwit van belang ( bijv . Voor aE-catenine (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) is een geschikte controle). Commercieel verkrijgbare gelfilteringsnormen maken uitstekende controleproteïnen, omdat ze een aantal maten bedekken en de neiging hebben om geen aggregaten te bevatten. - Optioneel bereiden positieve controle monsters die een eiwit bevatten dat bindt aan F-actine, met en zonder F-actine. Zorg ervoor dat de concentratie (en) gelijk is aan die van deE eiwit van belang
OPMERKING: Deze controle is handig, aangezien het aantoont dat de experimentele condities (bijvoorbeeld bereid F-actine, reactiebuffer en centrifugatie) F-actine binden toestaan. Aangezien de pelleteringsanalyse geen zwakke F-actininteracties kan detecteren (zie de discussie), wordt aanbevolen dat het bekende F-actine bindende eiwit een matige tot zwakke affiniteit heeft voor F-actine ( dwz in het lage micromolaire bereik ). Gezuiverde F-actine bindende eiwitten zijn in de handel verkrijgbaar.
- Bereiding monster (s) die het eiwit van belang zonder F-actine bevatten. Zorg ervoor dat de concentratie van eiwitten in deze monsters overeenstemt met de concentratie in de plus plus-actin-monsters.
- Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij RT.
OPMERKING: Langere incubatietijden zijn goed, ervan uitgaande dat het eiwit van belang stabiel is, maar waarschijnlijk onnodig is. Als het eiwit van belang niet bij RT stabiel is, kunnen monsters bij 4 ° C geïncubeerd worden. In dit geval kunnen langere incubatietijden nodig zijn. - Laad de monsters in de centrifugrotor. Plaats de buizen binnen de rotor om te helpen bij het resuspenderen van de pellet na centrifugeren.Merk hiervoor alle centrifugebuizen ( bijv. Met een steekproefnummer) en plaats alle buizen in de rotor in dezelfde positie ( bijv. Het nummer naar buiten).
- Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C in een ultracentrifuge.
- Na centrifugeren, verwijder 3/4 van de supernatant ( bijv . 45 μL indien het startvolume 60 μL) uit elke buis was en meng deze met 1/3 volumes 4x monsterbuffer (15 μL in dit geval) in een aparte microcentrifugebuis.
- Verwijder de overblijvende supernatant met een gel-laadpunt, let erop dat de pellet niet wordt verstoord (die zichtbaar kan zijn als een glasachtige vlek).
OPMERKING: Het is belangrijk om de supernatant zo snel mogelijk na de voltooiing van de centrifuge te verwijderen om de dissociatie na afscheiding van eiwitten te beperken. Was ook de pellet niet met reactiebuffer om dezelfde reden.
- Verwijder de overblijvende supernatant met een gel-laadpunt, let erop dat de pellet niet wordt verstoord (die zichtbaar kan zijn als een glasachtige vlek).
- Voeg 4/3 volumes 1x monsterbuffer toe aan elke pelleT ( bijv . 80 μl indien het startvolume 60 μl was).
OPMERKING: Dit maakt de verdunning hetzelfde als voor de supernatant (stap 4.8, 1/3 volumes van 4x monsterbuffer werden toegevoegd), waardoor de directe vergelijking tussen pellet- en supernatantmonsters en de bepaling van het percentage eiwit dat werd gepelleteerd, mogelijk was.- Voeg monsterbuffer aan alle buizen toe en incubeer gedurende tenminste 5 minuten bij RT. Laat de pellet in de monsterbuffer zitten om het herstel van het monster te verbeteren.
- Triturateer het monster 8-10 keer met een p200 pipettip om de pellet te resuspenderen door het pelletgebied van de buis voortdurend te wassen. Scherp de pipettaart voorzichtig over de pellet tijdens de trituratie om te helpen bij resuspensie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u tijdens het tritureren geen lucht in de steekproef invoert, aangezien dit de proefbuffer zal bellen en het herstel van het monster zal verminderen. - Breng de geresuspendeerde monsters naar microfuge buizen na trituratie. </ Ol>
- Analyseer de supernatant- en pelletmonsters door SDS-PAGE en Coomassie-kleuring 8 door 10-15 μL monster per baan te laden; Dit is voldoende om de eiwitten te visualiseren.
OPMERKING: Proteïnen die co-sedimenten met F-actine zullen verrijkt worden in de "plus F-actin" pelletmonsters over de "nee F-actine" pelletmonsters ( Figuur 1A ). Standaard Coomassie blue staining is voldoende voor detectie als de eiwitconcentraties zich in het 0,1-10 μM bereik bevinden. Colloïdale Coomassie 9 of Western blotting kan gebruikt worden om de gevoeligheid te verhogen als lagere eiwitconcentraties worden gebruikt om interacties met hogere affiniteit te meten. - Image Coomassie-gekleurde gels met behulp van een scanner of imaging systeem (stap 5.12).
5. Pelleteringsassay - kwantificering
Opmerking: Als specifieke binding aan F-actine wordt waargenomen, kan het nuttig zijn om de affiniteit van t te metenHij interactie. Dit wordt bereikt door een paar wijzigingen en toevoegingen aan het protocol in sectie 4 te maken. Voor een uitstekende gids voor het ontwerpen en interpreteren van bindende analyses, zie Pollard 10 . Een stroomdiagram ( Figuur 2 ) wordt verstrekt voor hulp bij de analyse en kwantificering.
- Bepaal het concentratiebereik om te testen.
OPMERKING: Het concentratiebereik hangt af van het eiwit en moet zich overschrijden van een concentratie onder de schijnbare K d ( bijv. 1 μM) tot concentraties die voldoende zijn om binding te verzadigen. Het is van cruciaal belang dat de binding verzadiging bereikt in meerdere monsters in het hoge einde van het concentratiebereik om een nauwkeurige bindingscurve te genereren ( Figuur 1C ). Zoals hierboven vermeld, hebben veel actine-bindende eiwitten een affiniteit voor F-actine in het lage micromolaire bereik (1-5 μM). Voor een eiwit met een Kd van 0,5-1 μM zou een bruikbaar uitgangsconcentratiebereik 0,1-1 zijn0 μM. - Hard spin (stap 2.3) het eiwit van belang om aggregaten te verwijderen. Verdun het eiwit serieel om een concentratieserie te maken die 7-8 monsters bevat bij 2x de te testen eindconcentratie. Als bijvoorbeeld het bereik om te testen 0,1-8 uM is, bereidt u de volgende verdunningen op in 1x reactiebuffer: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 en 0,2 μM.
OPMERKING: Als het toegevoegde eiwit meer dan 10% -20% van de eerste verdunning (het 16 μM monster in het bovenstaande voorbeeld) bevat, kan het nodig zijn om het eiwit verder te concentreren of de dialyse te dialyseren Eiwit in 1x reactiebuffer. Zorg ervoor dat u genoeg van elke verdunning voor "plus F-actine" en "geen F-actine" monsters voorbereidt. - Bereiding van monsters (zoals in sectie 4), door het eiwit van belang te verwennen tot de gewenste concentraties in 1x reactiebuffer in ultracentrifugebuizen. Houd de monstervolumes laag (40-60 μL) om te vermijden dat u grote hoeveelheden eiwit gebruikt door ultracentraal te gebruikenRifuge buizen met kleine minimumvolumes ( bijv . 7 x 20 mm buizen die elk 0,2 ml bevatten).
- Voeg F-actine toe aan de gewenste eindconcentratie op de juiste monsters en breng het volume op met 1x reactiebuffer. Bijvoorbeeld, voor 50 μl reacties met 2 μM F-actine, zorg ervoor dat elk monster 25 μL 2x eiwit, 10 μl 10 μM F-actine en 15 μl 1x reactiebuffer heeft. Inclusief controlemonsters (stappen 4.4.2 en 4.4.3).
OPMERKING: Voor negatieve en positieve controles gebruik één concentratie binnen het te testen bereik (stap 5.1), ideaal in de buurt van het midden tot het hoge uiteinde van het bereik ( bijv. 4 μM indien het concentratiebereik 0,1-10 μM is).
- Voeg F-actine toe aan de gewenste eindconcentratie op de juiste monsters en breng het volume op met 1x reactiebuffer. Bijvoorbeeld, voor 50 μl reacties met 2 μM F-actine, zorg ervoor dat elk monster 25 μL 2x eiwit, 10 μl 10 μM F-actine en 15 μl 1x reactiebuffer heeft. Inclusief controlemonsters (stappen 4.4.2 en 4.4.3).
- Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij RT.
- Na 30 minuten verwijder 1/5 van elk monster ( bijv. 10 μL van de 50 μL reactie) en meng met 20 μl water en 10 μl 4x monsterbuffer.
OPMERKING: dit zijn de "Totaal" sAmples en wordt gebruikt om een standaardkromme te genereren. - Laad de monsters in de ultracentrifuge rotor. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 100.000 xg en 4 ° C.
- Optioneel, na centrifugering, verwijder 3/4 van de supernatant ( bijv. 30 μL als het gecentrifugeerde volume 40 μL) uit elke buis was en meng deze met 4x monsterbuffer (10 μL in dit geval) in een aparte microfuge buis. Verwijder de overblijvende supernatant met een gel-laadpunt, let erop dat de pellet niet wordt verstoord.
OPMERKING: Bij het meten van de bindingsaffiniteit hoeft het supernatant niet te worden uitgevoerd. Niettemin kan het nuttig zijn om de supernatant op te slaan, vooral bij het testen van een nieuw eiwit. - Verwijder de supernatant indien niet analyseren (stap 5.7).
- Resuspendeer de pellet in 1 volume van 1x monsterbuffer ( bijv. 40 μl indien het gecentrifugeerde volume 40 μl was).
- Voeg monsterbuffer aan alle buizen toe en incubeer gedurende tenminste 5 minuten bij RT.
- TrReinig het monster 8-10 keer met een p200 pipettip, wasser het pelletgebied van de buis voortdurend. Scherp de pipettaart voorzichtig over de pellet tijdens de trituratie om te helpen bij resuspensie.
- Breng het geresuspendeerde eiwit over naar een microcentrifugebuis.
OPMERKING: dit zijn de "Pellet" monsters. - Analyseer de Total en Pellet-monsters door SDS-PAGE 8 . Voer alle monsters op één gel, indien mogelijk; Indien niet, laat de pelletmonsters op een gel en de totale monsters op een seconde lopen.
OPMERKING: Gezien het aantal monsters, wordt een groot gel systeem aanbevolen voor analyse. Als monsters worden uitgevoerd op twee of meer gels, is het belangrijk dat alle gels identiek zijn ( dwz dezelfde Coomassie-oplossing en een identieke tijd in vlek / afbraak). - Image Coomassie-gekleurde gels met behulp van een beeldvormingssysteem dat de eiwitbandintensiteiten meet over een breed ( dwz een twee tot drie log) en lineair bereik. Zorg ervoor dat de afbeeldingen aOpnieuw verzameld zonder verzadigde pixels.
OPMERKING: Lasergebaseerde beeldsystemen bieden de beste gevoeligheids- en signaal-geluidsverhoudingen. - Met behulp van ImageJ of een vergelijkbaar analyse programma, meet de intensiteit van eiwitband en bereken de hoeveelheid gebonden eiwit.
OPMERKING: Gebruik voor alle voorbeeldmetingen het selectievakje in ImageJ om een regio van interesse (ROI) rond elke band te tekenen en meet (Analyse> Meet) het gebied en gemiddelde grijze waarde. Bereken de achtergrond voor elke gel door de gemiddelde grijze waarde van een gebied zonder monster te meten. Trek de achtergrondgemiddelde grijze waarde van elke ROI gemiddelde grijze waarde af en vermenigvuldig vervolgens met het gebied om de geïntegreerde dichtheidswaarde voor elke band te verkrijgen.- Meet het eiwit van belangsterkte intensiteiten van de totale monsters ( figuur 2A ).
- Genereer een standaardkromme door de bandintensiteit ( dwz de geïntegreerde dichtheidsmetingen) tegen eiwitmassa te plotten ( Figuur2B).
- Meet de hoeveelheid eiwit van belang die co-sedimenteert met F-actine (co-sedimented protein, Figuur 2C ).
- Meet de hoeveelheid eiwit van belang die in de afwezigheid van F-actine (achtergrond sedimentatie, Figuur 2D ) sedimenteert.
- Trek de achtergrond sedimentatie af van het co-sedimentatie eiwit ( dwz trek de waarden van stap 5.13.4 af van stap 5.13.3) om de hoeveelheid eiwit die gebonden is aan F-actine te bepalen.
- Meet de hoeveelheid F-actine in elke pellet ( Figuur 2E ). Bepaal de gemiddelde hoeveelheid F-actine per monster en verdeel dan elk monster met het gemiddelde om de verhouding van F-actine in elk monster te bepalen ten opzichte van het gemiddelde ( dwz de getallen onder de banden).
- Voor elk monster verdeel de hoeveelheid gebonden proteïne (berekend in stap 5.13.5) door de F-actin actin-pelletverhouding (stap 5.13.6) om in te stellen voor verschillen in de pellet.
NOTE: Deze waarde is het genormaliseerde gebonden eiwit. - Gebruik de standaardkromme (stap 5.13.2) om de hoeveelheid (massa) van genormaliseerd gebonden eiwit (stap 5.13.7) in elk monster te berekenen.
OPMERKING: Het eiwit dat oorspronkelijk is verwijderd (het "totaal" monster), evenals het geladen hoeveelheid (dat, tenzij de volledige pellet geladen is, een deel van de pellet zal zijn) moet worden verantwoord bij het berekenen van de totale hoeveelheid eiwit Dat pelleteerde. - Bepaal de concentratie van gebonden eiwit in elk monster uit de totale massa eiwit in de pellet (berekend in stap 5.13.8) en het volume van het monster. Trek deze waarde af van de startconcentratie om de hoeveelheid vrij eiwit te bepalen. Verdeel de concentratie van gebonden eiwit door de concentratie van actine (μM / μM actin) en plot versus de concentratie van vrij eiwit om een bindingscurve te genereren ( Figuur 1C ).
OPMERKING: Aangezien F-actine geen enkele, uniforme soort is, is het moeilijkCultus om de molaire concentratie van F-actine uit de G-actin concentratie te extrapoleren. Gebruik de start G-actin concentratie om de hoeveelheid gebonden eiwit (μM / μM actin) te bepalen en schat de schijnbare concentratie van bindingsplaatsen in de reactie te bepalen. De concentratie van bindingsplaatsen is gewoonlijk minder dan de concentratie van actine monomeren in de reactie omdat niet alle actine polymeriseert en omdat een enkel actine bindend eiwit molecuul contact kan maken met meerdere monomeren op het actine filament.
- Met behulp van een statistisch programma bepaalt u de affiniteit (Kd) en Bmax van de bindingscurve door gebruik te maken van nonlinear least squares regressie.
OPMERKING: Scatchard plots worden ontmoedigd voor het analyseren van bindende gegevens, mede omdat ze kunnen verduisteren of binding verzadigd is en omdat ze experimentele fout 10 kunnen vervalsen.
Representative Results
We onderzochten αE-catenin homodimer binding aan F-actine in de co-sedimentatie assay. Sinds vorige experimenten hebben aangetoond dat de affiniteit van aE-catenin homodimeer voor F-actine ongeveer 1 μM en de B max nabij 1 11 is , hebben we de test uitgevoerd met een lage concentratie van F-actine (0,2 μM in plaats van 2 μM; de discussie). Aangezien 0,2 μM onder de kritische concentratie ligt, werd phalloidine toegevoegd om het F-actin te polymeriseren gepolymeriseerd uit konijnskeletspier G-actine (stap 3.3). Toenemende concentraties van aE-catenine homodimeer (0,125-12,0 μM) werden geïncubeerd in aanwezigheid of afwezigheid van 0,2 μM F-actine. De monsters werden gecentrifugeerd en de resulterende pellets werden geanalyseerd ( Figuur 1A ). Zoals verwacht, vergelijkt de aE-catenin-homodimeer die samen met F-actine boven de achtergrond ( Figuur 1A , de F-actine-pelletmonsters aan de geen-F-acTin pellet monsters). BSA werd uitgevoerd als een negatieve controle ( Figuur 1B ). Gebonden eiwit werd gekwantificeerd en geproduceerd over vrij eiwit om de affiniteit van de interactie te berekenen ( Figuur 1C ). De getekende gegevens passen het beste bij een Hill-vergelijking. De berekende K d was 2,9 μM, de B max was 0,2 en de heuvelcoëfficiënt (h) was 4,8. Aldus bindt aE-catenine homodimeer F-actine coöperatief met een lage micromolaire affiniteit, consistent met eerdere werkzaamheden (een Kd van 2,9 μM versus ~ 1,0 μM) 11 .
Figuur 1: Hoge snelheid F-actine co-sedimentatie assay. ( A ) Verhoging van concentraties (0,125-12,0 μM) αE-catenine homodimeer werden geïncubeerd met (linker panelen) of zonder (rechter panelen) 0,2 μM F-actine gestabiliseerd met phalloidin. Ze werden 30 minuten geïncubeerd bij RT en gecentrifugeerd. Het totaal (7,5% van het uitgangsmateriaal) en gepelleteerd materiaal (50% van het gepelleteerde materiaal) werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie-kleurstof. ( B ) 4 μM BSA werd uitgevoerd als een negatieve controle. Totale en pelletsteekproeven, met (+) of zonder (-) F-actine, werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie-kleurstof. ( C ) Verbonden αE-catenine (μM / μM actine) van A werd getekend tegen vrij αE-catenin (μM), en de data past bij een Hill-vergelijking (rode lijn). De K d , B max en Hill coëfficiënt (h) zijn vermeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Actin pelleting kwantificatie - flow chart. In dit schema worden de belangrijkste stappen beschreven in sectie 5, met voorbeelden van totaal- en pelletmonsters ( A , CE ) en de standaardcurve ( B ) die wordt gebruikt voor kwantificering. 5.13 stappen: 1 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang in de totale monsters (A). 2 ) Genereer een standaardkromme door de bandintensiteit tegen eiwitmassa (B) te plotten. 3 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang die mede-sedimenteert met F-actine ( C ). 4 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang die in de afwezigheid van F-actine ( D ) pelleteerde. 5 ) Subtract D van C om de hoeveelheid eiwit die gebonden is aan F-actine te bepalen. 6 ) Meet de hoeveelheid F-actine in elke pellet (E), bereken de gemiddelde hoeveelheid F-actine per monster en verdeel elk monster op het gemiddelde (de onderstaande aantallen tonen de verhouding). 7 )Voor elk monster verdeel de hoeveelheid gebonden eiwit (berekend in stap 5) door de F-actin pelletsverhouding (berekend in stap 6) om af te stemmen op verschillen in de pellet. 8 ) Gebruik de standaardkromme ( B ) om de hoeveelheid (massa) van genormaliseerd gebonden eiwit in elk monster te berekenen (stap 7). 9 ) Bepaal de concentratie van vrij eiwit en gebonden proteïne om een bindende bocht te creëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De actin co-sedimentatie test is een eenvoudige techniek die snel kan bepalen of een eiwit F-actine bindt. Met enkele wijzigingen kan de techniek ook worden gebruikt om de affiniteit van de interactie te meten. Naast de punten die in het bovenstaande protocol zijn opgeworpen, dienen de volgende problemen in aanmerking te komen bij het ontwerpen, uitvoeren en interpreteren van de test.
Proteïne van belang
Vers bereid of bevroren eiwit kan in de test worden gebruikt. Als bevroren eiwit wordt gebruikt, wordt het sterk aanbevolen dat de resultaten worden vergeleken met vers (nooit bevroren) eiwitten om ervoor te zorgen dat het bevriezen geen invloed heeft op F-actin binding.
G-actin Bron
Veel pelleteringsexperimenten gebruiken G-actine geïsoleerd van spier door zijn relatieve overvloed. Er zijn drie belangrijkste actinisotypes in zoogdieren - alfa, bèta en gamma - die opmerkelijk gelijkwaardig zijn (> 90% sequentie identity). Niettemin zijn er functionele verschillen tussen de isotypen 12 , 13 . Indien mogelijk, moet het G-actin isotype dat in de bindingsassay gebruikt wordt, overeenkomen met het in vivo isotype. Bijvoorbeeld, als een eiwit in de skeletspier wordt uitgedrukt, is alpha-actine de beste keuze; Als een eiwit wordt uitgedrukt in fibroblasten, wordt beta-actine aanbevolen.
Phalloidin Gebruik
Aangezien phalloidin F-actine bindt, kan het de binding van sommige F-actine bindende eiwitten blokkeren of zelfs blokkeren ( bijv. Phalloidin blokken cofiline van binding aan actinfilamenten) 14 . Zo moet phalloidin met voorzichtigheid worden gebruikt en de resultaten vergeleken met monsters die niet met phalloidine behandeld zijn, indien mogelijk.
Hoge Achtergrond
Het is niet ongewoon dat eiwitten sedimenten in afwezigheid van F-actine ( Figuur 1A , geen F-actine pelletmonsters). Echter, hoge niveaus van achtergrond sedimentatie kunnen true actin co-sedimentatie maskeren en het moeilijk maken, of niet onmogelijk, te bepalen of een eiwit F-actine bindt of de affiniteit van de interactie meet. Het toevoegen van polidicanol aan de reactiebuffer (stap 4.1) kan de achtergrond aanzienlijk verminderen en is een makkelijke oplossing. Als dat de achtergrond niet vermindert, kan het bijstellen van de reactiebuffer, zoutconcentratie en / of incubatietemperatuur helpen.
Bindende Curve
Om een bindingscurve te genereren, is het nodig om de concentratie van het eiwit van belang of het F-actine over een reeks reacties te variëren. In de praktijk is het gemakkelijker en beter om F-actine bij een vaste concentratie te handhaven en de concentratie van het eiwit van belang te variëren. Het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie ( bijv. 2 μM) in de pelleteringsbepaling beperkt de niet-specifieke inhaling bij hogere concentraties van F-actine en voorkomtDepolymerisatie bij lagere (<0,5 μM) concentraties van F-actine. Depolymerisatie kan voorkomen worden met gebruik van phalloidine, hoewel dit een mogelijke complicerende factor in het systeem introducert (zie stap 3.3 en hoger). Het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie maakt het ook mogelijk om de F-actin pellet over de monsters te vergelijken (en normaliseren) en om mislukte experimenten te identificeren ( dwz waar de F-actin pellet zeer variabel is, waardoor analyses over concentraties voorkomen). Tenslotte, het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie maakt het mogelijk om te bepalen of de binding aan het actinfilament coöperatief is ( Figuur 1C ).
Verzadigde Binding
Zoals bij alle bindende experimenten is het van cruciaal belang dat de binding aan F-actine verzadigd is en dat de concentratie van eiwit plus F-actine plateaus ( Figuur 1C ). Zonder een plateau is het niet mogelijk om een nauwkeurige dissociatie-evenwichtskonstante te berekenen. Zo, hetHet is belangrijk om de verdovingsreeks die moet worden getest, zorgvuldig te plannen en om altijd hogere concentraties eiwitten te bevatten ( dwz ten minste 5- tot 10 keer hoger dan de verwachte K d ).
Bindende analyse
Om de gemeten dissociatieconstanten concluderend te zijn, moet de test worden uitgevoerd met behulp van een F-actin concentratie die de concentratie van bindingsplaatsen op F-actine toelaat voor het belang van het eiwit veel lager dan de affiniteit. Om te controleren of aan dit criterium is voldaan, schat de concentratie bindingsplaatsen van B max . Bijvoorbeeld, als [F-actin] 2 μM en Bmax = 0,5 was, dan [bindingsplaatsen] ≈ 1 μM. De K d moet ten minste 5- tot 10-voudig groter zijn dan [bindingsplaatsen]. Als de gemeten Kd van dezelfde orde van grootte als [bindingsplaatsen] is, dan is het mogelijk dat de waargenomen bindingscurve een titratie van high affiniteitsbindende si vertegenwoordigtTes dan een echte bindende isotherm. Als dit wordt waargenomen, herhaal de test met een 10-voudige lagere F-actin concentratie om een nauwkeurige affiniteit te meten. Voor interacties met hoge affiniteit kan falloidine stabilisatie (stap 3.3) nodig zijn om een F-actin concentratie te bereiken die laag genoeg is om nauwkeurig affiniteit te meten.
Tenslotte zijn er fundamentele beperkingen met de co-sedimentatie-analyse die onderzoekers moeten bewust zijn bij het uitvoeren en evalueren van de test. Het belangrijkste is dat de co-sedimentatie-analyse geen echte evenwichtskonstante produceert. De producten van binding ( dat wil zeggen eiwit plus F-actine) worden gescheiden van de reactanten tijdens centrifugeren, waarna de producten dan kunnen dissociëren om een nieuw evenwicht te creëren. Als gevolg daarvan kan de co-sedimentatie-analyse misverwerkende of onvoldoende detecties voor lage-affiniteit detecteren. Aangezien veel actine-bindende eiwitten een lage ( d.w.z. micromolaire) affiniteit voor F-actine hebben, een negatief resultaat (
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant HL127711 naar AVK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 | |
| S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 | |
| Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL | ThermoFisher Scientific | 45233 | |
| Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 | |
| Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 | |
| Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 | |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |
References
- Pollard, T. D.
- Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins. Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).
- Lappalainen, P. Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks. Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).
- Mullins, R. D., Hansen, S. D. In vitro studies of actin filament and network dynamics. Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).
- Miller, P. W., et al. Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin. J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).
- Wickline, E. D., et al. alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments. J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).
- Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Hansen, S. D., et al. alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).
- Perrin, B. J., Ervasti, J. M. The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).
- Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).
- Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments. J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays. Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).
