Summary
Dit protocol beschrijft de methode voor het bepalen van basale en forskolin gestimuleerde lipolyse in inguineuze vetkussens die worden verkregen uit normale Chow Diet (NCD) of met hoge vet dieet (HFD) ± capsaicine gevoed wild type muizen. Als een index voor lipolyse werd de glycerol-afgifte gemeten van ingewanden van adipose vetpads.
Abstract
Lipolyse is een proces waarbij de lipide opgeslagen als triglyceriden in vetweefsels worden gehydrolyseerd in glycerol en vetzuren. Dit artikel beschrijft de methode voor de meting van basale en forskolin (FSK) gestimuleerde lipolyse in de ingewanden van de ingewanden die geïsoleerd zijn van wilde type muizen die normaal chow dieet (NCD), dik vet dieet (HFD) of een vet dieet met 0,01 % Van capsaïcine (CAP; transient receptor potential vanilloid subfamily 1 (TRPV1) agonist) gedurende 32 weken. De hier beschreven werkwijze voor het uitvoeren van ex vivo lipolyse wordt aangenomen van Schweiger et al. 1 Wij presenteren een gedetailleerd protocol voor het meten van glycerol niveaus door UV-zichtbare (UV / VIS) spectrofotometrie. De hier beschreven methode kan gebruikt worden om inguineuze vetpadsjes te isoleren voor lipolyse metingen om consistente resultaten te verkrijgen. Het protocol dat wordt beschreven voor inguikende vetpadsjes kan gemakkelijk worden uitgebreid om lipolyse in andere weefsels te meten.
Introduction
Adipose weefsels bewaren energie aangezien vet 2 en vetzuuroxidatie nodig is voor thermogenese 3 , 4 . Vetzuren die door diëten worden ingezet, worden samen met apoproteïnen in chylomicrons verpakken en via bloedcirculatie aan verschillende weefsels in het lichaam afgeleverd. Hoewel de meeste cellen in het lichaam een reserve van energie opslaan, slaat vetweefsel overmatige energie op als vet 5 , 6 . Lipolyse in vetweefsel wordt gereguleerd door complexe processen en de moleculaire details van lipolyse blijven nog vaag 7 .
Lipolyse is een proces waarbij triglyceriden (TGL) opgeslagen in vetweefsel worden gehydrolyseerd om glycerol en vetzuren (FA) te produceren door het enzym adipose triglyceride lipase (ATGL) 8 . Verandering in basale en gestimuleerde lipolyse is een kenmerkend kenmerk van obesitas. De bAsale lipolyse wordt gereguleerd door ATGL activatie 9 , die TGL omzettert naar diacylglycerol (DAG), dat vervolgens wordt geëhydrolyseerd aan monoacylglycerol (MAG). Activatie van hormoon gevoelige lipase (HSL) via adenylyl cyclase activeert cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) afhankelijke proteïne kinase A (PKA) stimulatie en veroorzaakt lipolyse. Meting van lipolyse, basaal en gestimuleerd, is daarom belangrijk om de activiteit van eiwitten die bij dit proces betrokken zijn te analyseren. Ook het ontrafelen van de moleculaire regulering van lipolyse kan gunstig zijn voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën tegen obesitas 10 . Aangezien moleculen die lipolyse en vetzuuroxidatie stimuleren, potentiële kandidaten zijn voor het verminderen van vetten die in depots worden opgeslagen, is het belangrijk om een robuuste test voor reproduceerbaarheid te gebruiken.
Eerder gepubliceerde gegevens suggereren dat activatie van TRPV1 eiwit uitgedrukt in wit vetweefsel door CAP versterkte basaleEn FSK (adenylyl cyclase activator) gestimuleerde lipolyse in inguikende vetpads 11 . Vorige onderzoek suggereert ook dat de langetermijnactivering van TRPV1 door CAP het PKA 12 activeert. Aangezien de activatie van PKA lipolyse 13 , 14 stimuleert, waarbij zowel de basale als PKA-afhankelijke gestimuleerde lipolyse in buikvliespads geïsoleerde worden geïsoleerde van NCD of HFD (± CAP) -fed muizen na 32 weken van de voeding van de respectieve diëten, de rol van TRPV1 Activatie in lipolyse.
Dit artikel beschrijft een efficiënte methode om basale en gestimuleerde lipolyse te bepalen. Hoewel andere methoden die gebruik maken van radioactieve isotopen van glycerol en vervelende high performance vloeistofchromatografie of gaschromatografie / massaspectrometrie voor metingen 15 , 16 beschikbaar zijn, biedt deze methode een meer directe, eenvoudige en kosteneffectieveTechniek om lipolyse in vetweefsels te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen volgen de richtlijnen voor dierenwelzijn van de Universiteit van Wyoming.
1. Behuizing en voeding van dieren
OPMERKING: Volwassen mannelijke wilde type muizen (C57BL / 6) (12 tot 24 weken oud) werden gefokt in de onderzoeksdierfaciliteit volgens de goedgekeurde protocollen van de Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC).
- Vanaf week 6 worden huismuizen in groepen van vier in afzonderlijke kooien toegewezen en willekeurig toegewezen tot voedingsgroepen van NCD of HFD (± 0,01% CAP) tot de leeftijd van 38 jaar.
OPMERKING: CAP is een agonist van TRPV1 kanaal eiwit uitgedrukt in vetweefsels 11 , 17 . Meng CAP met HFD in een blender in de kap en breng het gemengde mengsel over op een dienblad met kleine 1 in 2 partities. Houd de bak in een -20 ° C vriezer. Verwijder de lade die het HFD + CAP-dieet van de vriezer na 24 uur bevat en verwijder deze in een container bij -20 &# 176; C vriezer tot gebruik. - Huismuizen in een klimaat gecontroleerde omgeving (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% vochtigheid) met een 12/12-licht / donkere cyclus met toegang tot aangewezen dieet en water ad libitum .
- Op het einde van 38 weken ontleed ingewanden vetweefsels en gebruik voor lipolyse experimenten (secties 2-7).
2. Voorbereiding van muizen voor de experimenten
- Anesthetiseer muizen door injectie van ketamine en xylazine mengsel (respectievelijk 10 mg / kg en 80 mg / kg lichaamsgewicht). Injecteer 0,01 ml van het mengsel / 10 g lichaamsgewicht van de muis.
- Bevestig diepe verdoving door een stevige teenknijp. Als er een pedaalreflex is, test de muis na ten minste 30 seconden opnieuw.
- Gebruik vetvezelsalf om de droogheid van de ogen te voorkomen tijdens de verdoving. Laat geen muizen onbewaakt tijdens een van de procedures.
- Euthanize muizen door injectie van een hoge dosis ketamine en xylazine mengsel injectie (respectievelijk 10 mg / kg en 80 mg / kg lichaamsgewicht) mengselE (0,01 ml / 10 g lichaamsgewicht) gevolgd door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Deze methode van euthanasie is goedgekeurd door de IACUC van de Universiteit van Wyoming.
3. Isolatie van buikspieren
- Plaats de muis (gedurende 32 weken met NCD of HFD (± CAP)) aan de linkerkant voor de procedure.
OPMERKING: Door de muis aan de linkerzijde te plaatsen, zullen de linker voorbanden en linker achterlijm op het dissectieplatform liggen, terwijl de rechter voorbanden en rechter achterblok van het platform naar voren komen. - Steriliseer het huidoppervlak met een 2 inch 2 gaasblokje die in ongeveer 2,5 ml 70% ethanol is geweekt. Maak een 2 - 3 mm laterale snede door de huid met behulp van een scalpel om de onderliggende vetlaag te onthullen.
- Maak een 1 cm snede (afhankelijk van de grootte van de muis) door de huid met een scalpel net onder de ribbekleding over het dorsale oppervlak dat aan de twee zijdelingse insnijdingen past.
- Schil de huidklep door het voorzichtig te slepenGebruik steriele tang en laat het subcutane pad intact door de vetpadsjes niet te knippen. Dit is het dikke pad dat onder de huid ligt.
- Dissect het vetpaneel zorgvuldig van de onderliggende spier en fascia met behulp van een schaar. Trek het vetpaneel als het uit de onderliggende spier is gesneden.
OPMERKING: Het gewicht en de grootte van de vetpads hangt af van het type muizen (NCD of HFD (± CAP) -fed). - Gebruik een pincet om deze over te brengen naar een petrischaal met fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) tot de lipolyse-experimenten, bij kamertemperatuur (~ 15 min).
- Zet de dikke pads uit de rechterkant van de muis, zoals beschreven in stappen 3.2-3.6.
4. Basale glycerolvrijstelling van de buikspieren
- Gebruik een scherpe schaar om ongeveer 20 mg vetweefsel in 5 tot 8 stukken te snijden.
- Incubeer de gesneden stukken ingewande vetpads in 200 μl incubatiemedium (Dulbecco's Modified Eagel Medium (DMEM) die 2% vetzuur bevatrunderserumalbumine (BSA)) bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid gedurende 60 min.
- Verzamel het incubatiemedium en vries bij -80 ° C voor lipolyse assay.
OPMERKING: De snijstukken worden gebruikt voor het bepalen van eiwitconcentratie na lipidextractie. - Breng de gesneden vetstukken met behulp van tweezers in 1 ml extractieoplossing (chloroform: methanol (2: 1, v / v) en 1% ijsazijn) en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C onder krachtig schudden bij 100 rpm. Gooi de vet extractie oplossing weg.
OPMERKING: Deze stap trekt vet uit de gesneden stukken. Gooi de vet-extractieoplossing weg omdat het de eiwitbepaling zal bemoeien. - Breng het weefsel over (vanaf stap 4.2.2) met behulp van pincetjes in een steriele microfuge buis die 500 μl lysisoplossing bevat (0,3 N NaOH met 0,1% natriumdodecylsulfaat, SDS) en incubeer overnacht (12 uur) bij 55 ° C onder krachtig schudden Bij 100 tpm.
- Verzamel het incubatiemedium en vries bij -80 ° C voor lipolyse assay.
- Bepaal de eiwitconcentratie van weefsel (stap 4.2.3) met behulp van het bicinchoninezuur (BCA) -reagens en BSA als standaard 18 .
- Dooi het bevroren medium (stap 4.2.1) op ijs en bepaal het glycerolgehalte van het medium met behulp van een vrij glycerolreagens zoals beschreven in protocols secties 6 en 7 6 .
- Extrapoleren van de concentratie glycerol in monsters uit de standaardkromme die is geformuleerd met behulp van glycerolstandaarden 19 en express lipolyse als nanomol glycerol per mg eiwit per h 20 .
5. FSK-gestimuleerde lipolyse
- Preincubate ongeveer 20 mg inguinale vetpads (5 tot 8 stuks stukjes) verkregen uit NCD of HFD (± CAP) -fed wilde type muis in 200 μL DMEM, bevattende 2% vetzuurvrije BSA, 10 μM FSK en 5 μM Triacsine C bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid gedurende 60 min.
- Breng de stukken weefsel met een pincet een identiek medium en incubeer nogmaals 60 min bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid. Verzamel het incubatiemedium en opslaan bij -80 ° C tot de lipolyse-analyse.
OPMERKING: Stimuleren van lipolyse veroorzaakt een snelle afgifte van vetzuren en glycerol binnen 15 minuten, dat is lineair tijdens het eerste uur en daarna plateaus. Aangezien de snelheid van gestimuleerde lipolyse hoger en stabiel is tussen het eerste en tweede uur van FSK-stimulatie, werd dit protocol gemeten lipolyse in de gestimuleerde toestand na de tweede incubatieperiode zoals eerder beschreven 1 . Dus, beide experimentele stappen (5.1 en 5.1.1) zijn noodzakelijk.
6. Bereiding van Vrij Glycerol Reagens
- Reconstitueer het glycerolreagens 19 in 40 ml gedeïoniseerd water in een amberkleurige glazen flesje, plaats een stop op de fles en meng goed door 10 keer in te keren. Meng niet door schudden.
- Bewaar de injectieflacon bij 4 ° C in een koelkast, beschermd tegen licht, door de injectieflacon volledig met aluminiumfolie te bedekken.
- Ga verder met de bereiding van glycerol standaard (sectie 7).
7. Bereiding van Glycerol Standaard en Bepaling van Glycerol Inhoud
- Maak een voorraad van 1 mM door 35 μl van de geleverde voorraad te verdunnen met 65 μl gedeïoniseerd water.
OPMERKING: De leverancier geleverde glycerol standaard voorraad is 2,8 mM glycerol. - Neem vijf 1 cm lengte wegwerp methacrylaatcuvetten. Benoem de cuvetten met een markering als 0, 1.25, 2.5, 5 en 10 nmol standaard.
- Voeg 0, 1.25, 2.5, 5 en 10 μL 1 mM glycerol standaard toe aan de respectievelijke gelabelde cuvetten. Maak het volume van elke cuvette tot 10 μL met gedeïoniseerd water.
- Maak 1 tot 10 verdunning van alle monsters (uit stap 4.4 of 5.1.1) door 10 μl van het monster toe te voegen aan 90 μl gedeïoniseerd water in verse 500 μL geperfileerde centrifugebuizen. Voeg 10 μL van de verdunde monsters toe in de cuvetten die zijn gemerkt met het desbetreffende monster identificatienummer.
- Schakel de UV-VIS-spectrofotometer in en zet de golf inLengte tot 540 nm.
- Verwarm het vrije glycerolreagens naar kamertemperatuur door de injectieflacon (stap 6.2) bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten te houden.
- Stel een reeks gemerkte cuvetten op als blanco "0" nmol standaard (stap 7.3), standaards (stap 7.3) en monsters (stap 7.4).
- Voeg 10 μL van elk van de standaard en het monster toe in de respectieve gemerkte cuvette. Gebruik "0" nmol standaard als leeg.
- Voeg 0,8 ml gratis glycerolreagens in elke cuvette, die de glycerolstandaarden bevat met een pipet van 1 ml.
- Bedek de cuvette met een 1,5 cm vierkante plastic paraffine film en meng de inhoud door de cuvette 3 keer in te wenden en plaats gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de cuvette in de UV-VIS spectrofotometer en teken de absorptie (540 nm golflengte) op.
- Bepaal de standaardkromme met behulp van de concentraties van de normen (nmol) in de X-as en de opgenomen absorptie in de Y-as.
- Bereken de concentratie van glYcerol in de monsters (nmol) door extrapolatie onder gebruikmaking van de standaardkromme die in stap 7.12 is getekend.
- Vermenigvuldig de concentratie van monsters (nmol / cuvette) met de verdunningsfactor 10 (zie stap 7.4) en 20 (totaal volume)
- Verdeel de concentratie glycerol in elk monster (stap 7.13) met het mg eiwit berekend volgens de BCA-methode.
OPMERKING: Aangezien de ingewanden van de ingewanden voor 60 minuten geïncubeerd worden, vertegenwoordigen de resultaten als nmol glycerol / mg eiwit / uur.
- Maak een voorraad van 1 mM door 35 μl van de geleverde voorraad te verdunnen met 65 μl gedeïoniseerd water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het effect van CAP op basale en gestimuleerde lipolyse te evalueren, heeft dit onderzoek gemeten lipolyse in inguineuze vetvochtige pads geïsoleerd van NCD of HFD (± CAP) -fed wilde type muizen. De representatieve resultaten voor de basale en FSK-gestimuleerde lipolyse voor de ingewanden worden weergegeven in Tabel I. Basal- en FSK-gestimuleerde glycerolvrijstelling in aanwezigheid van Triacsin C, die acylcoA synthetase remt en voorkomt de regeneratie van TGL. Zoals getoond in figuur 1 , onderdrukken HFD de FSK-gestimuleerde lipolyse, en CAP verhoogde zowel basale als FSK-gestimuleerde lipolyse. Triacsine C werd gebruikt om de regeneratie van TGL uit glycerol en vetzuren 11 te remmen. Alle gegevens worden uitgedrukt als middel ± SEM Vergelijkingen tussen groepen worden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA en post-hoc analyses werden uitgevoerd met behulp van de t- toets van de Student. Voorbeeld maten zijn ingesteld Om te bepalen of de gemiddelde waarde van een uitkomstvariabele in één groep significant verschilt van die in een andere groep. Een p-waarde <0,05 wordt beschouwd als statistisch significant.
Figuur 1: CAP verhoogt de basale en FSK-gestimuleerde glycerolvrijstelling in de buikspieren. Staafdiagrammen vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van basale en FSK (10 μM) gestimuleerde glycerolvrijstelling (nmol / mg proteïne / h) in de ingewanden van de ingewanden die geïsoleerd zijn van NCD of HFD (± CAP) gevulde wilde type muizen. ** Vertegenwoordigt statistische betekenis voor p-waarde <0,05 voor n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
5 / 55625fig2.jpg "/>
Figuur 2: Hydrolyse van triglyceriden (TGL) resulteert in de opwekking van vrije vetzuren (FFA) en glycerol. FFA ondergaat mitochondriale P-oxidatie. Dit stimuleert thermogenese, samen met de upregulation of uncoupling protein 1 (UCP-1). Glycerolvrijstelling wordt gemeten volgens het protocol dat in het artikel wordt beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| lipolyse (Nmolen glycerol / mg eiwit / h) | NCD (N = 6) | HFD (N = 6) | HFD + CAP (N = 6) |
| basale | 16,22 ± 1,28 | 17,16 ± 1,48 | 52,07 ± 2,66 |
| FSK gestimuleerd (Met Triacsin C) | 54,88 ± 3,27 | 41,23 ± 4,43 | 72,04 ± 4,16 |
Tabel 1: Effect van GLB op basale en FSK gestimuleerde lipolyse in buikspieren. Gemiddelde basale en FSK-gestimuleerde glycerol-vrijgave ± SEM gemeten in inguinet vet vetweefsel verkregen uit NCD, HFD of HFD + CAP-gevoed wild type muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het afbraakproces van TGL in glycerol en vetzuren wordt gekatalyseerd door ATGL 9 tijdens basale lipolyse en georkestreerd door een reeks eiwitten die de activatie van adenylylcyclase / PKA-afhankelijke weg gedurende gestimuleerde lipolyse 21 , 22 , 23 omvatten. Verbetering van lipolyse verhoogt het plasma gehalte aan vetzuren voor transport en energiegebruik 24 . Vetzuren worden door mitochondriën opgevat als acetyl CoA, die gebruikt wordt om energie te produceren.
De mate en omvang van lipolyse kan efficiënt worden gemeten door glycerol vrijkomen van vetweefsels ( Tabel 1 en Figuur 1 ). Hydrolyse van TGL produceert vetzuren en glycerol. Uit het vorige onderzoek bleek dat de voedingssupplementatie van CAP aanzienlijk de basale en FSK-gestimuleerde glycerol releas verbeterdeE van inguinale en bruine dikke pads 11 , 17 . De verhoogde productie van vetzuren uit verhoogde lipolyse zou kunnen dienen als voedingsmiddel om warmte en thermogenese te produceren, aangezien CAP ook de expressie van mitochondriale UCP-1 in de ingewanden van de ingewanden aanzienlijk verhoogde. In overeenstemming met deze opvatting blijkt eerder onderzoek dat de CAP de expressie van peroxisom proliferator geactiveerde receptor alfa (PPARα) in inguikale vetpads heeft verbeterd, die een kritische rol speelt bij de mitochondriale vetzuuroxidatie en bij de transcriptie-upregulatie van UCP-1 25 , 26 , 27 . Bijgevolg verhoogde GLB ook de metabolische activiteit, warmteproductie en energieuitgaven in HFD-gevoed muizen 28 , 29 . Verder, HFD-voeding onderdrukt gestimuleerde lipolyse terwijl CAP verhoogde basale en FSK-gestimuleerde PKA-afhankelijkeT lipolyse evenals verbeterde insuline gevoeligheid 30 . Daarom, zoals beschreven in het model in Figuur 2 , is het redelijk om te interpreteren dat CAP CAPTISCHE BEGRIPPELEN EN GE gestimuleerde lipolyse veroorzaakt zonder insulineresistentie te veroorzaken, aangezien het overtollige vet wordt verbrand om warmte te produceren door middel van mitochondriale UCP-1 upregulatie.
In dit artikel wordt de methode beschreven voor het meten van glycerolvrijstelling uit witte vetweefsels. Alhoewel verschillende methoden die stabiele isotopen van glycerol gebruiken, beschikbaar zijn, hebben ze een hoge prestatie vloeistofchromatografie of gaschromatografie / massaspectrometrie nodig voor metingen 15 , 16 . Ook zijn metingen van glycerolradio-tracer geassocieerd met niet-specificiteiten 31 . Alternatieve methoden omvatten het bepalen van mRNA en eiwitgehalten van lipasen en regulerende eiwitten die betrokken zijn bij lipolyse. Colorimetrische methoden zijn ook beschikbaar voor dEtermine de concentratie van lange keten vetzuren in omloop. De hier beschreven werkwijze is zeer efficiënt bij het analyseren van glycerolvrijstelling uit vetweefsels, aangezien het kan worden gedaan met behulp van een plaatlezer die in staat is tot fluorescentie en absorptiemeting. Ook biedt de vereenvoudigde analytische methode voor glycerolvrijstelling die in dit artikel wordt beschreven verbeterde stabiliteit en precisie 32 .
Standaard operatieprocedures dienen te worden toegepast, aangezien deze methode chirurgische technieken omvat om vetpads te isoleren. Dit protocol beveelt het gebruik van vetvrije BSA aan. Dit kan een luchtbellenvorming veroorzaken, wat de absorptie-aflezing inmengt. Daarom moet u voorzichtig zijn met het hanteren van monsters om luchtbellen te voorkomen. Voorzorg moet worden genomen om geen monsters te schudden of omkeren tijdens de BSA-behandeling, tenzij een dergelijke stap in het protocol wordt aanbevolen. Ook is de vetxtractiestap van inguinet vet belangrijk omdat de aanwezigheid van vet wit zal bemoeienH bepaling van het vetwegweefselproteïne. Bovendien, tijdens de bereiding van glycerolstandaarden, is het belangrijk om de inhoud door inversie te mengen en de injectieflacon niet te schudden.
De hier beschreven methode kan gebruikt worden voor het succesvol isoleren van buikvliespads voor verschillende assays, waaronder lipolyse metingen. Het lipolyseprotocol dat is beschreven voor inguikende vetpadsjes kan gemakkelijk worden uitgebreid tot de meting van lipolyse in andere weefsels. De methoden zijn geoptimaliseerd voor allerlei vetpads, evenals preadipocyten.
Samenvattend beschrijft dit artikel de methode voor het meten van basale en FSK-gestimuleerde glycerolvrijstelling in inguineuze vetvochtpadsjes geïsoleerd uit NCD of HFD (± CAP) -fed muizen. De gepresenteerde gegevens suggereren dat TRPV1-activering door CAP de basale en FSK-gestimuleerde lipolyse verhoogde en de accumulatie van lipiden in het vetweefsel verhinderde. Deze gegevens tonen een kritieke rol van TRPV1 eiwit in de regulatioN lipolyse in wit vetweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de AHA Award nr. 15BGIA23250030, het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de NIH onder onderscheiding nummer 8P20 GM103432-12 en de faculteitsbijdrage Universiteit van Wyoming in Aid to BT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
