Summary
Este protocolo descreve o método de determinação da lipólise basal e estimulada com forscolina em almofadas de gordura inguinal obtidas a partir de dieta normal (NCD) ou dieta rica em gordura (HFD) ± capsaicina alimentada com camundongos de tipo selvagem. Como índice de lipólise, a libertação de glicerol foi medida a partir de almofadas de gordura adiposa inguinal.
Abstract
A lipólise é um processo pelo qual o lípido armazenado como triglicerídeos em tecidos adiposos é hidrolisado em glicerol e ácidos graxos. Este artigo descreve o método para a medição de lipólise estimulada basal e forscolina (FSK) nas almofadas de gordura inguinal isoladas de camundongos de tipo selvagem alimentados com dieta normal (NCD), dieta com alto teor de gordura (HFD) ou uma dieta rica em gordura contendo 0,01 % De capsaicina (CAP; agonista do subfamília Vanilloid do potencial de receptores transitórios 1 (TRPV1) durante 32 semanas. O método aqui descrito para a realização de lipólise ex vivo é adotado a partir de Schweiger et al. 1 Apresentamos um protocolo detalhado para medir os níveis de glicerol por espectrofotometria UV-Visível (UV / VIS). O método descrito aqui pode ser usado para isolar com sucesso as almofadas de gordura inguinal para medições de lipólise para obter resultados consistentes. O protocolo descrito para almofadas de gordura inguinal pode prontamente ser ampliado para medir a lipólise em outros tecidos.
Introduction
Os tecidos adiposos armazenam a energia como gordura 2 e a oxidação de ácidos gordos é necessária para a termogênese 3 , 4 . Os ácidos gordurosos ingeridos através de dietas são embalados juntamente com as apoproteínas em quilomicrons e entregues a diferentes tecidos no corpo através da circulação sanguínea. Embora a maioria das células no corpo armazene uma reserva de energia, o tecido adiposo armazena o excesso de energia como gordura 5 , 6 . A lipólise no tecido adiposo é regulada por processos complexos e os detalhes moleculares da lipólise ainda permanecem vagos 7 .
A lipólise é um processo pelo qual os triglicerídeos (TGL) armazenados em tecido adiposo são hidrolisados para produzir glicerol e ácidos graxos (FA) pela enzima lipidélio triglicerídeo adiposo (ATGL) 8 . As alterações na lipólise basal e estimulada são características da obesidade. O bA lipólise de asal é regulada pela ativação ATGL 9 , que converte TGL em diacilglicerol (DAG), que posteriormente é hidrolisado em monoacil glicerol (MAG). A ativação da lipase sensível a hormonas (HSL) via adenilil ciclase ativa a estimulação da proteína quinase A (PKA) dependente da adenosina cíclica (cAMP) e causa lipólise. A medição da lipólise, basal e estimulada, é, portanto, importante analisar a atividade das proteínas envolvidas neste processo. Além disso, desvendar a regulação molecular da lipólise pode ser benéfica para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra a obesidade 10 . Uma vez que, moléculas que estimulam lipólise e oxidação de ácidos gordos são potenciais candidatos para a diminuição de gorduras armazenadas em depósitos, é importante empregar um ensaio robusto para a reprodutibilidade.
Dados anteriormente publicados sugerem que a ativação da proteína TRPV1 expressa em tecido adiposo branco por CAP reforçada basalE FSK (ativador de adenilil ciclase) - lipólise estimulada em almofadas de gordura inguinal 11 . Pesquisas anteriores também sugerem que a ativação a longo prazo de TRPV1 por CAP ativa a PKA 12 . Uma vez que a ativação da PKA estimula a lipólise 13 , 14 , a medição da lipólise estimulada basal e PKA estimulada nas almofadas de gordura inguinal isoladas de ratos NCD ou HFD (± CAP) após 32 semanas de alimentação, as dietas respectivas validarão o papel de TRPV1 Ativação na lipólise.
Este artigo descreve um método eficiente de determinação de lipólise basal e estimulada. Embora outros métodos que empregem isótopos radioativos de glicerol e cromatografia líquida tediosa de alta performance ou cromatografia gasosa / espectrometria de massa para medições 15 , 16 estejam disponíveis, esse método oferece um método mais direto, simples e econômicoTécnica para determinar lipólise em tecidos adiposos.
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Protocol
Todos os protocolos seguem as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Wyoming.
1. Alojamento e alimentação de animais
NOTA: Os ratos adultos de tipo selvagem masculino (C57BL / 6) (idade 12 a 24 semanas) foram criados na unidade animal de pesquisa de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados Institucionais (IACUC).
- A partir da semana 6 da idade, os ratos domésticos em grupos de quatro em gaiolas separadas e atribuí-los aleatoriamente em grupos de alimentação de NCD ou HFD (± 0,01% CAP) até a semana 38 de idade.
NOTA: CAP é um agonista da proteína do canal TRPV1 expresso em tecidos adiposos 11 , 17 . Misture o PAC com HFD em um liquidificador dentro do capô e transfira a mistura misturada para uma bandeja contendo pequenas unidades de 1 em 2 . Mantenha a bandeja dentro de um congelador de -20 ° C. Remova a bandeja contendo a dieta HFD + CAP do congelador após 24 h e guarde em um recipiente a -20 &# 176; congelador C até o uso. - Ratinhos de casa em um ambiente controlado pelo clima (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% de umidade) com um ciclo de 12/12 luz / escuridão com acesso a dieta designada e água ad libitum .
- No final de 38 semanas, dissecar tecidos adiposos inguinais e usar para experiências de lipólise (seções 2-7).
2. Preparando ratos para as experiências
- Anestesiar ratinhos injetando mistura de ketamina e xilazina (10 mg / kg e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente). Injetar 0,01 mL da mistura / 10 g de peso corporal do mouse.
- Confirme a anestesia profunda por uma prega firme. Se houver um reflexo do pedal, teste o mouse novamente após pelo menos 30 s.
- Use uma pomada de olho veterinário para evitar a secura dos olhos durante a anestesia. Não deixe ratos sem vigilância durante nenhum dos procedimentos.
- Eutanizar camundongos injetando uma dose elevada de mistura de ketamina e mistura de xilazina (10 mg / kg e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente)E (0,01 ml / 10 g de peso corporal) seguido de deslocamento cervical.
NOTA: Este método de eutanásia é aprovado pela IACUC da Universidade de Wyoming.
3. Isolamento de almofadas de gordura adiposa inguinal
- Coloque o mouse (alimentado com NCD ou HFD (± CAP) por 32 semanas) deitado à esquerda para o procedimento.
NOTA: Ao colocar o mouse no lado esquerdo, o membro anterior esquerdo e o membro traseiro esquerdo estarão na plataforma de dissecação, enquanto o membro dianteiro direito e o membro traseiro direito ficarão afastados da plataforma. - Esterilizar a superfície da pele com uma almofada de 2 polegadas de 2 gazes embebidas em cerca de 2,5 mL de etanol a 70%. Faça um corte lateral de 2 a 3 mm através da pele usando um bisturi para revelar a camada gordurosa subjacente.
- Faça um corte de 1 cm (dependendo do tamanho do mouse) através da pele usando um bisturi logo abaixo da caixa torácica através da superfície dorsal juntando as duas incisões laterais.
- Retire a aba da pele arrastando-a cuidadosamenteUsando fórceps estéril e deixa a almofada subcutânea intacta ao não cortar as almofadas de gordura. Esta é a almofada gorda situada debaixo da pele.
- Disseca cuidadosamente a almofada de gordura do músculo subjacente e da fáscia usando um par de tesouras. Puxe a almofada gorda à medida que é cortada do músculo subjacente.
NOTA: O peso e o tamanho das almofadas de gordura dependem do tipo de camundongos (NCD ou HFD (± CAP) -fed). - Use pinças para transferi-lo para uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) até a experiência de lipólise, à temperatura ambiente (~ 15 min).
- Aqueça as almofadas de gordura do lado direito do mouse conforme descrito nos passos 3.2-3.6.
4. Liberação basal de glicerol das almofadas de gordura inguinal
- Use tesoura afiada para cortar cerca de 20 mg de tecido adiposo em 5 a 8 peças.
- Incubar as peças cortadas de almofadas de gordura inguinal em 200 μL de meio de incubação (Dulbecco's Model Eagel's Medium (DMEM) contendo 2% de ácido gordoAlbumina de soro bovino livre (BSA)) a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 60 min.
- Recolher o meio de incubação e congelar a -80 ° C para ensaio de lipólise.
NOTA: As peças cortadas são usadas para a determinação da concentração de proteína após a extração de lipídios. - Transfira as peças de gordura cortada com a ajuda de pinças para 1 mL de solução de extração (clorofórmio: metanol (2: 1, v / v) e 1% de ácido acético glacial) e incubar durante 60 minutos a 37 ° C sob agitação vigorosa a 100 Rpm. Descarte a solução de extração de gordura.
NOTA: Esta etapa extrairá gordura das peças cortadas. Descarte a solução de extração de gordura, pois interferirá com a determinação da proteína. - Transferir o tecido (a partir do passo 4.2.2) usando uma pinça num tubo de microcentrífuga estéril contendo 500 μL de solução de lise (0,3 N de NaOH contendo 0,1% de dodecilsulfato de sódio SDS) e incubar durante a noite (12 h) a 55 ° C sob agitação vigorosa A 100 rpm.
- Recolher o meio de incubação e congelar a -80 ° C para ensaio de lipólise.
- Determine a concentração de proteína do tecido (passo 4.2.3) usando o reagente do ácido bicinconinico (BCA) e BSA como padrão 18 .
- Descongelar o meio congelado (passo 4.2.1) no gelo e determinar o teor de glicerol do meio utilizando um reagente de glicerol livre conforme descrito nas secções de protocolo 6 e 7 6 .
- Extrapolar a concentração de glicerol em amostras da curva padrão plotada usando padrões de glicerol 19 e lipólise expressa como nanomoles de glicerol por mg de proteína por h 20 .
5. Lipólise estimulada por FSK
- Pré-incuba cerca de 20 mg de almofada de gordura inguinal (5 a 8 partes cortadas) obtidas a partir de NCD ou HFD (± CAP) - rato selvagem de tipo selvagem em 200 μL de DMEM contendo 2% de BSA livre de ácidos graxos, 10 μM de FSK e 5 μM de Triacsina C em 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% de umidade durante 60 min.
- Transfira as peças de tecido usando pinças para um meio idêntico e incube por mais 60 min a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de umidade. Recolher o meio de incubação e armazenar a -80 ° C até o ensaio de lipólise.
NOTA: A estimulação da lipólise provoca a liberação rápida de ácidos gordurosos e glicerol dentro de 15 minutos, que é linear durante a primeira hora, e planaltos a partir daí. Uma vez que a taxa de lipólise estimulada é maior e estável entre a primeira e segunda horas de estimulação com FSK, este protocolo mediu a lipólise no estado estimulado após o segundo período de incubação como descrito anteriormente 1 . Então, as etapas experimentais (5.1 e 5.1.1) são necessárias.
6. Preparação do Reagente Gratuito de Glicerol
- Reconstitua o reagente de glicerol 19 em 40 mL de água desionizada em um frasco de vidro colorido âmbar, coloque uma rolha no frasco e misture bem invadindo 10 vezes. Não misture agitando.
- Armazene o frasco para injectáveis a 4 ° C dentro de um frigorífico protegido da luz, cobrindo o frasco completamente com papel alumínio.
- Proceda à preparação do padrão de glicerol (seção 7).
7. Preparação do padrão de glicerol e determinação do teor de glicerol
- Faça um estoque de 1 mM diluindo 35 μL do estoque fornecido com 65 μL de água desionizada.
NOTA: O estoque padrão de glicerina fornecido pelo fabricante é 2,8 mM de glicerol. - Pegue cinco cubetas descartáveis de metacrilato de 1 cm de comprimento de caminho. Rotule as cuvetes usando um marcador como padrão 0, 1.25, 2.5, 5 e 10 nmol.
- Adicione 0, 1,25, 2,5, 5 e 10 μL de padrão de glicerol 1 mM às respectivas cuvetes rotuladas. Faça o volume de cada cuvete para 10 μL com água desionizada.
- Faça uma diluição de 1 a 10 de todas as amostras (do passo 4.4 ou 5.1.1), adicionando 10 μL da amostra a 90 μL de água desionizada em tubos de centrífuga pré -tiquetados frescos de 500 μL. Adicione 10 μL das amostras diluídas nas cubetas rotuladas com o respectivo número de identificação da amostra.
- Ligar o espectrofotômetro UV-VIS e ajustar a ondaComprimento até 540 nm.
- Aquecer o reagente de glicerol livre até à temperatura ambiente, mantendo o frasco (passo 6.2) à temperatura ambiente durante 15 min.
- Configure uma série de cuvetes rotulados como padrão de nmol "0" em branco (passo 7.3), padrões (etapa 7.3) e amostras (passo 7.4).
- Adicione 10 μL de cada padrão e amostra na respectiva cuvete rotulada. Use "0" nmol padrão como em branco.
- Adicione 0,8 mL de reagente de glicerol livre em cada cuvete, contendo os padrões de glicerol usando uma pipeta de 1 mL.
- Cubra a cuvete com uma película de parafina de plástico quadrada de 1,5 cm e misture o conteúdo invadindo a cuvete por 3 vezes e reserve à temperatura ambiente por 10 min.
- Coloque a cuvete no espectrofotômetro UV-VIS e grave a absorvância (comprimento de onda de 540 nm).
- Trace a curva padrão usando as concentrações dos padrões (nmol) no eixo X e a absorvância registrada no eixo Y.
- Calcule a concentração de glYcerol nas amostras (nmol) por extrapolação usando a curva padrão plotada no passo 7.12.
- Multiplique a concentração de amostras (nmol / cuvete) com o fator de diluição 10 (consulte o passo 7.4) e 20 (volume total)
- Divida a concentração de glicerol em cada amostra (passo 7.13) pelo mg de proteína calculado pelo método BCA.
NOTA: Uma vez que as amostras da almofada de gordura inguinal são incubadas durante 60 min, representam os resultados como nmol de glicerol / mg de proteína / h.
- Faça um estoque de 1 mM diluindo 35 μL do estoque fornecido com 65 μL de água desionizada.
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Representative Results
Para avaliar o efeito da CAP sobre lipólise basal e estimulada, esta pesquisa mediu a lipólise em almofadas de gordura adiposa inguinal isoladas de camundongos selvagens de NCD ou HFD (± CAP). Os resultados representativos para a lipólise basal e estimulada por FSK para as almofadas de gordura inguinal são apresentados na Tabela I. Liberação de glicerol estimulada basal e FSK na presença de Triacsina C, que inibe a acil coA sintetase e evita a regeneração de TGL. Conforme mostrado na Figura 1 , HFD suprimiu a lipólise estimulada por FSK, e CAP aumentou a lipólise basal e estimulada por FSK. Triacsina C foi utilizada para inibir a regeneração de TGL a partir de glicerol e ácidos gordurosos 11 . Todos os dados são expressos como médias ± SEM As comparações entre grupos são analisadas usando ANOVA unidirecional e as análises pos hoc foram realizadas usando o teste t de Student. Os tamanhos de amostra estão configurados Para determinar se o valor médio de uma variável de resultado em um grupo diferiu significativamente daquele em outro grupo. Um valor p <0,05 é considerado como estatisticamente significativo.
Figura 1: CAP Aumenta a liberação de glicerol estimulada basal e FSK em almofadas de gordura inguinal. Os gráficos de barras representam a média ± SEM de liberação de glicerol estimulada basal e FSK (10 μM) (nmol / mg de proteína / h) nas almofadas de gordura inguinal isoladas de camundongos selvagens de NCD ou HFD (± CAP). ** Representa significância estatística para p-valor <0,05 para n = 6. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Figura 2: hidrólise de triglicerídeos (TGL) resultados na geração de ácidos graxos livres (FFA) e glicerol. O FFA sofre uma β-oxidação mitocondrial. Isto, juntamente com a regulação positiva da proteína de desacoplamento 1 (UCP-1) estimula a termogênese. A liberação de glicerol é medida pelo protocolo descrito no artigo. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
| Lipólise (Nmoles de glicerol / mg de proteína / h) | NCD (N = 6) | HFD (N = 6) | HFD + CAP (N = 6) |
| Basal | 16,22 ± 1,28 | 17,16 ± 1,48 | 52.07 ± 2.66 |
| FSK Estimulado (Com Triacsin C) | 54,88 ± 3,27 | 41,23 ± 4,43 | 72,04 ± 4,16 |
Tabela 1: Efeito do CAP sobre Lipólise Basal e FSK Estimulada em Almofadas de Gordura Inguinal. Versão basal basal e FSK estimulada com glicerol ± SEM medida no tecido adiposo adiposo inguinal obtido a partir de camundongos de tipo selvagem alimentados com NCD, HFD ou HFD + CAP.
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Discussion
O processo de degradação de TGL em glicerol e ácidos graxos é catalisado por ATGL 9 durante a lipólise basal e orquestrado por uma série de proteínas, incluindo a ativação da via adenilil ciclase / dependente de PKA durante a lipólise estimulada 21 , 22 , 23 . O aprimoramento da lipólise aumenta os níveis plasmáticos de ácidos graxos para transporte e uso de energia 24 . Os ácidos gordurosos são absorvidos pelas mitocôndrias como acetil CoA, que é usado para produzir energia.
O grau e extensão da lipólise podem ser medidos eficientemente pela libertação de glicerol a partir de tecidos adiposos ( Tabela 1 e Figura 1 ). A hidrólise de TGL produz ácidos graxos e glicerol. Pesquisas anteriores mostraram que a suplementação dietética de CAP aumentou significativamente as libertações de glicerol estimuladas basalmente e FSKE de almofadas de gordura inguinal e marrom 11 , 17 . O aumento da produção de ácidos graxos a partir de lipólise aumentada poderia servir de alimento para produzir calor e termogênese, uma vez que a CAP também aumentou significativamente a expressão da UCP-1 mitocondrial nas almofadas de gordura inguinal. Consistente com esta noção, pesquisas anteriores sugerem que a PAC aumentou a expressão do receptor alfa ativado por proliferador de peroxisoma (PPARα) em almofadas de gordura inguinal, que desempenha um papel crítico na oxidação mitocondrial de ácidos graxos e na regulação positiva da transcrição da UCP-1 25 , 26 , 27. Conseqüentemente, a CAP também aumentou a atividade metabólica, a produção de calor e o gasto de energia em ratos alimentados com HFD 28 , 29 . Além disso, a alimentação de HFD suprimiu a lipólise estimulada, enquanto o CAP aumentou a dependência basal e FSK-estimulada por PKAT lipólise, bem como uma maior sensibilidade à insulina 30 . Portanto, conforme descrito pelo modelo na Figura 2 , é razoável interpretar que a PAC aumenta a lipólise basal e estimulada sem causar resistência à insulina à medida que o excesso de gordura é queimado para produzir calor pela regulação mitochondrial UCP-1.
Este artigo descreve o método de medir a libertação de glicerol a partir de tecidos adiposos brancos. Embora haja vários métodos que utilizem isótopos estáveis de glicerol, eles requerem cromatografia líquida de alta performance ou cromatografia gasosa / espectrometria de massa para medições 15 , 16 . Além disso, as medições do rastreador de glicerol estão associadas a não especificidades 31 . Métodos alternativos incluem a determinação dos níveis de proteínas de mRNA e proteína e proteínas reguladoras envolvidas na lipólise. Métodos colorimétricos também estão disponíveis para dEtermine a concentração de ácidos graxos de cadeia longa em circulação. O método aqui descrito é muito eficiente na análise da liberação de glicerol a partir de tecidos adiposos, pois pode ser feito usando um leitor de placas capaz de medir a fluorescência e a absorvência. Além disso, o método analítico simplificado para liberação de glicerol descrito neste artigo proporciona estabilidade e precisão melhoradas 32 .
Os procedimentos operacionais padrão devem ser praticados, pois este método envolve técnicas cirúrgicas para isolar as almofadas de gordura. Este protocolo recomenda o uso de BSA sem gordura. Isso pode causar a formação de bolhas de ar, o que interferirá com a leitura de absorvência. Portanto, deve-se ter cuidado ao manusear amostras para evitar bolhas de ar. Deve tomar precaução para não agitar ou inverter amostras durante o tratamento com BSA, a menos que tal passo seja recomendado no protocolo. Além disso, o passo de extração de gordura da gordura inguinal é crítico, uma vez que a presença de gordura irá interferir com a ingenuidadeH determinação da proteína do tecido adiposo inguinal. Além disso, durante a preparação de padrões de glicerol, é importante misturar o conteúdo por inversão e não agitar o frasco.
O método descrito aqui pode ser usado para isolar com sucesso as almofadas de gordura inguinal para vários ensaios, incluindo medidas de lipólise. O protocolo de lipólise descrito para almofadas de gordura inguinal pode ser prontamente estendido para a medição da lipólise em outros tecidos. Os métodos são otimizados para todos os tipos de almofadas de gordura, bem como pré-adipócitos.
Em resumo, este artigo descreve o método para medir a liberação de glicerol estimulada basal e FSK em almofadas de gordura adiposa inguinal isoladas de camundongos com NCD ou HFD (± CAP). Os dados apresentados sugerem que a ativação de TRPV1 por CAP aumentou a lipólise basal e estimulada por FSK e impediu a acumulação de lipídios nos tecidos adiposos. Esses dados demonstram um papel crítico da proteína TRPV1 na regulaçãoN de lipólise em tecido adiposo branco.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio AHA nº 15BGIA23250030, o Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH sob o número de prêmio 8P20 GM103432-12 e o Subsídio de Faculdade da Universidade de Wyoming em Aid to BT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
