Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Abstract

De rode Tribolium castaneum is uitgegroeid tot een belangrijke insect modelorganisme in ontwikkelings-genetica en de evolutionaire ontwikkelingsbiologie. De waarneming van Tribolium embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie heeft meerdere voordelen ten opzichte van conventionele groothoek en confocale fluorescentiemicroscopie. Vanwege de unieke eigenschappen van een licht-sheet based microscoop, kunnen driedimensionale beelden van levende exemplaren worden opgenomen met hoge signaal-ruisverhouding en een aanzienlijk verlaagde foto-bleking en foto- toxiciteit langs meerdere richtingen gedurende perioden dat verschillende duren dagen. Met meer dan vier jaar van ontwikkeling van de methodiek en een continue toename van data, lijkt het geschikt moment in standard operating procedures vast te stellen voor het gebruik van licht plaat technologie in de Tribolium gemeenschap als in het insect gemeenschap in het algemeen. Dit protocol beschrijft drie bevestigingstechnieken geschof andere doeleinden, presenteert twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen Tribolium geschikt voor langdurige levende beeldvorming, stelt vijf fluorescerende kleurstoffen intracellulaire structuren vaste embryo label verschaft informatie aangaande data naverwerking voor de tijdige evaluatie van de geregistreerde gegevens. Representatieve resultaten concentreren op de lange termijn live-imaging, optische sectie en de observatie van dezelfde embryo langs meerdere richtingen. De respectieve datasets worden geleverd als downloadbare bron. Tenslotte beschrijft het protocol kwaliteitscontroles voor levende beeldvormende assays huidige beperkingen en de toepasbaarheid van de beschreven procedures met andere insectensoorten.

Dit protocol is vooral bedoeld voor ontwikkelingsstoornissen biologen die imaging oplossingen die standaard laboratoriumapparatuur overtreffen zoeken. Het bevordert de continue poging om de kloof tussen de technisch georiënteerde laboratoria / gemeenschappen, die zich ontwikkelen en verfijnen micro sluitenkopiëren methodologisch, en de life science laboratoria / gemeenschappen, die 'plug-and-play' oplossingen voor technische uitdagingen vereisen. Bovendien ondersteunt een axiomatische benadering die de biologische vraagstukken in het middelpunt van de aandacht beweegt.

Introduction

De rode Tribolium castaneum, die behoort tot de grote familie van zwartlijfkevers (Tenebrionidae), heeft een lange geschiedenis binnen de landbouw- en biowetenschappen en is het tweede best bestudeerde model insect modelorganisme na de vrucht Drosophila melanogaster vliegen. Gedurende de laatste vier decennia, het werd een krachtige en populaire insect modelorganisme in ontwikkelingsstoornissen genetica, in de evolutionaire ontwikkelingsbiologie en tijdens de laatste twintig jaar, in embryonale morfogenese voor een verscheidenheid van redenen:

Drosophila en Tribolium behoren beide tot de Holometabola, maar gedivergeerd ongeveer 300 miljoen jaar geleden 1, 2, 3, 4. Terwijl de embryonale ontwikkeling van Drosophila algemeen wordt beschouwd als zeer afgeleid, Tribolium toont een voorouderlijke vorm van ontling die in een aanzienlijk groter deel van insectensoorten 5, 6, 7, 8, 9. Enerzijds, Tribolium vertoont niet-involutie head ontwikkeling, namelijk de monddelen en antennes reeds ontstaan tijdens embryogenese 10, 11, 12, 13, 14, 15. Ten tweede, Tribolium de beginselen van korte kiem ontwikkeling, namelijk buiksegmenten worden achtereenvolgens een achterste groeizone tijdens germband rek 16, 17, 18, 19. Ten derde, Tribolium ontwikkelt en later degradeerttwee extra-embryonale membranen dwz het amnion, die het embryo enige ventraal bedekt en de serosa, waarbij het embryo volledig omhult 20, 21, 22. Beide membranen spelen een cruciale morfogenetische 23 en de beschermende rol tegen micro-organismen 24, 25 en 26 uitdroging. Ten vierde, de embryonale ontwikkeling benen volledig functioneel tijdens het larvale levensfase en dienen als primordia voor de volwassen benen tijdens pupal metamorfose 27, 28, 29, 30, 31.

Door hun geringe omvang en bescheiden eisen, de teelt van Tribolium in het laboratorium is vrij eenvoudig. Culturen van wildtype (WT) stammen of transgene lijnen gewoonlijk uit ongeveer 100-300 volwassenen en kan binnen één liter glazen flessen (footprint 80 cm2) gevuld 3-4 cm hoog (ongeveer 50 g) met groeimedium dat uit volledige korreltarwe bewaard meel aangevuld met actieve droge gist. Een watertoevoer is niet nodig. Dit maakt het mogelijk zelfs kleine laboratoria om tientallen kever culturen binnen kleine of middelgrote handel verkrijgbaar insect incubators te houden. Later ontwikkelingsstadia van Tribolium (larven na ongeveer het vierde stadium, poppen en volwassenen) zijn gemakkelijk gescheiden van het groeimedium door zeven. Gesynchroniseerde embryo's worden verkregen door het incuberen volwassenen kortstondig op eierleggende medium. Voor snelle ontwikkeling, worden kever kweken bij 32 ° C (ongeveer vier weken per generatie) gehouden, terwijl voorraadbeheer typisch uitgevoerd bij 22-25 ° C (ongeveer tien weken per generatie).

In de afgelopen tien jaar veel standaard techniques zijn geleidelijk aangepast en geoptimaliseerd voor Tribolium, zoals samengevat in de Emerging Modelorganismen boeken 32. Van groot belang voortbewogen genetische werkwijzen zoals embryonale 33, larvale 34, 35 of ouderlijke 36, 37 RNA-interferentie genexpressie knockdown kiemlijn transformatie met ofwel de piggyBac 38, 39 of Minos 40 transposase systeem CRISPR / Cas9 gebaseerde genoom 41 techniek. Voorts is de Tribolium genoom gesequenced ongeveer tien jaar geleden 42, en is nu in de derde ronde van genoom samenstel los 43, die efficiënt en genoom-brede identificatie en systematische analyse van genen mogelijk maakt 44 45, 46. Bovendien, de genomen van vier andere soorten coleoptera zijn vergelijkende genetische benaderingen 47, 48, 49, 50. In samenwerking met de gesequenced genoom, hebben twee grote genetische analyses uitgevoerd, namelijk een insertie mutagenese scherm 51 en een systematische RNA interferentie-genexpressie knockdown scherm 52, 53.

Fluorescentie levende beeldvorming met groothoek, confocale of lichte vel gebaseerde microscopie (LSFM) maakt het mogelijk om de morfologie van embryonale Tribolium acht als functie van de tijd (de morfogenese) in een multi-dimensionele context (tabel 1). In groothoek en confocale fluorescentie microscopie, de Excitatie en emissie licht wordt geleid door dezelfde objectieflens. In beide benaderingen wordt het gehele monster verlicht elke geregistreerde tweedimensionale vlak. Derhalve worden de monsters onderworpen aan zeer hoge energieniveaus. In LSFM alleen de fluoroforen in het brandvlak worden geëxciteerd door een ontkoppeling van belichting en detectie door twee loodrecht objectieflenzen (figuur 1). LSFM komt in twee canonieke implementaties - de enkel vlak belichting microscoop (SPIM) en de digitale gescande laserlicht vel basis fluorescentiemicroscoop (DSLM figuur 2) - en biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van traditionele werkwijzen: (i) intrinsieke optische sectie vermogen, (ii) goede axiale resolutie, (iii) sterk verlaagd niveau van foto-bleken, (iv) lage foto-toxiciteit, (v) een hoge signaal-ruisverhouding, (vi) een relatief hoge meetsnelheid, (vii) beeldvorming langs meerdere richtingen en (viii) diepere penetratie dankzij het gebruik van lage numerieke apertuur verlichtingsobjektiefstelsel lenzen 54, 55, 56.

LSFM is al met succes toegepast in Tribolium tot bijna het gehele embryonale morfogenese 57 te documenteren en aan de principes van extra-embryonale membraan breuk aan het begin van dorsale sluiting 23 te analyseren. Om de aantrekkelijkheid van LSFM verhogen in de Tribolium gemeenschap en voor insecten wetenschap in het algemeen, is het van groot belang is voor standard operating procedures vast te stellen en de methoden, protocollen en het zwembad van de middelen om een niveau te verbeteren waar de microscoop wordt een gemak-of -gebruik standaard instrument in ontwikkelingsbiologie laboratoria, en de biologische vragen verblijven in het centrum van de belangstelling.

Dit protocol begint met de basisprincipes van Tribolium </ em> teelt, dwz het onderhoud, de voortplanting en embryo collectie. Vervolgens worden twee experimentele strategieën toegelicht: (i) levende beeldvorming van op maat gemaakte transgene lijnen en (ii) beeldvorming vaste embryo's die werden gekleurd met fluorescente kleurstoffen (Tabel 2). Vervolgens drie bevestigingstechnieken met lichtjes verschillende doeleinden worden toegelicht (figuur 3 en tabel 3): (i) het agarosekolom, (ii) de agarose halfrond en (iii) het nieuwe spinnenweb houder. Het protocol legt vervolgens de data acquisitie procedure LSFM. Beeldvormende modaliteiten en de belangrijkste overwegingen zijn geschetst. Tenslotte wordt embryo retrieval uitgelegd en suggesties voor basisgegevens transformatie worden geleverd. In de representatieve resultaten, actuele beeldgegevens van twee nieuwe maat en Glia-blauwe 58 transgene lijnen weergegeven en de bijbehorende datasets beeldvorming verschaft als downloadbare bron. Bovendien, imagegegevens van vaste embryo's die werden gekleurd met verschillende fluorescentie kleurstoffen worden gepresenteerd. De discussie richt zich op de kwaliteitscontrole, de huidige beperkingen van de live-imaging benadering en de aanpassing van het protocol bij andere soorten.

Het protocol is bestemd voor lichte plaat gebaseerde fluorescentie microscopen die zijn voorzien van een monsterkamer en een draaibaar klemmechanisme gestandaardiseerde monsterhouders 54, 59, 60, die typisch cilindervormige elementen van metaal, kunststof of glas met een diameter in het millimeterbereik. Het protocol is geschikt voor canonische implementaties, namelijk SPIM en DSLM, alsmede voor opstellingen met twee of meer belichting en detectie armen 61, 62, 63. De representatieve resultaten tonen gegevens in twee spektraalkanalen, groen (illumination met een 488 nm laser detectie door een 525/50 banddoorlaatfilter) en rode (belichting met een 561 nm laser detectie door een 607/70 banddoorlaatfilter), maar het protocol kan worden uitgebreid tot drie of vier spektraalkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Veehouderij van Tribolium Cultures

OPMERKING: Standaard omstandigheden worden gedefinieerd als een incubatietemperatuur van 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid in een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus. Voor meer informatie over Tribolium en veeteelt, de respectieve richtlijnen beschikbaar 64. Dit protocol vereist twee verschillende op meel gebaseerde media, dat kan worden bereid kilogramhoeveelheden en houdbaarheid van meerdere maanden.

  1. Voordat hij met meel en actieve droge gist, slaan de ongeopende verpakking bij -20 ° C gedurende 24 uur en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. Deze procedure voorkomt potentiële ziekteverwekkers.
  2. Passen generfd tarwebloem en inactieve droge gist door een zeef met 710 urn maaswijdte, bereidt vervolgens groeimedium door daaraan gezeefde generfd bloem met 5% (w / w) gezifte inactief droge gist.
  3. Pass 405 fijn tarwemeel en inactieve droge gist door een zeef met 250 & #181; m maaswijdte, bereidt vervolgens eierleggende medium door daaraan gezeefd 405 fijne tarwebloem met 5% (w / w) gezifte inactief droge gist.
  4. Passeer de respectieve Tribolium cultuur door middel van een zeef met 800 urn maaswijdte. Gooi de overgebleven groeimedium. Breng de larven, poppen en volwassenen met een groot glas schotel.
  5. Als er geen nageslacht cultuur bestaat, over te dragen ongeveer 80 larven en / of poppen om een ​​nieuwe glazen fles naar een nieuw nageslacht cultuur te creëren. Als er geen larven en / of poppen aanwezig zijn, neemt ongeveer 40 volwassenen plaats. Voeg 50 g groeimedium en incubeer onder normale omstandigheden.
  6. Verzamel ongeveer 300 volwassenen (500-700 mg) in een nieuwe glazen fles naar de beeldvorming cultuur te creëren. Voeg 50 g groeimedium en incubeer onder normale omstandigheden. Laat de beeldvorming kweek te regelen gedurende ten minste 24 uur in vers kweekmedium vóór embryo.
  7. Vervang het groeimedium van de imaging cultuur minstens om de twee weeks, die kan worden uitgevoerd in samenhang met embryo (zie 3.2). Na twee tot drie maanden, volledig vervangen van de imaging cultuur door het nieuwe volwassenen uit het nageslacht cultuur.
  8. Indien een niet homozygote transgene lijn wordt gebruikt, curate nakomelingen culturen vaak door het verwijderen van niet-transgene dieren. Idealiter genereren homozygote lijnen indien de respectieve transgen niet dodelijk of laat steriliteit indien aanwezig op beide chromosomen. Homozygote culturen hebben typisch een hogere gemiddelde fluorescentie niveau en de algemene experimentele omstandigheden zijn smaller, aangezien slechts één genotype aanwezig is.

2. Microscoop Instellingen en kalibratie

OPMERKING: De Tribolium embryo een anterior-posterior lengte van ongeveer 600-660 urn en een transversale diameter van ongeveer 300-330 urn. De meeste moderne CCD camera's hebben een sensorchip grootte van ongeveer 9 mm x 7 mm, dat wil zeggen een diameter van 11,4 urn en een pixel-pixelafstand van 6,45 urn.In combinatie met een vergroting van 10X objectief, kan het embryo worden afgebeeld in zijn geheel met een pixel pitch van 0,645 urn. De meeste moderne sCMOS camera's hebben een grotere sensor chip afmeting van ongeveer 16 mm x 14 mm, dat wil zeggen een diameter van 21,3 urn en een pixel-pixelafstand van 6,5 urn. In combinatie met een vergroting van 20x objectief, kan het embryo worden afgebeeld in zijn geheel met een pixel pitch van 0,325 urn.

  1. Bevestig de belichting en detectie objectieven aan de microscoop. Waarborgen dat lasers en fluorescentie filters overeenkomen met de fluorofoor absorptie- en emissiespectra goed.
  2. Bevestig de monsterkamer aan de microscoop. Vul de monsterkamer met PBS pH 7,4 of andere geschikte buffer beeldvorming.
  3. Schakel en kalibreren de microscoop. Uitgebreide kalibratie routines en richtlijnen voor het oplossen van problemen voor custom-built light-sheet gebaseerde microscopen (meer specifiek voor de DSLM implementatie) zijn gepubliceerd previously 65. Voor commerciële apparaten, volg de instructies van de fabrikant zeer zorgvuldig. Verkeerd gebruik kan de monsterkamer van het medium uitputten en verwoesting leiden naar het instrument en het specimen.

3. Verzameling van transgene embryo's of WT

  1. Voorbij de beeldvormende kolonie door een zeef met maaswijdte 800 pm. Verzamel volwassen kevers in een nieuwe glazen fles en voeg 10 g eierleggende medium. Incubeer de eierleggende kweek gedurende 1 uur bij 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid in licht.
  2. Voorbij de eierleggende cultuur door een zeef met 800-um maaswijdte volwassenen scheiden van de eierleggende medium dat ongeveer 30-100 embryo bevat. Transfer volwassenen om een ​​nieuwe glazen fles en voeg ofwel de oude of 50 g vers groeimedium.
  3. Als observatie moet beginnen tegen uniform blastoderm fase (voorbeeld dataset DS0002), incubeer de eierleggende medium gedurende 15 uur bij 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid. To beginnen bij het begin van terugtrekking germband (bijvoorbeeld datasets DS0001 en DS0003), incubeer embryo's gedurende 23 uur bij 32 ° C en 70% relatieve vochtigheid. Als andere ontwikkelingsstadia gewenst, verwezen naar de desbetreffende literatuur 64, 65 en passen incubatietijd en / of temperatuur nodig.

4. Embryo Dechorionation

OPMERKING: De chorion is het buitenste gedeelte van de eierschaal en bestaat uit eiwitten en polysachariden. Het sterk lichtabsorberende maar niet essentieel voor een goede ontwikkeling en kan derhalve chemisch worden verwijderd.

  1. Voorbij de eierleggende medium door een zeef met maaswijdte 300 urn. Verzamelen van de embryo's in een cel zeef van 100 urn maaswijdte en gooi de overgebleven eierleggende medium.
  2. Bereid een 6-wells plaat als volgt: vul de A1, A2, A3 en B3 putjes met 10 mL PBS pH 7,4 en B1 en B2 putjes met 9 ml PBS. Voeg vervolgens voorzichtig1 ml natriumhypochloriet naar B1 en B2. Let op de voortgang van de stappen 4,3-4,8 onder de stereo microscoop. VOORZICHTIG natriumhypochloriet is corrosief.
  3. Plaats de cel zeef in de put A1 (PBS pH 7,4) en was de embryo gedurende één minuut onder voorzichtig roeren. Grotere bloemdeeltjes moeten losmaken van het embryo.
  4. Breng de cel zeef om de put B1 (natriumhypochloriet in PBS pH 7,4) en schud de plaat krachtig gedurende 30 seconden. De resterende bloemdeeltjes moet volledig los van het embryo.
  5. Breng de cel zeef om de put A2 (PBS pH 7,4) en was de embryo's gedurende 1 min onder zacht schudden.
  6. Voor dechorionation, breng de cel zeef om de B2 put (natriumhypochloriet in PBS pH 7,4). Schud de plaat krachtig tot het chorion breuken en los van het embryo. Het chorion lijkt op een dunne semi-transparante membraan met gescheurde randen, terwijl dechorionated embryo een gewone silhouet.
  7. Transfer the cel zeef om de put A3 (PBS pH 7,4) en was de embryo's gedurende 1 min onder zacht schudden. Indien chorion fragmenten nog de embryo's na het wassen verbonden Herhaal stap 4.6.
  8. Bewaar de embryo's in de B3 goed (PBS pH 7,4). Opslag gedurende enkele uren is niet schadelijk voor de embryo's, maar in gedachten houden dat de ontwikkeling doorgaat.
  9. Voor niet-homozygote transgene lijnen, verwijder niet fluorescerende embryo indien mogelijk. Voor fixatie en kleuring van WT of transgene embryo's, verder met stap 5. Voor live beeldvorming van transgene embryo verder met stap 6.

5. vitellinemembraan permeabilisatie, fixatie en kleuring

OPMERKING: De vitellinemembraan is de binnenlaag van de eierschaal. Het is ongevoelig voor fluorescente kleurstoffen en moet chemisch permeabel worden voor kleuring daarmee.

  1. Vul een scintillatieflesje met fixatie / permeabilisatie (1,5 mL 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS pH 6,9 eennd 1,5 ml n-heptaan). Transfer embryo's met een penseel aan de flesjes. flesjes cover met aluminiumfolie om fluoroforen te beschermen tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten op een schudplatform bij 50 omwentelingen per minuut. LET paraformaldehyde is giftig en bijtend, n-heptaan is brandbaar en giftig.
  2. Verwijder fixeeroplossing en behandelen embryo drie maal gedurende 15 min in 3 mL 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 en daarna eenmaal gedurende 15 minuten in 3 ml 1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 op een schudplatform bij 50 omwentelingen per minuut. LET OP Triton X-100 is bijtend.
  3. Verwijder permeabilisatie oplossing en voeg 0,5 ml kleuroplossing aan het flesje. Illustratieve kleuringoplossingen worden gegeven in tabel 2. Vlek embryo overnacht bij 4 ° C op een schudplatform bij 50 omwentelingen per minuut. Voor de in tabel 2 voorgesteld kleurstoffen, wassen is niet nodig.

6. Bereiding Montagevoorbeeld Agarose

  1. Voeg 1 g low-meltagarose 100 mL PBS pH 7,4 en verwarm het mengsel gedurende 2-3 minuten in een magnetron bij 800 W. Als kleine agarosedeeltjes nog aanwezig, herhaalt het verwarmingsproces in 30 seconden intervallen totdat de deeltjes volledig op te lossen. De montage agarose hoeft niet vers bereid telkens de agarose stolde kan opnieuw vloeibaar gemaakt door verhitting zoals hierboven beschreven. Dit proces kan 5-6 maal herhaald worden voordat te veel water verdampt is.
  2. Laat de agarose afkoelen tot ongeveer 40-45 ° C en vult twee 1,5 ml reageerbuisjes met de verwarmde agarose en houd deze buizen bij 35 ° C in een thermoblok.

7. Embryo Montage en inbrengen in de monsterkamer

  1. Optie 1: agarosekolom (figuur 3A-C, eerste kolom, tabel 3, tweede kolom)
    1. Vul een 1,0 ml spuit met gedestilleerd water en plaats deze aan een van de glazen capillaire openingen met een kleine rubberen slang.Vul het capillair halverwege met gedestilleerd water.
    2. Kies een embryo met een penseel en plaats het op de binnenzijde van de andere glazen capillaire opening. Ga snel naar de volgende stap voor de embryo uitdroogt.
    3. Plak het capillair in de vloeistof agarose en langzaam trek een paar ul vloeibare agarose naast het embryo in het capillair. Vervolgens snel verhogen de trekkracht, zodat de embryo meegesleept de agarose. Uiteindelijk dienen sommige pi agarose boven en onder de embryo. Stel de capillaire opzij voor een paar minuten en laat de agarose stollen.
    4. Verkorten van de capillair met een diamant glassnijder tot een lengte van ongeveer 5 mm. De overblijvende fragment moet volledig gevuld met agarose en het embryo moet binnen het tweede kwartiel.
    5. Plaats de stalen cilinder met de pen in de monsterkamer en plak de capillaire fragment bovenop de pen. De agarosekolom uitsteken enkele millimeters from het capillair fragment met het deel dat het embryo bevat.
  2. Optie 2: Agarose hemisfeer (Figuur 3A-C, tweede kolom, tabel 3, derde kolom)
    1. Trek 200 gl vloeibare agarose in een 1,0 ml spuit vervolgens gebruikt om de stalen pijp vanaf de top met agarose vullen tot een halve bol vormt aan de bodemopening. De halve bol diameter moet gelijk zijn aan de diameter van de buizen. Wacht een paar minuten tot de agarose is gestold.
    2. Kies een embryo met een penseel en herschikken op het uiteinde van de borstel, zodat het voorste uiteinde toegankelijk wordt. Dompel de agarose halfrond in vloeibare agarose te bedekken met een dunne film.
    3. Plaats de embryo met zijn voorste einde rechtop op de paal van de agar halfrond. Draai de stalen pijp rond en corrigeer de positie van het embryo met de borstel. Eventueel stabiliseren van de embryo agarose door toevoeging van 2 pi aan het embryo / halfrond grens. ideaally, moet kleiner zijn dan de helft van de embryo oppervlak bedekt met agarose en de flanken moet zo hoog mogelijk zijn.
    4. Plaats de stalen pijp met de halve bol en embryo langzaam in de monsterkamer.
  3. Optie 3: Spinneweb houder (figuur 3A-C, derde kolom, tabel 3, vierde kolom)
    1. Kies een embryo met een penseel en opzij leggen.
    2. Bedek het sleufgat van het spinnenweb houder met 5-8 gl vloeibare agarose, dan de meeste van de agarose te verwijderen totdat er slechts een dunne agarose film achter.
    3. Plaats de embryo op de agarose film en zijn positie aan te passen. Beweeg voorzichtig het embryo aan de x-as centrum van het sleufgat en stapel hem langwerpige anterior-posterior as de langsas van het sleufgat.
    4. Plaats de houder spinnenweb met gemonteerde embryo langzaam in de monsterkamer. Positioneer het spinnenweb houder, zodat het niet interfereert met de excitatie en emissielicht, dus 45 ° ten opzichte van de x- en z-as.

8. Light Sheet-gebaseerde fluorescentie microscopie

  1. Beslis samen hoeveel richtingen (en waarlangs oriëntaties) het embryo moet worden afgebeeld. Vier richtingen (langs de oriëntaties 0 °, 90 °, 180 ° en 270 °) gewoonlijk een goede trade-off tussen dekking en energiebelasting.
  2. Stel het aantal fluorescentiekanalen. De belangrijkste parameters voor elk kanaal de laserlijn, de fluorescentie filter, het laservermogen en de belichtingstijd. Voor de lange termijn live-imaging, is het belangrijk dat de geïntegreerde energiebelasting de tolerantie van het embryo niet overschrijdt. Een belichtingstijd van 25-50 ms zorgt voor snelle beeldvorming, terwijl een laservermogen van 100 tot 300 pW afbreuk doet aan de levensvatbaarheid van de embryo. Voor vaste monsters, belichtingstijd en laservermogen kan ten minste worden verdubbeld.
  3. Voor live imaging tests, het configureren van de time lapse. de complete embryogenese van Tribolium duurt ongeveer zeven dagen bij kamertemperatuur (23 ± 1 ° C) en iets minder dan drie dagen bij 32-35 ° C 64. Definieert het tijdsinterval volgens de morfogenetische gebeurtenissen die genomen moeten worden. Voor korte tijd intervallen, overweeg dan het verlagen van de blootstelling tijd en laservermogen (zie 8.2).
  4. Positioneer het embryo in doorgelaten licht stand langs de x- en y-assen in het midden van het gezichtsveld zonder bloot te stellen aan de laser. Roteer het embryo 360 ° in 90 ° stappen voor het embryo voor schade die tijdens het montageproces kunnen plaatsvinden onderzoeken.
  5. Draai de embryo geschikte wijze rond de y-as om de embryonale as af te stemmen op de microscoop assen, bijvoorbeeld de horizontale as de x-as, dat wil zeggen de dorsoventrale as de z-as. Bij gebruik van de houder spinnenweb techniek kan aanpassing niet mogelijk.
  6. In de fluorescentiemodus Definieer de z-stack for elke richting. Voeg 25-50 urn ruimtelijke buffer voor en achter het embryo. Waaronder de buffer, de typische z-stack omvat ongeveer 350-400 urn voor een Tribolium embryo. Bepaal tevens de z-afstand, die vier keer de laterale afstand moet zijn, dat wil zeggen de afstand langs de x- en y-assen 66.
  7. Als twee of meer embryo's worden afgebeeld parallel herstarten op 8.4 met de volgende embryo.
  8. Voor langdurige beeldvorming voor dat de monsterkamer gevuld met voldoende PBS pH 7,4 of andere beeldvormende buffer. Ook de monsterkamer opening.
  9. Start het beeldvormingsproces. Voor de lange termijn live-imaging, toezien op de correcte overname langs alle kanten in alle kanalen voor alle embryo's. Controleer regelmatig de komende dagen dat de embryo's in leven zijn en in de juiste positie.

9. Embryo Retrieval en Quality Control

  1. Zodra beeldvorming is voltooid, verwijdert de monsterhouder metde embryo's uit de monsterkamer. Alleen embryo's van live-imaging tests moeten worden opgehaald. Gefixeerd en gekleurd embryo kan worden weggegooid.
  2. Indien een levend beeldvorming werd uitgevoerd, breng de embryo een objectdrager. Voor het agarosekolom techniek pak het embryo van de omringende agarose met een scalpel, micro-mes of scheermes. Voor de agarose halfrond techniek dragen de halve bol met de platte kant naar de objectdrager. Embryo verwijdering is niet nodig. Voor het spinnenweb houder techniek voorzichtig demonteren het embryo uit de agarose film met een penseel. Incubeer de objectdrager in een kleine glazen schaal in verzadigde luchtvochtigheid atmosfeer onder standaardomstandigheden tot de larven uitkomen.
  3. Na het uitkomen, dragen de larven individuele putjes van een 24-wells plaat en voeg 500 mg groeimedium aan elk putje. Incubeer onder normale omstandigheden. Vergelijk de totale ontwikkelingstijd en morfologie van de afgebeelde larven aan niet-afgebeeld WT en transgene larvae (zie bespreking). In assays die kenmerkend WT ontwikkeling, mag geen duidelijke morfologische aberraties idealiter merkbaar.
  4. Zodra de larven ontwikkelen zich tot gezonde volwassenen, hen de nodige WT partners van dezelfde achtergrond stam. Na twee weken te controleren op nageslacht productie. Ook interessant om de vruchtbaarheid van het nageslacht controleren door te koppelen inter pares. Alleen wanneer het afgebeelde embryo's ontwikkelen tot vruchtbare volwassenen die vruchtbaar nageslacht te produceren, kan de beeldvorming procedure worden beschouwd als niet-invasieve.

10. Image Data Processing

LET OP: Voor de beeldgegevens verwerkt, is de open-source software voor beeldverwerking ImageJ 67 of haar derivaat FIJI 68 worden aanbevolen. Beide versies evenals uitgebreide documentatie zijn te vinden op www.imagej.net. De standaard bestandsformaat voor LSFM data is de Tagged Image File Format (TIFF). De intrinsieke container optie kan de stowoede van afbeeldingsstapels zoals z-stacks of tijdreeksen van z maximale verhogingen in één bestand in ImageJ of FIJI te openen drag-and-drop.

  1. Draai zo nodig de z-stacks aan de voorste-achterste as van het embryo met de y-as (Image → Transformeren → Roteren) sluiten. Houd er rekening mee dat de rotatie parameters moeten afzonderlijk worden ingesteld voor elke richting, maar niet voor het tijdsverloop en de fluorescentie-kanalen.
  2. Snijd de z-stacks langs de x-, y- en z-assen, zodat slechts minimale achtergrond (20-40 pixels langs de x- en y-assen, 5-10 vlakken langs de z-as) blijft (voor x - en y-assen gebruikt Rechthoekig selectiegereedschap, vervolgens Afbeelding → gewas, de z-as, gebruik Afbeelding → Stacks → Extra → Slice Keeper). Houd er rekening mee dat het bijsnijden parameters moeten afzonderlijk worden ingesteld voor elke richting, maar niet voor de tijdstippen en de fluorescentie-kanalen.
  3. Bereken de z maximale projectie voor elke z-stack(Afbeelding → Stacks → Z Project, kiezen Max Intensity). Intensiteitsprojectiewerkwijze berekeningen procedures data vereenvoudigen dat één ruimtelijke dimensie verwijderen.
  4. Voor langdurige levende beeldgegevens, overwegen een ImageJ of FIJI script uitvoert bewerkingsstappen 10,1-10,3 alle richtingen, alle tijdstippen en alle fluorescentiekanalen 65. Idealiter samenvoegen alle z maximum uitsteeksels per kanaal en richting en opslaan als een tijdreeks in een TIFF container. Alternatief kan de plug-BigDataViewer 69 voor FIJI worden gebruikt om door Terabyte grote datasets navigeren.
  5. Afhankelijk van de transgene lijn en beeldvormingsmodaliteiten, kan dynamische intensiteit aanpassing van de tijd stapels wenselijk als gevolg van foto-bleking en / of fluorofoor expressie fluctuaties. Ofwel de ImageJ- of FIJI-intrinsieke Bleach Correction-functie (Afbeelding → Pas → Bleach Correctie, kiezen Histogram Matching) of Dedicated software 65 worden voorgesteld.
  6. Als het embryo werd genoteerd en / of langs meerdere richtingen en met verschillende fluorescentiekanalen, horizontale combinatie van de richtingen (Image → Stacks → Extra → combineren) en kanaal samenvoegen (Afbeelding → kleur samenvoegen → Channels) aanbevolen.
  7. Registratie en fusie van z-stacks langs meerdere richtingen 70 verkregen, eventueel in combinatie met deconvolutie 71, maakt de berekening van superieure driedimensionale beelden van dezelfde kwaliteit en isotrope resolutie. Zowel plug-ins zijn open source en vooraf geïnstalleerd FIJI, maar zij vereisen de aanwezigheid van mijlpalen (fluorescerende microbolletjes, bijvoorbeeld korrels) rond het monster.
  8. Open-source framework voor grootschalige kwantitatieve data-extractie en analyse zijn ook beschikbaar, bijvoorbeeld voor segmentatie en tracering van celkernen 72 of cell vormherkenningsmiddelen 73.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol beschrijft een experimenteel kader voor fluorescentie beeldvorming van levende of gefixeerd en gekleurd Tribolium embryo's met LSFM. Vanwege de lage foto-bleken en foto-toxiciteit, een direct gevolg van de optische sectie vermogen, LSFM bijzonder geschikt voor langdurig leven beeldvorming.

De nieuwe AGOC {ATub'H2B-mEmerald} nr.1 transgene lijn brengt een histone2B mEmerald-fusie-eiwit onder controle van de alfa-tubuline promotor 74 1. Het toont een enhancer trap-achtige expressiepatroon 51, aangezien het fluorescentiesignaal voornamelijk wordt verkregen uit de serosa, de dooierzak en verschillende neuronale cel clusters. Met deze lijn 66 ​​h embryonale ontwikkeling bij kamertemperatuur (23 ± 1 ° C) werden geregistreerd, die germband terugtrekken en dorsale sluiting (aanvullend Film 1). Dezelijn kan worden gebruikt om neuronale clusters binnen de kop appendages (figuur 4A) en de dynamiek van serosa migratie tijdens dorsale sluiting (Figuur 4B) te visualiseren. De nieuwe AGOC {ATub'H2B-mEmerald} nr.4 lijn draagt ​​dezelfde transgen als nr.4 lijn, maar in een andere genome locatie. Het niet duidelijk enhancer trap patroon vertonen, maar het fluorescentiesignaal spatiotemporeel alom detecteerbaar als eerder beschreven voor deze promoter 74. Deze lijn is afgebeeld bij de overgang van gastrulatie tegen rek germband de optische sectie worden aangetoond op twee diepteniveaus (Figuur 4C). Een ander kenmerk, speciaal voor levende beeldvorming, is het verwerven van z-stacks langs meerdere richtingen via sample rotatie, die standaard LSFM opstellingen gebruikt ontwikkelingsbiologie. Bijvoorbeeld in de Glia-58 blauwe lijn, monster rotatie alleows de waarneming van glia cellen reorganisatie langs en rond de ventrale zenuw snoer en de proliferatie dynamiek in de linker kop kwab, die alleen juiste wijze uit de dorsale site gezien in dezelfde embryo (figuur 4D, Aanvullende Film 2). De live-imaging datasets in verband met deze studie worden weergegeven als een downloadbare resource, meta en toegang tot informatie zijn te vinden bij het tweede Aanvullend tabel 1.

Aangezien de keuze van transgene lijnen voor levende beeldvorming nog beperkt is, kunnen kleine fluorescente kleurstoffen worden gebruikt om specifiek te labelen intracellulaire structuren. SYTOX Green bindt aan celkernen en kan worden gevisualiseerd in het groene kanaal, terwijl YOYO-1 en BOBO-3 jodium binden aan de nucleaire envelop en kan worden gevisualiseerd in de groene en rode kanaal (Figuur 5A). Deze kleurstoffen kunnen worden gebruikt om bepaalde embryonale structuur te markerengelen, zoals de serosa littekens (Figuur 5B, eerste kolom), de dorsale ventrale serosa cellen (Figuur 5B, tweede kolom) of de serosa-amnion-germband weefsel drielaagse die ontstaat tijdens serosa raamsluitconstructies (Figuur 5B, derde tot vijfde kolom). Tweekleurige kleuring maakt de visualisatie van twee intracellulaire structuren in hetzelfde embryo, bijvoorbeeld kern envelop met het actine cytoskelet, die kan worden gekleurd met Alexa Fluor-geconjugeerd Phalloidine kleurstoffen. Bijvoorbeeld kan YOYO-1 jodide gecombineerd met Phalloidin 546 (figuur 5C), terwijl BOBO-3 te combineren met Phalloidin 488 (Figuur 5D).

Het is ook handig om vast te stellen en te kleuren transgene embryo's die al een zekere fluorescerend eiwit tot expressie, omdat de fixatie procedure dooft de intrinsieke fluorescence signaal slechts marginaal. Zo kunnen embryo's uit AGOC {ATub'H2B-mEmerald} nr.4 transgene lijn, waarbij de kernen worden gedetecteerd in het groene kanaal, worden gekleurd met Phalloidin 546 zodat het actine cytoskelet zichtbaar in het rode kanaal (figuur 6 ).

Figuur 1
Figuur 1: Vergelijking van de conventionele Widefield, confocale laser scanning en Licht vel gebaseerde fluorescentie microscopie. Gebruikelijke groothoek epifluorescentie microscopie gebruikt xenon arc / kwikdamplampen met geschikte filters of high-power lichtdioden als lichtbron. Voor elk verkregen beeld tweedimensionaal, wordt het gehele monster verlicht met een niet buigingsbegrensde lichtkegel. In confocale laser scanning fluorescentiemicroscopie, een buigingsbegrensde Gaussische laserbundel scanned door het monster en de fluorescentie wordt gedetecteerd incoherent punt voor punt. Bij bekende groothoek epifluorescentie microscopie wordt het gehele monster verlicht elk verkregen beeld tweedimensionaal. Gezien vel gebaseerde fluorescentiemicroscopie, een buigingsbegrensde Gaussische laserbundel verlicht het monster loodrecht op de detectie-as. Fluorescentie wordt gedetecteerd ofwel vlak per vliegtuig of lijn per lijn. Tijdens de verwerving van een tweedimensionaal beeld, slechts een klein volume gecentreerd op het brandvlak van het objectief detectie ervaart de effecten van het excitatielicht. Het resterende volume van het monster is niet verlicht, niet bijdraagt ​​aan out-of-focus onscherpte, heeft geen last van foto-toxische effecten en niet fluoroforen als gevolg van foto-bleken te verliezen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

ep-together.within-page = "1"> Figuur 2
Figuur 2: Het principe van Light Sheet-gebaseerde fluorescentie microscopie. In LSFM, belichting en detectie zijn in ten minste twee optische paden. Ten minste één belichting arm wordt gebruikt om de lichtwaaier (cyaan) te genereren, waarbij ten minste één detectiedomein dat arm is voorzien van een geschikt filter en een camera voor de parallelle detectie van het fluorescentiesignaal (groen). LSFM twee canonische implementaties, de enkelvoudige (of selectief) vlak belichting microscoop (achtergrond) en het afgetaste digitale laserlicht plaat microscoop (rode achtergrond). Door het specimen en het licht plaat ten opzichte van elkaar worden drie-dimensionale beelden verkregen. Informatie over meerdere richtingen wordt verzameld door roteren van het monster om de y-as, die bij voorkeur is gericht volgens de zwaartekracht.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Drie verschillende montagetechnieken gebruikt in de opname van de embryonale ontwikkeling van Tribolium met licht Sheet-gebaseerde fluorescentie microscopie. (A) De agarosekolom betrekking op een stalen cilinder met een puntig het agarosekolom, waarbij het embryo is ingebed, uit een glazen capillair duwt. De agarose hemisfeer is gemonteerd op een stalen pijp. Het embryo is de pool van de halve bol met een kleine hoeveelheid agarose gevoegd. Het spinnenweb houder is een metalen plaat met een sleufgat boven op de stalen cilinder. Het embryo is gelijmd op een dunne film die agarose t overspantHij sleufgat. (B) Regelingen van de drie bevestigingstechnieken in een lichtwaaier microscoop. (C) De drie bevestigingstechnieken toegepast binnen een DSLM. (D) Voorbeelden van beelden van embryo's van Glia-blauwe transgene lijn die met de drie bevestigingstechnieken. De embryo's, die bij het begin van terugtrekking germband zijn weergegeven met hun achterste einde naar boven gericht om de transmissie lichtbeelden passen. FM, fluorescentiemodus; ZA, z maximale projectie met intensiteitinstellingsinrichting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Live-Imaging van Tribolium embryo's. (A </ Strong>) Een embryo van de AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 regel bij de overgang van germband terugtrekken dorsale sluiting. Deze lijn vertoont een enhancer trap expressiepatroon. Het fluorescentiesignaal wordt vooral in de serosa, de dooierzak en enkele neuronale cel clusters. De embryo's die gedurende 15 uur met een interval van 5 uur. Het detail beelden tonen cel clusters in het hoofd aanhangsels. Aanvankelijk worden de clusters nog onder sereuze cellen (eerste kolom), op serosa breuk, de cellen te volgen met de draaibeweging van de kop. (B) Dezelfde embryo's in dorsale sluiting voor 01:30 uur met een interval van 00:30 uur. Het detail beelden tonen de migratie van de gescheurde serosa over de dooierzak. (C) Bovenste rij: Een embryo van de AGOC {ATub'H2B-mEmerald} nr.4 leiding bij de overgang van gastrulatie tegen rek germband. Middelste en onderste rij: Single vlakken wordt in twee dieptes gedurende een periode van 10:30 uur met een interval van 1:30h. (D) Een embryo van Glia-blauwe lijnen germband terugtrekken getoond gedurende 50:30 uur met een interval van 07:30 uur. De detailbeeiden geven de morfogenetische reorganisatie van de gliacellen in de linker hoofd kwab. ZA, z maximale projectie met intensiteitinstellingsinrichting; PA enkel vlak met intensiteitinstellingsinrichting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Fixatie, kleuring en Iimaging WT embryo tijdens Germband rek. (A) Embryo's gekleurd met ofwel SYTOX Green, namelijk een fuzzy nucleaire kleuring of YOYO-1 jodide of BOBO-3 jodide, namelijk twee nucleaire envelop vlekken. (B) YOYO-1 jodide gekleurde embryO. Gegevens tonen de serosa litteken (eerste kolom), de kern omhullende van het grote postérieure ventrale serosa cellen (tweede kolom) of drie lagen weefselorganisatie van de serosa, de amnion en de feitelijke embryonaal weefsel (derde tot vijfde kolom). (C) Tweekleurige kleuren met YOYO-1 jodide en Phalloidin 546. (D) Tweekleurige kleuren met Phalloidin 488 en BOBO-3 jodide. ZA, z maximale projectie met intensiteitinstellingsinrichting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Beelden van gefixeerd en gekleurd Transgene embryo's uit de AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} # 1 regel. Deze transgene lijn uitdrukt mEmerald-labeled histone2B (H2B) onder besturing van de alfa-tubuline promotor 1, waarbij de kernen / chromatine alomtegenwoordig markeert het gehele embryonale ontwikkeling. Het embryo werd verder gekleurd met Alexa Fluor 546 Phalloidin, waarbij het actine cytoskelet / f-actine labels. ZA, z maximale projectie met intensiteitinstellingsinrichting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

criterium fluorescentiemicroscoop Type
conventionele groothoek confocale laser scanning licht-sheet based
objectief setup een objectieflens, middelhoog NA twee loodrecht objectieflenzen, verlichting: lage NA, detectie: hoge NA
belichtingslichtbron witte lichtbron en de juiste filters (bv kwik korte boog lampen)
of LED-gebaseerde met een clean-up filters 		laser sanering filter
(Bijvoorbeeld diodes of lasers DPPS) 		laser sanering filter
(Bijvoorbeeld diodes of lasers DPPS)
verlichting per tweedimensionaal beeld gehele monster gehele monster
(Typisch tweedimensionale Gaussische bundel scan) 		Alleen brandpuntsvlak
(DSLM: eendimensionale Gauss bundelaftasting)
opsporing parallel
(Gewoonlijk CCD-camera of sCMOS) 		sequentiële
(Fotovermenigvuldigerbuis) 		parallel
(Gewoonlijk CCD of SCMOS camera)
imaging snelheid snel (milliseconden per afbeelding) langzame (seconden per afbeelding) snel (milliseconden per afbeelding)
out-of-focus fluorescentie geen discriminatie bijna volledig geblokkeerd door de pinhole
(Afstoting efficiency afhankelijk van diameter) 		bijna onbestaande
(Alleen als gevolg van verstrooiing)
ruimtelijke dimensies 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
verdere vrijheidsgraden 2
(Tijd, fluorescentiekanaal) 		2
(Tijd, fluorescentiekanaal) 		3
(Tijd, fluorescentie kanaal richting)
laterale resolutie r
(0,6 λ / NA) 		0,66 r
(0,4λ / NA) 		r
(0,6 λ / NA)
optische sectie vermogen Nee Ja
(Discriminatie op het detectiepad) 		Ja
(discriminatie op de verlichting route 75)
beschikbaarheid en prijs voornamelijk commerciële, lage kosten voornamelijk commerciële, dure commerciële, dure
custom-built, matige 54,59,60,75
live-imaging publicaties met betrekking tot Tribolium embryo zes 44,76,77,78,79,80 zeven 23,77,79,81,82,81
(draaiende schijf confocale) 83,84,85 		vier 23,57,65,86

Tabel 1 - Kenmerken van fluorescentienvu Microscopietechnieken gebruikt in Tribolium leven Imaging.

verfstof kleuring verdunning
SYTOX Green kernen (fuzzy) 1: 10.000 (1: 100 in DDH 2 O en 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
YOYO-1 Iodide nucleaire envelop 1: 10.000 (1: 100 in DDH 2 O en 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
BOBO-3 Iodide nucleaire envelop 1: 10.000 (1: 100 in DDH 2 O en 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
Alexa Fluor 488 Phalloidin actine cytoskelet 1: 100 (in 1% (w / v) BSA in PBS)
Alexa Fluor 546 Phalloidin actine cytoskelet

Tabel 2 - Kleuring Solutions.

agarosekolom
(Optie 1) 		halfrond
(Optie 2) 		spinnenweb houder
(optie 3)
motivering embryo is ingebed in een agarose kolom die uit een capillair wordt geduwd achterste uiteinde van embryo wordt gelijmd pool van een agarose hemisfeer embryo verlijmd dunne film agarose spanning een sleufgat
monsterhouder stalen cilinder met pin stalen pijp stalen cilinder met
sleufgat
onbeperkt (any) onbeperkt (any) vier (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
vereiste vaardigheidsniveau matig hoog laag
agarose rond het embryo hoog laag matig
aantal embryo's per sessie maximaal drie een tot zes
embryo retrieval tricky gemakkelijk gemakkelijk
wegwerpmateriaal glascapillairen - -
aanbevolen voor op korte termijn live-imaging, gekleurd embryo op lange termijn live-imaging op lange termijn live-imaging, gekleurd embryo
<strong> referenties drie 23,87,88 twee 57,65 deze publicatie

Tabel 3 - montagemethoden en nadelen.

waren geen uitzondering fenotype inductie motivering stap referentie (methodologische)
embryonale RNA interferentie dubbelstrengs RNA geïnjecteerd in embryo's in het stadium syncytieel blastoderm neerhalen één of meer specifieke genen injecteren embryo's na stap 4.8. twee 33,81
ouderlijke RNA interferentie dubbelstrengs RNA zijdelings geïnjecteerd in female poppen tussen de buiksegmenten 3 en 4, wat leidt tot gen knock-in het nageslacht neem de poppen uit stap 1.5. twee 36,37
recessieve letale embryonale mutantlijnen Eierleggende culturen die een embryonaal recessieve letale mutatie heterozygoot opbrengst ongeveer 25% homozygoot mutant nageslacht voeren kruis mutantlijn in imaging lijnen Stap 1.5. drie 39,51,89
toepassing van extrinsieke factoren bepaalde biologisch actieve of toxische factoren extrinsiek toegepast op de embryo's te voegen aan de beeldvorming buffer voeg factor beeldvorming buffer in stap 2.2. twee 83,85

Tabel 4 - LSFM Live-Imaging van waren geen uitzondering Phenotypes

Aanvullende Tabel 1 - Metadata en parameter voor de lange termijn live-imaging Datasets DS0001-0003. Klik hier om het bestand te downloaden.

Aanvullende Movie 1 - Live-Imaging van een Tribolium Embryo van de AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgene lijn.
Deze lijn vertoont een enhancer trap expressiepatroon. Het fluorescentiesignaal wordt voornamelijk gevonden in de serosa, de dooierzak en een subset van neuronale cellen. Het embryo is getoond op vier oriëntaties van 00:00 uur tot 66:00 uur met een tussenpoos van ongeveer 00:30 uur tussen de tijdstippen. De film begint bij het begin van germband terugtrekken en eindigt zodra dorsale sluiting is voltooid. Framesnelheid vijf frames per seconde. ZA,z maximale projectie met intensiteitinstellingsinrichting. Klik hier om het bestand te downloaden.

Aanvullende Movie 2 - Live-Imaging van een Tribolium Embryo van de Glia-blauwe transgene lijn.
Het embryo is getoond op vier oriëntaties van 00:00 uur tot 66:00 uur met een tussenpoos van ongeveer 00:30 uur tussen de tijdstippen. De film begint bij het begin van germband terugtrekken en eindigt zodra dorsale sluiting is voltooid. Framesnelheid vijf frames per seconde. ZA, z maximale projectie met intensiteitinstellingsinrichting. Klik hier om het bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kwaliteitscontrole

In levende beeldvormende assays, moet het preparaat en registratieprocedure niet-invasief, dat wil zeggen noch de mechanische en chemische hanteren (verzamelen, dechorionation, montage op de monsterhouder) noch de geïntegreerde lading energie tijdens de waarneming de levensvatbaarheid van het preparaat moeten beïnvloeden. Voor studies die kenmerkend WT ontwikkeling, is het raadzaam om alleen gegevens uit experimenten waarin het embryo overleeft het opnameproces, wordt met succes opgehaald en zich ontwikkelt tot een gezonde volwassene. De volwassen mag geen morfologische afwijkingen vertonen, vruchtbaar moeten zijn en de nakomelingen moeten ook vruchtbaar zijn. Er zijn drie belangrijke redenen voor de lage overlevingskansen, vooral op de lange termijn voor live imaging assays:

Eerst werd het embryo oppervlak uitgebreid bedekt met agarose in stap 7, wat waarschijnlijk belemmert ion en gasuitwisseling en vernauwt de embryo Mechanisch. Beïnvloed embryo's, vooral wanneer afgebeeld tijdens de vroege embryogenese, meestal ontwikkelen onopvallend voor enkele uren, arresteren plotseling en snel verliezen hun fluorescentie-signaal. Met enige ervaring kan het oppervlakgedeelte dat agarose ingebed met de halve bol techniek onder eenderde worden gehouden, terwijl het spinnenweb houder techniek ten hoogste de helft van het oppervlak is bedekt met een zeer dunne agaroselaag. Ten tweede, de geïntegreerde energie belasting van het embryo dan de tolerantie. De waarden die in stap 8.2 dienen als een vuistregel, maar de volgende criteria moeten worden overwogen: (i) embryo's tijdens de vroege embryonale ontwikkeling niet laser bestraling verdragen evenals embryo's tijdens de late embryonale ontwikkeling, (ii), hoewel de geïntegreerde energiebedrijven load kunnen identiek zijn, groter laservermogen met hetzij lagere belichtingstijd of langere tijdsintervallen lijkt meer stress dan lager laservermogen te worden met een hoge belichtingstijd of kortere tijdsintervallen(Iii) hogere golflengtes zijn meestal beter verdragen en (iv) voor transgene lijnen, wordt de tolerantiegrens line-specifiek, terwijl fluorofoor expressie sterk lijkt omgekeerd evenredig met de laserbestraling tolerantie zijn. Daarnaast is het ontwerp van het fusie-eiwit en / of de intracellulaire lokalisatie ook een rol spelen. Ten derde wordt het embryo beschadigd tijdens de montage proces. De cruciale factor is dat de incubatietijd in de natriumhypochlorietoplossing zo klein als nodig is om het chorion volledig te verwijderen. Langere incubatietijden kunnen schadelijk zijn voor de embryo's. Zorg moet worden genomen om niet doorboren of knijp de embryo met de borstel en het monteren agarose bij omgevingstemperatuur te houden. Beschadigde embryo's kunnen worden vastgesteld tijdens stap 8.4 voor de daadwerkelijke beeldvorming proces begint, zodat beschadigde embryo's kunnen worden vervangen met levensvatbare degenen.

Door het volgen van deze richtlijnen, meestal rond de 85-90% van de embryos overleven de live-imaging procedure en doorgeefluik. Ongeveer 90% van de gearceerde embryo's ontwikkelen tot gezonde en vruchtbare volwassenen. De overlevingsverhouding lijkt onafhankelijk van afbeelden temperatuur en montagetechnieken (wanneer de agarosekolom wordt gebruikt voor het afbeelden periode van ten hoogste een halve dag), maar enigszins afneemt met verhoogde laser bestraling. Als extra controle, met name tijdens de initiële karakterisering van op maat gemaakte transgene lijnen op fluorescentie levende beeldvorming of het kader dat fase als precursor voor een uitgebreide experimentele reeks, is het raadzaam om niet-afgebeelde WT en transgene embryo parallel aan de afgebeelde embryo's die zijn geïncubeerd bij dezelfde temperatuur als het afgebeelde embryo, en vergelijk de ontwikkelingstijd en morfologie 65.

Bovendien moet studies waren geen uitzondering fenotypen (Tabel 4) via rechtstreekse beeldvorming kenmerkend een niet-getroffen c beheerdontrole- embryo parallel. Het wordt aanbevolen om de behandeling van zowel embryo's zoveel mogelijk gelijk te houden, maar dit moet afzonderlijk worden beschouwd voor elke experimentele strategie:

Neerhalen door RNA interferentie.

Voor embryonale RNA interferentie 33, 81, dient embryo's uit dezelfde eierleggende kweek ofwel geïnjecteerd met functionele of controle dubbelstrengige RNA. De verschillend geïnjecteerde embryo's vervolgens gelijktijdig in dezelfde LSFM worden afgebeeld met behulp van de agarosekolom of spinnenweb houder techniek. Voor parenterale RNA interferentie 36, 37, moet de beeldvormende kweek worden gesplitst in twee subculturen. Vrouwelijke poppen van een subcultuur moet worden geïnjecteerd met de functionele dubbelstrengs RNA, terwijl de andere subcultuur worden geïnjecteerd met controle dubbelstrengige RNA. embryo collectie worden parallel uitgevoerd, en zowel de experimentele als de controle embryo kan gelijktijdig in dezelfde microscoop worden afgebeeld met de agarosekolom of spinnenweb houder techniek.

Recessieve letale embryonale mutant lijnen.

Bij het werken met recessieve embryonale letale mutanten 39, 89, 91, 92, 93, een eierleggend kweek van heterozygote mutanten, die normaal fenotype onopvallend zijn, levert theoretisch 25% homozygoot mutant nageslacht (maar soms minder vanwege praktische hantering uitgeeft 89) en 75% fenotypisch onopvallende nakomelingen (50% heterozygote mutanten en 25% WTS). Het wordt aanbevolen om het spinneweb houder techniek gebruiken om een ​​aantal embryo's te monteren van een dergelijk-eierleggende cultuur. De homozygote mutanten kunnen i wordendentified in de loop van beeldvorming door de manifestatie van het fenotype, terwijl het zich normaal ontwikkelende embryo's dienen als controles. Het genotype van de afgebeelde monsters kan worden bepaald zodra beeldvorming en kwaliteitscontrole voltooid.

Toepassing van extrinsieke factoren.

Indien de invloed van extrinsieke factoren binnen de beeldvormende buffer 83, 85, zoals bioactieve of giftige stoffen, ontwikkeling onderzocht parallelle beeldvorming tezamen met een controle embryo in dezelfde LSFM typisch niet mogelijk. Daarom heeft beeldvorming achtereenvolgens worden uitgevoerd. Optimaal wordt de tijd tussen opeenvolgende experimenten geminimaliseerd en de embryo's uit dezelfde kweek beeldvorming. Als alternatief twee identiek geconstrueerde en bedreven LSFMs kunnen worden gebruikt. In dit geval moet embryo's uit hetzelfde ei legperiode worden gebruikt, maar het is van groot belang dat the calibratie van zowel microscoop voorzichtig uitgevoerd dat de afbeeldingseigenschappen vergelijkbaar. Via de spinnenweb houder techniek kunnen meerdere embryo's voor elke conditie te beelden tegelijk. Met de agarosekolom techniek, kan de extrinsieke factoren worden gehinderd door het bereiken van de embryo's.

Huidige beperkingen van de LSFM live-imaging benadering

LSFM is een krachtig hulpmiddel embryonale morfogenese analyse van niet-invasieve wijze meervoudige brede schaal dimensies. Standaard bedieningsprocedures, zoals voorgesteld in dit protocol, zal het proces ondersteunen lichtwaaier technologie te vestigen als standaardinstrument in ontwikkelingsbiologie. Echter, de aanpak beperkt door een aantal factoren op diverse experimentele en organisatorische niveaus:

Aanvankelijk LSFM is ontwikkeld om een ​​monster te analyseren op een moment. Alle huidige benaderingen die beeld twee of meer embryo gelijktijdig in dezelfde microscoop b y 'stapelen' het specimen langs de y-as in de agarosekolom of spinnenweb houder lost dit probleem slechts tot op zekere hoogte. Multiwell-platen of dekglaasje-gebaseerde opstellingen zijn 94, 95, 96. Echter, ze lijdt aan een verminderde beeldkwaliteit en offeren een deel van de essentiële voordelen van LSFM, zoals beeldvorming langs meerdere richtingen. Momenteel is de beste optie is om te werken met meerdere microscopen in parallel, wat redelijkerwijs mogelijk wordt wanneer dure componenten, zoals de laser, worden gedeeld 60.

Met de EFA-nGFP 57, 65, 84, FNL 86, wordt de intelligente 58, 86, de AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, de AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 en Glia-blue= "xref"> 58, slechts zes op maat gemaakte transgene lijnen die geschikt zijn voor de lange termijn voor live beeldvorming zijn momenteel beschikbaar. Bovendien, de HC079 (amnion), G12424 (serosa) en G04609 (hart) enhancer trap lijnen 51 werden gekarakteriseerd met LSFM 23. Als alternatief kunnen fluorescerende embryo's ook worden gegenereerd door mRNA 81 of kleurstof injectie 79, deze benaderingen zijn relatief eenvoudig, maar ook last van beperkingen 86. Verschillende andere normen steeds vereist zoals cytoskeletal-, organelle- en membraan gemerkte lijnen of lijnen die tot expressie fluoroforen van sommige niet-alomtegenwoordige promotoren tot bepaalde organen of weefsels te observeren. Idealiter die lijnen zijn ook verkrijgbaar met verschillende fluorescente proteïnen.

Een andere uitdaging is het datavolume wordt gegenereerd door LSFM. Door acquisitie van gegevens in drie ruimtelijke dimensies en ten minste drie further vrijheidsgraden (tijd, richting, fluorescentiekanaal), kan de grootte van levende imaging datasets eenvoudig vele gigabytes oplopen tot enkele terabytes. Zelfs na drie-dimensionale bijsnijden en ZIP-gebaseerde compressie van de TIFF containers, drie illustratieve datasets waaraan deze studie hebben afmetingen van 31,6, 12,6 en 45,1 Gigabyte, namelijk 89,3 Gigabyte in totaal. Bij het werken met LSFM, is het nodig om de respectieve infrastructuur voor gegevensopslag en -verwerking 88, 97 hebben.

De hoogste beeldkwaliteit wordt verkregen aan het oppervlak van het embryo, maar met toenemende diepte, het fluorescentiesignaal wordt steeds wazig. Zo wordt het achterste uiteinde van de germband waarop de dooierzak vouwen tijdens gastrulatie en kan niet goed worden opgelost (figuur 4C, eerste tot vijfde kolom). Beeldvorming langs meerdere richtingen lost dit probleem op ten minste een deelially - hoogwaardige informatie van het oppervlak rondom het embryo beschikbaar is, maar de innerlijke regio's blijven vaag. Momenteel geen bevredigende oplossingen zijn verkrijgbaar, maar op de lange termijn, infrarood fluorescerende eiwitten 98, 99 of genetische benaderingen microscoop opstellingen met adaptive optics 100 kan worden beschouwd.

Aanpassing voor andere soorten

Inmiddels is LSFM gebruikt om de embryonale ontwikkeling van drie insectensoorten documenteren, namelijk de fruitvlieg Drosophila melanogaster 61, 62, 101, het schutbord vlieg Megaselia abdita 102 en de rode Tribolium castaneum 57. De experimentele kader standaardprocedures en montagetechnieken beschreven should gemakkelijk aan andere insectensoorten. Kiemlijn transformatieprotocollen voor vele insecten die behoren tot verschillende orden zijn 103, waaronder soorten economische en / of medisch belang, zoals de honingbij 104 verschillende lepidopterans 105, 106 of meer soorten muggen 107, 108, 109. Met respectievelijke transgene lijnen geschikt voor levende fluorescentie beeldvorming kan de embryonale morfogenese van insecten kenmerk terwijl gezien hun evolutionaire lijnen en / of niche. Ongeveer een miljoen insectensoorten zijn beschreven en nog eens twintig miljoen insecten soorten die het meest waarschijnlijk bestaan 110, die meer dan 400 miljoen jaar evolutie 2. Alleen de vergelijkende aanpak zal informatie die genereert op zijn beurt provides inzichten die niet kan worden verkregen door het bestuderen van de ontwikkelingsbiologie principes van slechts een enkele soort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

auteur Bijdragen

FS en EHKS bedacht het onderzoek. FS gegenereerd AGOC de transgene lijnen. Licht-sheet based fluorescentiebeeldvorming werd uitgevoerd door FS en SK. FS en EHKS schreef het manuscript met de input van SK.

Acknowledgments

Wij danken Sven Plath voor technische ondersteuning. De Glia-blauwe transgene lijn was een soort geschenk van Gregor Bucher (Göttingen, Duitsland). Het onderzoek werd gefinancierd door de Cluster of Excellence Frankfurt am Main voor macromoleculaire complexen (CEF-MC, EXC 115, spreker Volker Dötsch) gedeeltelijk toegekend aan EHKS bij de Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS, directeur Enrico Schleiff) bij het Goethe Universität Frankfurt am Main door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

Developmental Biology Arthropod insect Coleoptera, Morfogenese embryogenese niet-invasieve langdurige fluorescentie live-imaging light-sheet op basis van fluorescentie microscopie drie-dimensionale licht microscopie LSFM DSLM SPIM
Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter