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Developmental Biology

लाइट शीट के आधार पर जीने की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या फिक्स्ड और स्टेन्ड Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ कीट भ्रूण के morphogenesis इमेजिंग कला के राज्य बन गया है। यह प्रोटोकॉल की रूपरेखा और तीन बढ़ते Tribolium castaneum भ्रूण के लिए उपयुक्त तकनीक तुलना, दो उपन्यास कस्टम निर्मित ट्रांसजेनिक लाइनों में अच्छी तरह से लाइव इमेजिंग के लिए अनुकूल का परिचय है, आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण पर चर्चा करता है और वर्तमान प्रयोगात्मक सीमाओं इंगित करता है।

Abstract

लाल आटा बीटल Tribolium castaneum विकास आनुवंशिकी और विकासवादी विकास जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण कीट मॉडल जीव बन गया है। प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Tribolium भ्रूण के अवलोकन पारंपरिक widefield और कोंफोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इसने कई फायदे हैं। एक प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोप के अद्वितीय गुणों के कारण, रहने वाले नमूनों में से तीन आयामी छवियों उच्च संकेत से शोर अनुपात के साथ दर्ज किया जा सकता और काफी अवधि कि कई पिछले से अधिक फोटो विरंजन के साथ-साथ कई दिशाओं के साथ तस्वीर विषाक्तता कम दिन। Methodological विकास और डेटा की एक सतत वृद्धि के चार से अधिक वर्षों के साथ, समय Tribolium समुदाय में प्रकाश चादर प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए भी कीट समुदाय में के रूप में बड़े पैमाने पर मानक संचालन प्रक्रियाओं की स्थापना करने के लिए उपयुक्त लगता है। यह प्रोटोकॉल तीन बढ़ते च उपयुक्त तकनीक का वर्णनया विभिन्न प्रयोजनों के दो उपन्यास कस्टम निर्मित ट्रांसजेनिक Tribolium लाइनों लंबे समय तक जीना इमेजिंग के लिए उपयुक्त प्रस्तुत करता है, पाँच फ्लोरोसेंट रंजक तय भ्रूण के intracellular संरचनाओं लेबल करने के लिए सुझाव देता है और दर्ज आंकड़ों के समय पर मूल्यांकन के लिए डेटा पोस्ट-प्रोसेसिंग के बारे में जानकारी प्रदान करता है। प्रतिनिधि परिणाम लंबे समय तक जीना इमेजिंग, ऑप्टिकल सेक्शनिंग और कई दिशाओं के साथ एक ही भ्रूण के अवलोकन पर ध्यान केंद्रित। संबंधित डेटासेट एक डाउनलोड संसाधन के रूप में प्रदान की जाती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल को लाइव इमेजिंग assays, वर्तमान सीमाओं और अन्य कीट प्रजातियों को रेखांकित किया प्रक्रियाओं की प्रयोज्यता के लिए गुणवत्ता नियंत्रण की चर्चा।

इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से विकास जीव जो इमेजिंग समाधान है कि मानक प्रयोगशाला उपकरणों मात की तलाश के लिए है। यह तकनीकी रूप से केंद्रित प्रयोगशालाओं / समुदायों, जो विकास और माइक्रो को निखारने के बीच की खाई को बंद करने के निरंतर प्रयास को बढ़ावा देता हैmethodologically प्रतिलिपि बनाएँ, और जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं / समुदायों, जो तकनीकी चुनौतियों का सामना करने के लिए 'प्लग-एंड-प्ले' समाधान की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह एक स्वयंसिद्ध दृष्टिकोण है कि ध्यान के केंद्र में जैविक सवालों ले जाता है का समर्थन करता है।

Introduction

लाल आटा बीटल Tribolium castaneum, जो कजलानेवाला बीट्लस के बड़े परिवार (Tenebrionidae) के अंतर्गत आता है, कृषि और जीवन विज्ञान के भीतर एक लंबा इतिहास रहा है और दूसरा सबसे अच्छा अध्ययन किया फल के बाद मॉडल कीट मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खी है। पिछले चार दशकों के दौरान, यह विकासवादी विकास जीव विज्ञान में विकास आनुवंशिकी में एक शक्तिशाली और लोकप्रिय कीट मॉडल जीव बन गया, और, पिछले बीस वर्षों के दौरान, कई कारणों से के लिए भ्रूण morphogenesis में:

ड्रोसोफिला और Tribolium दोनों Holometabola के हैं, लेकिन लगभग 300 मिलियन साल पहले 1, 2, 3, 4 अलग हुए। ड्रोसोफिला के भ्रूण के विकास आम तौर पर अत्यधिक व्युत्पन्न माना जाता है, Tribolium devel का एक और अधिक पैतृक मोड से पता चलताopment कि कीट प्रजातियों 5, 6, 7, 8, 9 की एक काफी बड़ा अनुपात में पाया जाता है। सबसे पहले, Tribolium गैर involuted सिर विकास दर्शाती है, यानी अपनी mouthparts और एंटीना embryogenesis 10, 11, 12, 13, 14, 15 के दौरान पहले से ही उभरते हैं। दूसरे, Tribolium शॉर्ट रोगाणु विकास, यानी पेट क्षेत्रों germband बढ़ाव 16, 17, 18, 19 के दौरान एक पीछे विकास क्षेत्र से क्रमिक रूप से जुड़ जाते हैं के सिद्धांतों इस प्रकार है। तीसरा, Tribolium विकसित करता है और बाद में खराबी आ रहीदो अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली भ्रूणावरण है, जो भ्रूण केवल पेट को शामिल किया गया, और serosa, जो भ्रूण पूरी तरह से envelops 20, 21, 22 अर्थात्। दोनों झिल्ली एक महत्वपूर्ण मॉर्फ़ोजेनेटिक 23 के साथ ही सूक्ष्मजीवों 24, 25 और सुखाना 26 के खिलाफ रक्षात्मक भूमिका निभाते हैं। चौथा, embryonically विकासशील पैर लार्वा जीवन चरण के दौरान पूरी तरह से कार्य कर रहे हैं और पोटा संबंधी कायापलट 27, 28, 29, 30, 31 के दौरान वयस्क पैरों के लिए primordia के रूप में सेवा करते हैं।

उनके छोटे आकार और मामूली मांगों के कारण, प्रयोगशाला में Tribolium की खेती काफी सरल है। जंगली प्रकार की संस्कृति (WT) उपभेदों या ट्रांसजेनिक लाइनों आम तौर पर चारों ओर 100-300 वयस्कों से मिलकर बनता है और एक लीटर कांच की बोतलें (पदचिह्न 80 सेमी 2) भरे तीन से चार सेंटीमीटर उच्च (लगभग 50 ग्राम) विकास का माध्यम है कि पूरा अनाज गेहूं के होते हैं के साथ भीतर रखा जा सकता है आटा निष्क्रिय सूखा खमीर के साथ पूरक। एक पानी की आपूर्ति आवश्यक नहीं है। यह यहां तक ​​कि छोटे प्रयोगशालाओं छोटे या मध्यम आकार के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कीट इन्क्यूबेटरों के भीतर बीटल संस्कृतियों के दर्जनों रखने के लिए अनुमति देता है। Tribolium के बाद विकास के चरणों (लार्वा लगभग के बाद चौथे इनस्टार, प्यूपा और वयस्कों) आसानी से sieving द्वारा विकास माध्यम से अलग होती है। सिंक्रनाइज़ भ्रूण अंडे बिछाने माध्यम पर संक्षिप्त अवधि के लिए वयस्कों विकासशील द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। तेजी से विकास के लिए, बीटल संस्कृतियों, 32 डिग्री सेल्सियस (पीढ़ी प्रति के बारे में चार सप्ताह) पर रखा जाता है, जबकि स्टॉक रखने को आम तौर पर 22-25 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है (लगभग दस सप्ताह पीढ़ी के अनुसार)।

पिछले एक दशक के भीतर, कई मानक टीईसीhniques धीरे-धीरे अनुकूलित किया गया है और Tribolium के लिए अनुकूलित, उभरती हुई मॉडल जीवों किताबें 32 में संक्षेप के रूप में। काफी महत्व की उन्नत हैं जैसे कि भ्रूण 33 के रूप में आनुवंशिक तरीकों, लार्वा 34, 35 या अभिभावकों की 36, 37 आरएनए हस्तक्षेप आधारित जीन नॉकडाउन, या तो piggyBac 38, 39 या 40 मिनोस Transposase प्रणाली और CRISPR / Cas9 आधारित जीनोम के साथ germline परिवर्तन इंजीनियरिंग 41। इसके अलावा, Tribolium जीनोम के बारे में एक दशक पहले 42 अनुक्रम निर्धारण किया गया है, और जीनोम के तीसरे दौर विधानसभा 43 जारी है, जो कुशल और जीनोम चौड़ा पहचान और जीन 44 के व्यवस्थित विश्लेषण की अनुमति देता है में है 45, 46। इसके अतिरिक्त, चार अन्य coleopteran प्रजातियों के जीनोम तुलनात्मक आनुवंशिक दृष्टिकोण 47, 48, 49, 50 के लिए उपलब्ध हैं। अनुक्रम जीनोम के साथ मिलकर दो बड़े पैमाने पर आनुवंशिक विश्लेषण एक इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस स्क्रीन 51 और एक व्यवस्थित आरएनए हस्तक्षेप आधारित जीन पछाड़ना स्क्रीन 52, 53 यानी, प्रदर्शन किया गया है।

Widefield, कोंफोकल या प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोपी (LSFM) के साथ प्रतिदीप्ति लाइव इमेजिंग एक बहु-आयामी संदर्भ (तालिका 1) में समय के एक समारोह (यानी morphogenesis) के रूप में Tribolium की भ्रूण आकृति विज्ञान निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है। widefield और कोंफोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में, Excitव्यावहारिक और उत्सर्जन प्रकाश एक ही उद्देश्य लेंस के माध्यम से निर्देशित है। दोनों दृष्टिकोण में, पूरे नमूना हर दर्ज की गई दो आयामी विमान के लिए प्रकाशित किया जाता है। इसलिए, नमूनों बहुत ही उच्च ऊर्जा स्तर के अधीन हैं। LSFM में, केवल फोकल विमान में fluorophores दो लंबवत व्यवस्था की ऑब्जेक्टिव लेंस (चित्रा 1) का उपयोग करके रोशनी और पता लगाने के एक decoupling की वजह से बहुत उत्साहित हैं। LSFM दो कैनन कार्यान्वयन में आता है - एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोप (SPIM) और डिजिटल स्कैन किया लेजर प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (DSLM, चित्रा 2) - और पारंपरिक दृष्टिकोण पर कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है: (i) आंतरिक ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, (ii) अच्छा अक्षीय संकल्प, (iii) फोटो विरंजन की दृढ़ता से कम स्तर, (iv) बहुत कम तस्वीर विषाक्तता, (v) उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात, (vi) अपेक्षाकृत उच्च अधिग्रहण गति, (छ) इमेजिंग कई दिशाओं और (vi के साथकम संख्यात्मक एपर्चर रोशनी ऑब्जेक्टिव लेंस 54, 55, 56 के उपयोग के कारण ii) गहरी ऊतक प्रवेश।

LSFM पहले से ही सफलतापूर्वक लगभग पूरे भ्रूण morphogenesis 57 दस्तावेज़ के लिए और पृष्ठीय बंद 23 की शुरुआत में अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली टूटना के सिद्धांतों का विश्लेषण करने के Tribolium में लागू किया गया है। Tribolium समुदाय में और सामान्य रूप में कीट विज्ञान के लिए LSFM के आकर्षण बढ़ाने के लिए, यह काफी महत्व की है मानक संचालन प्रक्रियाओं की स्थापना के लिए और तरीकों, प्रोटोकॉल और एक स्तर के लिए संसाधनों की पूल में सुधार करने के जहां माइक्रोस्कोप एक आसानी से हो जाता है विकासात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में मानक उपकरण प्रयोग, और जैविक सवालों ध्यान के केंद्र में रहते हैं।

यह प्रोटोकॉल Tribolium की मूल बातें <साथ शुरू होता है/ em> खेती, यानी रखरखाव, प्रजनन और भ्रूण संग्रह। इसके बाद, दो प्रयोगात्मक रणनीति दर्शाए गए हैं: (i) विशेष रूप से निर्मित ट्रांसजेनिक लाइनों की लाइव इमेजिंग और (ii) तय भ्रूण कि फ्लोरोसेंट रंजक (तालिका 2) के साथ दाग रहे थे की इमेजिंग। (I) agarose स्तंभ, (ii) agarose गोलार्द्ध और (iii) उपन्यास मकड़ी का जाला धारक: बाद में, थोड़ा अलग उद्देश्यों के साथ तीन बढ़ते तकनीक विस्तार (चित्रा 3 और 3 तालिका) में विस्तार से बताया गया है। प्रोटोकॉल तो LSFM साथ डाटा अधिग्रहण प्रक्रिया बताते हैं। इमेजिंग तौर तरीकों और महत्वपूर्ण विचार दिए गए हैं। अंत में, भ्रूण पुनर्प्राप्ति समझाया गया है और बुनियादी डाटा प्रोसेसिंग के लिए सुझाव दिए गए हैं। प्रतिनिधि परिणामों में, से लाइव इमेजिंग डेटा दो उपन्यास विशेष रूप से निर्मित और Glia नीले 58 ट्रांसजेनिक लाइनों दिखाया जाता है और संबंधित इमेजिंग डेटासेट एक डाउनलोड संसाधन के रूप में प्रदान की जाती हैं। साथ ही, छवितय भ्रूण के डेटा है कि प्रतिदीप्ति रंजक की एक किस्म साथ दाग रहे थे प्रस्तुत कर रहे हैं। चर्चा गुणवत्ता नियंत्रण, लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण की वर्तमान सीमाओं और अन्य प्रजातियों के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर केंद्रित है।

प्रोटोकॉल प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी कि एक नमूना कक्ष और मानकीकृत नमूना धारकों 54, 59, 60, जो आमतौर पर सिलेंडर के आकार का एक व्यास के साथ धातु, प्लास्टिक या कांच के बने तत्व हैं के लिए एक घूर्णन योग्य क्लैंप तंत्र से लैस हैं के लिए लिखा है मिलीमीटर रेंज में। प्रोटोकॉल भी दोनों कैनन कार्यान्वयन, यानी SPIM और DSLM, साथ ही दो या अधिक रोशनी और पहचान हथियार 61, 62, 63 के साथ सेटअप के लिए के लिए उपयुक्त है। प्रतिनिधि परिणाम दो वर्णक्रमीय चैनलों में डेटा बताते हैं, हरे (इलएक 488 एनएम लेजर, का पता लगाने के एक के माध्यम से 525/50 607/70 फिल्टर bandpass एक के माध्यम से फिल्टर) और लाल (एक 561 एनएम लेजर के साथ रोशनी, का पता लगाने bandpass), लेकिन प्रोटोकॉल के साथ Lumination तीन या चार वर्णक्रमीय चैनलों के लिए विस्तारित किया जा सकता।

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Protocol

1. Tribolium संस्कृतियों का पालन

नोट: मानक स्थितियों में एक 12 घंटे उज्ज्वल / 12 घंटे अंधेरे चक्र 25 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता के एक ऊष्मायन तापमान के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। Tribolium पालन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, संबंधित दिशा-निर्देश उपलब्ध 64 कर रहे हैं। यह प्रोटोकॉल दो अलग आटा आधारित मीडिया, जो किलोग्राम मात्रा में तैयार किया जा सकता है और कई महीनों के लिए संग्रहीत की आवश्यकता है।

  1. आटा और निष्क्रिय सूखा खमीर के साथ काम करने से पहले, 24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर बंद संकुल की दुकान और फिर उन्हें कमरे के तापमान को गर्म करते हैं। यह प्रक्रिया संभावित रोगज़नक़ों दूर करता है।
  2. 710 सुक्ष्ममापी जाल आकार के साथ एक चलनी के माध्यम से पूर्ण अनाज गेहूं का आटा और निष्क्रिय सूखा खमीर दर्रा, तो 5% के साथ sifted पूर्ण अनाज के आटे के पूरक (w / w) निष्क्रिय सूखा खमीर sifted द्वारा विकास का माध्यम तैयार करते हैं।
  3. 250 & # के साथ एक चलनी के माध्यम से 405 ठीक गेहूं का आटा और निष्क्रिय सूखा खमीर दर्रा181 मी जाल आकार, तो 5% के साथ sifted 405 ठीक गेहूं के आटे के पूरक (w / w) निष्क्रिय सूखा खमीर sifted द्वारा अंडे बिछाने मध्यम तैयार करते हैं।
  4. के माध्यम से संबंधित Tribolium संस्कृति दर्रा के साथ एक चलनी 800 सुक्ष्ममापी जाल आकार। बचे हुए विकास का माध्यम त्यागें। एक बड़ा गिलास पकवान के लार्वा, प्यूपा और वयस्कों में स्थानांतरित करें।
  5. कोई संतान संस्कृति मौजूद है, तो एक नया संतान संस्कृति की स्थापना के लिए एक नया कांच की बोतल के लिए लगभग 80 लार्वा और / या प्यूपा हस्तांतरण। कोई लार्वा और / या प्यूपा मौजूद हैं, लगभग 40 वयस्कों के बजाय लेने के लिए। विकास का माध्यम के 50 ग्राम जोड़ें और मानक परिस्थितियों में सेते हैं।
  6. इमेजिंग संस्कृति की स्थापना के एक और नया कांच की बोतल में लगभग 300 वयस्कों (500-700 मिलीग्राम) इकट्ठा। विकास का माध्यम के 50 ग्राम जोड़ें और मानक परिस्थितियों में सेते हैं। इमेजिंग संस्कृति भ्रूण संग्रह से पहले ताजा विकास माध्यम में कम से कम 24 घंटे के लिए समझौता करने की अनुमति दें।
  7. इमेजिंग संस्कृति कम से कम हर दो हम के विकास का माध्यम बदलेंई.के.एस. है, जो भ्रूण संग्रह के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है (3.2 देखें)। दो से तीन महीने के बाद, संतान संस्कृति से नई वयस्कों द्वारा पूरी तरह से इमेजिंग संस्कृति की जगह।
  8. एक गैर समयुग्मक ट्रांसजेनिक लाइन का इस्तेमाल किया जाता है, तो संतान संस्कृतियों गैर ट्रांसजेनिक जानवरों को हटाने के द्वारा अक्सर क्यूरेट। आदर्श रूप में, समयुग्मक लाइनों उत्पन्न करता है, तो संबंधित ट्रांस्जीन घातक नहीं है या बाँझपन जब दोनों गुणसूत्रों पर उपस्थित कारण बनता है। Homozygous संस्कृतियों आम तौर पर एक उच्च औसत प्रतिदीप्ति स्तर है और कुल मिलाकर प्रयोगात्मक शर्तों, संकरा कर रहे हैं के बाद से केवल एक ही जीनोटाइप मौजूद है।

2. माइक्रोस्कोप सेटअप और अंशांकन

नोट: Tribolium भ्रूण 600-660 के बारे में सुक्ष्ममापी के पूर्वकाल-पीछे लंबाई और के बारे में 300-330 सुक्ष्ममापी की एक अनुप्रस्थ व्यास है। अधिकांश आधुनिक सीसीडी कैमरों, के बारे में 9 मिमी x 7 मिमी की सेंसर चिप आकार 11.4 सुक्ष्ममापी की एक व्यास, और 6.45 सुक्ष्ममापी के एक पिक्सेल पिक्सेल दूरी अर्थात्।जब एक 10X आवर्धन ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ संयुक्त, भ्रूण 0.645 सुक्ष्ममापी के एक पिक्सेल पिच के साथ टोटो में उतारी जा सकता है। अधिकांश आधुनिक sCMOS कैमरों के बारे में 16 मिमी x 14 मिमी का एक बड़ा सेंसर चिप आकार, 21.3 सुक्ष्ममापी के एक व्यास यानी, और 6.5 सुक्ष्ममापी के एक पिक्सेल पिक्सेल दूरी की है। जब एक 20X आवर्धन ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ संयुक्त, भ्रूण 0.325 सुक्ष्ममापी के एक पिक्सेल पिच के साथ टोटो में उतारी जा सकता है।

  1. माइक्रोस्कोप के लिए रोशनी और पहचान ऑब्जेक्टिव लेंस संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि लेसरों और प्रतिदीप्ति फिल्टर फ्लोरोफोरे अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा बहुत अच्छी तरह से मेल खाते हैं।
  2. माइक्रोस्कोप के लिए नमूना कक्ष देते हैं। पीबीएस पीएच 7.4 या किसी अन्य उचित इमेजिंग बफर के साथ नमूना चैम्बर भरें।
  3. पर स्विच और माइक्रोस्कोप जांच। व्यापक अंशांकन दिनचर्या और कस्टम निर्मित प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोप के लिए समस्या निवारण दिशा निर्देशों (DSLM कार्यान्वयन के लिए और अधिक विशेष) जनसंपर्क प्रकाशित किया गया हैeviously 65। वाणिज्यिक उपकरणों के लिए, निर्माता के निर्देशों को बहुत सावधानी से पालन करें। दुर्व्यवहार के माध्यम के नमूना कक्ष व्यय करना और साधन के साथ-साथ नमूना के लिए तबाही का कारण बन सकता है।

3. ट्रांसजेनिक या WT भ्रूण का संग्रह

  1. 800 सुक्ष्ममापी जाल आकार के साथ एक चलनी के माध्यम से इमेजिंग कॉलोनी गुजरती हैं। एक नया कांच की बोतल में वयस्क बीट्लस इकट्ठा और अंडे बिछाने माध्यम की 10 ग्राम जोड़ें। रोशनी में 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 70% सापेक्ष आर्द्रता के लिए अंडे बिछाने संस्कृति सेते हैं।
  2. 800-सुक्ष्ममापी जाल आकार के साथ एक चलनी के माध्यम से अंडे बिछाने संस्कृति दर्रा अंडे बिछाने माध्यम है, जो चारों ओर 30-100 भ्रूण होता है से वयस्कों को अलग करने के। एक नया कांच की बोतल के लिए वयस्कों के स्थानांतरण और नए सिरे से विकास माध्यम से या तो पुराने या 50 ग्राम जोड़ें।
  3. अवलोकन वर्दी निषिक्त चरण (उदाहरण के डाटासेट DS0002) पर शुरू कर देना चाहिए, तो 25 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर 15 घंटे के लिए अंडे बिछाने मध्यम सेते हैं। टीओ germband त्याग (उदाहरण के डेटासेट DS0001 और DS0003) की शुरुआत में शुरू करते हैं, 32 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर 23 घंटे के लिए भ्रूण सेते हैं। अन्य विकास के चरणों वांछित रहे हैं, तो संबंधित साहित्य 64, 65 को देखें और आवश्यक के रूप में ऊष्मायन समय और / या तापमान अनुकूलन।

4. भ्रूण dechorionation

ध्यान दें: जरायु खोल की बाहरी परत है और प्रोटीन और पॉलीसैकराइड के होते हैं। यह दृढ़ता से प्रकाश शोषक लेकिन समुचित विकास के लिए नहीं आवश्यक है और इस प्रकार रासायनिक हटाया जा सकता है।

  1. 300 सुक्ष्ममापी जाल आकार के साथ एक चलनी के माध्यम से अंडे बिछाने मध्यम गुजरती हैं। 100 सुक्ष्ममापी जाल आकार के साथ एक सेल छन्नी में भ्रूण को एकत्र करें और बचे हुए अंडे बिछाने मध्यम त्यागें।
  2. इस प्रकार एक 6 अच्छी तरह से थाली तैयार: 10 एमएल पीबीएस पीएच 7.4 और 9 एमएल पीबीएस के साथ B1 और B2 कुओं के साथ A1, A2, A3 और बी 3 कुओं भरें। फिर ध्यान से जोड़नेB1 और B2 के लिए 1 एमएल सोडियम हाइपोक्लोराइट। चरणों 4.8 स्टीरियो खुर्दबीन के नीचे करने के लिए 4.3 की प्रगति का निरीक्षण करें। चेतावनी सोडियम हाइपोक्लोराइट संक्षारक है।
  3. ए 1 में अच्छी तरह से (पीबीएस पीएच 7.4) में सेल छन्नी डालें और कोमल आंदोलन के तहत एक मिनट के लिए भ्रूण धोने। बड़ी आटा कणों भ्रूण से अलग कर देना चाहिए।
  4. बी 1 में अच्छी तरह से (पीबीएस पीएच 7.4 में सोडियम हाइपोक्लोराइट) करने के लिए सेल छन्नी स्थानांतरण 30 रों के लिए सख्ती से थाली हिला। शेष आटा कणों भ्रूण से पूरी तरह से अलग कर देना चाहिए।
  5. ए 2 अच्छी तरह से (पीबीएस पीएच 7.4) के लिए सेल छन्नी स्थानांतरण और सौम्य आंदोलन के तहत 1 मिनट के लिए भ्रूण धोने।
  6. dechorionation के लिए, (पीबीएस पीएच 7.4 में सोडियम हाइपोक्लोराइट) बी 2 में अच्छी तरह से करने के लिए सेल छन्नी हस्तांतरण। जरायु फट जाता जब तक सख्ती थाली हिला और भ्रूण से अलग हो जाता है। जरायु, पंगु किनारों के साथ एक पतली, अर्द्ध पारदर्शी झिल्ली की तरह लग रहा है, जबकि dechorionated भ्रूण एक सादे सिल्हूट की है।
  7. स्थानांतरण वेंअच्छी तरह से ए 3 के लिए ई सेल छन्नी (पीबीएस पीएच 7.4) और कोमल आंदोलन के तहत 1 मिनट के लिए भ्रूण धोने। किसी भी जरायु टुकड़े अभी भी धोने के बाद भ्रूण से जुड़े होते हैं, तो चरण 4.6 दोहराएँ।
  8. बी 3 अच्छी तरह से (पीबीएस पीएच 7.4) में भ्रूण की दुकान। कई घंटे के लिए भंडारण भ्रूण को नुकसान नहीं करता है, लेकिन है कि विकास जारी है को ध्यान में रखना।
  9. गैर समयुग्मक ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए, किसी भी गैर फ्लोरोसेंट भ्रूण यदि संभव हो तो हटा दें। निर्धारण और WT या ट्रांसजेनिक भ्रूण के धुंधला के लिए, ट्रांसजेनिक भ्रूण के लाइव इमेजिंग के लिए कदम 5. साथ जारी है, चरण 6 के साथ जारी है।

5. Vitelline झिल्ली permeabilization, फिक्सेशन, और धुंधला

ध्यान दें: vitelline झिल्ली eggshell की भीतरी परत है। यह फ्लोरोसेंट रंजक के लिए अभेद्य है और इस प्रकार रासायनिक धुंधला से पहले permeabilized किया जाना है।

  1. निर्धारण / permeabilization समाधान (1.5 एमएल 4% (w / v) पीबीएस पीएच 6.9 एक में paraformaldehyde के साथ एक सिंटिलेशन शीशी भरेंnd 1.5 एमएल एन हेपटैन)। शीशियों के लिए एक तूलिका के साथ भ्रूण स्थानांतरण। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर शीशियों प्रकाश से fluorophores की रक्षा और प्रति मिनट 50 चक्र पर एक कमाल मंच पर 30 मिनट के लिए सेते हैं करने के लिए। चेतावनी paraformaldehyde विषाक्त और संक्षारक है, एन हेपटैन ज्वलनशील और विषैला होता है।
  2. (V / v) निर्धारण समाधान निकालें और भ्रूण 3 में 15 मिनट के लिए पीबीएस पीएच 7.4 में में 3 एमएल 0.1% (v / v) ट्राइटन X-100 15 मिनट के लिए तीन बार के इलाज और बाद में एक बार एमएल 1% ट्राइटन X-100 में प्रति मिनट 50 चक्र पर एक कमाल मंच पर पीबीएस पीएच 7.4। चेतावनी ट्राइटन X-100 संक्षारक है।
  3. permeabilization समाधान निकालें और शीशी 0.5 एमएल धुंधला समाधान जोड़ें। अनुकरणीय धुंधला समाधान 2 तालिका में प्रदान की जाती हैं। प्रति मिनट 50 चक्र पर एक कमाल मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में दाग भ्रूण। रंगों तालिका 2 में प्रस्तावित के लिए, कपड़े धोने की आवश्यक नहीं है।

6. Agarose बढ़ते की तैयारी

  1. जोड़े 1 ग्राम कम पिघल100 एमएल पीबीएस पीएच 7.4 करने के लिए agarose और 800 डब्ल्यू पर एक माइक्रोवेव ओवन में 2-3 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी छोटे agarose कणों अभी भी मौजूद हैं, तो 30 सेकंड के अंतराल में हीटिंग प्रक्रिया को दोहराने जब तक पूरी तरह से कणों भंग। बढ़ते agarose हीटिंग द्वारा agarose जम फिर से तरलीकृत किया जा सकता है जैसा कि ऊपर वर्णित हाल में हर बार तैयार रहने की जरूरत नहीं है। इस प्रक्रिया को बहुत अधिक पानी सुखाया गया है से पहले 5-6 बार दोहराया जा सकता।
  2. agarose लगभग 40-45 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा, फिर गरम agarose के साथ दो 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों को भरने और एक thermoblock में 35 डिग्री सेल्सियस पर उन ट्यूबों रखने के लिए अनुमति दें।

7. भ्रूण बढ़ते और निवेशन नमूना चैंबर में

  1. विकल्प 1: Agarose स्तंभ (चित्रा 3 ए -सी, पहले कॉलम; तालिका 3, दूसरे स्तंभ)
    1. आसुत जल के साथ एक 1.0 एमएल सिरिंज भरें और गिलास केशिका उद्घाटन से एक के लिए यह एक छोटे से रबर की नली का उपयोग करके देते हैं।आसुत जल से केशिका आधे रास्ते भरें।
    2. एक तूलिका के साथ एक भ्रूण उठाओ और अन्य गिलास केशिका उद्घाटन के अंदरूनी हिस्से पर रखें। अगले चरण पर जल्दी से आगे बढ़ें से पहले भ्रूण बाहर सूख जाता है।
    3. तरल agarose में केशिका चिपका और धीरे धीरे केशिका में भ्रूण के साथ तरल agarose के कुछ μL आकर्षित। फिर जल्दी से ड्राइंग बल इतना है कि भ्रूण agarose के साथ घसीटा जाता है वृद्धि हुई है। अंत में, agarose के कुछ μL ऊपर और भ्रूण नीचे होना चाहिए। कुछ मिनट के लिए अलग केशिका निर्धारित करें और Agarose जमना करते हैं।
    4. के बारे में 5 मिमी की लंबाई के लिए एक हीरे कांच कटर के साथ केशिका रखें। शेष टुकड़ा पूरी तरह से agarose के साथ भरा जाना चाहिए और भ्रूण द्वितीय चतुर्थक भीतर होना चाहिए।
    5. नमूना कक्ष में पिन के साथ स्टील सिलेंडर डालें, और उसके बाद पिन के शीर्ष पर केशिका टुकड़ा चिपके रहते हैं। agarose स्तंभ कुछ मिलीमीटर च ​​बढ़ाना चाहिएबात यह है कि भ्रूण में शामिल है के साथ केशिका टुकड़ा ROM।
  2. विकल्प 2: Agarose गोलार्द्ध (चित्रा 3 ए -सी, दूसरे स्तंभ, तालिका 3, तीसरे स्तंभ)
    1. एक 1.0 एमएल सिरिंज में तरल agarose के 200 μL ड्रा, तो इसका इस्तेमाल नीचे उद्घाटन के अवसर पर एक गोलार्द्ध रूपों जब तक agarose के साथ ऊपर से स्टील पाइप भरने के लिए। गोलार्द्ध व्यास पाइप व्यास के बराबर होना चाहिए। कुछ मिनट प्रतीक्षा करें जब तक agarose जम गया है।
    2. एक तूलिका के साथ एक भ्रूण उठाओ और ब्रश की नोक पर यह पुन: व्यवस्थित इतना है कि पूर्वकाल अंत सुलभ हो जाता है। तरल agarose में agarose गोलार्द्ध डुबकी एक पतली फिल्म के साथ कवर करने के लिए।
    3. इसके पूर्वकाल अंत के साथ भ्रूण ईमानदार agarose गोलार्द्ध के पोल पर रखें। चारों ओर स्टील पाइप मुड़ें और ब्रश के साथ भ्रूण की स्थिति को ठीक करें। यदि आवश्यक हो, भ्रूण / गोलार्द्ध सीमा के agarose 2 μL जोड़कर भ्रूण को स्थिर। आदर्शly, भ्रूण की सतह के आधे से भी कम agarose में शामिल किया जाना चाहिए और किनारों संभव के रूप में खड़ी होना चाहिए।
    4. धीरे-धीरे नमूना कक्ष में गोलार्द्ध और भ्रूण के साथ स्टील पाइप डालें।
  3. विकल्प 3: मकड़ी का जाला धारक (चित्रा 3 ए -सी, तीसरे स्तंभ, तालिका 3, चौथे स्तंभ)
    1. एक तूलिका के साथ एक भ्रूण उठाओ और इसे अलग रख दें।
    2. 5-8 μL तरल agarose के साथ मकड़ी का जाला धारक की slotted छेद कवर, तो केवल एक पतली agarose फिल्म बनी हुई है जब तक agarose के सबसे को हटा दें।
    3. agarose फिल्म पर भ्रूण रखें और अपनी स्थिति को समायोजित करें। ध्यान रखा छेद के x- अक्ष केंद्र के लिए भ्रूण ले जाते हैं, और slotted छेद की लम्बी अक्ष के साथ अपने लम्बी पूर्वकाल-पीछे अक्ष संरेखित करें।
    4. धीरे-धीरे नमूना कक्ष में घुड़सवार भ्रूण साथ मकड़ी का जाला धारक डालें। मकड़ी का जाला धारक स्थिति इतना है कि यह उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता हैप्रकाश, x और z- अक्ष के लिए यानी 45 डिग्री रिश्तेदार।

8. लाइट शीट आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. कितने दिशाओं (और जिसके साथ झुकाव) भ्रूण imaged किया जाना चाहिए साथ तय करें। चार दिशाओं (झुकाव 0 डिग्री, 90 डिग्री, 180 ° और 270 ° साथ) आम तौर पर एक अच्छा व्यापार बंद कवरेज और ऊर्जा लोड के बीच प्रदान करते हैं।
  2. प्रतिदीप्ति चैनलों की संख्या सेट करें। प्रत्येक चैनल के लिए प्रमुख मानकों लेजर लाइन, प्रतिदीप्ति फिल्टर, लेजर शक्ति और जोखिम समय कर रहे हैं। लंबे समय तक जीना इमेजिंग के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एकीकृत ऊर्जा लोड भ्रूण की सहिष्णुता से अधिक नहीं है। 25-50 एमएस के एक जोखिम समय, तेजी से इमेजिंग सुनिश्चित करता है, जबकि 100 और 300 के बीच μW एक लेजर शक्ति भ्रूण की व्यवहार्यता प्रभावित नहीं होना चाहिए। तय नमूने, जोखिम समय और लेजर बिजली के लिए कम से कम दोगुनी हो जा सकता है।
  3. लाइव इमेजिंग assays के लिए, समय चूक कॉन्फ़िगर करें। कंप्यूटर अनुप्रयोगTribolium की lete embryogenesis कमरे के तापमान (23 ± 1 डिग्री सेल्सियस) और 32-35 डिग्री पर दिन एक छोटे से तीन से भी कम समय सी 64 पर के बारे में सात दिन लगते हैं। मॉर्फ़ोजेनेटिक कि घटनाओं का पालन करना चाहिए के अनुसार अस्थायी अंतराल को परिभाषित करें। कम अस्थायी अंतराल के लिए, जोखिम समय और लेजर शक्ति (8.2 देखें) को कम करने पर विचार करें।
  4. लेजर के संपर्क में लाने के बिना x और दृश्य के क्षेत्र के केन्द्र में y अक्षों के साथ संचरण प्रकाश मोड में भ्रूण रखें। कि बढ़ते प्रक्रिया के दौरान हुई किया जा सकता था किसी भी नुकसान के लिए भ्रूण की जांच करने के 90 ° चरणों में 360 डिग्री से भ्रूण घुमाएँ।
  5. माइक्रोस्कोप के साथ, अक्ष उदाहरण के लिए x- अक्ष के साथ पार्श्व अक्ष, z- अक्ष के साथ dorsoventral अक्ष यानी भ्रूण अक्ष संरेखित करने के लिए y- अक्ष के चारों ओर उचित रूप से भ्रूण घुमाएँ। मकड़ी का जाला धारक तकनीक का उपयोग करते हैं, संरेखण संभव नहीं हो सकता।
  6. प्रतिदीप्ति मोड में, के लिए z के ढेर को परिभाषितप्रत्येक दिशा r। 25-50 सुक्ष्ममापी के सामने स्थानिक बफर के रूप में और भ्रूण के पीछे जोड़ें। बफर सहित, ठेठ z के ढेर एक Tribolium भ्रूण के लिए चारों ओर 350-400 सुक्ष्ममापी शामिल किया गया। इसके अलावा, जेड-दूरी है, जो चार बार पार्श्व रिक्ति होना चाहिए परिभाषित x- साथ रिक्ति IE और y अक्षों 66।
  7. दो या अधिक भ्रूण समानांतर में imaged रहे हैं, तो अगले भ्रूण के साथ 8.4 पर पुनरारंभ करें।
  8. लंबे समय तक इमेजिंग के लिए, यह सुनिश्चित करें कि नमूना कक्ष पर्याप्त पीबीएस पीएच 7.4 या अन्य इमेजिंग बफर से भरा है। इसके अलावा नमूना कक्ष खोलने कवर किया।
  9. इमेजिंग प्रक्रिया प्रारंभ करें। लंबे समय तक जीना इमेजिंग के लिए, सभी भ्रूण के लिए सभी चैनलों में सभी दिशाओं साथ सही अधिग्रहण की निगरानी। कभी कभी अगले कुछ दिनों कि भ्रूण जीवित और उचित स्थिति में हैं के दौरान की जाँच करें।

9. भ्रूण पुनर्प्राप्ति और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. इमेजिंग पूरा कर लिया है एक बार, के साथ नमूना धारक को दूरनमूना कक्ष से भ्रूण। लाइव इमेजिंग assays से भ्रूण को पुनः प्राप्त किया जाना है। फिक्स्ड और दाग भ्रूण खारिज किया जा सकता है।
  2. तो एक जीवित इमेजिंग परख प्रदर्शन किया गया था, एक वस्तु स्लाइड के लिए भ्रूण हस्तांतरण। agarose स्तंभ तकनीक के लिए, एक छुरी, सूक्ष्म चाकू या रेजर ब्लेड के साथ agarose आसपास से भ्रूण निकालें। agarose गोलार्द्ध तकनीक के लिए, वस्तु स्लाइड के लिए फ्लैट पक्ष के साथ गोलार्द्ध हस्तांतरण। भ्रूण को हटाने आवश्यक नहीं है। मकड़ी का जाला धारक तकनीक के लिए, धीरे एक तूलिका के साथ agarose फिल्म से भ्रूण उतरना। लार्वा हैच जब तक मानक परिस्थितियों में संतृप्त नमी वातावरण में एक छोटे कांच की डिश में वस्तु स्लाइड सेते हैं।
  3. अंडे सेने के बाद, एक 24 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं को लार्वा हस्तांतरण और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए विकास का माध्यम की 500 मिलीग्राम जोड़ें। मानक परिस्थितियों में सेते हैं। गैर imaged WT और ट्रांसजेनिक larv के कुल विकास समय और imaged लार्वा की आकारिकी की तुलना करेंएई (चर्चा देखें)। assays कि WT विकास की विशेषताएँ में, कोई स्पष्ट रूपात्मक aberrations आदर्श रूप से ध्यान देने योग्य होना चाहिए।
  4. एक बार लार्वा, स्वस्थ वयस्कों के लिए विकसित एक ही पृष्ठभूमि तनाव के उचित WT सहयोगियों के साथ उन्हें प्रदान करते हैं। दो सप्ताह के बाद, संतान उत्पादन के लिए जाँच करें। इसके अलावा उन्हें अंतर pares संभोग से संतान की प्रजनन क्षमता की जाँच करने पर विचार करें। केवल जब imaged भ्रूण उपजाऊ वयस्कों है कि उपजाऊ संतान उत्पादन में विकसित, इमेजिंग प्रक्रिया गैर इनवेसिव माना जा सकता है।

10 छवि डेटा प्रोसेसिंग

नोट: छवि डाटा प्रोसेसिंग के लिए, ओपन-सोर्स इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर ImageJ 67 या उसके व्युत्पन्न फिजी 68 सिफारिश की है। दोनों संस्करणों के साथ-साथ व्यापक प्रलेखन www.imagej.net में पाए जाते हैं। LSFM डेटा के लिए मानक फ़ाइल स्वरूप टैग छवि फ़ाइल स्वरूप (TIFF) है। आंतरिक कंटेनर विकल्प STO की अनुमति देता हैइस तरह के z के ढेर या एक ही फ़ाइल के भीतर z अधिकतम अनुमानों खींचें और ड्रॉप के माध्यम से ImageJ या फिजी में खोला जा सकता है कि समय श्रृंखला के रूप में छवि के ढेर के क्रोध।

  1. यदि आवश्यक हो, y- अक्ष (छवि → → घुमाएँ रूपांतरण) के साथ भ्रूण के पूर्वकाल-पीछे अक्ष संरेखित करने के लिए z के ढेर बारी बारी से। कृपया ध्यान दें प्रत्येक दिशा के लिए व्यक्तिगत रूप से स्थापित किया जाना है, लेकिन समय चूक और प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए नहीं है कि रोटेशन मापदंडों।
  2. क्रॉप साथ z के ढेर x-, y- और z अक्ष ताकि केवल न्यूनतम पृष्ठभूमि (20 - x- और y- अक्ष के साथ 40 पिक्सल, 5 - जेड अक्ष के साथ 10 विमानों) के लिए एक्स (बनी हुई है - और y अक्षों, आयताकार चयन उपकरण के बाद, छवि फसल → का उपयोग करें; z- अक्ष, उपयोग छवि → ढेर → उपकरण → स्लाइस कीपर) के लिए। कृपया ध्यान दें प्रत्येक दिशा के लिए व्यक्तिगत रूप से सेट किया जाना है कि फसल मानकों, लेकिन समय के अंक और प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए नहीं।
  3. प्रत्येक z के ढेर के लिए z अधिकतम प्रक्षेपण की गणना करें(छवि → ढेर → Z परियोजना, मैक्स तीव्रता चुनते हैं)। तीव्रता प्रक्षेपण गणना डेटा सरलीकरण प्रक्रियाओं है कि एक स्थानिक आयाम को दूर कर रहे हैं।
  4. लंबे समय तक जीना इमेजिंग डेटा के लिए, एक ImageJ या फिजी स्क्रिप्ट प्रदर्शन प्रसंस्करण 10.1 सभी दिशाओं, हर समय अंक और सभी प्रतिदीप्ति चैनलों 65 के लिए 10.3 करने के लिए चरण उपयोग करने पर विचार। आदर्श रूप में, चैनल और दिशा प्रति सभी z अधिकतम अनुमानों को श्रेणीबद्ध करने और उन्हें एक TIFF कंटेनर में एक समय श्रृंखला के रूप में सहेजें। वैकल्पिक रूप से, फिजी के लिए BigDataViewer 69 प्लग में टेराबाइट-बड़े डेटा सेट में नेविगेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
  5. ट्रांसजेनिक लाइन और इमेजिंग तौर तरीकों के आधार पर, समय के ढेर के गतिशील तीव्रता समायोजन फोटो विरंजन और / या फ्लोरोफोरे अभिव्यक्ति उतार चढ़ाव के कारण वांछनीय हो सकता है। या तो ImageJ- या फिजी-आंतरिक ब्लीच सुधार समारोह (छवि → → ब्लीच सुधार, चुनें हिस्टोग्राम मिलान समायोजित करें) या dedicaटेड सॉफ्टवेयर 65 सुझाव दिया है।
  6. भ्रूण दर्ज की गई थी, तो और / या एकाधिक दिशाओं के साथ और, दिशा-निर्देश की क्षैतिज संयोजन (छवि → ढेर → उपकरण → कम्बाइन) और चैनल मर्ज कई प्रतिदीप्ति चैनलों में (छवि → रंग मर्ज → चैनल) सिफारिश की है।
  7. पंजीकरण और z-ढेर कई दिशाओं 70 के साथ हासिल कर ली, deconvolution 71 के साथ संयोजन में अंततः के विलय, वर्दी गुणवत्ता और आइसोट्रोपिक संकल्प के बेहतर तीन आयामी छवियों की गणना की अनुमति देता है। दोनों प्लग इन खुला स्रोत और फिजी में पहले से स्थापित हैं, लेकिन वे नमूना चारों ओर स्थलों की उपस्थिति (फ्लोरोसेंट microspheres, जैसे मोती) की आवश्यकता होती है।
  8. बड़े पैमाने पर मात्रात्मक डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर चौखटे भी उपलब्ध हैं, विभाजन और सेल नाभिक 72 या सेल की ट्रैकिंग के लिए उदाहरण के लिएएल आकार मान्यता 73।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल जीवन यापन की प्रतिदीप्ति इमेजिंग या LSFM साथ तय की और दाग Tribolium भ्रूण के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचे का वर्णन है। तस्वीर-विरंजन और फोटो विषाक्तता, अपनी ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता का एक सीधा परिणाम के निम्न स्तर के कारण, LSFM विशेष रूप से अच्छी तरह से लंबे समय तक जीना इमेजिंग के लिए अनुकूल है।

उपन्यास AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 ट्रांसजेनिक लाइन अल्फा ट्यूबिलिन 1 प्रमोटर 74 के नियंत्रण में एक histone2B-mEmerald संलयन प्रोटीन व्यक्त करता है। यह एक बढ़ाने जाल की तरह अभिव्यक्ति पैटर्न 51 से पता चलता बाद से प्रतिदीप्ति संकेत मुख्य रूप से serosa, जर्दी थैली और कई neuronal कोशिका समूहों से प्राप्त होता है। इस लाइन का उपयोग करना, कमरे के तापमान (23 ± 1 डिग्री सेल्सियस) भ्रूण के विकास के 66 घंटे के दर्ज किए गए, germband त्याग और पृष्ठीय बंद (पूरक मूवी 1) को कवर। इसलाइन सिर उपांग (चित्रा 4 ए) और पृष्ठीय बंद (चित्रा 4 बी) के दौरान serosa प्रवास की गतिशीलता के भीतर neuronal समूहों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। उपन्यास AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 लाइन # 4 लाइन के रूप में ही ट्रांस्जीन वहन करती है, लेकिन एक अलग जीनोमिक स्थान पर। यह एक स्पष्ट बढ़ाने जाल पैटर्न प्रदर्शित नहीं करता है, लेकिन प्रतिदीप्ति संकेत spatiotemporally सर्वत्र पता लगाने योग्य के रूप में इस प्रमोटर 74 के लिए पहले से वर्णित है। इस लाइन gastrulation से संक्रमण पर उतारी थी बढ़ाव germband करने के लिए दो गहराई का स्तर (चित्रा 4C) में ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए। एक अन्य विशेषता यह है, खासकर लाइव इमेजिंग के लिए, नमूना रोटेशन, जो विकासात्मक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता LSFM सेटअप के लिए मानक है के माध्यम से कई दिशाओं साथ z के ढेर के अधिग्रहण है। उदाहरण के लिए, Glia नीले 58 लाइन में, नमूना रोटेशन सभीसाथ और उदर तंत्रिका कॉर्ड और साथ ही वाम सिर लोब में प्रसार गतिशीलता है, जो केवल पृष्ठीय साइट से ठीक से देखा जा सकता है, एक ही भ्रूण में (चित्रा 4D, पूरक मूवी 2) के आसपास glia सेल पुनर्गठन के अवलोकन ows। इस अध्ययन के साथ जुड़े रहते इमेजिंग डेटासेट एक डाउनलोड संसाधन, मेटा और उपयोग के बारे में जानकारी के रूप में प्रदान की जाती हैं पूरक तालिका 1 में पाए जाते हैं।

के बाद से लाइव इमेजिंग के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों के चुनाव अभी भी सीमित है, छोटी फ्लोरोसेंट रंजक विशेष रूप से intracellular संरचनाओं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। Sytox ग्रीन नाभिक सेल और हरे चैनल में देखे जा सकते हैं, YOYO -1 और BOBO-3 आयोडाइड परमाणु लिफाफा करने के लिए बाध्य और हरे या लाल चैनल में क्रमश: (चित्रा 5 ए) में देखे जा सकते हैं, जबकि बांधता है। इन रंगों के कुछ भ्रूण struct उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताइस तरह के serosa निशान (चित्रा 5 ब, पहला स्तंभ), पीछे उदर serosa कोशिकाओं (चित्रा 5 ब, दूसरे स्तंभ) या serosa-भ्रूणावरण-germband ऊतक त्रिकोणीय परत है कि serosa खिड़की बंद करने के दौरान उभर के रूप में ures, (चित्रा 5 ब, करने के लिए तृतीय पांचवें स्तंभ)। दोहरे रंग धुंधला ही भ्रूण में दो intracellular संरचनाओं के दृश्य, उदाहरण के लिए परमाणु लिफाफा एक साथ actin cytoskeleton, जो एलेक्सा Fluor-संयुग्मित Phalloidin रंगों के साथ सना हुआ जा सकता के साथ की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, YOYO -1 आयोडाइड, Phalloidin 546 (चित्रा 5C) के साथ जोड़ा जा सकता है, जबकि BOBO-3 Phalloidin 488 (चित्रा 5D) के साथ जोड़ा जा सकता है।

यह भी ठीक करने और ट्रांसजेनिक भ्रूण कि पहले से ही एक निश्चित फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त दाग है, क्योंकि निर्धारण प्रक्रिया आंतरिक fluorescenc quenches सुविधाजनक हैई संकेत केवल मामूली। उदाहरण के लिए, AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 ट्रांसजेनिक लाइन, जिसमें नाभिक हरे चैनल में पाया जाता है, से भ्रूण Phalloidin 546 तो (चित्रा 6 कि actin cytoskeleton लाल चैनल में दिखाई देने लगता है के साथ दाग जा सकता है )।

आकृति 1
चित्रा 1: पारंपरिक विदेफीएल्ड, Confocal लेज़र स्कैनिंग और प्रकाश शीट आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की तुलना। पारंपरिक widefield एपि-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उपयुक्त फ़िल्टर या उच्च शक्ति प्रकाश प्रकाश स्रोत के रूप डायोड उत्सर्जन के साथ क्सीनन चाप / पारा वाष्प लैंप का उपयोग करता है। प्रत्येक का अधिग्रहण दो आयामी छवि के लिए, पूरे नमूना एक गैर विवर्तन सीमित प्रकाश शंकु के साथ प्रकाशित किया जाता है। कोंफोकल लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में, एक विवर्तन सीमित गाऊसी लेजर बीम अनुसूचित जाति हैनमूना के माध्यम से anned और प्रतिदीप्ति असंगति से बिंदु-दर-बिंदु का पता चला है। पारंपरिक widefield एपि-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए इसी प्रकार, पूरे नमूना प्रत्येक हासिल कर ली द्वि-आयामी चित्रों के लिए प्रकाशित किया जाता है। प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में, एक विवर्तन सीमित गाऊसी लेजर बीम का पता लगाने अक्ष के लंबवत नमूना उजागर करता है। प्रतिदीप्ति या तो पता चला है विमान-दर-हवाई जहाज या पंक्ति-दर-पंक्ति। एक दो आयामी छवि के अधिग्रहण के दौरान केवल एक छोटी मात्रा का पता लगाने के उद्देश्य का केन्द्र विमान पर केंद्रित उत्तेजना प्रकाश के प्रभाव का अनुभव करता है। नमूना के शेष मात्रा प्रकाशित किया जाता है नहीं, बाहर के फोकस कलंक के लिए योगदान नहीं है, तस्वीर-विषाक्त प्रभाव से ग्रस्त नहीं है और फोटो विरंजन के कारण fluorophores खोना नहीं करता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ईपी-together.within-पेज = "1"> चित्र 2
चित्र 2: प्रकाश शीट आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का सिद्धांत। LSFM में, रोशनी और पहचान कम से कम दो ऑप्टिकल पथ में विभाजित हैं। जबकि कम से कम एक का पता लगाने के हाथ एक उपयुक्त फिल्टर और प्रतिदीप्ति संकेत (हरा) के समानांतर पता लगाने के लिए एक कैमरा के साथ सुसज्जित है कम से कम एक रोशनी हाथ, प्रकाश शीट (सियान) उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। LSFM दो कैनन कार्यान्वयन, एकल (या चयनात्मक) विमान रोशनी माइक्रोस्कोप (नीले रंग की पृष्ठभूमि) और डिजिटल स्कैन किया लेजर प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप (लाल रंग की पृष्ठभूमि) है। नमूना और एक दूसरे के प्रकाश चादर रिश्तेदार जाकर, तीन आयामी छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं। कई दिशाओं साथ सूचना जो प्राथमिक रूप से गुरुत्वाकर्षण के साथ उन्मुख है y- अक्ष, चारों ओर नमूना घूर्णन द्वारा एकत्र किया जाता है।ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3 चित्र: तीन अलग बढ़ते लाइट शीट आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Tribolium के भ्रूण के विकास की रिकॉर्डिंग में प्रयुक्त तकनीकें। (ए) agarose स्तंभ एक छोटे पिन कि agarose स्तंभ, जिसमें भ्रूण एक गिलास केशिका से बाहर अंतर्निहित है, धक्का के साथ एक स्टील सिलेंडर को दर्शाता है। agarose गोलार्द्ध एक स्टील पाइप पर रखा गया है। भ्रूण agarose की एक छोटी राशि के साथ गोलार्द्ध के पोल से जुड़ी है। मकड़ी का जाला धारक एक slotted छेद स्टील सिलेंडर के शीर्ष पर रखा के साथ धातु के एक पत्रक है। भ्रूण एक पतली agarose फिल्म है कि टी तक फैला से चिपका हैवह छेद slotted। (बी) के एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप के अंदर तीन बढ़ते तकनीक की योजनाएं। (सी) तीन बढ़ते एक DSLM के भीतर लागू तकनीक। (डी) Glia नीले ट्रांसजेनिक तीन बढ़ते तकनीकों के साथ दर्ज की रेखा के भ्रूण से अनुकरणीय छवियों। भ्रूण है, जो germband त्याग की शुरुआत में कर रहे हैं, उनके पीछे अंत शीर्ष संचरण प्रकाश छवियों से मेल करने की दिशा में केंद्रित साथ दिखाए जाते हैं। एफएम, प्रतिदीप्ति मोड; ZA, तीव्रता समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: Tribolium भ्रूण की लाइव इमेजिंग। (ए </ Strong>) AGOC पृष्ठीय बंद होने germband त्याग से संक्रमण पर {ATub'H2B-mEmerald} # 1 लाइन के एक भ्रूण। यह पंक्ति बढ़ाने जाल अभिव्यक्ति पैटर्न दर्शाती है। प्रतिदीप्ति संकेत मुख्य रूप से serosa, जर्दी थैली और कुछ न्यूरोनल कोशिका समूहों में पाया जाता है। भ्रूण 5 घंटे के अंतराल के साथ 15 घंटे की अवधि में दिखाया गया है। विस्तार छवियों सिर उपांग में कोशिका समूहों दिखा। प्रारंभ में, समूहों अभी भी, serosal कोशिकाओं (पहला स्तंभ) के अंतर्गत आते हैं serosa टूटना पर, कोशिकाओं सिर के मोड़ आंदोलन में आगे बढ़ने के। (बी) एक ही भ्रूण 00:30 ज के अंतराल के साथ 01:30 ज के लिए पृष्ठीय बंद के दौरान दिखाया। विस्तार छवियों जर्दी थैली से अधिक उठी serosa के प्रवास को दिखाते हैं। (सी) शीर्ष पंक्ति: gastrulation से संक्रमण पर AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 लाइन का एक भ्रूण बढ़ाव germband करने के लिए। मध्य और निचले पंक्ति: एकल विमानों 1:30 के अंतराल के साथ 10:30 घंटा की अवधि में दो गहराई में दिखाया जाता हैएच। (डी) 07:30 ज के अंतराल के साथ 50:30 घंटा की अवधि में दिखाया germband त्याग के दौरान Glia-नीली रेखा के एक भ्रूण। विस्तार छवियों बाईं सिर लोब में glial कोशिकाओं के मॉर्फ़ोजेनेटिक पुनर्गठन दिखा। ZA, तीव्रता समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण; तीव्रता समायोजन के साथ पीए एकल विमान। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: फिक्सेशन, धुंधला, और Germband लंबा दौरान WT भ्रूण की Iimaging। (ए) या तो Sytox ग्रीन के साथ दाग भ्रूण, यानी एक फजी परमाणु दाग, या YOYO -1 आयोडाइड या BOBO-3 आयोडाइड, यानी दो परमाणु लिफाफा दाग। (बी) YOYO -1 आयोडाइड से सना हुआ Embryओ। विवरण serosa निशान (प्रथम कॉलम), बड़े पीछे-उदर serosa कोशिकाओं के परमाणु लिफाफा (दूसरे स्तंभ) या serosa के त्रि-स्तरीय ऊतक संगठन, भ्रूणावरण और वास्तविक भ्रूण ऊतक (तीसरे पांचवें स्तंभ के लिए) दिखा। (सी) YOYO -1 आयोडाइड और Phalloidin 546. (डी) Phalloidin 488 और BOBO-3 आयोडाइड के साथ दोहरे रंग धुंधला के साथ दोहरे रंग धुंधला। ZA, तीव्रता समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} # 1 लाइन से फिक्स्ड और स्टेन्ड ट्रांसजेनिक भ्रूण की छवियाँ। इस ट्रांसजेनिक लाइन को व्यक्त करता है mEmerald-लेबलएड histone2B (H2B) अल्फा ट्यूबिलिन 1 प्रमोटर, जो पूरे भ्रूण के विकास के दौरान सर्वत्र नाभिक / क्रोमेटिन के निशान के नियंत्रण में। भ्रूण आगे एलेक्सा Fluor 546 Phalloidin, जो actin cytoskeleton / च-actin लेबल के साथ दाग था। ZA, तीव्रता समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मापदंड प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी प्रकार
पारंपरिक व्यापक क्षेत्र कोंफोकल लेजर स्कैनिंग प्रकाश चादर आधारित
ऑब्जेक्टिव लेंस सेटअप एक ऑब्जेक्टिव लेंस, मध्यम उच्च NA दो लंबवत व्यवस्था की ऑब्जेक्टिव लेंस, रोशनी: कम एनए, का पता लगाने: उच्च NA
रोशनी प्रकाश स्रोत सफेद प्रकाश स्रोत और उचित फिल्टर (जैसे पारा कम चाप लैंप)
या सफाई फिल्टर के साथ एलईडी आधारित 		सफाई फिल्टर के साथ लेजर
(उदाहरण के लिए डायोड या DPPS लेज़रों) 		सफाई फिल्टर के साथ लेजर
(उदाहरण के लिए डायोड या DPPS लेज़रों)
द्वि-आयामी चित्र प्रति रोशनी पूरे नमूना पूरे नमूना
(आमतौर पर दो आयामी गाऊसी बीम स्कैन) 		केवल फोकल विमान
(DSLM: एक आयामी गाऊसी बीम स्कैन)
खोज समानांतर
(आमतौर पर सीसीडी या sCMOS कैमरा) 		क्रमबद्ध
(फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब) 		समानांतर
(आमतौर पर सीसीडी या एससीएमओएस कैमरा)
इमेजिंग गति तेजी से (छवि प्रति मिलीसेकंड) धीमी गति से (छवि प्रति सेकंड) तेजी से (छवि प्रति मिलीसेकंड)
बाहर का फोकस प्रतिदीप्ति कोई भेदभाव नहीं पिनहोल से लगभग पूरी तरह से अवरुद्ध
(अस्वीकृति दक्षता व्यास पर निर्भर करता है) 		लगभग न के बराबर
(केवल बिखरने की वजह से)
स्थानिक आयामों 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
स्वतंत्रता के आगे डिग्री 2
(समय, प्रतिदीप्ति चैनल) 		2
(समय, प्रतिदीप्ति चैनल) 		3
(समय, प्रतिदीप्ति चैनल, दिशा)
पार्श्व संकल्प आर
(0.6 λ / एनए) 		0.66 r
(0.4λ / एनए) 		आर
(0.6 λ / एनए)
ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता नहीं हाँ
(पता लगाने के मार्ग में भेदभाव) 		हाँ
(रोशनी मार्ग 75 में भेदभाव)
उपलब्धता और कीमत मुख्य रूप से वाणिज्यिक, कम लागत मुख्य रूप से वाणिज्यिक, महंगा वाणिज्यिक, महंगा
कस्टम निर्मित मध्यम 54,59,60,75
लाइव इमेजिंग प्रकाशनों Tribolium भ्रूण को कवर छह 44,76,77,78,79,80 सात 23,77,79,81,82,81
(कताई डिस्क कोंफोकल) 83,84,85 		चार 23,57,65,86

तालिका 1 - प्रतिदीप्त के लक्षणTribolium में इस्तेमाल nce माइक्रोस्कोपी तकनीक इमेजिंग रहते हैं।

रंग धुंधला हो जाना पतला करने की क्रिया
Sytox ग्रीन नाभिक (फजी) 1: 10,000 (1: 100 DDH 2 हे में और 1: 1% में 100 (w / v) पीबीएस में बीएसए)
YOYO -1 आयोडाइड परमाणु लिफाफा 1: 10,000 (1: 100 DDH 2 हे में और 1: 1% में 100 (w / v) पीबीएस में बीएसए)
BOBO-3 आयोडाइड परमाणु लिफाफा 1: 10,000 (1: 100 DDH 2 हे में और 1: 1% में 100 (w / v) पीबीएस में बीएसए)
एलेक्सा Fluor 488 Phalloidin actin cytoskeleton 1: 100 (1% (w / v) पीबीएस में बीएसए में)
एलेक्सा Fluor 546 Phalloidin actin cytoskeleton

तालिका 2 - समाधान धुंधला हो जाना।

agarose स्तंभ
(विकल्प 1) 		गोलार्द्ध
(विकल्प 2) 		मकड़ी का जाला धारक
(विकल्प 3)
तर्क भ्रूण एक agarose स्तंभ है कि एक केशिका से बाहर धकेल दिया जाता है में अंतर्निहित है भ्रूण के पीछे अंत एक agarose गोलार्द्ध के पोल से चिपका है भ्रूण एक slotted छेद फैले पतली agarose फिल्म से चिपका है
नमूना धारक पिन के साथ स्टील सिलेंडर स्टील पाइप साथ स्टील सिलेंडर
slotted छेद
असीमित (कोई भी) असीमित (कोई भी) चार (0 डिग्री, 90 डिग्री, 180 डिग्री, 270 °)
आवश्यक कौशल स्तर मध्यम उच्च कम
भ्रूण के आसपास agarose उच्च कम मध्यम
प्रति सत्र भ्रूणों की संख्या तीन तक एक अप करने के लिए छह
भ्रूण पुनर्प्राप्ति मुश्किल आसान आसान
डिस्पोजेबल उपकरण कांच केशिकाओं - -
के लिए सिफारिश की अल्पकालिक लाइव इमेजिंग, दाग भ्रूण लंबे समय तक जीना इमेजिंग लंबे समय तक जीना इमेजिंग, दाग भ्रूण
<strong> संदर्भ तीन 23,87,88 दो 57,65 इस प्रकाशन

तालिका 3 - बढ़ते तरीके फायदे और नुकसान।

aberrational फेनोटाइप प्रेरण तर्क कदम संदर्भ (पद्धति)
भ्रूण आरएनए हस्तक्षेप दोहरे धागे आरएनए दस्तक-डाउन करने के लिए एक या अधिक विशिष्ट जीन syncytial निषिक्त चरण के दौरान भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता चरण 4.8 के बाद भ्रूण इंजेक्षन। दो 33,81
माता पिता का आरएनए हस्तक्षेप दोहरे धागे आरएनए फ़ेमा में पार्श्व इंजेक्ट किया जाता हैपेट खंडों 3 और 4 के बीच ले प्यूपा, जो संतान में जीन नॉक-नीचे की ओर जाता है चरण 1.5 से प्यूपा ले। दो 36,37
पीछे हटने का भ्रूण घातक उत्परिवर्ती लाइनों अंडा बिछाने संस्कृतियों है कि 25% homozygote उत्परिवर्ती संतान के बारे में पीछे हटने का भ्रूण घातक उत्परिवर्तन विषमयुग्मजी उपज ले चरण 1.5 दौरान इमेजिंग लाइन में उत्परिवर्ती लाइन पार करते हैं। तीन 39,51,89
बाह्य कारकों के आवेदन कुछ जैवसक्रिय या विषाक्त कारकों बाहर से उन्हें इमेजिंग बफर में जोड़कर भ्रूण पर लागू होते हैं चरण 2.2 दौरान इमेजिंग बफर करने के लिए कारक जोड़ें। दो 83,85

सारणी 4 - Aberrational समलक्षणियों की LSFM लाइव इमेजिंग

पूरक तालिका 1 - मेटाडाटा और पैरामीटर लंबे समय तक लाइव इमेजिंग डेटासेट DS0001-0003 के लिए। फ़ाइल डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 1 - से AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 ट्रांसजेनिक लाइन एक Tribolium भ्रूण की लाइव इमेजिंग।
यह पंक्ति बढ़ाने जाल अभिव्यक्ति पैटर्न दर्शाती है। प्रतिदीप्ति संकेत मुख्य रूप से serosa, जर्दी थैली और neuronal कोशिकाओं के एक सबसेट में पाया जाता है। भ्रूण समय बिंदुओं के बीच 00:30 ज के अंतराल के साथ 66:00 ज 00:00 ज से चार झुकाव के साथ दिखाया गया है। फिल्म germband त्याग की शुरुआत में शुरू होता है और एक बार पृष्ठीय बंद पूरा हो गया है समाप्त होता है। फ्रेम दर प्रति सेकंड पांच फ्रेम है। ZA,तीव्रता समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। फ़ाइल डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 2 - Glia नीले ट्रांसजेनिक लाइन से एक Tribolium भ्रूण की लाइव इमेजिंग।
भ्रूण समय बिंदुओं के बीच 00:30 ज के अंतराल के साथ 66:00 ज 00:00 ज से चार झुकाव के साथ दिखाया गया है। फिल्म germband त्याग की शुरुआत में शुरू होता है और एक बार पृष्ठीय बंद पूरा हो गया है समाप्त होता है। फ्रेम दर प्रति सेकंड पांच फ्रेम है। ZA, तीव्रता समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। फ़ाइल डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

गुणवत्ता नियंत्रण

लाइव इमेजिंग assays में, तैयारी और रिकॉर्डिंग प्रक्रिया, गैर इनवेसिव होना चाहिए यानी न यांत्रिक और रासायनिक से निपटने (संग्रह, dechorionation, नमूना धारक पर बढ़ते) और न ही अवलोकन के दौरान एकीकृत ऊर्जा लोड नमूना की व्यवहार्यता प्रभावित करना चाहिए। अध्ययन है कि WT विकास की विशेषताएँ के लिए, यह प्रयोगों जिसमें भ्रूण रिकॉर्डिंग प्रक्रिया बच जाता है, सफलतापूर्वक लिया गया है और एक स्वस्थ वयस्क के रूप में विकसित से केवल उपयोग डेटा की सिफारिश की है। वयस्क किसी भी रूपात्मक aberrations नहीं दिखाना चाहिए, उपजाऊ होना चाहिए और उसके संतान भी उपजाऊ होना चाहिए। वहाँ कम बचने की दर के लिए तीन प्रमुख कारणों में, विशेष रूप से लंबे समय तक जीना इमेजिंग जांच में कर रहे हैं:

सबसे पहले, भ्रूण सतह चरण 7, जो शायद आयन और गैस विनिमय में बाधा और भ्रूण mechan constricts दौरान agarose के साथ बड़े पैमाने पर कवर किया गया थाically। प्रभावित भ्रूण है, खासकर जब जल्दी embryogenesis दौरान imaged, आम तौर पर inconspicuously कई घंटे के लिए, विकसित अचानक गिरफ्तारी और उनके प्रतिदीप्ति संकेत जल्दी खो देते हैं। कुछ अनुभव के साथ, सतह अंश है कि agarose में गोलार्द्ध तकनीक का उपयोग करके अंतर्निहित है, एक तिहाई से नीचे रखा जा सकता है, जबकि मकड़ी का जाला धारक तकनीक के साथ कम से सतह के सबसे आधा एक बहुत पतली agarose परत से आच्छादित है। दूसरे, एकीकृत ऊर्जा लोड भ्रूण के लिए लागू किया सहिष्णुता से अधिक है। चरण 8.2 में दिए गए मूल्यों एक सामान्य नियम के रूप में सेवा करते हैं, लेकिन निम्नलिखित मानदंडों को विचार किया जाना चाहिए: (i) जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान भ्रूण देर भ्रूण के विकास के दौरान लेजर विकिरण सहना नहीं है और साथ ही भ्रूण के रूप में, (ii) हालांकि एकीकृत ऊर्जा लोड समान हो सकता है, या तो कम जोखिम समय या उससे अधिक समय अस्थायी अंतराल के साथ उच्च लेजर शक्ति एक उच्च जोखिम समय या कम अस्थायी अंतराल के साथ कम लेजर शक्ति की तुलना में अधिक तनावपूर्ण हो गया लगता है(Iii) उच्च तरंग दैर्ध्य आम तौर पर बेहतर सहन और (iv) ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए, सहनशीलता की सीमा रेखा विशिष्ट प्रतीत होता हैं, जबकि फ्लोरोफोरे अभिव्यक्ति शक्ति विपरीत रूप से लेजर विकिरण सहिष्णुता के लिए आनुपातिक हो रहा है। साथ ही, संलयन प्रोटीन के डिजाइन और / या intracellular स्थानीयकरण भी एक भूमिका निभाते हैं। तीसरा, भ्रूण बढ़ते प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त है। यहाँ सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह है कि सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान में ऊष्मायन समय आवश्यक के रूप में पूरी तरह से जरायु दूर करने के लिए के रूप में कम है। लंबे समय तक ऊष्मायन बार भ्रूण को नुकसान पहुँचा सकता है। देखभाल भी पंचर नहीं करने के लिए या ब्रश के साथ भ्रूण निकल जाती है और एक परिवेश के तापमान पर agarose बढ़ते रखने के लिए लिया जाना चाहिए। क्षतिग्रस्त भ्रूण वास्तविक इमेजिंग प्रक्रिया से पहले चरण 8.4 दौरान पहचाना जा सकता है, शुरू इतना है कि क्षतिग्रस्त भ्रूण व्यवहार्य लोगों के साथ बदला जा सकता है।

उन दिशा निर्देशों का पालन, आम तौर पर चारों ओर 85-90 Embry की% सेओएस लाइव इमेजिंग प्रक्रिया और पक्षियों के बच्चे जीवित रहते हैं। रची भ्रूण के चारों ओर 90% स्वस्थ और उपजाऊ वयस्कों में विकसित करना। अस्तित्व के अनुपात इमेजिंग तापमान और बढ़ते तकनीक (जब agarose स्तंभ आधे से अधिक नहीं एक दिन की इमेजिंग अवधि के लिए प्रयोग किया जाता है) से स्वतंत्र हो गया लगता है, लेकिन थोड़ा लेजर विकिरण के बढ़े स्तर के साथ कम हो जाती है। एक अतिरिक्त नियंत्रण, विशेष रूप से प्रतिदीप्ति लाइव इमेजिंग या ढांचे के लिए एक व्यापक प्रयोगात्मक दृश्य के लिए अग्रदूत के रूप में चरण की स्थापना के लिए विशेष रूप से निर्मित ट्रांसजेनिक लाइनों के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के दौरान के रूप में, यह imaged के समानांतर में गैर imaged WT और ट्रांसजेनिक भ्रूण को चलाने के लिए सिफारिश की है भ्रूण है, जो imaged भ्रूण के रूप में ही तापमान पर इनक्यूबेट कर रहे हैं, और तुलना उनके विकास समय और आकृति विज्ञान 65।

इसके अलावा, अध्ययन है कि लाइव इमेजिंग के माध्यम से aberrational समलक्षणियों (तालिका 4) की विशेषताएँ भी एक गैर प्रभावित ग चलाना चाहिएसमानांतर में ontrol भ्रूण। यह संभव के रूप में समान दोनों भ्रूण के उपचार रखने के लिए सिफारिश की है, लेकिन यह प्रत्येक प्रयोगात्मक रणनीति के लिए व्यक्तिगत रूप से विचार किया जाना है:

नॉक डाउन आरएनए हस्तक्षेप के माध्यम से।

भ्रूण आरएनए हस्तक्षेप 33, 81 के लिए, भ्रूण है कि एक ही अंडा बिछाने संस्कृति से निकाले जाते हैं या तो कार्यात्मक या को नियंत्रित दोहरे धागे शाही सेना का इंजेक्शन दिया जाना चाहिए। अलग ढंग से इंजेक्शन भ्रूण तो या तो agarose स्तंभ या मकड़ी का जाला धारक तकनीक का उपयोग करके एक ही LSFM में एक साथ imaged किया जाना चाहिए। माता पिता का आरएनए हस्तक्षेप 36, 37 के लिए, इमेजिंग संस्कृति दो उप-संस्कृतियों में विभाजित किया जाना चाहिए। एक उपसंस्कृति की महिला प्यूपा, कार्यात्मक दोहरे धागे आरएनए इंजेक्शन किया जाना चाहिए, जबकि अन्य उपसंस्कृति नियंत्रण दोहरे धागे शाही सेना का इंजेक्शन दिया जाना चाहिए। भ्रूण collection समानांतर में किया जाना चाहिए, और दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण भ्रूण agarose स्तंभ या मकड़ी का जाला धारक तकनीक का उपयोग करके एक ही माइक्रोस्कोप में एक साथ imaged किया जा सकता है।

पीछे हटने का भ्रूण घातक उत्परिवर्ती लाइनों।

जब पीछे हटने का भ्रूण घातक उत्परिवर्ती 39, 89, 91, 92, 93 के साथ काम करने, विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती, जो आम तौर phenotypically अगोचर हैं, पैदावार सैद्धांतिक रूप से 25% समयुग्मक उत्परिवर्ती संतान की एक अंडा बिछाने संस्कृति (लेकिन कभी कभी कम व्यावहारिक हैंडलिंग के कारण जारी करता है 89) और phenotypically अगोचर संतान (50% विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती और 25% WTS) का 75%। यह इस तरह के एक अंडे बिछाने संस्कृति से कई भ्रूण माउंट करने के लिए मकड़ी का जाला धारक तकनीक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। समयुग्मक उत्परिवर्ती मैं हो सकता हैफेनोटाइप की अभिव्यक्ति द्वारा इमेजिंग के पाठ्यक्रम में dentified है, जबकि सामान्य रूप से विकासशील भ्रूण नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं। imaged नमूनों के जीनोटाइप एक बार इमेजिंग और गुणवत्ता नियंत्रण पूरा कर रहे हैं निर्धारित किया जा सकता।

बाह्य कारकों के अनुप्रयोग।

इमेजिंग बफर 83, 85, जैसे जैवसक्रिय या जहरीले पदार्थ, पर विकास की जांच की है, समानांतर एक ही LSFM में एक नियंत्रण भ्रूण के साथ इमेजिंग एक साथ अंदर बाह्य कारकों के प्रभाव आम तौर पर संभव नहीं है। इसलिए, इमेजिंग क्रमिक रूप से प्रदर्शन किया जाना है। बेहतर, बाद के प्रयोगों के बीच का समय कम से कम है और भ्रूण एक ही इमेजिंग संस्कृति से निकली है। वैकल्पिक रूप से, दो हूबहू का निर्माण किया और संचालित LSFMs इस्तेमाल किया जा सकता। इस मामले में, एक ही अंडे बिछाने अवधि से भ्रूण इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन यह काफी महत्व th इस बात का हैदोनों माइक्रोस्कोप के ई अंशांकन ध्यान से आयोजित किया जाता है ताकि इमेजिंग गुण तुलनीय है। मकड़ी का जाला धारक तकनीक का उपयोग करके, प्रत्येक शर्त के लिए कई भ्रूण एक ही बार में उतारी जा सकता है। agarose स्तंभ तकनीक के साथ, बाह्य कारकों भ्रूण तक पहुंचने से रोके जा सकता है।

LSFM लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण के वर्तमान सीमाओं

LSFM कई व्यापक बढ़ाया आयामों में भ्रूण morphogenesis विश्लेषण करने के लिए गैर invasively एक शक्तिशाली उपकरण है। स्टैंडर्ड ऑपरेशन प्रक्रियाओं, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित, प्रक्रिया का समर्थन विकासात्मक जीव विज्ञान में एक मानक उपकरण के रूप में प्रकाश चादर प्रौद्योगिकी की स्थापना के लिए होगा। हालांकि, दृष्टिकोण विविध प्रयोगात्मक और संगठनात्मक स्तर पर कारकों की एक संख्या के द्वारा सीमित है:

प्रारंभ में, LSFM एक समय में एक नमूना विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था। सभी मौजूदा कि छवि दृष्टिकोण दो या अधिक भ्रूण एक साथ एक ही माइक्रोस्कोप ख में वाई 'स्टैकिंग' agarose कॉलम में y- अक्ष या मकड़ी का जाला धारक पतों केवल एक निश्चित सीमा तक इस मुद्दे के साथ नमूना। बहु अच्छी तरह से थाली और coverslip आधारित व्यवस्था उपलब्ध 94, 95, 96 है। हालांकि, वे कम छवि गुणवत्ता से ग्रस्त हैं और ऐसे कई दिशाओं साथ इमेजिंग के रूप में LSFM से आवश्यक लाभ में से कुछ का त्याग। वर्तमान में, सबसे अच्छा विकल्प है जो यथोचित संभव हो जाता है जब इस तरह के लेजर के रूप में महंगा घटकों, साझा कर रहे हैं 60 समानांतर में कई सूक्ष्मदर्शी, के साथ काम करने के लिए है।

EFA-nGFP 57, 65, 84 के साथ, FNL 86, बुद्धिमान 58, 86, AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 और Glia नीले= "xref"> 58, केवल छह कस्टम निर्मित ट्रांसजेनिक लंबे समय तक जीना इमेजिंग के लिए उपयुक्त लाइनों वर्तमान में उपलब्ध हैं। इसके अलावा, HC079 (भ्रूणावरण), G12424 (serosa) और G04609 (हृदय) बढ़ाने जाल लाइनों 51 LSFM 23 के साथ की विशेषता की है। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट भ्रूण भी mRNA 81 द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है या इंजेक्शन 79 डाई, उन दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सीधा कर रहे हैं, लेकिन यह भी सीमाओं 86 से ग्रस्त हैं। और भी कई मानक अभी भी, cytoskeletal- organelle- और झिल्ली लेबल लाइनों या लाइनों कि कुछ गैर सर्वव्यापक प्रमोटरों के तहत fluorophores केवल कुछ अंगों या ऊतकों का निरीक्षण करने के रूप में इस तरह व्यक्त की आवश्यकता है। आदर्श रूप में, उन पंक्तियों के भी विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ उपलब्ध हैं।

एक और चुनौती LSFM द्वारा उत्पन्न डेटा की मात्रा है। तीन स्थानिक आयामों और कम से कम तीन फू में जानकारी के अधिग्रहण के कारणस्वतंत्रता (समय, दिशा, प्रतिदीप्ति चैनल) की rther डिग्री, लाइव इमेजिंग डेटासेट के आकार आसानी से कुछ ही टेराबाइट के लिए कई गीगाबाइट तक पहुँच सकते हैं। यहां तक कि तीन आयामी फसल और TIFF कंटेनरों की ज़िप आधारित संपीड़न के बाद, तीन अनुकरणीय इस अध्ययन के साथ जुड़े डेटासेट 31.6, 12.6 और 45.1 गीगाबाइट में कुल यानी 89.3 गीगाबाइट के आकार की है। जब LSFM साथ काम करना, यह डेटा भंडारण और प्रसंस्करण 88, 97 के लिए संबंधित बुनियादी सुविधाओं के लिए आवश्यक है।

उच्चतम छवि गुणवत्ता भ्रूण की सतह पर प्राप्त किया जाता है, लेकिन गहराई में वृद्धि के साथ, प्रतिदीप्ति संकेत अधिक से अधिक धुँधली हो जाता है। उदाहरण के लिए, germband के पीछे अंत gastrulation के दौरान जर्दी थैली गुना द्वारा कवर हो जाता है और ठीक से हल नहीं किया जा सकता है (चित्रा 4C, पहले पांचवें स्तंभ के लिए)। कई दिशाओं साथ इमेजिंग कम से कम भाग में इस समस्या का हलially - सभी भ्रूण के चारों ओर की सतह से उच्च गुणवत्ता की जानकारी उपलब्ध है, लेकिन भीतरी क्षेत्रों फजी रहते हैं। वर्तमान में, कोई संतोषजनक समाधान उपलब्ध हैं, लेकिन लंबे समय में, अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन 98, आनुवंशिक दृष्टिकोण 99 या माइक्रोस्कोप सेटअप अनुकूली प्रकाशिकी 100 के साथ माना जा सकता है।

अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलन

अब तक, LSFM फल यानी, मेलानोगास्टर 61, 62, 101 ड्रोसोफिला मक्खी बालटी 102 और लाल आटा बीटल Tribolium castaneum 57 abdita उड़ Megaselia तीन कीट प्रजातियों का भ्रूण के विकास के दस्तावेज़ के लिए इस्तेमाल किया गया है,। प्रयोगात्मक ढांचा, मानक संचालन प्रक्रियाओं और बढ़ते तकनीक यहाँ वर्णित shoulआसानी से अन्य कीट प्रजातियों के लिए अनुकूल होगी। कि विभिन्न आदेशों के हैं कई कीड़ों के लिए जर्मलाइन परिवर्तन प्रोटोकॉल ऐसे मधुमक्खी 104 के रूप में किफायती और / या चिकित्सा महत्व के प्रजातियाँ, कई lepidopterans 105, 106 या एक से अधिक मच्छर प्रजातियों 107, 108, 109 सहित उपलब्ध 103 कर रहे हैं। संबंधित ट्रांसजेनिक प्रतिदीप्ति लाइव इमेजिंग के लिए उपयुक्त लाइनों के साथ, कीड़ों की भ्रूण morphogenesis जबकि उनके विकासवादी प्रजातियों और / या पारिस्थितिक आवासों पर विचार लक्षण वर्णन किया जा सकता है। के बारे में एक लाख कीट प्रजातियों वर्णित किया गया है और एक और दो करोड़ कीड़े प्रजातियों सबसे अधिक संभावना मौजूद 110, विकास 2 की 400 मिलियन से अधिक वर्षों के कवर। केवल तुलनात्मक दृष्टिकोण है कि जानकारी उत्पन्न होगा बारी प्रावधानों मेंdes अंतर्दृष्टि जो केवल एक ही प्रजाति के विकास के सिद्धांतों का अध्ययन करके प्राप्त नहीं किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

लेखक योगदान

एफएस और EHKS अनुसंधान की कल्पना की। एफएस ट्रांसजेनिक AGOC लाइनों उत्पन्न। प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति इमेजिंग एफएस और एस के द्वारा किया गया था। एफएस और EHKS एसके से इनपुट के साथ पांडुलिपि लिखा था।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए स्वेन प्लाथ धन्यवाद। Glia नीले ट्रांसजेनिक लाइन ग्रेगर बुचर (गौटिंगेन, जर्मनी) से एक तरह का उपहार था। अनुसंधान उत्कृष्टता फ्रैंकफर्ट के क्लस्टर द्वारा वित्त पोषित किया macromolecular परिसर (CEF-एम सी, EXC 115, स्पीकर वोल्कर डो्स्च) गेटे पर आण्विक लाइफ साइंसेज के लिए Buchmann संस्थान (BMLS, निदेशक इंरिको श्लेइफ) पर EHKS भाग में दी गई am Main यूनिवर्सिटैट फ्रैंकफर्ट ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा मुख्य हूँ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

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References

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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

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