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Developmental Biology

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Abstract

Der rote Mehlkäfer Tribolium castaneum ist zu einem wichtigen Insektenmodellorganismus in der Entwicklungsgenetik und Evolutionsentwicklungsbiologie worden. Die Beobachtung von Tribolium Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Weitfeld- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften eines Lichtbogenbasierten Mikroskop dreidimensionale Bilder lebender Proben mit hohem Signal-Rausch-Verhältnisse und eine deutlich reduzierte Photobleich sowie Phototoxizität entlang mehrerer Richtungen über Perioden aufgezeichnet werden, die mehrere dauern Tage. Mit mehr als vier Jahren der methodischen Entwicklung und eine kontinuierlichen Steigerung von Daten, scheint die Zeit entsprechende Standardarbeitsanweisungen für die Verwendung von Lichtblatt - Technologie in der Tribolium Gemeinschaft zu etablieren sowie in den Insekt Gemeinschaft. Dieses Protokoll beschreibt drei Montagetechniken geeignet foder verschiedene Zwecke, stellt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien Tribolium geeignet für Langzeit - Echtzeit- Bildgebung, schlägt fünf Fluoreszenzfarbstoffe intrazelluläre Strukturen von festen Embryonen etikettieren und liefert Informationen über die Daten Nachverarbeitung für die rechtzeitige Auswertung der aufgezeichneten Daten. Repräsentative Ergebnisse konzentrieren sich auf die langfristige Echtzeit-Bildgebung, optischen Schneidens und der Beobachtung des gleichen Embryos entlang mehrerer Richtungen. Die entsprechenden Datensätze werden als herunterladbare Ressource bereitgestellt. Schließlich beschreibt das Protokoll Qualitätskontrollen für Echtzeit-Bildgebung Assays aktuellen Einschränkungen und die Anwendbarkeit der beschriebenen Verfahren auf andere Insektenarten.

Dieses Protokoll wird für Entwicklungsbiologen in erster Linie gedacht, die Imaging-Lösungen suchen, die Standard-Laborgeräte entwickeln. Es fördert den kontinuierlichen Versuch, die Lücke zwischen den technisch orientierten Laboratorien / Gemeinden zu schließen, die sich entwickeln und Mikros verfeinernKopieren methodologisch und das Life-Science-Labor / Gemeinden, die technischen Herausforderungen 'Plug-and-Play' Lösungen erfordern. Darüber hinaus unterstützt es einen axiomatischen Ansatz, der die biologischen Fragen in den Mittelpunkt der Aufmerksamkeit bewegt.

Introduction

Die rote Mehlkäfer Tribolium castaneum, die von Schwarzkäfer (Tenebrionidae) zur großen Familie gehört, hat eine lange Geschichte in der Landwirtschaft und Lebenswissenschaften und ist die zweite am besten untersuchte Modell Insektenmodellorganismus nach der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. In den letzten vier Jahrzehnten wurde es ein starker und beliebtes Insekt Modellorganismus in der Entwicklungsgenetik, in der evolutionären Entwicklungsbiologie und in den letzten zwanzig Jahren in der embryonalen Morphogenese für eine Vielzahl von Gründen:

Drosophila und Tribolium gehören beide zur Holometabola, aber etwa 300.000.000 Jahre wichen vor 1, 2, 3, 4. Während die embryonale Entwicklung von Drosophila allgemein als hoch abgeleitet betrachtet wird, zeigt einen Tribolium Vorfahren Modus Entwicklung , die in einem deutlich größeren Anteil an Insektenart 5, 6, 7, 8, 9 zu finden ist. Erstens weist Tribolium nicht-involuted Kopfentwicklung, dh seine Mundwerkzeuge und Antennen entstehen bereits während der Embryonalentwicklung 10, 11, 12, 13, 14, 15. Zweitens folgt Tribolium die Prinzipien der Kurzkeimentwicklung, dh Abdominalsegmente 16 sind der Reihe nach von einer posterioren Wachstumszone während germband Dehnung hinzugefügt, 17, 18, 19. Drittens entwickelt Tribolium und später degradiertzwei extraembryonalen Membranen dh das Amnion, das nur den Embryo ventral abdeckt und der Serosa, die den Embryo vollständig einhüllt 20, 21, 22. Beide Membranen spielen eine entscheidende morphogenetischen 23 sowie Schutzfunktion gegen Mikroorganismen 24, 25 und Austrocknungs 26. Viertens sind die embryonal Entwicklungs Beine während des Larvenentwicklungsstadium voll funktionsfähig und dienen als Primor für den erwachsenen Beine während pupal Metamorphose 27, 28, 29, 30, 31.

Aufgrund ihrer geringen Größe und bescheidenen Forderungen, Anbau von Tribolium im Labor ist recht unkompliziert. Kulturen von Wildtyp (WT) Stämme oder transgenen Linien besteht typischerweise von etwa 100-300 Erwachsenen und kann innerhalb von Ein-Liter - Glasflaschen (footprint 80 cm 2) gefüllt drei vor vier Zentimetern hoch (etwa 50 g) mit Wachstumsmedium gehalten werden , das aus Vollkornweizen besteht Mehl mit inaktiver Trockenhefe ergänzt. Eine Wasserversorgung ist nicht erforderlich. Auf diese Weise kann auch kleine Laboratorien Dutzende von Käfern Kulturen innerhalb kleinen oder mittelgroßen Handel erhältlich Insekten Inkubatoren zu halten. Späteren Entwicklungsstadien von Tribolium (Larven nach etwa der vierten Larvenstadium, Puppen und Adulte) leicht aus dem Wachstumsmedium durch Sieben getrennt. Synchronisierte Embryonen erhalten von Erwachsenen für eine kurze Zeit auf Eiablage Medium inkubiert. Für die schnelle Entwicklung, Käfer Kulturen werden bei 32 ° C (etwa vier Wochen pro Generation) gehalten, während der Lagerhaltung typischerweise bei 22 bis 25 ° C (etwa 10 Wochen pro Generation) durchgeführt wird.

Innerhalb der letzten zehn Jahre, viele Standard-techniques wurden für Tribolium allmählich angepasst und optimiert, wie 32 in den Schwellenmodellorganismen Bücher zusammengefasst. Von großer Bedeutung sind genetische Methoden vorgeschoben , wie beispielsweise embryonale 33, Larven 34, 35 oder Eltern 36, 37 RNA - Interferenz-basierte Knock-Down, mit Keimbahn - Transformation entweder das 38 piggyBac, 39 oder dem Minos 40 Transposase - System und CRISPR / Cas9 basierter Genom Technik 41. Darüber hinaus hat der Tribolium Genom etwa ein Jahrzehnt 42 her sequenziert worden und ist nun in der dritten Runde der Genomanordnung 43 freizugeben, die 44 effizient und genomweite Identifikation und systematische Analyse von Genen ermöglicht , 45, 46. Darüber hinaus sind die Genome von vier anderen Coleoptera - Spezies für vergleichende genetische Ansätze 47, 48, 49, 50. In Verbindung mit dem sequenzierten Genom, zwei großen genetischen Analysen dh einen Insertionsmutagenese Bildschirm 51 und ein systematischen RNA - Interferenz basierenden Knock-Down - Bildschirm 52 durchgeführt wurden, 53.

Fluoreszenz Echtzeit- Bildgebung mit Weitfeld-, konfokaler oder Lichtbogen-Basis - Mikroskopie (LSFM) ermöglicht die embryonale Morphologie von Tribolium als Funktion der Zeit (dh die Morphogenese) in einem mehrdimensionalen Kontext (Tabelle 1) zu beobachten. In Weitfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die excitation und Emissionslicht wird durch die gleiche Objektivlinse geführt wird. Bei beiden Ansätzen wird die gesamte Probe für jede aufgenommene zweidimensionale Ebene beleuchtet. Somit werden die Proben auf eine sehr hohe Energieniveaus ausgesetzt. In LSFM nur die Fluorophore in der Fokusebene sind auf eine Entkoppelung der Beleuchtung und Detektion angeregt durch Verwendung von zwei senkrecht zueinander angeordneten Objektivlinsen (Abbildung 1). LSFM kommt in zwei kanonische Implementierungen - die einzige Ebene Beleuchtungsmikroskop (SPIM) und das digitale abgetastete Laserlichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskop (DSLM, Bild 2) - und bietet mehrere entscheidende Vorteile gegenüber traditionellen Herangehensweisen: (i) intrinsische optischen Schneidens fähig, (ii) ein gutes axiale Auflösung, (iii) stark reduzierter Gehalt an Photobleich, (iv) sehr geringe Phototoxizität, (v) hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis, (vi) relativ hohe Erfassungsgeschwindigkeit, (vii) -Bildgebung entlang mehrerer Richtungen und (viii) tiefere Gewebepenetration durch die Verwendung von niedrigeren numerischen Apertur Beleuchtungsobjektivlinsen 54, 55, 56.

LSFM wird bereits in Tribolium zu dokumentieren fast den gesamten embryonalen Morphogenese 57 und zu analysieren , um die Prinzipien der extraembryonalen Membranruptur zu Beginn des Rückenverschlusses 23 erfolgreich eingesetzt. Um die Attraktivität der LSFM in der Tribolium Gemeinschaft und für Insekten Wissenschaft im Allgemeinen zu erhöhen, ist es von großer Bedeutung zu etablieren Standard - Betriebsverfahren und die Methoden, Protokolle und den Pool von Ressourcen auf ein Niveau zu verbessern , wo das Mikroskop ein wird die Einfachheit des -Nutzung Standardwerkzeug in der Entwicklungsbiologie Labors und die biologischen Fragen in den Mittelpunkt der Aufmerksamkeit bleiben.

Dieses Protokoll beginnt mit den Grundlagen von Tribolium </ em> Anbau, dh Wartung, Reproduktion und Embryo - Entnahme. Als nächstes werden zwei Versuchsstrategien dargestellt: (i) Echtzeit- Bildgebung von maßgeschneiderten transgenen Linien und (ii) Darstellung von festen Embryonen , die mit Fluoreszenzfarbstoffen (Tabelle 2) gefärbt wurden. (I) die Agarose - Säule, (ii) die Agarose Hemisphäre und (iii) der neuen Spinnweben Inhaber: Anschließend werden im Detail (Abbildung 3 und Tabelle 3) drei Befestigungstechniken mit leicht unterschiedlichen Zwecken erläutern. Das Protokoll erklärt dann den Einlesevorgang mit LSFM. Bildgebungsverfahren und wichtige Überlegungen skizziert. Schließlich wird Embryo Retrieval erklärt und Vorschläge für grundlegende Datenverarbeitung zur Verfügung gestellt werden. In den repräsentativen Ergebnissen, Livebilddaten von zwei neuartigen maßgefertigte und die Glia-blue 58 transgene Linien gezeigt sind und die jeweiligen Abbildungsdatensätze werden als herunterladbare Ressource bereitgestellt. Zusätzlich BildDaten von Fest Embryonen, die mit einer Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt wurden vorgestellt. Die Diskussion konzentriert sich auf die Qualitätskontrolle, die derzeitigen Beschränkungen des Live-Imaging-Ansatz und die Anpassung des Protokolls zu anderen Arten.

Das Protokoll ist für die Lichtbogen-Basis geschrieben Fluoreszenzmikroskope , die mit einer Probenkammer und einer drehbaren Klemmmechanismus für standardisierte Probenhaltern 54, 59, 60, ausgestattet, die mit einem Durchmesser von Metall, Kunststoff oder Glas bestehen typischerweise zylinderförmige Elemente sind , im Millimeterbereich. Das Protokoll ist auch geeignet für beide kanonische Implementierungen, das heißt SPIM und DSLM sowie für Aufbauten mit zwei oder mehr Beleuchtungs- und Detektionsarme 61, 62, 63. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, Daten, die in zwei spektralen Kanälen, grün (illumination mit einem 488 nm-Laser, Feststellung durch einen 525/50 Bandpaßfilters) und Rot (Beleuchtung mit einem 561-nm-Laser, Feststellung durch einen 607/70 Bandpaßfilters), aber das Protokoll kann auf drei oder vier spektrale Kanäle erweitert werden.

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Protocol

1. Haltung von Tribolium Cultures

HINWEIS: Standardbedingungen werden als eine Inkubationstemperatur von 25 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12 h definiert Hell / 12 h Dunkel-Zyklus. Weitere Informationen über die Tribolium Haltung, sind entsprechende Richtlinien 64 zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert zwei verschiedene Mehlbasis Medien, die in Kilogramm-Mengen und gespeichert für mehrere Monate vorbereitet werden kann.

  1. Vor Beginn der Arbeit mit Mehl und inaktiver Trockenhefe, lagert die ungeöffneten Verpackungen bei -20 ° C für 24 h und dann auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Dieses Verfahren eliminiert potenzielle Krankheitserreger.
  2. Passieren Vollkornweizenmehl und inaktive Trockenhefe durch ein Sieb mit 710 um Maschenweite, dann Wachstumsmedium herzustellen, indem man das gesiebte Vollkornmehl mit 5% ergänzen (w / w) gesiebten inaktive Trockenhefe.
  3. Übergeben Sie 405 feinen Weizenmehl und inaktive Trockenhefe durch ein Sieb mit 250 & #181; m Maschenweite, dann Eiablage Medium herzustellen, indem man den gesiebte 405 feinen Weizenmehls mit 5% ergänzen (w / w) inaktiv Trockenhefe gesiebten.
  4. Übergeben Sie die jeweiligen Tribolium Kultur durch ein Sieb mit 800 & mgr; m Maschenweite. Entsorgen Sie das übriggebliebene Wachstumsmedium. Übertragen Sie die Larven, Puppen und Erwachsene zu einem großen Glasschale.
  5. Wenn keine Nachkommen Kultur vorhanden ist, übertragen etwa 80 Larven und / oder Puppen auf eine neue Glasflasche eine neue Nachkommen Kultur zu etablieren. Wenn keine Larven und / oder Puppen vorhanden sind, nehmen rund 40 Erwachsene statt. In 50 g Wachstumsmedium und Inkubation unter Standardbedingungen.
  6. Collect etwa 300 Erwachsene (500-700 mg) in einer anderen neuen Glasflasche die Abbildungskultur zu etablieren. In 50 g Wachstumsmedium und Inkubation unter Standardbedingungen. Lassen Sie die Abbildungskultur für mindestens 24 h in frischem Wachstumsmedium vor dem Besamungs zu regeln.
  7. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium der Abbildungs ​​Kultur mindestens alle zwei wirEKS, die in Verbindung mit embryo Sammlung durchgeführt werden können (siehe 3.2). Nach zwei bis drei Monaten, ersetzen Sie die Bildkultur vollständig durch neue Erwachsene aus der Nachkommenschaft Kultur.
  8. Wenn ein Nicht-homozygote transgene Linie verwendet wird, kuratieren die Nachkommen Kulturen häufig durch nicht-transgenen Tieren zu entfernen. Idealerweise homozygote Linien erzeugen, wenn das jeweilige Transgen nicht letal ist oder Sterilität bewirkt, wenn auf beiden Chromosomen. Homozygot Kulturen haben in der Regel ein höheres durchschnittliches Fluoreszenzniveau und die Gesamt experimentellen Bedingungen sind schmaler, da nur ein Genotyp vorhanden ist.

2. Mikroskop Einrichtung und Kalibrierung

HINWEIS: Der Tribolium Embryo weist eine anterior-posteriore Länge von etwa 600-660 & mgr; m und ein Querdurchmesser von etwa 300-330 & mgr; m. Die meisten modernen CCD - Kameras haben eine Sensorchipgröße von etwa 9 mm x 7 mm, dh mit einem Durchmesser von 11,4 um, und ein Pixel-Pixel - Abstand von 6,45 & mgr; m.Wenn sie mit einer 10 - facher Vergrößerung Objektivlinse kombiniert wird , kann der Embryo mit einem Pixelabstand von 0,645 & mgr; m in toto abgebildet werden. Die meisten modernen sCMOS Kameras haben eine größere Sensorchipgröße von etwa 16 mm x 14 mm, also einem Durchmesser von 21,3 um, und ein Pixel-Pixel - Abstand von 6,5 um. Wenn sie mit einer 20 - facher Vergrößerung Objektivlinse kombiniert wird , kann der Embryo mit einem Pixelabstand von 0,325 & mgr; m in toto abgebildet werden.

  1. Bringen Sie die Beleuchtungs- und Detektionsobjektivlinsen zum Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass Laser und Fluoreszenzfilter das Fluorophor Absorptions- und Emissionsspektren entsprechen sehr gut.
  2. Bringen Sie die Probenkammer mit dem Mikroskop. Füllen der Probenkammer, die mit PBS pH 7,4 oder einer anderen geeigneten Abbildungspuffer.
  3. Einschalten und das Mikroskop kalibrieren. Umfassende Kalibrierungsroutinen und Fehlerbehebung Richtlinien für maßgeschneiderte Lichtbogenbasis Mikroskope (genauer gesagt für die DSLM Implementierung) wurden pr veröffentlichteviously 65. Für gewerbliche Geräte, folgen den Anweisungen des Herstellers sehr sorgfältig. Falsche Handhabung könnte die Probenkammer des Mediums und verursachen Chaos in das Instrument als auch die Probe führen.

3. Sammlung von transgenen oder WT Embry

  1. Übergeben der Abbildungs ​​Kolonie durch ein Sieb mit 800 um Maschenweite. Sammeln erwachsene Käfer in einer neuen Glasflasche und mit 10 g Eiablage Medium. Inkubiere die Eiablage Kultur für 1 h bei 25 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit in Licht.
  2. Übergeben der Eiablage Kultur durch ein Sieb mit 800 & mgr; m Maschenweite Erwachsene aus der Eiablage Medium zu trennen, die um 30-100 Embryonen enthält. Übertragen Erwachsene auf eine neue Glasflasche und fügen Sie entweder die alte oder 50 g frisches Wachstumsmedium.
  3. Wenn Beobachtung an dem einheitlichen Blastodermstadium (Beispiel-Datensatz DS0002) beginnen sollte, inkubiere die Eiablage Medium für 15 h bei 25 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit. To startet zu Beginn des Zurückziehens germband (Beispiel Datensätze DS0001 und DS0003), inkubieren Embryonen für 23 h bei 32 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit. Wenn andere Entwicklungsstufen erwünscht sind, beziehen sich auf die jeweilige Literatur 64, 65 und anzupassen Inkubationszeit und / oder Temperatur nach Bedarf.

4. Embryo dechorionation

HINWEIS: Die Chorion die äußere Schicht der Eischale und besteht aus Proteinen und Polysacchariden. Es ist stark lichtabsorbierenden aber nicht wesentlich für die richtige Entwicklung und damit chemisch entfernt werden kann.

  1. Übergeben der Eiablage Medium durch ein Sieb mit 300 um Maschenweite. Sammeln der Embryos in einem Zellfilter mit 100 & mgr; m Maschenweite und verwerfen die übrig gebliebenen Eiablage Medium.
  2. Vorbereiten eine 6-Well-Platte wie folgt: Füllen der A1, A2, A3 und B3 Vertiefungen mit 10 ml PBS pH 7.4 und den B1- und B2-Vertiefungen mit 9 ml PBS. Dann sorgfältig hinzufügen1 mL Natriumhypochlorit B1 und B2. Beachten Sie die Fortschritte der Schritte 4,3 bis 4,8 unter dem Stereomikroskop. VORSICHT Natriumhypochlorit ist ätzend.
  3. Legen Sie die Zelle Sieb in die A1 gut (PBS pH-Wert 7,4) und waschen Sie die Embryonen eine Minute lang unter leichtem Schütteln. Größere Mehlpartikel aus den Embryonen lösen sollte.
  4. Übertragen der Zellsieb zum B1 gut (Natriumhypochlorit in PBS pH 7,4) und schüttelt die Platte kräftig für 30 s. Die restlichen Mehlpartikel sollten vollständig von den Embryonen lösen.
  5. Übertragen der Zellsieb zum A2 gut (PBS pH 7,4) und wäscht die Embryonen für 1 min unter leichtem Schütteln.
  6. Für dechorionation, überträgt die Zellsieb an den B2 gut (Natriumhypochlorit in PBS pH 7,4). Schütteln Sie die Platte kräftig, bis die Chorion Brüche und löst sich von den Embryonen. Das Chorion sieht aus wie ein dünner, halbtransparente Membran mit abgerissenen Kanten, während dechorionated Embryonen eine einfache Silhouette aufweist.
  7. Transfer the Zellsieb gut an der A3 (PBS pH 7,4) und die Embryonen für 1 min unter leichtem Rühren gewaschen werden. Wenn irgendwelche Chorion-Fragmente noch zu den Embryonen nach dem Waschen angebracht sind, wiederholen Sie Schritt 4.6.
  8. Lagern Sie die Embryonen in der B3 gut (PBS pH 7,4). Lagerung für mehrere Stunden nicht schadet die Embryonen, aber bedenken Sie, dass die Entwicklung geht weiter.
  9. Für nicht-homozygoten transgenen Linien, entfernen Sie alle nichtfluoreszierenden Embryonen, wenn möglich. Zur Fixierung und Färbung von WT oder transgenen Embryonen, mit Schritt 5 für Echtzeit-Bildgebung transgener Embryonen weiter, weiter mit Schritt 6.

5. Vitelline Membranpermeabilisierung, Fixierung und Färbung

HINWEIS: Die Vitellinmembran die innere Schicht der Eischale ist. Es ist undurchlässig für fluoreszierende Farbstoffe und somit chemisch vor der Färbung permeabilisiert werden.

  1. Füllen ein Szintillationsfläschchen mit Fixierung / Permeabilisierung Lösung (1,5 ml von 4% (w / v) Paraformaldehyd in PBS pH 6,9 einnd 1.5 ml n-Heptan). Übertragen Embryonen mit einem Pinsel in die Fläschchen. Abdeckung Vials mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen Fluorophore und für 30 Minuten auf einer Schüttelplattform bei 50 Umdrehungen pro Minute inkubiert. VORSICHT Paraformaldehyd ist giftig und korrosiv, n-Heptan ist entzündlich und toxisch.
  2. Entfernen Fixierungslösung und Behandlung von Embryonen dreimal für 15 min in 3 ml 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 und danach einmal für 15 min in 3 ml 1% (v / v) Triton X-100 in PBS, pH 7,4 auf einer Schüttelplattform bei 50 Umdrehungen pro Minute. VORSICHT Triton X-100 ist ätzend.
  3. Entfernen Permeabilisierung Lösung und 0,5 mL Färbelösung in das Fläschchen. Exemplarische Färbelösungen sind in Tabelle 2 bereitgestellt. Stain Embryos über Nacht bei 4 ° C auf einer Schüttelplattform bei 50 Umdrehungen pro Minute. Für die vorgeschlagenen Farbstoffe in Tabelle 2 ist Waschen nicht erforderlich.

6. Herstellung von Agarose Montage

  1. 1 g niedrigschmelzAgarose zu 100 ml PBS, pH 7,4, und die Mischung für 2-3 min in einem Mikrowellenofen bei 800 W. Wenn kleine Agarose-Teilchen noch vorhanden sind, wiederholen Sie den Heizprozess in 30 sec-Intervallen, bis die Teilchen vollständig auflösen. Die Montage Agarose muss nicht jedes Mal neu vorbereitet werden, kann die erstarrte Agarose durch Erwärmen wieder verflüssigt werden, wie oben beschrieben. Dieser Vorgang kann 5-6 mal vor zu viel Wasser verdunstet wiederholt werden.
  2. Lassen Sie die Agarose auf etwa 40-45 ° C abkühlen, dann füllt zwei 1,5 ml-Reaktionsröhrchen mit dem erwärmten Agarose und so alle Röhrchen bei 35 ° C in einem Thermoblock.

7. Embryo Montage und Insertion in die Probenkammer

  1. Option 1: Agarosesäule (3A -C, erste Spalte, Tabelle 3, zweite Spalte)
    1. Füllen Sie eine 1,0-ml-Spritze mit destilliertem Wasser und befestigen es an einen der Glaskapillare Öffnungen, die durch einen kleinen Gummischlauch.Füllen Sie die Kapillare zur Hälfte mit destilliertem Wasser.
    2. Wähle einen Embryo mit einem Pinsel und sie auf der Innenseite der anderen Glas Kapillaröffnung. Gehen Sie schnell zum nächsten Schritt, bevor der Embryo austrocknet.
    3. Haften die Kapillare in die flüssige Agarose und langsam ein paar & mgr; l Flüssigkeit Agarose neben den Embryo in die Kapillare ziehen. Dann erhöht schnell die Ziehkraft, so dass der Embryo zusammen mit dem Agarose gezogen wird. Am Ende soll ein paar ul Agarose über und unter dem Embryo sein. Stellen Sie die Kapillare beiseite für ein paar Minuten und lassen Sie die Agarose erstarren.
    4. Kürzen die Kapillare mit einem Diamantglasschneider auf eine Länge von etwa 5 mm. Das verbleibende Fragment sollte vollständig mit Agarose gefüllt werden und der Embryo sollte innerhalb des zweiten Quartil sein.
    5. Setzen Sie den Stahlzylinder mit dem Stift in die Probenkammer, und dann bleibt das kapillare Fragment auf der Oberseite des Stiftes. Die Agarose-Säule sollte eine wenige Millimeter f herausragenrom das kapillare Fragment mit dem Teil, das den Embryo enthält.
  2. Option 2: Agarose Halbkugel (3A -C, zweite Spalte, Tabelle 3, die dritte Spalte)
    1. Zeichne 200 ul Flüssigkeit Agarose in eine 1,0-ml-Spritze, dann verwenden, das Stahlrohr von oben mit Agarose, bis eine Halbkugel bildet sich an der unteren Öffnung zu füllen. Die Halbkugel Durchmesser soll das Rohrdurchmesser gleich groß sein. Warten Sie ein paar Minuten, bis die Agarose erstarrt ist.
    2. Wähle einen Embryo mit einem Pinsel und neu ordnen sie auf der Spitze der Bürste, so dass das vordere Ende zugänglich wird. Tauchen Sie die Agarose Hemisphäre in flüssige Agarose zu bedecken es mit einem dünnen Film.
    3. Setzen Sie den Embryo mit seinem vorderen Ende aufrecht auf dem Pol des Agarose-Hemisphäre. Biegen das Stahlrohr herum und Korrektur der Position des Embryos mit dem Pinsel. Falls erforderlich, stabilisiert den Embryo durch Zugabe von 2 & mgr; l Agarose zu dem Embryo / Hemisphäre Grenze. Ideally, weniger als die Hälfte der Embryooberfläche sollte möglichst in Agarose und die Flanken bedeckt sein sollten so steil sein.
    4. Legen Sie das Stahlrohr mit der Halbkugel und Embryo langsam in die Probenkammer.
  3. Option 3: Cobweb Halter (3A -C, dritte Spalte, Tabelle 3, die vierte Spalte)
    1. Wählen Sie einen Embryo mit einem Pinsel und zur Seite legen.
    2. Deckt das Langloch des Spinnweben-Halters mit 5-8 & mgr; l Flüssigkeit Agarose, dann entfernt die meisten der Agarose, bis nur ein dünner Agarose Film bleibt.
    3. Platzieren Sie den Embryo auf die Agarose-Film und stellen Sie ihre Position. Bewegen Sie vorsichtig den Embryo in der x-Achsenmitte des Langlochs, und richtet ihre längliche anterior-posterior-Achse mit der Längsachse des Langlochs.
    4. Setzen Sie den Spinnweben Halter mit montiertem embryo langsam in die Probenkammer. Platzieren Sie den Spinnweben Halter, so dass es nicht mit der Anregung und Emission nicht störtLicht, das heißt 45 ° relativ zu den x- und z-Achse.

8. Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie

  1. Entscheiden, wie viele Richtungen entlang (und entlang der Orientierungen) sollte der Embryo abgebildet werden. Vier Richtungen (entlang der Ausrichtung 0 °, 90 °, 180 ° und 270 °) in der Regel bieten einen guten Kompromiss zwischen Reichweite und Energiebelastung.
  2. Stellen Sie die Anzahl der Fluoreszenzkanäle. Die Hauptparameter für jeden Kanal sind die Laserlinie, die Fluoreszenz-Filter, die Laserleistung und die Belichtungszeit. Für langfristige Live-Bildgebung ist es wichtig, dass die integrierte Energiebelastung nicht die Toleranz des Embryos nicht übersteigt. Eine Belichtungszeit von 25-50 ms sorgt für eine schnelle Bildgebung, während eine Laserleistung zwischen 100 und 300 & mgr; W nicht der Lebensfähigkeit des Embryos beeinflussen sollte. Für feste Proben, Belichtungszeit und Laserleistung kann mindestens verdoppelt werden.
  3. Für Live-Imaging-Assays, konfigurieren Sie den Zeitablauf. die complete Embryonalentwicklung von Tribolium dauert etwa sieben Tage bei Raumtemperatur (23 ± 1 ° C) und etwas weniger als drei Tage bei 32-35 ° C 64. Definiert den zeitlichen Abstand nach den morphogenetischen Ereignissen, die eingehalten werden sollten. Für kurze zeitliche Intervalle, erwägen Senkung Belichtungszeit und Laserleistung (siehe 8.2).
  4. Positionieren des Embryos im Transmissionsmodus Licht entlang der x- und y-Achse in der Mitte des Sichtfeldes, ohne es zu dem Laser ausgesetzt wird. Drehen, um den Embryo um 360 ° in 90 ° -Schritten um den Embryo für Schäden zu untersuchen, die während des Montageprozesses aufgetreten sein könnten.
  5. Drehen , um den Embryo in geeigneter Weise um die y-Achse die embryonischen Achsen auszurichten mit dem Mikroskopachse, beispielsweise die Querachse mit der x-Achse, dh die dorsoventralen Achse mit der z-Achse. Wenn die Spinnweben Haltertechnik, Ausrichtung möglicherweise nicht möglich sein.
  6. Im Fluoreszenzmodus definiert den z-Stapel for jede Richtung. Hinzufügen von 25-50 & mgr; m als räumlicher Puffer vor und hinter dem Embryo. Einschließlich den Puffern deckt der typische z-Stapel rund 350-400 & mgr; m für einen Tribolium embryo. Definieren auch den z-Abstand, die das Vierfache der seitliche Abstand sein sollte, dh der Abstand entlang der x- und y-Achse 66.
  7. Wenn zwei oder mehr Embryos parallel abgebildet werden, startet bei 8.4 mit dem nächsten Embryo.
  8. Für die Langzeitbildgebung, sicherzustellen, dass die Probenkammer mit ausreichend PBS pH 7,4 oder anderen Bildgebungspuffern gefüllt ist. Außerdem deckt die Probenkammeröffnung.
  9. Starten Sie das Imaging-Verfahren. Für langfristige Live-Bildgebung, überwachen die korrekte Erfassung entlang aller Richtungen in allen Kanälen für alle Embryonen. überprüft gelegentlich in den nächsten Tagen, dass die Embryonen am Leben und in der richtigen Position sind.

9. Embryo Retrieval und Qualitätskontrolle

  1. Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Probenhalter mitdie Embryonen aus der Probenkammer. Nur Embryonen aus Live-Imaging-Assays haben abgerufen werden. Fixiert und gefärbt Embryonen verworfen werden.
  2. Wenn eine Echtzeit-Bildgebung Assay durchgeführt wurde, übertragen, um den Embryo zu einem Objektträger. Für die Agarose-Säule Technik, extrahieren die Embryonen aus der umgebenden Agarose mit einem Skalpell, Mikro-Messer oder einer Rasierklinge. Für die Agarose-Technik Hemisphäre, überträgt die Halbkugel mit der flachen Seite auf den Objektträger. Embryo Entfernung ist nicht erforderlich. Für die Spinnweben Halter Technik absteigen sanft die Embryos aus dem Agarose-Film mit einem Pinsel. Inkubieren der Objektträger in einem kleinen Glasschale in gesättigte Feuchtigkeitsatmosphäre unter Standardbedingungen, bis die Larven schlüpfen.
  3. Nach dem Schlüpfen der Larven übertragen auf einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte und füge 500 mg Wachstumsmediums in jeder Vertiefung. Inkubiere unter Standardbedingungen. Vergleichen Sie die Gesamtentwicklungszeit und die Morphologie der abgebildeten Larven nicht bebilderte WT und transgenen larvae (siehe Diskussion). In Assays, die WT-Entwicklung, keine offensichtlichen morphologischen Abweichungen charakterisieren sollte idealerweise bemerkbar.
  4. Sobald die Larven zu gesunden Erwachsenen entwickeln, ihnen mit entsprechenden WT Partnern gleichen Hintergrundstamm. Nach zwei Wochen prüfen Nachkommen Produktion. Sehen Sie sich auch die Fruchtbarkeit der Nachkommen zu prüfen , durch Paarung sie inter pares. Erst wenn die abgebildeten Embryonen in fruchtbaren Erwachsenen entwickeln, die fruchtbare Nachkommen erzeugen, kann das Bildgebungsverfahren nicht-invasive betrachtet werden.

10. Bilddatenverarbeitung

HINWEIS: Für die Bilddatenverarbeitung, die Open-Source - Bildverarbeitungssoftware ImageJ 67 oder dessen Derivates FIJI 68 empfohlen. Beide Versionen sowie eine umfassende Dokumentation an www.imagej.net gefunden. Das Standard-Dateiformat für LSFM Daten ist das Tagged Image File Format (TIFF). Die innere Behälter Option erlaubt es den storagt von Bildstapeln, wie beispielsweise z-Stapel oder Zeitreihen von z maximalen Projektionen innerhalb einer einzigen Datei, die in ImageJ oder FIJI per Drag-and-Drop geöffnet werden kann.

  1. Falls erforderlich, dreht, um die z-stapelt die anterior-posteriore Achse des Embryos mit der y-Achse (Bild → Transformation → Rotate) auszurichten. Bitte beachten Sie, dass die Rotationsparameter individuell für jede Richtung eingestellt werden müssen, aber nicht für den Zeitablauf und die Fluoreszenzkanäle.
  2. Zuschneiden den z-Stapels entlang der x-, y- und z-Achsen, so dass nur ein minimaler Hintergrund (20 bis 40 Pixel entlang der x- und y-Achsen, von 5 bis 10 Ebene entlang der Z-Achse) bleibt (für die x - und y-Achse und den rechteckigen Auswahlwerkzeug verwenden, dann Bild → Pflanzenbau, für die z-Achse, die Verwendung Bild → Stapel → Werkzeuge → Scheibe Keeper). Bitte beachten Sie, dass die Anbau Parameter individuell für jede Richtung eingestellt werden müssen, aber nicht für die Zeitpunkte und die Fluoreszenzkanäle.
  3. Berechnen Sie die z maximale Projektion für jeden z-Stack(Bild → Stapel → Z-Projekt, wählen Max Intensity). Intensity Projection Berechnungen sind Daten Vereinfachungsverfahren, die eine räumliche Dimension zu entfernen.
  4. Für Live - Bilddaten langfristig betrachtet einen ImageJ oder FIJI Skript , das die Verarbeitung 10.1 bis 10.3 für alle Richtungen, alle Zeitpunkt und alle Fluoreszenzkanäle 65 Stufen durchführt. Idealerweise verketten alle z maximalen Projektionen pro Kanal und die Richtung und als eine Zeitreihe in einem TIFF Container abzuspeichern. Alternativ kann die BigDataViewer 69 Plug-in für FIJI verwendet werden , um durch Terabyte-große Datenmengen zu navigieren.
  5. In Abhängigkeit von den transgenen Linie und bildgebenden Verfahren, dynamische Intensitätsanpassung der Zeitstapel könnten wünschenswert sein, aufgrund von Photobleichung und / oder Fluorophor-Expression Schwankungen. Entweder die ImageJ- oder FIJI-intrinsische Bleach Korrekturfunktion (Bild → Anpassen → Bleach Korrektur, wählt Histogramm Matching) oder dedicated Software 65 vorgeschlagen.
  6. Wenn der Embryo wurde aufgezeichnet und / oder entlang mehrerer Richtungen und in mehreren Fluoreszenzkanälen, horizontale Kombination der Richtungen (Bild → Stapel → Werkzeuge → Kombination) und Kanal merge (Bild → Farbmischen → Kanäle) empfohlen.
  7. Registrierung und Fusion von Z-Stapeln entlang mehrere Richtungen 70, eventuell in Kombination mit erworbenem Dekonvolution 71, erlauben die Berechnung von überlegenen dreidimensionalen Bildern mit gleichmßiger Qualität und isotroper Auflösung. Beide Plug-Ins sind Open Source und in FIJI vorinstalliert, aber sie erfordern das Vorhandensein von Kennungsmarken (fluoreszierende Mikrokügelchen, wie zB Kügelchen) um die Probe.
  8. Open-Source - Software - Frameworks für großräumige quantitative Datenextraktion und Analyse ist ebenfalls verfügbar, beispielsweise für die Segmentierung und Verfolgung von Zellkernen 72 oder cell Formerkennung 73.

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Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die Fluoreszenzabbildung von lebenden oder fixierten und gefärbten Tribolium Embryonen mit LSFM. Aufgrund der geringen Mengen an Photobleichung und Phototoxizität, eine direkte Folge seiner optischen Schneidens Fähigkeit ist LSFM besonders gut geeignet für die Langzeitechtzeit-Bildgebung.

Die neuartige Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgene Linie drückt ein histone2B mEmerald-Fusionsprotein unter der Kontrolle des alpha-Tubulin - 1 - Promotor 74. Es zeigt ein Enhancer - Trap-ähnlichen Expressionsmuster 51, da das Fluoreszenzsignal im Wesentlichen aus der Serosa, Dottersack und mehrere neuronale Zellcluster erhalten wird. Unter Verwendung dieser Linie, 66 hr der Embryonalentwicklung bei Raumtemperatur (23 ± 1 ° C) wurden aufgezeichnet, abdeckt germband Retraktion und dorsal Verschluss (Supplementary Film 1). DiesLinie kann verwendet werden , neuronale Cluster innerhalb der Kopfanhänge (4A) und die Dynamik der serosa Migration während dorsalen Schließung (4B) sichtbar zu machen. Die neuartige Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 4-Leitung trägt die gleichen Transgen als die # 4-Leitung, aber an einer anderen genomischen Lage. Dabei spielt es keine offensichtlichen Enhancer - Trap - Muster zeigen, aber das Fluoreszenzsignal wird räumlich - zeitlich ubiquitär nachweisbar als 74 zuvor für diesen Promotor beschrieben. Diese Linie wurde beim Übergang von der Gastrulation abzubildenden Dehnung germband die optische Schneiden Fähigkeit bei zwei Tiefenniveaus (4C) zu demonstrieren. Ein weiteres Merkmal, insbesondere für die Echtzeit-Bildgebung, ist der Erwerb von Z-Stapeln entlang mehrerer Richtungen über Probenrotation, die für LSFM Aufbauten verwendet in der Entwicklungsbiologie Standard ist. Zum Beispiel in der Glia-blue 58 Linie, alle ProbenrotationOWS die Beobachtung von Gliazellen Reorganisations entlang und um die Bauchmark sowie die Proliferation Dynamik im Kopflappens links, die nur richtig von der dorsalen Seite zu sehen sind, in dem gleichen Embryo (4D, Ergänzender Movie 2). Die Echtzeit- Bildgebung Datensätze mit dieser Studie verbunden ist , als herunterladbare Ressource, meta und Zugriffsinformationen vorgesehen sind in Tabelle 1 Ergänzungs gefunden.

Da die Wahl der transgenen Linien für Echtzeit-Bildgebung ist, kann immer noch beschränkt, kleine fluoreszierende Farbstoffe verwendet werden, um spezifisch intrazelluläre Strukturen kennzeichnen. SYTOX Grün bindet Zellkerne und kann in dem grünen Kanal dargestellt werden, während YOYO-1 und BOBO-3 Iodid zu der Kernhülle bindet und kann im grünen oder roten Kanal sichtbar gemacht werden, bzw. (5A). Diese Farbstoffe können verwendet werden, um bestimmte embryonale Struktur markierenures wie die Serosa Narbe (5B, erste Spalte), die posterior ventral serosa Zellen (5B, zweite Spalte) oder die Serosa-Amnion-germband Gewebe dreischichtigen, die während der Serosa Fensterverschlusses (5B, dritten austritt fünfte Spalte). Zweifarben-Färbung ermöglicht die Visualisierung von zwei intrazelluläre Strukturen im gleichen Embryo, beispielsweise die Kernhülle zusammen mit dem Aktin-Zytoskelett, der mit Alexa Fluor-konjugiertem Phalloidin Farbstoffe gefärbt werden kann. Zum Beispiel, YOYO-1 Iodide kann mit Phalloidin 546 (5C) kombiniert werden, während BOBO-3 kann mit Phalloidin 488 (5D) kombiniert werden.

Es ist auch bequem zu fixieren und transgene Embryos Fleck, der bereits ein gewisses fluoreszierendes Protein exprimieren, da das Fixationsverfahren die intrinsischen fluorescenc quenchte Signal nur geringfügig. Zum Beispiel Embryonen aus der Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 4 transgenen Linie, in der die Kerne in dem grünen Kanal detektiert werden, kann mit Phalloidin gefärbt wird 546 , so dass das Actin - Cytoskelett im roten Kanal (6 sichtbar wird , ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Vergleich der konventionellen Weitfeld, konfokale Laser Scanning und Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie. Herkömmliche Weitfeld- epi-Fluoreszenzmikroskopie verwendet Xenonbogen / Quecksilberdampflampen mit geeigneten Filtern oder High-Power-Leuchtdioden als Lichtquellen emittieren. Für jeden erfassten zweidimensionalen Bild, wird die gesamte Probe mit einem nicht-beugungsbegrenzten Lichtkegel ausgeleuchtet. In der konfokalen Laserrasterfluoreszenzmikroskopie, eine beugungsbegrenzte Gaußschen Laserstrahl scanned durch die Probe und die Fluoreszenz wird inkohärent Punkt-für-Punkt erfasst. Ähnlich zu herkömmlicher Weitfeld- epi-Fluoreszenzmikroskopie, wird die gesamte Probe für jedes erfasste zweidimensionales Bild beleuchtet. In Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie, ein beugungsbegrenzter Gauß-Laserstrahl beleuchtet die Probe senkrecht zur Detektionsachse. Fluoreszenz wird detektiert entweder Ebene-by-Ebene oder Linie-für-Linie. Während der Erfassung eines zweidimensionalen Bildes, nur ein kleines Volumen in der Fokalebene des Detektions Ziel zentriert erfährt die Wirkungen des Anregungslichts. Das verbleibende Volumen der Probe nicht beleuchtet wird, trägt nicht zur Out-of-focus blur, leidet nicht an phototoxischen Wirkungen und nicht Fluorophore verlieren aufgrund Fotobleichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ep-together.within-page = "1"> Figur 2
Abbildung 2: Das Prinzip der Lichtbogen basierte Fluoreszenzmikroskopie. In LSFM, Beleuchtung und Detektion mindestens zwei optische Wege aufgeteilt in. Wenigstens eine Beleuchtungs Arm verwendet, um die Lichtbogen (Cyan) zu erzeugen, während mindestens ein Erfassungsarm mit einem geeigneten Filter und eine Kamera für die parallele Detektion des Fluoreszenzsignals (grün) ausgestattet ist. LSFM hat zwei kanonische Implementierungen, die einzelne (oder selektiv) -Ebene Beleuchtungsmikroskop (blaue Hintergrund) und das digitale Bogenlaserlicht abgetastet Mikroskop (roter Hintergrund). Durch Bewegen der Probe und der Lichtbogen relativ zueinander, um dreidimensionale Bilder werden erfasst. Informationen entlang mehrerer Richtungen wird durch Drehen der Probe um die y-Achse gesammelt, die vorzugsweise entlang der Schwerkraft ausgerichtet ist.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Drei verschiedene Montagetechniken in der Aufzeichnung der Embryonalentwicklung von Tribolium mit Lichtblatt-basierter Fluoreszenzmikroskopie verwendet. (A) Die Agarosesäule bezieht sich auf einen Stahlzylinder mit einem kleinen Stift, der die Agarose - Säule drückt, in welcher der Embryo eingebettet ist, aus einer Glaskapillare. Die Agarose Halbkugel auf einer Stahlrohr montiert. Der Embryo wird mit einer kleinen Menge an Agarose zum Pol der Halbkugel befestigt ist. Die Spinnweben Halter ist ein Metallblech mit einem Langloch auf der Oberseite der Stahlzylinder angebracht ist. Der Embryo wird in eine dünne Folie geklebt, die Agarose t umspannter Langloch. (B) Schemata der drei Befestigungstechniken in einem Lichtbogen - Mikroskop. (C) die drei Befestigungstechniken innerhalb eines DSLM angewandt. (D) beispielhafte Bilder von Embryonen von Glia-blue transgenen Linie aufgezeichnet mit den drei Montagetechniken. Die Embryonen, die zu Beginn der germband Retraktion sind, sind mit ihrem hinteren Ende in Richtung oben orientiert dargestellt die Sendelichtbilder entsprechen. FM, Fluoreszenzmodus; ZA, z maximale Projektion mit Intensitätseinstellung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Live - Imaging von Tribolium Embryos. (A </ Strong>) Ein Embryo des Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} von germband Rückzug auf dorsal-Verschluss am Übergang # 1 Zeile. Diese Linie zeigt Expressionsmuster ein Enhancer-Trap. Das Fluoreszenzsignal wird in erster Linie in der Serosa, Dottersack und einige neuronalen Zellcluster gefunden. Der Embryo wird mit einem Intervall von 5 h über einen Zeitraum von 15 h dargestellt. Die Detailbilder zeigen Zellanhäufungen in den Kopf Anhängsel. Zunächst werden die Cluster noch von serösen Zellen bedeckt (erste Spalte), bei der Serosa Ruptur, lesen die Zellen, die mit der Drehbewegung des Kopfes entlang. (B) Gleiche Embryos während dorsalen Verschlusses für 1:30 h mit einem Intervall von 0.30 h gezeigt. Die Detailbilder zeigen die Migration des gerissenen Serosa über den Dottersack. (C) Obere Reihe: Ein Embryo des Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 4 line am Übergang von der Gastrulation Dehnung germband. Mittlere und untere Reihe: Einzelne Ebene in zwei Tiefen über einen Zeitraum von 10:30 Uhr mit einem Intervall von 1:30 gezeigtenh. (D) Ein Embryo der Glia-blaue Linie während germband Retraktion über einen Zeitraum von 50:30 h mit einem Intervall von 07:30 Stunden gezeigt. Die Detailbilder zeigen die morphogenetische Reorganisation der Gliazellen im linken Kopflappen. ZA, z maximale Projektion mit Intensitätseinstellung; PA einzige Ebene mit Intensitätseinstellung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Fixierung, Färbung und IIMAGING von WT Embryos während Germband Dehnung. (A) Die Embryonen gefärbt mit entweder SYTOX Grün, dh eine Fuzzy - Kernfärbung oder YOYO-1 Jodid oder BOBO-3 Iodid, dh zwei Kernhülle Flecken. (B) YOYO-1 Iodide gebeiztes embryO. Details zeigen die Serosa Narbe (erste Spalte), die Kernhülle der großen posterior-ventralen serosa Zellen (zweite Spalte) oder die dreischichtige Gewebeorganisation des serosa, das Amnion und den eigentlichen embryonalem Gewebe (dritte bis fünfte Spalte). (C) Zwei-Farben - Färbung mit YOYO-1 iodid und Phalloidin 546. (D) Zweifarben - Färbung mit Phalloidin 488 und BOBO-3 Iodide. ZA, z maximale Projektion mit Intensitätseinstellung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6: Bilder fixiert und gefärbt transgenen Embryos aus dem Ágóc {ATub 'H2B-mEmerald} # 1 Zeile. Diese transgene Linie drückt mEmerald-labeled histone2B (H2B) unter der Kontrolle des alpha-Tubulin - 1 - Promotor, der den Kern / Chromatin ubiquitär in der ganzen Embryonalentwicklung markiert. Der Embryo wurde weiter mit Alexa Fluor 546 Phalloidin, gebeizt, die dem Aktin-Zytoskelett / F-Aktin-Etiketten. ZA, z maximale Projektion mit Intensitätseinstellung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Kriterium Fluoreszenzmikroskop Typ
konventionelles weites Feld konfokalen Laser - Scanning Lichtbogen-basierte
Objektivaufbau eine Objektivlinse, mittel-hoch NA zwei senkrecht zueinander angeordneten Objektivlinsen, Beleuchtung: niedrige NA, Detektion: hohe NA
Beleuchtungslichtquelle Weißlichtquelle und geeignete Filter (zB Kurzbogenlampen Quecksilber)
oder LED-Basis mit Clean-up-Filter 		Laser mit Reinigungsfilter
(ZB Diode oder DPPS - Laser) 		Laser mit Reinigungsfilter
(ZB Diode oder DPPS - Laser)
Beleuchtungs pro zweidimensionalem Bild ganz Probe ganz Probe
(Typischerweise zweidimensionale Gaußsche Strahlabtastung) 		nur Fokalebene
(DSLM: eindimensionale Gauß'sche Strahlabtastung)
Entdeckung parallel
(Typischerweise CCD-Kamera oder sCMOS) 		sequentiell
(Photomultiplier-Röhre) 		parallel
(Typischerweise CCD oder scmOS-Kamera)
Bildgebungsgeschwindigkeit schnell (Millisekunden pro Bild) langsam (Sekunden pro Bild) schnell (Millisekunden pro Bild)
out-of-focus Fluoreszenz keine Diskriminierung nahezu vollständig durch das kleine Loch blockiert,
(Ablehnungs Effizienz ist abhängig von Durchmesser) 		fast nicht existent
(Nur aufgrund von Streuung)
räumliche Dimensionen 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
weitere Freiheitsgrade 2
(Zeit, Fluoreszenz-Kanal) 		2
(Zeit, Fluoreszenz-Kanal) 		3
(Zeit, Fluoreszenzkanal, Richtung)
laterale Auflösung r
(0,6 λ / NA) 		0,66 r
(0,4λ / NA) 		r
(0,6 λ / NA)
optisches Schneiden Fähigkeit Nein Ja
(Diskriminierung in dem Detektionspfad) 		Ja
(Diskriminierung im Beleuchtungspfad 75)
Verfügbarkeit und Preis überwiegend kommerziell, niedrig Kosten überwiegend kommerzielle, teuer kommerzielle, teuer
custom-built, moderate 54,59,60,75
Live - Publikationen Abbildungs Tribolium Embryonen Abdecken sechs 44,76,77,78,79,80 sieben 23,77,79,81,82,81
(Spinnscheibe konfokale) 83,84,85 		vier 23,57,65,86

Tabelle 1 - Eigenschaften von fluoreszierennce Mikroskopie - Techniken verwendet in Tribolium leben Imaging.

Farbstoff Färbung Verdünnung
SYTOX Grün Kern (fuzzy) 1: 10.000 (1: 100 in ddH 2 O und 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
YOYO-1 Iodide Atomhülle 1: 10.000 (1: 100 in ddH 2 O und 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
BOBO-3-Iodid Atomhülle 1: 10.000 (1: 100 in ddH 2 O und 1: 100 in 1% (w / v) BSA in PBS)
Alexa Fluor 488 Phalloidin Aktin-Zytoskelett 1: 100 (in 1% (w / v) BSA in PBS)
Alexa Fluor 546 Phalloidin Aktin-Zytoskelett

Tabelle 2 - Färbelösungen.

Agarosesäule
(Option 1) 		Hemisphäre
(Option 2) 		Cobweb Halter
(Option 3)
Gründe Embryo wird in einer Agarose-Säule eingebettet, die aus einer Kapillare gedrückt wird, posterioren Ende des Embryos zu Pol einer Agarose Halbkugel geklebt Embryo wird auf dünnen Film Agarose verleimt ein Langloch Spanning
Beispiel halter Stahlzylinder mit pin Stahlrohr Stahlzylinder mit
Langloch
unbegrenzt (any) unbegrenzt (any) vier (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
erforderlich Qualifikationsniveau mäßig hoch niedrig
Agarose um den Embryo hoch niedrig mäßig
Anzahl der Embryonen pro Sitzung bis zu drei eins bis zu sechs
Embryo Retrieval knifflig einfach einfach
Einweg - Geräte Glaskapillaren - -
empfohlen für kurzfristige Live-Bildgebung, gefärbte Embryonen Langzeit Live-Bildgebung Langzeit Live-Bildgebung, gefärbte Embryonen
<strong> Referenzen drei 23,87,88 zwei 57,65 diese Veröffentlichung

Tabelle 3 - Montagemethoden Vorteile und Nachteile.

Aberrationsdiagramm Phänotyp Induktions Gründe Schritt Referenz (methodologische)
embryonale RNA-Interferenz doppelsträngige RNA wird während der syncytial Blastodermstadium in Embryonen injiziert, ein oder mehrere spezifische Gene, knock-down injizieren Embryonen nach dem Schritt 4.8. zwei 33,81
elterliche RNA-Interferenz doppelsträngige RNA wird seitlich in FEMA injiziertenle Puppen zwischen den Bauch Segmente 3 und 4, die Knock-down-Gen an der Nachkommenschaft führt nehmen Sie die Puppen aus Schritt 1.5. zwei 36,37
rezessive embryonale letale Mutanten-Linien Eiablage Kulturen, die eine rezessive embryonale letale Mutation heterozygot Ausbeute etwa 25% homozygot mutierten Nachkommen tragen kreuzen Mutantenlinie in Abbildungslinie während Schritt 1.5. drei 39,51,89
Anwendung von äußeren Faktoren bestimmte bioaktive oder toxischen Faktoren extrinsisch auf die Embryonen angewendet, indem sie an den Abbildungspuffer Zugabe fügen Faktor Abbildungspuffer während Schritt 2.2. zwei 83,85

Tabelle 4 - LSFM Live - Imaging von Aberrationsdiagramm Phänotypen

Ergänzende Tabelle 1 - Metadaten und Parameter für die Langzeit - Live - Imaging-Datensätze DS0001-0003. Bitte klicken Sie hier um die Datei herunterzuladen.

Ergänzende Film 1 - Live - Imaging eines Tribolium Embryo aus dem Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 1 Transgene Linie.
Diese Linie zeigt Expressionsmuster ein Enhancer-Trap. Das Fluoreszenzsignal wird in erster Linie in der Serosa, Dottersack und eine Untergruppe von neuronalen Zellen gefunden. Der Embryo wird entlang von vier Orientierungen von 00:00 h bis 66:00 h mit einem Intervall von 00:30 Stunden zwischen den Zeitpunkt gezeigt. Der Film beginnt am Anfang des germband Rückzugs und endet, sobald Rückenverschluss abgeschlossen ist. Die Bildrate beträgt fünf Bildern pro Sekunde. ZA,z maximale Projektion mit Intensitätseinstellung. Bitte klicken Sie hier um die Datei herunterzuladen.

Ergänzungs Movie 2 - Live - Imaging eines Tribolium Embryo aus der Glia-blau Transgene Linie.
Der Embryo wird entlang von vier Orientierungen von 00:00 h bis 66:00 h mit einem Intervall von 00:30 Stunden zwischen den Zeitpunkt gezeigt. Der Film beginnt am Anfang des germband Rückzugs und endet, sobald Rückenverschluss abgeschlossen ist. Die Bildrate beträgt fünf Bildern pro Sekunde. ZA, z maximale Projektion mit Intensitätseinstellung. Bitte klicken Sie hier um die Datei herunterzuladen.

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Discussion

Qualitätskontrolle

In Echtzeit- Bildgebung Assays, muss die Herstellung und Aufzeichnungsverfahren nicht-invasiv sein, dh weder die mechanische und chemische Behandlung (Sammlung, dechorionation, auf die Probenhaltermontage) noch die integrierte Energiebelastung während der Beobachtung sollte die Lebensfähigkeit der Probe beeinflussen. Für Studien, die WT Entwicklung zu charakterisieren, ist es nur die Verwendung von Daten aus Experimenten empfohlen, in denen der Embryo den Aufzeichnungsprozess überlebt, abgerufen wird erfolgreich und entwickelt sich zu einem gesunden Erwachsenen. Der Erwachsene sollte zeigen keine morphologischen Abweichungen sollten fruchtbar sein und seine Nachkommen auch fruchtbar sein sollte. Es gibt drei Hauptgründe für die niedrigen Überlebensraten, vor allem bei Langzeit Live-Bildgebung Tests:

Zunächst wurde die Oberfläche embryo extensiv mit Agarose während Schritt 7 abgedeckt, die wahrscheinlich Ionen- und Gasaustausch behindert und einengt, den Embryo mechanmatisch. Betroffene Embryonen, vor allem, wenn während der frühen Embryonalentwicklung abgebildet wird, entwickelt typischerweise unauffällig für mehrere Stunden, verhaften plötzlich und verliert ihr Fluoreszenzsignal schnell. Mit einiger Erfahrung, der Oberflächenanteil, der unter Verwendung der Technik Halbkugel in Agarose eingebettet ist, kann unter einem Drittel, während es mit dem Spinnennetzhalter Technik gehalten werden, höchstens die Hälfte von der Oberfläche durch eine sehr dünne Agarose-Schicht bedeckt ist. Zweitens, übersteigt die integrierte Energielast auf den Embryo angelegt, um die Toleranz. Die angegebenen Werte in Schritt 8.2 dienen als Faustregel, aber sollten die folgenden Kriterien berücksichtigt werden: (i) Embryonen während der frühen Embryonalentwicklung keine Laserbestrahlung sowie Embryonen während der späten embryonalen Entwicklung, (ii), obwohl die integrierte Energie ertragen Last könnte identisch sein, höhere Laserleistung mit entweder niedrigeren oder längerem Belichtungszeit zeitlichen Intervallen erscheint als niedrigere Laserleistung mit einer hohen Belichtungszeit oder kürzer zeitlichen Intervallen mehr Stress zu sein, (Iii) höhere Wellenlängen sind in der Regel besser verträglich und (iv) für die transgenen Linien, erscheint die Toleranzgrenze Linie spezifisch zu sein, wohingegen Fluorophor Expressionsstärke an die Laserbestrahlungstoleranz umgekehrt proportional zu sein scheint. Darüber hinaus spielen die Gestaltung des Fusionsproteins und / oder die intrazelluläre Lokalisation auch eine Rolle. Drittens wird der Embryo während des Montageprozesses beschädigt. Der wichtigste Faktor hierbei ist, dass die Inkubationszeit in der Natriumhypochloritlösung so kurz wie nötig, um vollständig die Chorion zu entfernen. Längere Inkubationszeiten können die Embryonen schädigen. Es sollte auch nicht durchstoßen werden genommen oder drücken Sie die Embryonen mit der Bürste und die halten Agarose bei einer Umgebungstemperatur Montage. Beschädigte Embryonen können während Schritt 8.4 vor der eigentlichen Abbildungsprozess beginnt identifiziert werden, so dass beschädigte Embryonen können mit tragfähigen ersetzt werden.

Durch diese Richtlinien befolgen, typischerweise um 85-90% des embryos überleben die Live-Bildgebungsverfahren und Luke. Rund 90% der geschlüpften Embryonen entwickeln sich zu gesunden und fruchtbaren Erwachsenen. Das Überlebensverhältnis wird von der Bildgebung Temperatur und Montagetechniken, unabhängig zu sein (wenn die Agarose-Säule für Abbildungsperioden von nicht mehr als einen halben Tag verwendet wird), aber etwas verringert sich mit erhöhten Mengen an Laserbestrahlungsstärke. Als zusätzliche Kontrolle, insbesondere bei der erstmaligen Beschreibung von maßgeschneiderten transgenen Linien für die Fluoreszenzechtzeit-Bildgebung oder die Rahmenphase als Vorläufer für eine umfassende experimentelle Sequenz zur Festlegung, wird empfohlen, nicht bebilderte WT und transgenen Embryos in parallel zur abzubildenden läuft Embryonen, die auf die gleiche Temperatur wie der bebilderten Embryo inkubiert werden, und vergleichen ihre Entwicklungszeit und Morphologie 65.

Weiterhin Studien , die Aberrationseigenschaften Phänotypen (Tabelle 4) über Echtzeit- Bildgebung Charakterisierung sollten auch einen nicht betroffenen c laufenontrol Embryo in parallel. Es wird empfohlen, die Behandlung beiden Embryonen so ähnlich wie möglich zu halten, aber dies berücksichtigt werden muss individuell für jede experimentelle Strategie:

Knock-down über RNA - Interferenz.

Für embryonale RNA - Interferenz - 33, 81, Embryonen , die aus der gleichen Eiablage Kultur ableiten sollten entweder mit funktionellem oder steuern , doppelsträngige RNA injiziert werden. Die unterschiedlich injizierten Embryonen sollten dann unter Verwendung entweder die Agarosesäule oder die Spinnweben Haltertechnik gleichzeitig in der gleichen LSFM abgebildet werden. Zum parenteral RNA interference 36, 37, sollte die Abbildungs Kultur in zwei Subkulturen aufgeteilt werden. Weibliche Puppen von einer Subkultur sollen mit der funktionellen doppelsträngigen RNA injiziert werden, während die anderen Subkultur soll mit Steuer doppelsträngige RNA injiziert werden. Embryo collection sollte parallel durchgeführt werden, und sowohl die Versuchs- und der Kontrollembryo kann unter Verwendung der Agarose-Säule oder Spinngewebe Halter Technik gleichzeitig in demselben Mikroskop abgebildet werden.

Rezessiv embryonale tödliche Mutantenlinien.

Wenn mit rezessivem embryonalem letalem Mutanten 39 arbeitet, 89, 91, 92, 93, eine Eiablage Kultur von heterozygoten Mutanten, die in der Regel phänotypisch unauffällig sind, Ausbeuten theoretisch 25% homozygot mutierten Nachkommen (aber manchmal weniger aufgrund der praktischen Handhabung gibt 89) und 75% der phänotypisch unauffälligen Nachkommen (50% heterozygot und 25% Mutanten WTs). Es wird empfohlen, die Spinnweben Halter Technik zu verwenden, mehrere Embryonen aus einem solchen Eiablage Kultur zu montieren. Die homozygoten Mutanten können mir seindentified im Verlauf der Abbildung durch die Manifestation des Phänotyps, während die normalerweise entwickelnden Embryonen als Kontrollen dienen. Der Genotyp der abgebildeten Proben bestimmt werden kann, sobald Bildgebungs- und Qualitätskontrolle abgeschlossen sind.

Die Anwendung von äußeren Faktoren.

Wenn der Einfluß von äußeren Faktoren innerhalb des Abbildungspuffers 83, 85, zB bioaktiven oder toxischer Substanzen, auf der Entwicklung untersucht wird, die parallele Bildgebung zusammen mit einem Kontrollembryo in der gleichen LSFM ist typischerweise nicht möglich. Daher weist Abbildungs ​​sequentiell durchgeführt werden. Optimalerweise wird die Zeit zwischen den nachfolgenden Experimenten minimiert und die Embryonen stammen aus der gleichen Abbildungs ​​Kultur. Alternativ können zwei identisch aufgebauten und betriebenen LSFMs verwendet werden kann. In diesem Fall Embryonen aus der gleichen Eiablagezeit soll verwendet werden, aber es ist von großer Bedeutung, dass the Kalibrierung sowohl Mikroskop wird sorgfältig durchgeführt, so dass die Abbildungseigenschaften vergleichbar sind. Durch die Verwendung der Spinnweben Halter Technik, mehrere Embryonen für jede Bedingung auf einmal abgebildet werden. Mit der Agarose-Säule Technik könnten die extrinsischen Faktoren vom Erreichen der Embryonen behindert werden.

Aktuelle Einschränkungen des LSFM Live - Imaging - Ansatz

LSFM ist ein mächtiges Werkzeug embryonalen Morphogenese nicht-invasiv in mehreren breit skalierten Dimensionen zu analysieren. Standardbetriebsverfahren, wie in diesem Protokoll vorgeschlagen, werden den Prozess unterstützen, um Licht Sheet-Technologie als Standardwerkzeug in der Entwicklungsbiologie aufzubauen. Allerdings ist der Ansatz von einer Reihe von Faktoren auf verschiedene experimentelle und organisatorische Ebene beschränkt:

Zunächst wurde LSFM eine Probe zu einem Zeitpunkt, zu analysieren entwickelt. Alle aktuellen nähert sich das Bild zwei oder mehr Embryonen gleichzeitig in demselben Mikroskop b y ‚Stapelung‘ die Probe entlang der y-Achse in der Agarose-Säule oder die Spinnwebe Halter behebt dieses Problem nur bis zu einem bestimmten Grad. Multi-Well - Teller- und Deckglas-basierte Setups zur Verfügung stehen 94, 95, 96. Allerdings leiden sie unter reduzierter Bildqualität und einige der wesentlichen Vorteile von LSFM, wie Bildgebung entlang mehrerer Richtungen opfern. Derzeit ist die beste Option mit mehreren Mikroskopen parallel zu arbeiten, was vernünftigerweise möglich wird , wenn teuere Komponenten, wie der Laser 60 geteilt werden.

Mit dem EFA-nGFP 57, 65, 84, 86 der FNL, die 58 Brainy, 86, die Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 1, die {Ágóc ATub'H2B-mEmerald} # 4 und die Glia-blue= „xref“> 58, nur sechs maßgeschneiderte transgenen Linien geeignet für die Langzeit Live - Bildgebung ist derzeit verfügbar. Darüber hinaus haben die HC079 (Amnion), G12424 (Serosa) und G04609 (Herz) Enhancer - Trap - Leitungen 51 sind mit LSFM 23 gekennzeichnet. Alternativ können fluoreszierend Embryonen auch durch mRNA 81 oder Farbstoff 79 Injektion erzeugt werden, sind diese Ansätze relativ einfach, aber leiden auch unter Einschränkungen 86. Mehrere weitere Standards werden nach wie vor erforderlich, so wie cytoskeletal-, organelle- und Membran-markierten Linien oder Leitungen, die unter bestimmten Fluorophore nicht ubiquitäre Promotoren exprimieren nur bestimmte Organe oder Gewebe zu beobachten. Idealerweise sind diese Linien auch mit unterschiedlichen Fluoreszenzproteinen zur Verfügung.

Eine weitere Herausforderung ist das Datenvolumen von LSFM erzeugt. Aufgrund Erfassung von Informationen in drei räumlichen Dimensionen und mindestens drei fueitere Freiheitsgrade (Zeit, Richtung, Fluoreszenzkanal), kann die Größe der Live-Abbildungsdatensätze leicht viele Gigabytes auf wenige Terabytes erreichen. Auch nach dem dreidimensionalen Zuschneiden und ZIP-basierte Komprimierung der TIFF - Container, die drei beispielhaften Datensätze mit dieser Studie verbunden sind haben Größen von 31,6, 12,6 und 45,1 Gigabytes, dh 89,3 Gigabyte insgesamt. Wenn mit LSFM arbeitet, ist es notwendig , die entsprechende Infrastruktur für die Datenspeicherung und 88 Verarbeitung zu haben, 97.

Die höchste Bildqualität wird an der Oberfläche des Embryos erhalten, jedoch mit der Tiefe zunimmt, das Fluoreszenzsignal wird mehr und mehr verschwommen. Zum Beispiel wird das hintere Ende des germband durch den Dottersack Falte während der Gastrulation abgedeckt und nicht richtig aufgelöst werden kann (4C, erste bis fünfte Spalte). Imaging entlang mehrerer Richtungen löst dieses Problem zumindest teilmathematisch - qualitativ hochwertige Informationen von der Oberfläche rund um den Embryo zur Verfügung steht, aber die inneren Bereiche unscharf bleiben. Derzeit sind keine befriedigenden Lösungen zur Verfügung, aber auf lange Sicht, Infrarot - Fluoreszenzproteine 98, genetische Ansätze 99 oder Mikroskop - Setups mit adaptiver Optik 100 in Betracht gezogen werden könnte.

Anpassung für andere Arten

Inzwischen hat LSFM verwendet worden , um die embryonale Entwicklung von drei Insektenarten zu dokumentieren, dh die Fruchtfliege Drosophila melanogaster 61, 62, 101, versenken die Megaselia abdita 102 und dem roten Reismehlkäfer Tribolium castaneum 57 fliegen. Der experimentelle Rahmen, Standardbetriebsverfahren und Montage hier beschriebenen Techniken should auf andere Insektenarten leicht anpassbar sein. Keimbahn - Transformationsprotokolle für viele Insekten , die zu unterschiedlichen Aufträgen gehören , sind verfügbar 103, einschließlich Spezies von wirtschaftlicher und / oder medizinischen Bedeutung, wie die Honigbiene 104, mehrere Lepidoptera 105, 106 oder mehr Mückenart 107, 108, 109. Mit jeweiligen transgenen Linien geeignet für Fluoreszenzechtzeit-Bildgebung, die embryonalen Morphogenese von Insekten können unter Berücksichtigung ihrer Evolutionslinien und / oder ökologischen Nischen charakterisiert werden. Über eine Million Insektenarten beschrieben worden , und weitere zwanzig Millionen Insektenarten die meisten existieren wahrscheinlich 110, die mehr als 400 Millionen Jahren der Evolution 2. Nur der vergleichende Ansatz wird diese Informationen erzeugt wiederum provides Einsichten, die erhalten werden können, nicht durch die Entwicklungsprinzipien von nur einer einzigen Art zu studieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Autor Beiträge

FS und Ehks konzipierte die Forschung. FS erzeugt, um die transgenen Linien Ágóc. Lichtbogen-basierte Fluoreszenz-Bildgebung wurde durch FS und SK durchgeführt. FS und Ehks schrieb das Manuskript mit dem Input von SK.

Acknowledgments

Wir danken Sven Plath für den technischen Support. Die Glia-blau transgene Linie war ein freundliches Geschenk von Gregor Bucher (Göttingen, Deutschland). Die Forschung wurde von dem Exzellenzcluster Frankfurt am Main für Makromolekulare Komplexe (CEF-MC, EXC 115, Sprecher Volker Dötsch) teilweise zu Ehks am Buchmann-Institut für Molekulare Biowissenschaften (BMLS, Direktor Enrico Schleiff) an der Goethe gewährt finanziert Universität Frankfurt am Main von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

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References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

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